UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Estudio de las condiciones óptimas de extracción mediante
fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo
(Kalanchoe pinnata)
Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación
para la obtención del título de Ingeniero Químico
Autor: Yadira Isabel Vilca Tobar
Tutor: Dra. Elvia Victoria Cabrera Maldonado
QUITO
2019
ii
©DERECHOS DE AUTOR
Yo, Yadira Isabel Vilca Tobar en calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación Estudio de las condiciones óptimas de extracción
mediante fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata),
modalidad Proyecto de Investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO
ORGÁNICO DE LA ECONOMIA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del
Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso comercial de la
obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor
sobre la obra, establecidos en la norma citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 114 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad
de toda responsabilidad.
En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de Marzo del 2019.
Firma:
________________________
Yadira Isabel Vilca Tobar
C.C. 1725494098
iii
APROBACION DEL TUTOR
Yo, Elvia Victoria Cabrera Maldonado en calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad proyecto de investigación Estudio de las condiciones óptimas de extracción
mediante fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata),
elaborado por la estudiante Yadira Isabel Vilca Tobar, de la carrera de Ingeniería Química
de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, considero
que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el
campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador
que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea
habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad
Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de Marzo del 2019.
------------------------------------------
Dra. Elvia Cabrera
C.C. 1757151921
iv
DEDICATORIA
A Dios por guiar cada uno de mis pasos y ofrecerme la vida que hoy tengo y
A mi familia por ser mi fuerza motora y el pilar fundamental de mi vida.
v
AGRADECIMIENTOS
A cada uno de los profesores de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad
Central del Ecuador quienes me dieron las pautas durante toda la carrera para formarme
profesionalmente y así el día de hoy poder culminarla.
A la Doctora Elvia Cabrera, quien me apoyó con su conocimiento, tiempo y experiencia
para que pueda culminar mi trabajo de investigación y así poder realizarme como
profesional.
Doy gracias al Ingeniero Pablo Londoño y la Ingeniera Estefanía Villamarín por su
tiempo y colaboración durante la elaboración de mi trabajo de investigación.
A mi mejor amiga Lissette quien con sus palabras me dio ánimo en los momentos difíciles
y con la que compartí muchas alegrías también, gracias por tu apoyo incondicional
durante estos 15 años de amistad.
A todos y cada uno de mis amigos quienes me extendieron su mano en los tiempos
difíciles, a aquellos que estuvieron a mi lado durante toda la carrera y aquellas personas
que me brindaron la oportunidad de conocer el significado de la amistad.
A mi novio Cristian por estar a mi lado, llenarme de cariño y amor durante este proceso
y poder culminar uno de mis objetivos.
vi
CONTENIDO
Pág.
LISTA DE TABLAS……………………………………... ............................................ x
LISTA DE FIGURAS…………………………………… ........................................... xii
LISTA DE ANEXOS……………………………………. .......................................... xiv
RESUMEN………………………………………………. ........................................... xv
ABSTRACT………………………………………………. ........................................ xvi
INTRODUCCIÓN…………………………………………. .......................................... 1
1. MARCO TEÓRICO………………………………………. ................................. 3
1.1. Generalidades de la planta Kalanchoe Pinnata .................................................... 3
1.2. Principios Activos ............................................................................................... 4
1.2.1. Polifenoles .......................................................................................................... 4
1.2.2. Flavonoides ......................................................................................................... 5
1.3. Obtención de extractos por métodos convencionales ........................................... 6
1.3.1. Extracción Soxhlet .............................................................................................. 6
1.3.2. Extracción por maceración .................................................................................. 7
1.4. Obtención de extractos por fluidos supercríticos (EFS) ........................................ 8
1.4.1. Fluido supercrítico............................................................................................... 8
1.4.2. Extracción con fluido supercrítico (EFS) ............................................................. 9
1.4.3. Extracción con CO2 como fluido supercrítico .................................................... 10
1.4.4. Variables operacionales de la EFS ..................................................................... 11
1.5. Métodos de identificación y cuantificación de metabolitos secundarios ............. 13
vii
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL……………………………………….....14
2.1. Diseño Experimental para la extracción por CO2 supercrítico ........................... 14
2.1.1. Variables Dependientes ..................................................................................... 14
2.1.2. Variables Independientes: .................................................................................. 14
2.1.3. Variables Fijas................................................................................................... 14
2.1.4. Diseño Experimental ......................................................................................... 15
2.2. Diagrama de flujo del proceso de extracción mediante CO2 supercrítico ............ 16
2.3. Diagrama de fases del proceso ........................................................................... 17
2.4. Metodología para las fases de la Investigación................................................... 17
2.4.1. Tratamiento de las hojas de Kalanachoe Pinnata ............................................... 17
2.4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. Pinnata y
determinación del rendimiento .................................................................................... 21
2.4.3. Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de
Kalanachoe Pinnata. ................................................................................................... 26
2.4.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con
espectrometría de masa ............................................................................................... 30
2.4.5. Análisis de Datos............................................................................................... 32
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS……………………………………………..…33
3.1. Cálculos del tratamiento a las hojas de Kalanachoe Pinnata ............................. 33
3.1.1. Cálculo de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanachoe Pinnata ... 33
3.2. Cálculos de la extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K.
Pinnata y determinación del rendimiento .................................................................... 35
3.2.1. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente empleado en la extracción ........... 35
3.2.2. Cálculo del rendimiento del extracto.................................................................. 40
3.3. Cálculos de la estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las
hojas de Kalanachoe Pinnata. ..................................................................................... 42
3.3.1. Cálculos para la curva de calibración ................................................................. 42
viii
3.3.2. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos obtenidos por EFS .......... 43
3.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con
espectrometría de masa ............................................................................................... 48
3.4.1. Resultados de la caracterización por marchas fitoquímicas ................................ 48
3.4.2. Resultados de la caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de
masa ........................................................................................................................... 48
3.5. Resultados para el análisis de Datos .................................................................. 50
3.5.1. Análisis estadístico para el Rendimiento del extracto obtenido por EFS ............. 51
3.5.2. Análisis estadístico para el TFC de extracto obtenido por EFS........................... 52
4. DISCUSIÓN……………………………………………………………………..53
4.1. Características y consideraciones en el tratamiento de las hojas de Kalanchoe
pinnata. ....................................................................................................................... 53
4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. pinnata y
determinación del rendimiento .................................................................................... 55
4.2.1. Resultados del rendimiento de extracción .......................................................... 55
4.2.2. Optimización del rendimiento del extracto obtenido mediante fluido supercrítico
CO2 ............................................................................................................................. 56
4.2.3. Comparación entre la extracción por maceración y mediante fluido supercrítico
CO2 ............................................................................................................................. 58
4.3. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en el extracto de las hojas de
Kalanachoe pinnata .................................................................................................... 60
4.3.1. Resultados de la estimación (TFC) .................................................................... 60
4.3.2. Optimización del contenido total de flavonoides en las hojas de Kalanchoe
pinnata........................................................................................................................ 61
4.4. Resultados para la caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de
gases con espectrometría de masa del extracto de K. pinnata ....................................... 62
4.4.1. Caracterización mediante marcha fitoquímica.................................................... 62
4.4.2. Caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa (CG-EM)
................................................................................................................................... 63
ix
5. CONCLUSIONES…………………………………………. .................................... 64
6. RECOMENDACIONES………………………………………… ............................ 65
CITAS BIBLIOGRAFICAS………………………………….. ................................... 66
ANEXOS…………………………………………………………. .............................. 72
x
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Tipos de flavonoides y sus estructuras moleculares ......................................... 5
Tabla 2.Propiedades supercríticas de ciertas sustancias ................................................ 9
Tabla 3.Propiedades de algunas sustancias usadas como fluidos supercríticos ............. 10
Tabla 4. Investigaciones de extracción con fluidos supercríticos de productos naturales
................................................................................................................................... 12
Tabla 5. Diseño experimental de la investigación sin réplica ....................................... 15
Tabla 6. Niveles de los parámetros en investigación .................................................... 15
Tabla 7. Humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata ...................... 34
Tabla 8. Porcentaje de humedad de las hojas secas ...................................................... 35
Tabla 9. Flujos volumétricos empleados en cada experimento de la extracción por EFS
................................................................................................................................... 40
Tabla 10. Resultados de los rendimientos de los extractos obtenidos por EFS ............. 41
Tabla 11. Resultados de los volúmenes necesarios para aforar a 10 mL las soluciones
estándar ...................................................................................................................... 43
Tabla 12. Concentraciones de las soluciones diluidas de quercetina con sus respectivas
absorbancias ............................................................................................................... 43
Tabla 13. Concentraciones de quercetina equivalente en los extractos ......................... 45
Tabla 14. Contenido total de flavonoides (TFC) .......................................................... 47
Tabla 15. Identificación de flavonoides en el extracto ................................................. 48
Tabla 16. Compuestos identificados en el extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en etanol ........................................................................................................ 49
Tabla 17. Compuestos identificados en el extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en cloroformo ................................................................................................ 50
Tabla 18. Representación de los factores empleados en las hipótesis nulas y alternativas
................................................................................................................................... 51
Tabla 19. ANOVA para el rendimiento del extracto .................................................... 51
Tabla 20:ANOVA para el contenido total de flavonoides (TFC) del extracto .............. 52
xi
Tabla 21. Características de las hojas de Kalanchoe pinnata ....................................... 53
Tabla 22. Características y rendimientos de los extractos de las hojas de K. pinnata
obtenidos por diferentes tipos de extracción ................................................................ 59
xii
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Kalanchoe pinnata ........................................................................................ 3
Figura 2. Diagrama de fases para el CO2 ....................................................................... 8
Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de investigación ............................................ 16
Figura 4. Fases de la Investigación .............................................................................. 17
Figura 5. Hojas de Kalanchoe pinnata dentro de la estufa a las condiciones
especificadas ............................................................................................................... 19
Figura 6. Proceso de secado de las hojas de chiriyuyo ................................................. 19
Figura 7. Molino centrífugo ........................................................................................ 20
Figura 8. Sistema de análisis granulométrico ............................................................... 20
Figura 9. Esquema del equipo de fluido supercrítico ................................................... 22
Figura 10. Crisol con 40 g de polvo de hojas de K. pinnata ......................................... 23
Figura 11. Tanque extractor del equipo EFS ................................................................ 23
Figura 12. Tanque extractor dentro del horno del equipo EFS ..................................... 24
Figura 13. Imagen del equipo de Extracción con fluido supercrítico ............................ 26
Figura 14. Preparación de las soluciones estándar de quercetina para la curva de
calibración .................................................................................................................. 28
Figura 15. Reactivos preparados.................................................................................. 28
Figura 16. Extractos obtenidos por EFS ...................................................................... 29
Figura 17. Preparación de viale ................................................................................... 32
Figura 18. Curva de calibración de quercetina ............................................................. 44
Figura 19. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata disuelto
en etanol ..................................................................................................................... 48
Figura 20. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata disuelto
en cloroformo ............................................................................................................. 49
Figura 21. Efecto del Flujo de CO2 sobre el rendimiento de extracción ....................... 55
Figura 22. Diagrama de pareto estandarizado para el rendimiento del extracto ............ 57
xiii
Figura 23. Gráfica de efectos principales para el rendimiento del extracto obtenido por
extracción con fluido supercrítico CO2 ........................................................................ 57
Figura 24. Gráfico de superficie de respuesta estimada a temperatura constante .......... 58
Figura 25. Comparación de los rendimientos de extracción por maceración y EFS ...... 59
Figura 26. Diagrama de Pareto estandarizado para el TFC ........................................... 61
Figura 27. Efectos principales para el TFC .................................................................. 61
Figura 28. Gráfico de superficie de respuesta estimada a tiempo dinámico constante... 62
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pág.
ANEXO A. Análisis granulométrico del polvo de las hojas de K. pinnata ................... 73
ANEXO B. Mediciones de absorbancias de los diferentes extractos obtenidos por EFS
................................................................................................................................... 74
ANEXO C. Marcha Fitoquímica: Reacción de Shinoda ............................................... 75
ANEXO D. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cloruro Férrico ................................... 76
ANEXO E. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cianidina ............................................ 77
xv
TITULO: Estudio de las condiciones óptimas de extracción mediante fluido
supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata).
Autora: Yadira Isabel Vilca Tobar
Tutor: Dra. Elvia Victoria Cabrera Maldonado
RESUMEN
Se optimizaron las condiciones de presión, temperatura y tiempo dinámico, en el
rendimiento y contenido total de flavonoides (TFC) del extracto de las hojas de
Kalanchoe pinnata, obtenido mediante fluido supercrítico, CO2.
Para la extracción se trabajó con polvo de hoja con un tamaño de partícula (≤1 mm),
acondicionado a una humedad del 8–10%. Se llevó a presiones de 150 y 200 bar,
temperaturas de 35 y 40 ºC y tiempos dinámicos de 60 y 120 min, fijando el tiempo
estático en 80 min, el solvente a 5 L / min y una relación del 5% en masa de etanol
48%(v/v) / CO2. Para la estimación del TFC se aplicó el método colorimétrico de cloruro
de aluminio.
La identificación de las mejores condiciones se realizó aplicando la metodología de
superficie de respuesta con un diseño experimental 23. Se obtuvo como resultado un
rendimiento del 1,59% y un TFC de 0,4575 mg Quercetina Equivalente (QE) / g muestra
seca, a las condiciones óptimas: presión de 200 bar, temperatura de 35 ºC y tiempo
dinámico de 120 min, concluyendo que la variable con mayor influencia significativa es
la presión.
PALABRAS CLAVE: OPTIMIZACIÓN/ EXTRACCIÓN/ FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS / DIOXIDO DE CARBONO / KALANCHOE PINNATA /
CHIRIYUYO / FLAVONOIDES.
xvi
TITLE: Study of the optimal conditions of extraction through supercritical fluid of
the extract of the leaves of chiriyuyo (Kalanchoe pinnata).
Author: Yadira Isabel Vilca Tobar
Tutor: Dra. Elvia Victoria Cabrera Maldonado
ABSTRACT
The conditions of pressure, temperature and dynamic time, in the yield and total content
of flavonoids (TFC) of the extract of the leaves of Kalanchoe pinnata, obtained by means
of supercritical fluid, CO2, were optimized.
For the extraction we worked with leaf powder with a particle size (≤1 mm), conditioned
at a humidity of 8-10%. It was brought to pressures of 150 and 200 bar, temperatures of
35 and 40 ºC and dynamic times of 60 and 120 min, fixing the static time in 80 min, the
solvent at 5 L / min and a ratio of 5% in mass of ethanol 48% (v / v) / CO2. For the
estimation of the TFC, the colorimetric method of aluminum chloride was applied.
The identification of the best conditions was carried out applying the response surface
methodology with an experimental design 2 ^ 3. The result was a yield of 1.59% and a
TFC of 0.4575 mg Equivalent Quercetin (QE) / g dry sample, at the optimum conditions:
pressure of 200 bar, temperature of 35 ºC and dynamic time of 120 min, concluding that
the variable with the most significant influence is the pressure.
KEY WORDS: OPTIMIZATION / EXTRACTION / SUPERCRITICAL FLUIDS
/ CARBON DIOXIDE / KALANCHOE PINNATA / CHIRIYUYO / FLAVONOIDS.
1
INTRODUCCIÓN
El Ecuador posee una gran diversidad en cuanto a flora, que ha sido reconocida y
estudiada por varios años, aproximadamente existen 18766 especies de plantas
vasculares, de estas, se han detectado 5172 como especies útiles en lo que se refiere a
usos medicinales, alimenticios y materiales de construcción (Balslev, Navarrete, Torre,
& Macía, 2008). En el campo medicinal, 3118 plantas son usadas de forma tradicional
(Vacas Cruz et al., 2015). En cuanto a su distribución geográfica un 42 % se encuentra en
la región Oriente del Ecuador, de este porcentaje se identificó en la Provincia de Napo
(Tena) una planta llamada comúnmente Chiriyuyo, cuyo nombre científico es Kalanchoe
Pinnata, el extracto obtenido a partir de sus hojas, tallos y raíces presentan propiedades
particulares que lo convierten en un recurso biológico antioxidante, inmunomodulador,
antialérgico, anticancerígeno, antiviral, anticonvulsivo, antihipertensivo, antifúngico,
entre otros (Bopda et al., 2014).
Para la obtención de extractos a partir de materias primas vegetales se emplean métodos
tradicionales como la maceración y extracción soxhlet que si bien, proporcionan buenos
rendimientos (Alara, Abdurahman, & Ukaegbu, 2018a), involucran grandes cantidades
de tiempo y solvente así como también la descomposición de compuestos orgánicos.
En los últimos años se ha planteado ciertas tecnologías medioambientales como la
extracción asistida por microondas, extracción ultrasónica y extracción con fluido
supercrítico (EFS), siendo la última metodología empleada actualmente en varias
investigaciones y de las cuales se han obtenido mejores resultados de extracción de
compuestos activos de manera eficiente, superando las técnicas convencionales
(Ferrentino, Morozova, Mosibo, Ramezani, & Scampicchio, 2018).
En Ecuador están reportados algunos trabajos relacionados con la extracción de
compuestos mediante fluido supercrítico, la mayoría se enfatizan en la obtención de
aceites de semillas y determinación de compuestos activos de plantas pero, en la
actualidad no hay información respecto a la extracción con fluido supercrítico del extracto
2
activo de las hojas de Kalanchoe pinnata que, dada sus comprobadas propiedades
anteriormente señaladas, hace un interesante objetivo de estudio la optimización de la
extracción a partir de la fuente natural vegetal.
Basado en estas evidencias y gracias a la disponibilidad de un equipo de EFS en la
Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, se realizó un
estudio del proceso de extracción aplicando fluido supercrítico CO2 a las hojas de
Chiriyuyo para determinar si se obtiene un mejor resultado en cuanto a rendimiento y
calidad, optimizando las variables del proceso de extracción.
Este trabajo aporta con el desarrollo de investigaciones previas y además de la obtención
de un extracto natural de alta calidad en cuanto a compuestos activos que podrían ser
aplicados en el campo farmacéutico, alimenticio, cosmético, etc.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Generalidades de la planta Kalanchoe Pinnata
Kalanchoe pinnata también conocida como Bryophyllum pinnatum, es una planta
medicinal perteneciente a la familia Crussulaceae, el estudio del extracto acuoso de sus
hojas presenta gracias a los análisis fitoquímicos, alcaloides, saponinas, taninos, esteroles,
flavonoides, vitaminas, y minerales (Bopda et al., 2014), físicamente esta hierba exhibe
hojas de color verde oscuro festoneadas y bordadas por un color rojizo, tallos altos
(huecos) y flores colgantes en forma de campana.
Endémicamente proviene de Madagascar (Mora-Pérez & Hernández-Medel, 2016) pero
esta especie ha sido localizada también en las regiones templadas como Asia, Australia,
Nueva Zelanda, Polinesia, Ecuador, México, (Sharker et al., 2012a) debido a que ha sido
introducida y naturalizada.
Figura 1. Kalanchoe pinnata (autor)
Su actividad biológica le ha permitido destacarse en el campo farmacológico
combatiendo ciertas patologías como infecciones, reumatismo e inflamación; por otra
parte, también se utilizan para el tratamiento del dolor de oído, quemaduras, úlceras,
diarrea y picaduras de insectos (Bogucka-Kocka, Zidorn, Kasprzycka, Szymczak, &
Szewczyk, 2018)
4
1.2. Principios Activos
Esta hierba medicinal está constituida por un grupo de compuestos químicos endógenos
llamados antioxidantes, que son moléculas orgánicas capaces de inhibir o retrasar el
proceso de oxidación a través de varios mecanismos, uno de ellos es la interacción de
electrones liberados por estas sustancias con los radicales libres presentes en un cuerpo o
individuo. Esta neutralización se da gracias a una afinidad superior existente entre los
antioxidantes y los radicales libres en comparación con cualquier otro tipo de sustrato
oxidable; entendiendo como tal a la mayoría de moléculas orgánicas como inorgánicas
que forman parte de células vivas como por ejemplo los lípidos, proteínas, hidratos de
carbono, incluso el mismo ADN (García, 2001)(Uwalsky, 1840)(Justo & Gutiérrez, 2002)
(Iglesias, 2009).
1.2.1 Polifenoles
Una parte del potencial antioxidante en las plantas se debe a compuestos polifenólicos
presentes; estos son un grupo de metabolitos secundarios derivados naturalmente del
vegetal. Los polifenoles ejercen el papel de agentes reductores, eliminadores de iones
metálicos quelatos y de radicales libres, también están en la capacidad de estabilizarlos,
pueden ser cofactores de enzimas que catalizan reacciones oxidativas, inhiben oxidasas y
dan fin a reacciones de la cadena radical.
Existen varias clases de polifenoles, como por ejemplo ácidos benzoicos, ácidos
cinámicos, ácidos fenólicos, cumarinas y flavonoides (Martínez & Expósito, 2018), K.
pinnata contiene precisamente esta clase de polifenoles cuya actividad ayuda a la
prevención de algunos tipos de cáncer. Químicamente están presentes p-hidroxicinámico,
cafeico, p-cumárico, ferúlico, p-hidroxibenzoico, ácidos protocatéquicos, quercetina,
kaempferol, luteolina, astragalina, rutina y patuletina (Bogucka-Kocka et al., 2018).
5
1.2.2 Flavonoides
Los flavonoides son moléculas polifenólicas presentes esencialmente en las hojas de
plantas vasculares, se caracterizan por exhibir una estructura de tipo (C6-C3-C6) que
consiste de dos anillos bencénicos en los extremos de la molécula (anillo A y B), unidos
por tres átomos de carbono que pueden o no formar un tercer anillo denominado (anillo
C) (Soto, 2015); se dividen en flavonoides, isoflavonoides y neoflavonoides, además se
incluyen otras moléculas como las chalconas, hidrochalconas, auronas y auronoles
(Cabrera & Mach, 2012). Las modificaciones estructurales a la base se dan por sustitución
de grupos metoxilo, metilendioxi, acetilo y residuos de azúcares(Osmany Cuesta R,
Ingrid Márquez H, 2015).
Los flavonoides poseen diversas propiedades debido a la variación en el número y
disposición de los grupos hidroxilo, así como también de la naturaleza, grado de
alquilación y glicosilación de los mismos (Zamora, 2016), de esta forma tienen un poder
antioxidantes, antiinflamatorio, antialérgico, antitumoral, antifúngico e inhibidor de
enzimas.
Tabla 1. Tipos de flavonoides y sus estructuras moleculares (Marriott, 2013)
Tipo de Flavonoide Estructura Nombre
Isoflavonas
R1=H
R2=OCH3
R3=OH
Gliciteina
Chalconas R1=OH
R2=OH
R3= OCH3
2,6-dihidroxi-4´-
metoxichalcona
6
Tabla 1. (Continuación)
Tipo de Flavonoide Estructura Nombre
Flavanonas
R1=H
R2=H
R3=H
Pinocembrina
Flavonoles R1=OH
R2=OH
R3=H
Quercetina
Antocianinas
R1=OH
R2=OH
R3=H
Cianidina
1.3. Obtención de extractos por métodos convencionales
Para la obtención de extractos a partir de una planta, tradicionalmente se empleaban la
decocción o la infusión, que si bien, permiten extraer cierta parte activa de la planta, son
métodos poco reproducibles al contrario de la extracción soxhlet y maceración, que
además de ser simples, admiten una cuantificación de compuestos con cierta actividad
que se encuentran presentes en la muestra a examinar. (Verde, Aranday, & Rivas, 2016)
1.3.1. Extracción Soxhlet
La extracción soxhlet es una técnica de lixiviación comúnmente utilizada para la
extracción de compuestos fenólicos, trabaja con menos tiempo y solvente que otros
métodos convencionales como la maceración, generando así un elevado rendimiento en
7
cuanto a transferencia de masa a partir de una muestra (Alara, Abdurahman, & Ukaegbu,
2018b).
Operacionalmente es una técnica continua-discreta, donde se procede a colocar la muestra
vegetal en un soporte de dedal, este se llena de disolvente fresco condensado desde un
matraz de destilación hasta que llega al punto de desbordamiento donde es aspirado por
un sifón llevando los compuestos requeridos en el solvente nuevamente hacia el equipo
de destilación. Para concluir con la extracción se debe llevar a cabo un proceso de
evaporación y concentración. (Luque de Castro, Ruiz Jiménez, & García Ayuso, 2013)
En un estudio comparativo de extracción de aceite de nuez moscada entre EFS y
extracción soxhlet se observó un mayor rendimiento en la extracción con fluido
supercrítico con un valor de 38,8 g de aceite, mientras que con extracción soxhlet se
obtuvo 34 g de aceite ambos sobre 100 g de muestra. Además en lo que se refiere a
calidad, los extractos por EFS exhibieron un grupo éter aromático significativamente más
alto que en los extractos conseguidos por extracción soxhlet (Al-Rawi, Ibrahim, Majid,
Abdul Majid, & Kadir, 2013).
1.3.2. Extracción por maceración
Por mucho tiempo se ha empleado la maceración como un método de extracción sólido-
líquido, se lleva a cabo gracias al contacto del material vegetal en ciertas condiciones con
un solvente seleccionado por polaridad en un lapso de tiempo determinado; esta técnica
puede ser aplicada en frío o en caliente dependiendo de la materia prima o el
requerimiento, adicional, se puede complementar con agitación para mejorar la
solubilidad de compuestos y por ende la eficiencia del proceso. Por último, el extracto
obtenido se somete a evaporación para la concentración de los compuestos y eliminación
del solvente. (Enrique et al., 2013)(Bishr, El-Degwy, Abdel Hady, Amin, & Salama,
2017)
En una investigación sobre la extracción de piretrinas de flores de piretro
(Chrysanthemum cinerariifolium) con los métodos de maceración y fluido supercrítico se
observó que el rendimiento obtenido por la EFS tuvo un valor de aproximadamente 4,1
% del material extraído con respecto al peso de las flores secas con la ventaja de que no
8
requirió el uso de co-disolvente y en un tiempo de 40 minutos. Por otra parte, las
extracciones con maceración tradicional tuvieron contenidos máximos de sustancias
extraíbles en n-hexano (3,03%) y alcohol etílico (5,77%) en un tiempo de 4 días (Gallo
et al., 2017).
1.4. Obtención de extractos por fluidos supercríticos (EFS)
1.4.1. Fluido supercrítico
Se denomina fluido supercrítico a cierta sustancia pura que se encuentra operando en
condiciones de presión y temperatura por encima de su punto crítico; en un diagrama de
fases esta zona se designa como “estado supercrítico” y exhibe propiedades peculiares en
los compuestos, de modo que presentan características tanto de líquidos como de gases,
esta particularidad les permite tener alta densidad, baja viscosidad y elevada difusividad
que son propiedades susceptibles a cambios ya sea por efecto del aumento o disminución
de presión o temperatura (Valverde, 2002) (Cardona & Orrego, 2009).
Figura 2. Diagrama de fases para el CO2 (Romero et al., 2010)
9
El punto crítico es propio de cada sustancia de tal forma que escoger un solvente
apropiado es determinante a la hora de llegar a este estado.
Tabla 2.Propiedades supercríticas de ciertas sustancias (Liley et al., 1999)
Fluido Temperatura crítica
(°C)
Presión crítica
(atm)
Densidad crítica
(g/cm3)
CO2 31,06 73,9 0,463
N2O 36,42 72,8 0,321
NH3 132,50 113,0 0,236
C2H5OH 240,77 61,2 0,449
H2O 373,98 219,4 0,274
1.4.2. Extracción con fluido supercrítico (EFS)
La extracción con fluido supercrítico es una operación unitaria que se utiliza comúnmente
en la obtención de compuestos activos de una matriz vegetal por transferencia de masa a
partir del uso de un agente extractor en estado supercrítico.
Esta tecnología reemplaza los métodos de separación tradicionales gracias a ciertas
ventajas que presenta, una de ellas es que su procedimiento es amigable con el medio
ambiente debido a que no usa sustancias tóxicas o en caso de hacerlo, en pequeñas
cantidades, además no necesita ningún proceso de separación previo o adicional y debido
a que trabaja con fluidos supercríticos es posible ajustar el poder de solvatación del mismo
manipulando ciertas variables permitiendo realizar extracciones selectivas, rápidas y
efectivas en las que se proporciona un extracto estable y uniforme. (Favareto et al.,
2017)(Bishr et al., 2017)
La extracción se lleva a cabo bajo cuatro etapas generales, la primera es un ajuste de
temperatura mediante resistencias que aportan energía térmica, el solvente previamente
escogido se calienta hasta elevarlo por encima de su temperatura crítica. La segunda etapa
es un proceso de presurización en la que el disolvente ya calentado llega a un valor
superior a su presión crítica. La tercera etapa es la fase de extracción y el fluido ya en las
10
condiciones deseadas permanece en contacto con la muestra que lleva consigo el soluto.
Por último, queda la etapa de separación, aquí el gas se descomprime por debajo de su
presión crítica dejando al soluto libre en el recipiente del equipo (Ramírez, 2017)(Pantoja,
2016)
1.4.3. Extracción con CO2 como fluido supercrítico
El disolvente más empleado en extracciones con fluido supercrítico es el CO2, esto gracias
a las excelentes características que presenta frente a otros solventes, entre estas cabe
mencionar que es una sustancia no tóxica, no inflamable, no corrosiva, con alta pureza,
químicamente inerte y su adquisición es fácil y relativamente barata. (EntrainerHazuki et
al., 2016)
Por otra parte, su uso tiene un gran interés debido a que sus propiedades fisicoquímicas
como baja temperatura crítica evita o minimiza la degradación de compuestos
termolábiles y la generación de compuestos indeseables (Villanueva-Bermejo, Zahran,
García-Risco, Reglero, & Fornari, 2017); otras propiedades como la densidad, viscosidad
y difusividad le confieren una alta selectividad en cuanto a compuestos no polares, lo que
puede mencionarse como una ligera desventaja. La obtención de compuestos polares se
supera con la adición de pequeñas cantidades de agentes de arrastre como co-disolventes,
entre los más empleados el agua y etanol (Gallo et al., 2017).
Tabla 3.Propiedades de algunas sustancias usadas como fluidos supercríticos
(Antonio, Camacho, & Lobato, 2004)
Propiedades CO2 NH3 H2O(l) N2O CFC HC CH3OH
Toxicidad + - + + + -
Inflamabilidad + - + + - -
Bajo Costo + - + + - -
Reactividad + - - - + + -
Facilidad en alcanzar condiciones
supercríticas
+ - - + + + -
Impacto ambiental + + - -
11
Tabla 3. (Continuación)
Propiedades CO2 NH3 H2O(l) N2O CFC HC CH3OH
Gas en condiciones ambientales + + + + +
Polaridad - + + + + - +
Donde: (+) Favorable para la extracción (-) Desfavorable para la extracción
(CFC) Clorofluorocarbonados (HC) hidrocarburos
1.4.4. Variables operacionales de la Extracción con fluido supercrítico (EFS)
Para una extracción concreta con fluido supercrítico se debe tomar en cuenta las
características que tienen la matriz vegetal, la materia que se desea extraer y el disolvente
que se empleará, puesto que de estas dependen las condiciones operativas con las que se
diseñará la metodología experimental (Raventos, 2005).
Por otra parte, es necesario tener un conocimiento previo de las variables que van a tener
influencia durante el proceso de extracción ya que es el primer paso hacia una
optimización. A continuación se describen algunos de los factores que intervienen en este
tipo de extracción (Valverde, 2002):
Presión y Temperatura: el poder de solvatación del agente extractor está
estrictamente relacionado con su variabilidad.
Tipo de extracción: la extracción con fluido supercrítico se puede llevar a cabo de
forma estática o de forma dinámica donde su diferencia radica en la renovación del
disolvente.
Tiempo de extracción: el tiempo de contacto entre el disolvente y la matriz vegetal
es fundamental para lograr una buena extracción, se otorga un tiempo a cada tipo de
extracción.
Características de la muestra: el tamaño de partícula y la humedad de la muestra
son variables que se ven afectadas debido al área superficial de contacto y la
interacción de la cantidad de agua con el solvente en acción respectivamente.
Modificador: el tipo de co-solvente (polar o apolar) que se emplee, tendrá un mayor
o menor efecto de acuerdo al tipo de compuestos que se desee obtener.
12
Caudal del fluido supercrítico: dado el agente extractor está en la capacidad de
arrastrar consigo la mayor cantidad de soluto es importante la continua renovación de
volumen de fluido supercrítico en un tiempo determinado para evitar la saturación y
con ello mejorar la efectividad del proceso.
Relación co-solvente/solvente: según bibliografía la relación puede ser en volumen,
pero la más empleada es en masa entre los valores de (5-10) %.
Este tipo de extracción maneja una gran cantidad de variables que afectan el proceso, por
tal razón una sola condición no genera suficiente información al respecto, esta dificultad
se soluciona identificando e investigando un considerable número de factores bajo un
control adecuado modificando así la capacidad de extracción. Además en la EFS se puede
ajustar un gran número de variables que hacen que el proceso sea sensible, único y
específico (Sharif et al., 2014).
Tabla 4. Investigaciones de extracción con fluidos supercríticos de productos
naturales
Materia
Prima
Principio
activo
Condiciones
óptimas de
extracción
Resultados Fuente
Frutos de
Ammi visnaga
ɤ-Pyrones P (bar): 200
T (°C): 45
t.p. (mm): 1,4
R= 1,74%
(Bishr et al.,
2017)
Ají panca capsaicinoides P (bar): 400
T (°C): 40
R=13,337% (Gavilan &
Narda, 2016)
Mesocarpio
del fruto de
palma africana
Aceite esencial P (bar): 300
F (L/min): 4,2
T (°C): 50
R=8,0% (Morillo,
Fernández,
Hernández,
Castillo, &
Marquina, 2010)
Semillas de
mora
Aceite esencial P (bar): 350
T (°C): 60
R=14,5% (Pantoja-
Chamorro,
Hurtado-
Benavides, &
Martínez-
Correa, 2017)
13
Tabla 4. (Continuación)
Materia
Prima
Principio
activo
Condiciones
óptimas de
extracción
Resultados Fuente
Azafrán α-crocin P (bar): 350
T (°C): 60
Co: metanol
R =62,7%
(EntrainerHaz
uki et al.,
2016)
Donde: P= Presión, T= Temperatura, t.d.= Tiempo dinámico, t.p.= Tamaño de
partícula, F= Flujo de CO2, R= Rendimiento, Co= Co-solvente
1.5. Métodos de identificación y cuantificación de metabolitos secundarios
La identificación de metabolitos secundarios se logra con la aplicación de ciertas técnicas
de análisis cualitativo como las marchas fitoquímicas entre las cuales se tiene a la reacción
de shinoda, cianidina y cloruro férrico (Ortíz et al., 2016). Actualmente la cuantificación
de ciertos compuestos ha alcanzado un gran interés puesto que proporciona una idea de
calidad de extracto. Uno de los métodos más empleado para la cuantificación de
polifenoles, en específico flavonoides, es la espectrofotometría UV-Vis, que se basa en
la ley de Lambert Beer que no es otra cosa que una relación entre la absorbancia y la
concentración del soluto (Harvey, 2002).
Experimentalmente para la cuantificación se construye una curva de calibración estándar
a partir de un compuesto patrón, con los reactivos y longitudes de onda pertinentes; una
vez hecho esto, se encuentra una ecuación por regresión lineal que represente el modelo
y por con siguiente la determinación cuantitativa de flavonoides. Los valores son
representados en unidades de mg del flavonoide estándar equivalente por gramo de
muestra seca (Al-Owaisi, Al-Hadiwi, & Khan, 2014).
14
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Este trabajo de investigación partió de una extensa revisión bibliográfica actualizada, se
llevó a cabo en la ciudad de Quito en el Laboratorio de Investigación 212 de la Facultad
de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.
2.1. Diseño Experimental para la extracción por CO2 supercrítico
2.1.1. Variables Dependientes
Rendimiento del extracto (%)
Calidad del extracto: Contenido total de flavonoides (mg de quercetina equivalente
(QE) / g de muestra seca)
2.1.2. Variables Independientes:
Presión de extracción (bar)
Temperatura de extracción (°C)
Tiempo dinámico de extracción (min)
2.1.3. Variables Fijas
Porcentaje de humedad las hojas de K. Pinnata : (8 − 10 % )
Flujo de CO2 : (5𝐿
𝑚𝑖𝑛)
Relación en masa (etanol/ masa de CO2) : (5% masa)
Tiempo estático : (80 min)
Tamaño de partícula :(≤ 1)mm de diámetro
Co-solvente : Etanol 48 % (v/v) (mL/min
15
2.1.4. Diseño Experimental
Para la optimización de las variables en cuanto a rendimiento del extracto y contenido
total de flavonoides se optó por un diseño factorial 23 con una réplica., dando como
resultado 8 tratamientos y un total de 16 experimentos.
Tabla 5. Diseño experimental de la investigación sin réplica
Tratamientos
Variables
P (bar) T (°C) t (min) R (%) TFC
1 +1 +1 +1 R1 TFC1
2 +1 +1 -1 R2 TFC2
3 +1 -1 +1 R3 TFC3
4 +1 -1 -1 R4 TFC4
5 -1 +1 +1 R5 TFC5
6 -1 +1 -1 R6 TFC6
7 -1 -1 +1 R7 TFC7
8 -1 -1 -1 R8 TFC8
Donde: P = presión de extracción (bar)
T = temperatura de extracción (grados centígrados)
t = tiempo dinámico de extracción (minutos)
R= rendimiento del extracto (%)
TFC= contenido total de flavonoides (𝑚𝑔 𝑄𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎 𝐸𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎)
La tabla 4 muestra el diseño experimental con las variables para evaluar el efecto de la
presión de extracción, temperatura de extracción y tiempo dinámico de extracción
respecto al rendimiento del extracto y el contenido total de flavonoides.
Tabla 6. Niveles de los parámetros en investigación
Parámetros Niveles
Alto (+1) Bajo (-1)
Presión de extracción (bar) 200 150
Temperatura de extracción (°C) 40 35
Tiempo dinámico de extracción (min) 120 60
16
2.2. Diagrama de flujo del proceso de extracción mediante CO2 supercrítico
Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de investigación (autor)
17
2.3. Diagrama de fases del proceso
Figura 4. Fases de la Investigación (autor)
2.4. Metodología para las fases de la Investigación
2.4.1. Tratamiento de las hojas de Kalanachoe Pinnata
a. Sustancias y Reactivos
Agua H2O(l)
Etanol C2H5OH(l)
b. Materiales y Equipos
Hojas de Kalanachoe Pinnata
Papel periódico
Papel aluminio
Tina
Rociador V=(1L)
Balanza analítica Marca: BOECO.
Modelo: BAS 31 plus
A= (±0,0001g) R= (220g)
Tratamiento de las hojas
de Kalanchoe
pinnata
Extracción mediante CO2
supercrítico de las hojas de
Kalanachoe pinnata y
determinación del rendimiento
Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de
Kalanachoe pinnata
Caracterización por marchas
fitoquímicas y cromatografía de
gases con espectrometría de
masa
18
Vaso de precipitación A=(±50mL) V= (600mL)
Tijeras
Cucharilla metálica
Molino Centrífugo Marca: Retsch
Modelo: ZM200
Estufa Marca: Memmert
Modelo: 100-800
A= (±5°C) R= (30-330°C)
Sistema de análisis granulométrico Marca: Retsch Technology
Modelo: CAMSIZER
c. Procedimiento
En la parroquia de Misahualli, ubicada en la Provincia de Napo (Tena), bajo un clima
húmedo-tropical con temperaturas desde los 25°C; se recolectó 12 Kg de hojas frescas de
Kalanachoe pinnata y se envolvieron en papel periódico para que no se maltraten
mientras se trasladaban al laboratorio de Investigación 212 en la Facultad de Ingeniería
química de la Universidad Central del Ecuador (Quito).
Limpieza y desinfección de las hojas
Seleccionar y lavar las hojas con el fin de eliminar cualquier tipo de residuo o
impureza que interfiera con la extracción. Una vez realizado esto escurrir sobre papel
periódico por un lapso de 24 horas.
Desinfectar las hojas con ayuda de un rociador lleno de etanol al 96% y dejar actuar
por un tiempo de 4 horas.
19
Secado de las hojas
Una vez desinfectadas las hojas, se determinó la humedad promedio por un método
gravimétrico.
Colocar 50 gramos de hojas frescas cortadas sobre papel aluminio previamente
pesado, luego introducir dentro de una estufa a 60°C por 12 horas y pesar en lapsos
de cada 4 horas hasta que el valor de la masa sea constate, la diferencia entre la masa
inicial y la final fue la cantidad de humedad que perdió la muestra en el proceso de
secado. Realizar este procedimiento por triplicado.
Figura 5. Hojas de Kalanchoe pinnata dentro de la estufa a las condiciones
especificadas (autor)
Tomar una tijera y cortar el resto de las hojas en trozos pequeños, luego estos pedazos
colocar sobre papel periódico encima de las mesas del laboratorio y dejar secar bajo
sombra a temperatura ambiente durante 8 días. Calcular el porcentaje de humedad aun
presente en 5 muestras de aproximadamente 5 g de hojas secas con el procedimiento
anteriormente mencionado.
Figura 6. Proceso de secado de las hojas de chiriyuyo (autor)
20
Molienda y tamizado
Con ayuda de un vaso de precipitación de 600 mL ingresar las hojas cortadas y secas
con un porcentaje de humedad (8 − 10)% en un molino centrífugo y triturar a una
velocidad de 6000 (rpm); además tamizar con una malla de tamaño de partícula de 1
mm.
Figura 7. Molino centrífugo (autor)
Para el análisis granulométrico del polvo obtenido:
Colocar 10 g de la muestra sobre la tolva del equipo teniendo cuidado de no trasponer
las partículas unas sobre otras, luego encender el software de análisis CAMSIZER y
especificar la altura de la tolva, amplitud de vibración del alimentador y el rango de
medida, por último, trasportar a la zona de medida y determinar el tamaño promedio
de las partículas. Repetir el proceso 3 veces. Ver Anexo A
Figura 8. Sistema de análisis granulométrico (autor)
21
Almacenar el polvo de hojas de chiriyuyo en un recipiente hermético bajo sombra
hasta su uso posterior. Forrar con papel aluminio para evitar el contacto con la luz.
2.4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. pinnata y
determinación del rendimiento
a. Sustancias y Reactivos
Agua H2O(l)
Etanol C2H5OH(l)
Dióxido de Carbono CO2
b. Materiales y Equipos
Equipo de extracción con fluido supercrítico (EFS)
Marca: Applied Separations
Modelo: 7070
P máxima= (690 bar)
T máxima= (240 °C)
Balanza Análitica Marca: BOECO.
Modelo: BAS 31 plus
A= (±0,0001g) R= (220g)
Refrigerador: Marca: HACEB
Modelo: NEV HACEB SE ESS
446LT
Vaso de precipitación A= (±50mL) V=(250mL)
Balón aforado V=(100mL)
Probeta A= (±2mL) V=(100mL)
Crisol
Cucharilla metálica
Papel Aluminio
22
La Figura 9 muestra los equipos e instrumentos que forman parte del equipo de extracción
con fluido supercríticos donde: (1) Tanque de almacenamiento de CO2, (2) Bomba, (3)
Enfriador, (4) Tanque de extracción, (5) Horno, (6) Bomba del co-solvente, (7) Vial
recolector del extracto, (8) Rotámetro, (9) Válvula de venteo, (10) Compresor de aire,
(11) Recipiente Co-solvente, (TC) Controlador de temperatura, (PC) Controlador de
presión, (TI) Indicador de temperatura, (V) Válvulas.
Figura 9. Esquema del equipo de fluido supercrítico (Londoño-Larrea, Zapata, Lara-
López, & Villamarín-Barriga, 2018)
23
c. Procedimiento
En una balanza analítica con ayuda de una cucharilla metálica pesar aproximadamente
40 g de polvo de hojas de Kalanchoe pinnata en un crisol y tomar la medida del peso
con cuatro decimales. (muestra 1)
Con lana de propileno cubrir los orificios de las tapas del tanque extractor para evitar
acumulación de la muestra y ensamblar una tapa, luego añadir la muestra
conjuntamente con núcleos de ebullición hasta el tope (500 mL) y cerrar el tanque.
Figura 10. Crisol con 40 g de polvo de hojas de K. pinnata (autor)
Figura 11. Tanque extractor del equipo EFS (autor)
24
Colocar el tanque extractor dentro del horno de tal forma que la muestra quede en la
parte superior y el termopar del horno toque uno de los orificios del mismo, además
conectar con las líneas de gas respectivas verificando que las válvulas de entrada de
CO2, salida de extracto y venteo estén cerradas.
Figura 12. Tanque extractor dentro del horno del equipo EFS (autor)
Encender el equipo de EFS. Abrir la válvula del tanque de almacenamiento de CO2 y
permitir el paso hacia la bomba observando que el nivel de presión no sea menor a 45
bar para abastecer al sistema la presión suficiente y el buen funcionamiento; realizar
una prueba de fugas una vez abierta la válvula de entrada de CO2 al tanque extractor.
Una vez realizado esto, encender los interruptores de las resistencias y alcanzar las
condiciones de temperatura (35 y 40 °C), luego presionar el botón de seguridad de la
bomba y dejar comprimir hasta llegar a las condiciones de presión (150 y 200 bar),
dejar estabilizar y dar paso a la extracción estática por un tiempo de 80 minutos. Las
condiciones operacionales fueron ingresadas y seteadas en el software del equipo.
Horno
Tanque
extractor
Líneas de
gas
Termopar
25
Dar paso a la extracción dinámica durante (60 y 120) min con renovación de solvente
(CO2 al 99.9 % de pureza) a una razón de flujo de 5 L/min e ingreso de co-solvente
(etanol al 48%) previamente preparado por dilución en un balón aforado de 100 mL.
Además, en este paso también recolectar el extracto activo de la planta en un vial
propio del equipo (pesado y cubierto con papel aluminio previamente), para ello
conectar el mismo en la aguja de la válvula de salida de extracto y rotámetro.
Para la cantidad necesaria de co-solvente calcular el flujo volumétrico con una
relación en masa al 5% de (etanol/ masa de CO2) en (mL/min). Para la adición de este:
encender la bomba, conectar con mangueras hacia un contenedor de etanol (vaso de
precipitación de 250 mL) y realizar la respectiva purga para evitar la cavitación, por
último, dejar bombear el fluido hacia el tanque durante la extracción. Se usó cinta
adhesiva para mantener bien sujetas las mangueras en el contenedor de etanol.
Ya trascurrido el tiempo de extracción dinámica, cerrar la válvula de salida del
extracto, retirar el vial y proceder a tomar el peso en una balanza analítica. Por último,
almacenar en un refrigerador a 4°C hasta su análisis posterior.
Para la despresurización del tanque volver a abrir la válvula de salida del extracto y
dejar salir libremente el CO2 hasta una presión igual a 30 bar, previo cerrar las válvulas
de entrada y de almacenamiento del solvente. Llegado a ese valor cerrar la válvula de
salida del extracto y abrir la válvula de venteo hasta que la presión final sea cero.
Conjuntamente con este pasó apagar los interruptores de temperatura para que se
enfríe el tanque y proceder a su limpieza.
Repetir todo el proceso para cada una de las muestras que requiere el diseño
experimental (16 muestras).
Para determinar el rendimiento realizar una relación entre la cantidad de extracto
obtenido sobre la cantidad de muestra que ingresó al tanque extractor.
26
Figura 13. Imagen del equipo de Extracción con fluido supercrítico (autor)
2.4.3. Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de
Kalanachoe pinnata.
a. Sustancias y Reactivos
Agua destilada H2O(l)
Etanol C2H5OH(l)
Cloruro de aluminio AlCl3(S)
Acetato de sodio CH3COONa (S)
Quercetina C12H10O7 (S)
Rotámetro
Válvula salida
de extracto
Vial
recolector
Enfriador
Válvula de
venteo
Recipiente
co-solvente
Bomba co-
solvente
Bomba
Pantalla
y
Software
Válvula
entrada
CO2
Horno
Tanque de
CO2
27
b. Materiales y Equipos
Cucharilla metálica
Vaso de precipitación A= (±5mL) V=(100mL)
Balón aforado V=(50mL)
Balón aforado V=(10mL)
Balón aforado V=(100mL)
Micropipeta A= (±5uL) R=(100-1000uL)
Tubos de ensayo
Gradilla metálica
Probeta A= (±1mL) V=(10mL)
Probeta A= (±1mL) V=(100mL)
Balanza analítica Marca: BOECO.
Modelo: BAS 31 plus
A= (±0,0001g) R= (220g)
Espectrofotómetro UV-vis Marca: Agilent Technologies
Modelo: Cary 60
Baño ultrasónico Marca: OVAN
Modelo: ATM40-15LCD
c. Procedimiento
Para la estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en los extractos de las hojas
de Kalanchoe pinnata se siguió el procedimiento informado en (Al-Owaisi et al., 2014)
que es un método colorimétrico en el que se forma complejos estables entre el cloruro de
aluminio con los grupos hidroxilos fenólicos y cetona de los flavonoides (flavonas y
flavonoles). (Rafael, Agudelo, & Wagner, 2015). Se empleó quercetina como flavonoide
estándar.
28
Curva de Calibración
Para la solución madre, pesar en una balanza analítica 10 mg de quercetina y diluir
con etanol al 80% en un balón aforado de 50 mL, además realizar diluciones desde 5
a 30 (ug / mL) en balones aforados de 10 mL con ayuda de una probeta del mismo
volumen.
Figura 14. Preparación de las soluciones estándar de quercetina para la curva de
calibración (autor)
Mezclar cada una de las diluciones con los reactivos en tubos de ensayo empleando
una micropipeta en las siguientes proporciones: 500 µL de solución estándar con 1500
µL de etanol al 96%, 100 µL de cloruro de aluminio al 10%, 100 µL de acetato de
sodio 1 M y 2800 µL de agua destilada. Preparas las soluciones de los reactivos
previamente en el laboratorio.
Figura 15. Reactivos preparados (autor)
29
Colocar en una gradilla metálica los tubos de ensayo y dejar durante 30 minutos a
temperatura ambiente, transcurrido el tiempo ingresar las soluciones en la celda del
espectrofotómetro UV-vis y medir las absorbancias correspondientes a 415 nm.
Realizar 4 mediciones. Previo usar un blanco que contiene todos los reactivos ya antes
mencionados en las proporciones especificadas.
Realizar una gráfica concentración de quercetina en función de las absorbancias
medidas y obtener la respectiva ecuación a través de una regresión.
Tratamiento al extracto crudo de hojas de Kalanchoe pinnata
Diluir cada uno de los extractos obtenidos por EFS con 10 mL de etanol al 96% bajo
un baño ultrasónico a temperatura ambiente (solución EFS), luego tomar una alícuota
de 1 mL de estas soluciones con una micropipeta y colocar en un balón aforado de
100 mL. Completar el mismo con etanol al 96% con ayuda de una probeta de 100 mL
(solución diluida).
Figura 16. Extractos obtenidos por EFS (autor)
Poner en contacto cada una de las soluciones diluidas de los extractos con los
reactivos y en las proporciones anteriormente mencionadas, luego del tiempo
especificado para la reacción ingresar al espectrofotómetro UV-vis y tomar los
valores de las absorbancias (10 mediciones); antes de las mediciones usar un blanco
con los reactivos mencionados. Ver Anexo B
30
Para la estimación del contenido total de flavonoides en los extractos calcular a partir
de la ecuación de regresión lineal de la curva de calibración en unidades de (mg de
quercetina equivalente / g de muestra seca).
2.4.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con
espectrometría de masa
a. Sustancias y reactivos
Extracto de las hojas de Kalanchoe pinnata
Etanol C2H5OH (l)
Cloroformo CHCl3 (l)
Ácido Clorhídrico HCl (C)
Cloruro férrico FeCl3
Limaduras de magnesio Mg(S)
b. Materiales y Equipos
Jeringuillas A= (±1mL) V=(5mL)
Vasos de precipitación A= (±5mL) V=(100mL)
Balón aforado V=(25mL)
Filtros para jeringuillas
Viales
Estufa Marca: Memmert
Modelo: 100-800
A= (±5°C) R= (30-330°C)
Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masa
Marca: Agilent Technologies
Modelo: 7820
Número de serie: CN16032008
31
c. Procedimiento
Procedimiento para marchas Fitoquímicas
Las marchas fitoquímicas son pruebas químicas cualitativas y para la identificación de
flavonoides se sigue los ensayos mencionados en los que se produce cambios de
coloración por reacciones con ciertos reactivos (Osmany Cuesta R, Ingrid Márquez H,
2015).
Shinoda
Tomar aproximadamente 2 mL de extracto obtenido por EFS disuelto en etanol al 96
% y poner en contacto con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado más 3 limaduras
de magnesio. Un cambio de coloración de amarillo a rojizo y abundante espuma
indica presencia de Flavonoides. Ver Anexo C
Cloruro férrico
Tomar aproximadamente 2 mL de extracto obtenido por EFS disuelto en etanol al 96
% y puner en contacto con 1mL de cloruro férrico al 1% en un vaso de precipitación
de 100 mL. Un cambio de coloración de amarillo a verde, azul o negra revela la
existencia de flavonoides. Ver Anexo D
Reacción de cianidina
Tomar aproximadamente 2 mL de extracto obtenido por EFS disuelto en etanol al 96
% y poner en contacto con 1 mL de alcohol clorhídrico (alcohol etílico al 50% + ácido
clorhídrico concentrado en una proporción 2:1 v/v) en un vaso de precipitación de
100 mL. Un cambio de coloración de amarillo a rojo o rosa indica presencia de
flavonoides. Ver Anexo E
32
Procedimiento para cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masa
Se tomó los 2 extractos que presentaron las mejores condiciones en cuanto a rendimiento
y TFC, que estaban diluidos en etanol al 96% y se prepararon de la siguiente forma:
Tomar en una jeringuilla 4 mL de uno de los extractos diluidos y con ayuda de un
filtro introducir en un vial propio del equipo.
El otro extracto diluido dejar evaporar en una estufa a una temperatura de 35 °C por
un tiempo de 4 días, luego volver a diluir en 5 mL de cloroformo y de la misma forma
que el primer extracto preparar el segundo vial.
Figura 17. Preparación de viales (autor)
Introducir los dos viales en el cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de
masa donde previamente se debe ingresar las condiciones de operación y analizar.
2.4.5. Análisis de Datos
Para el análisis de datos de esta investigación, se empleó el software estadístico
STATGRAPHICS Centurion XVI.I, donde los datos se sometieron a un análisis de
varianza ANOVA con el objetivo de optimizar y conocer el efecto de las variables
establecidas sobre el rendimiento de extracción y contenido total de flavonoides de los
extractos obtenidos por EFS.
33
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
3.1. Cálculos del tratamiento a las hojas de Kalanachoe Pinnata
3.1.1. Cálculo de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanachoe Pinnata
a. Cálculo de la humedad de las hojas
𝒘 =𝒎. 𝒉. −𝒎. 𝒔.
𝒎. 𝒉.=
𝒎. 𝒂.
𝒎. 𝒉.× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏)
𝑤 =45,1611𝑔
50,0125𝑔× 100%
𝑤 = 90,2996 %
Donde:
w= Humedad (%)
m.h.= masa muestra húmeda (𝑔)
m.s.= masa muestra seca (𝑔)
m.a.= masa de agua en la muestra (𝑔)
b. Cálculo de la humedad promedio de las hojas
�̅� =𝐰𝟏 + 𝐰𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏
𝐧 (𝟐)
�̅� =90,2996 + 89,9843 + 88,5250
3
�̅� = 89,6030 %
Donde:
�̅� = Humedad promedio (%)
n = Número de muestras
34
c. Resultados de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata
Tabla 7. Humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata
Pruebas m.h (g) m.s. (g) m.a. (g) w (%) �̅� (%)
1 50,0125 4,8514 45,1611 90,2996
89,6030 2 50,0047 5,0083 44,9964 89,9843
3 50,0478 5,7430 44,3048 88,5250
3.1.2. Cálculo del porcentaje de humedad de las hojas secas de Kalanchoe pinnata
a. Cálculo del porcentaje de humedad
𝒘𝒑 =𝒎. 𝒔. 𝒉 − 𝒎. 𝒔. 𝒔
𝒎. 𝒔. 𝒉.=
𝒎. 𝒉.
𝒎. 𝒔. 𝒉.× 𝟏𝟎𝟎% (𝟑)
𝒘𝒑 =0,4357
5,1240× 𝟏𝟎𝟎%
𝒘𝒑 = 8,5031
Donde:
𝒘𝒑 = Porcentaje de humedad (%)
𝒎. 𝒔. 𝒉 = Muestra seca con porcentaje de humedad (𝑔)
𝒎. 𝒔. 𝒔 = Muestra seca sin humedad (𝑔)
𝒎. 𝒉. = Humedad en la muestra (𝑔)
b. Cálculo del porcentaje de humedad promedio de las hojas
𝒘𝒑̅̅ ̅̅ =𝐰𝟏 + 𝐰𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏
𝐧 (𝟒)
𝒘𝒑̅̅ ̅̅ =8,5031 + 8,1329 + 9,5752 + 8,5394 + 9,7139
5
𝒘𝒑̅̅ ̅̅ = 8,8933 %
Donde:
𝒘𝒑̅̅ ̅̅ = Porcentaje de humedad promedio (%)
n = Número de muestras
35
c. Resultados del porcentaje de humedad
Tabla 8. Porcentaje de humedad de las hojas secas
Muestras m.s.h (g) m.s.s (g) m.h. (g) 𝒘𝒑 (%) 𝒘𝒑̅̅ ̅̅ (%)
1 5,1240 4,6883 0,4357 8,5031
8,8933
2 5,2011 4,7781 0,4230 8,1329
3 5,0140 4,5338 0,4802 9,5772
4 5,2369 4,7897 0,4472 8,5394
5 5,0474 4,5571 0,4903 9,7139
3.2. Cálculos de la extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de
K. Pinnata y determinación del rendimiento
3.2.1. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente empleado en la extracción
a. Cálculo de la masa total de CO2 durante la extracción
Para el cálculo de la masa total de CO2 en la extracción se utilizó las ecuaciones de Van
der Waals y del Gas Ideal, donde se determinó la cantidad de moles y, por consiguiente,
la masa necesaria para la extracción estática y dinámica.
Moles de CO2 en la extracción estática
Se usó la ecuación de Van der Waals durante la extracción dinámica puesto que es la que
más se ajusta a las condiciones de trabajo en este caso altas presiones.
𝑷 =𝑹𝑻
𝑽𝒎 − 𝒃−
𝒂
𝑽𝒎𝟐 (𝟓)
𝑃 =𝑅𝑇𝑛
𝑉 − 𝑏𝑛−
𝑎𝑛2
𝑉2
Para:
P = 200 (bar) = 197,4 (atm)
T = 40 (°C) = 313,15 (K
36
197,4 𝑎𝑡𝑚 =(0,082
𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(313,15 𝐾)(𝑛)
(0,5 𝐿) − (𝑏)(𝑛)−
(𝑎)(𝑛2)
(0,5𝐿)2
𝒂 =𝟐𝟕 𝑹𝟐𝑻𝒄𝟐
𝟔𝟒 𝑷𝒄 (𝟔)
𝒃 =𝑹 𝑻𝒄
𝟖 𝑷𝒄 (𝟕)
Para:
Tc = 30,97 (°C) = 304,12 (K)
Pc = 73,9 (atm)
𝑎 =27 (0,082
𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)2(304,12 𝐾)2
64 (73,9 𝑎𝑡𝑚)
𝑎 = 3,594 𝑎𝑡𝑚 𝐿2
𝑚𝑜𝑙2
𝑏 = (0,082
𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)
2
(304,12 𝐾)
8 (73,9 𝑎𝑡𝑚)
𝑏 = 0,0427 𝐿
𝑚𝑜𝑙
Reemplazando a y b
197,4 𝑎𝑡𝑚 =(0,082
𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(313,15 𝐾)(𝑛)
(0,5 𝐿) − (0,0427 𝐿
𝑚𝑜𝑙)(𝑛)−
(3,594 𝑎𝑡𝑚 𝐿2
𝑚𝑜𝑙2 )(𝑛2)
(0,5𝐿)2
𝑛 = 7,0871 𝑚𝑜𝑙
Donde:
P = Presión (𝑎𝑡𝑚)
T = Temperatura (℃)
R = Constante universal de los gases ideales (𝑎𝑡𝑚 𝐿
𝑚𝑜𝑙 𝐾)
Vm = Volumen molar (𝐿
𝑚𝑜𝑙)
V = Volumen (𝐿)
37
n = Número de moles (mol)
a = Constante (Fuerza de atracción intermoleculares) (𝑎𝑡𝑚 𝐿2
𝑚𝑜𝑙2 )
b = Constante (Volumen que ocupan las moléculas) (𝐿
𝑚𝑜𝑙)
Masa de CO2 en la extracción estática
𝒎𝒆.𝒆. = 𝑴 × 𝒏 (𝟖)
𝑚𝑒.𝑒. = (44,01 𝑔
𝑚𝑜𝑙) × (7,0871 𝑚𝑜𝑙)
𝑚𝑒.𝑒. = 313,9453 𝑔
Donde:
𝒎𝒆.𝒆. = Masa de CO2 en la extracción estática (g)
M = Peso molecular (𝑔
𝑚𝑜𝑙)
Masa de CO2 en la extracción dinámica
La ecuación del gas ideal se emplea en la extracción dinámica puesto que se trabaja con
a condiciones atmosféricas es decir bajas presiones.
𝑷𝑽 = 𝒏𝑹𝑻 (𝟗)
𝑚𝑒.𝑑. =𝑃 𝑉 𝑀
𝑅𝑇
Para:
P = 0,72 (atm)
T = 20 (℃) = 293,15 (K)
𝑚𝑒.𝑑. =(0,72 𝑎𝑡𝑚) (44,01
𝑔𝑚𝑜𝑙)𝑉
(0,082 𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(293,15 𝐾)
38
𝑽 = 𝑸 × 𝒕 (𝟏𝟎)
Para:
Q = 5 (𝐿
𝑚𝑖𝑛); Valor fijado en el rotámetro del equipo de extracción
t = 60 (min)
𝑉 = (5𝐿
𝑚𝑖𝑛) × (60 𝑚𝑖𝑛)
𝑉 = 300 𝐿
Remplazando V
𝑚𝑒.𝑑. =(0,72 𝑎𝑡𝑚) (44,01
𝑔𝑚𝑜𝑙)(300𝐿)
(0,082 𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(293,15 𝐾)
𝑚𝑒.𝑑. = 395,4589 𝑔
Donde:
P = Presión (𝑎𝑡𝑚)
T = Temperatura (℃)
R = Constante universal de los gases ideales (𝑎𝑡𝑚 𝐿
𝑚𝑜𝑙 𝐾)
V = Volumen (𝐿)
n = Número de moles
M = Peso molecular ( 𝑔
𝑚𝑜𝑙)
t = Tiempo dinámico (𝑚𝑖𝑛)
Q = Caudal (𝐿
𝑚𝑖𝑛)
𝒎𝒆.𝒅.= Masa de CO2 en la extracción dinámica (𝑔)
Masa total de CO2 en la extracción
𝒎𝑪𝑶𝟐= 𝒎𝒆.𝒆. + 𝒎𝒆.𝒅. (𝟏𝟏)
𝑚𝐶𝑂2= 313,9453 𝑔 + 395,4589 𝑔
𝑚𝐶𝑂2= 709,404 𝑔
Donde:
𝒎𝑪𝑶𝟐 = Masa total de CO2 (𝑔)
39
b. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente (etanol 48 %)
Para el cálculo del flujo volumétrico del co-solvente en este caso etanol 48 % (v/v) se usó
una relación al 5% de masa de co-solvente/masa de CO2.
𝒎𝒆𝒕 = 𝒎𝑪𝑶𝟐× (
𝟓 𝒎𝒄𝒐𝒔𝒐𝒍
𝟏𝟎𝟎 𝒎𝑪𝑶𝟐
) (𝟏𝟐)
𝑚𝑒𝑡 = 709,404 𝑔 × (5 𝑔
100 𝑔 )
𝑚𝑒𝑡 = 35,4702
𝑽𝒆𝒕 =𝒎𝒆𝒕
𝒕 × 𝝆𝒆𝒕 (𝟏𝟑)
𝑉𝑒𝑡 =(35,4702 𝑔)
(60 𝑚𝑖𝑛) × (0,90207 𝑔
𝑐𝑚3)
𝑉𝑒𝑡 = 0,6534 𝑐𝑚3
𝑚𝑖𝑛≈ 0,6534
𝑚𝑙
𝑚𝑖𝑛
Donde:
𝒎𝒆𝒕 = Masa etanol al 48 % (𝑔)
𝒎𝑪𝑶𝟐 = Masa total de CO2 (𝑔)
𝒎𝒄𝒐𝒔𝒐𝒍 = Masa de co-solvente (𝑔)
𝑽𝒆𝒕 = Flujo volumétrico de etanol al 48% (𝑚𝑙
𝑚𝑖𝑛)
𝝆𝒆𝒕 = Densidad del etanol (𝑔
𝑐𝑚3)
t = Tiempo dinámico (𝑚𝑖𝑛)
40
c. Resultados del cálculo del flujo volumétrico
Tabla 9. Flujos volumétricos empleados en cada experimento de la extracción por
EFS
Experimento P (bar) T (°C) t (min) Co-solvente
(ml)
𝑽𝒆𝒕
(ml/min)
1 150 35 60 38,458 0,641
2 150 35 120 60,378 0,503
3 150 40 60 38,071 0,635
4 150 40 120 59,991 0,500
5 200 35 60 39,600 0,660
6 200 35 120 61,520 0,513
7 200 40 60 39,309 0,655
8 200 40 120 61,228 0,510
3.2.2. Cálculo del rendimiento del extracto
𝑹 =𝑭. 𝒆 − 𝑭. 𝒗
𝒎𝒎𝒊× 𝟏𝟎𝟎% =
𝑬𝒐𝒃
𝒎𝒎𝒊× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟒)
𝑅 =16,2843 − 16,1462
40,0170× 100%
𝑅 =0,1381
40,0170× 100%
𝑅 = 0,3451 %
Donde:
R = Rendimiento del extracto (%)
F.e. = Masa del frasco vial + extracto (𝑔)
F.v. = Masa del frasco vial vacío (𝑔)
𝑬𝒐𝒃 = Masa del extracto Obtenido (𝑔)
𝒎𝒎𝒊 = Masa de la muestra inicial (𝑔)
41
Tabla 10. Resultados de los rendimientos de los extractos obtenidos por EFS
EXP P
(bar)
T
(°C)
t
(min)
Frasco
vial
vacío
(g)
Frasco
vial +
extracto
(g)
Masa
extracto
obtenido
(g)
Masa
muestra
inicial
(g)
Rendimiento
(%)
1 150 35 60 16,1462 16,2843 0,1381 40,0170 0,3451
2 150 35 60 16,2229 16,3431 0,1202 40,0159 0,3004
3 200 35 60 16,1553 16,4115 0,2562 40,0270 0,6401
4 200 35 60 16,1337 16,3883 0,2546 40,0860 0,6351
5 200 40 60 16,1487 16,3596 0,2109 40,3930 0,5221
6 200 40 60 16,1101 16,3242 0,2141 40,1199 0,5337
7 200 35 120 16,2466 16,8889 0,6423 40,2602 1,5954
8 200 35 120 16,1098 16,6479 0,5381 40,1743 1,3394
9 200 40 120 16,2085 16,5519 0,3434 40,1028 0,8563
10 200 40 120 16,1975 16,5725 0,375 40,0125 0,9372
11 150 40 60 16,2174 16,328 0,1106 40,1882 0,2752
12 150 40 60 16,1657 16,255 0,0893 40,0547 0,2229
13 150 35 120 16,1948 16,3755 0,1807 40,1007 0,4506
14 150 35 120 16,1207 16,2326 0,1119 40,0639 0,2793
15 150 40 120 16,2105 16,3383 0,1278 40,0784 0,3189
16 150 40 120 16,1607 16,2835 0,1228 40,0774 0,3064
Donde:
Tratamiento
Réplica
EXP = Experimento
42
3.3. Cálculos de la estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de
las hojas de Kalanachoe Pinnata.
3.3.1. Cálculos para la curva de calibración
a. Concentración de la solución madre
𝑪𝑸 =𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝑸
𝟓𝟎 𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏×
𝟏 𝒈 𝑸
𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒈 𝑸× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟓)
𝐶𝑄 = 0,02 % = 𝐶1
Donde:
𝑪𝑸 = Concentración quercetina %(p/v)
Q = Quercetina
b. Concentración de la solución estándar
𝑪𝑬 =𝟓 𝒖𝒈 𝑸
𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏×
𝟏 𝒈 𝑸
𝟏𝟎𝟔 𝒖𝒈 𝑸× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟔)
𝐶𝐸 = 0,0005 % = 𝐶2
Donde:
𝑪𝑬 = Concentración solución estándar %(p/v)
Q = Quercetina
c. Volumen necesario para alcanzar la concentración de las soluciones diluidas
estándar
𝑪𝟏𝑽𝟏 = 𝑪𝟐𝑽𝟐 (𝟏𝟕)
𝑉1 =𝐶2𝑉2
𝐶1
𝑉1 =(0,0005 %)(10 𝑚𝐿)
(0,02 %)
𝑉1 = 0,25 𝑚𝐿 = 250 𝑢𝐿
43
Donde:
𝑪𝟏 = Concentración solución madre (%)
𝑽𝟏 = Volumen solución madre (𝑚𝐿)
𝑪𝟐 = Concentración solución estándar (%)
𝑽𝟐 = Volumen solución estándar (𝑚𝐿)
Tabla 11. Resultados de los volúmenes necesarios para aforar a 10 mL las
soluciones estándar
𝑪𝟏 % 𝑪𝟐 % 𝑽𝟐 (mL) 𝑽𝟏 (𝒎𝑳)
0,02 0,0005 10 0,25
0,02 0,0010 10 0,50
0,02 0,0015 10 0,75
0,02 0,0020 10 1,00
0,02 0,0025 10 1,25
0,02 0,0030 10 1,50
3.3.2. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos obtenidos por EFS
a. Cálculo de la concentración de quercetina equivalente a través de la ecuación
de la curva de calibración
Tabla 12. Concentraciones de las soluciones diluidas de quercetina con sus
respectivas absorbancias
Concentración de
Quercetina
(ug/mL)
absorbancias Absorbancia
promedio Señal 1 Señal 2 Señal 3 Señal 4
5 0,0887 0,0887 0,0888 0,0886 0,0887
10 0,1198 0,1195 0,1198 0,1199 0,1198
15 0,1948 0,1941 0,1943 0,1941 0,1943
25 0,2971 0,2990 0,2980 0,2981 0,2981
30 0,3597 0,3602 0,3602 0,3599 0,3600
44
Figura 18. Curva de calibración de quercetina
𝒚 = 𝟖𝟗, 𝟒𝟗𝟓𝒙 − 𝟏, 𝟗𝟖𝟕𝟕 (𝟏𝟖)
Si x = 0.0583
𝑦 = 89,495(0,0583) − 1,9877
𝑦 = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Donde:
y = Concentración de quercetina equivalente (𝒖𝒈 𝑸𝑬
𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏 )
x = Absorbancia
QE = Quercetina equivalente
y = 89,495x - 1,9877R² = 0,9934
0
5
10
15
20
25
30
35
0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 0,2500 0,3000 0,3500 0,4000
Co
nce
ntr
ació
n Q
uer
ceti
na
(u
g/m
L)
Absorbancia
45
b. Resultados del cálculo de las concentraciones de quercetina equivalente
Tabla 13. Concentraciones de quercetina equivalente en los extractos
EXP
P
(bar)
T
(ºC)
t (min)
(x)
Absorbancia
Promedio
(y)
(𝒖𝒈 𝒒𝒖𝒆𝒓𝒄𝒆𝒕𝒊𝒏𝒂 𝒆𝒒𝒖𝒊𝒗𝒂𝒍𝒆𝒏𝒕𝒆
𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏 )
1 150 35 60 0,05826 3,2263
2 150 35 60 0,05832 3,2316
3 200 35 60 0,08700 5,7984
4 200 35 60 0,13070 9,7093
5 200 40 60 0,12800 9,4677
6 200 40 60 0,12094 8,8358
7 200 35 120 0,22803 18,4198
8 200 35 120 0,19317 15,3000
9 200 40 120 0,17509 13,6820
10 200 40 120 0,19131 15,1336
11 150 40 60 0,05770 3,1762
12 150 40 60 0,03578 1,2144
13 150 35 120 0,07796 4,9893
14 150 35 120 0,05046 2,5282
15 150 40 120 0,05671 3,0876
16 150 40 120 0,05741 3,1502
Donde
Experimento
Réplica
c. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC)
Cálculo quercetina equivalente
𝐶(100 𝑚𝐿) = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑎 × 100 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑎
𝐶(100 𝑚𝐿) = 322,63 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝐶(10 𝑚𝐿) =322,63 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝐹𝑆× 10 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝐹𝑆
𝐶(10 𝑚𝐿) = 3226,27 𝑢𝑔 𝑑𝑒 𝑄𝐸
46
Donde:
𝑪(𝟏𝟎𝟎 𝒎𝑳) = Quercetina equivalente en los 100 mL de solución (Solución diluida)
𝑪(𝟏𝟎 𝒎𝑳) = Quercetina equivalente en los 10 mL de solución (Solución EFS)
De las conversiones anteriores se deriva la siguiente ecuación
𝑸𝑬 = 𝒚 × 𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = 𝒚 × 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 (𝟏𝟗)
𝑄𝐸 = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 1000 𝑚𝐿
𝑄𝐸 = 3226,27 𝑢𝑔
Donde:
y = Concentración de quercetina equivalente (𝒖𝒈 𝑸𝑬
𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏 )
𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = Volumen total de solución (𝑚𝐿)
𝑸𝑬 = Quercetina equivalente (𝑢𝑔)
Cálculo del contenido total de flavonoides (TFC)
𝑻𝑭𝑪 =𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒒𝒖𝒆𝒓𝒄𝒆𝒕𝒊𝒏𝒂 𝒆𝒒𝒖𝒊𝒗𝒂𝒍𝒆𝒏𝒕𝒆
𝒈 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒄𝒂 (𝟐𝟎)
𝑇𝐹𝐶 =3226,27 𝑢𝑔 𝑄𝐸
40, 0170 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎×
1 𝑚𝑔 𝑄𝐸
1000 𝑢𝑔 𝑄𝐸
𝑇𝐹𝐶 = 0,0806 𝑚𝑔 𝑄𝐸
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎
Donde:
𝑻𝑭𝑪 = Contenido total de flavonoides
𝑸𝑬 = Quercetina equivalente
47
d. Resultados de la TFC en el extracto de las hojas de kalanachoe pinnata.
Tabla 14. Contenido total de flavonoides (TFC)
EXP
P (bar)
T
(ºC)
t (min)
Quercetina
Equivalente
(QE)
(ug)
TFC
(mg QE/ g muestra
seca)
1 150 35 60 3226,28 0,0806
2 150 35 60 3231,65 0,0808
3 200 35 60 5798,37 0,1449
4 200 35 60 9709,30 0,2422
5 200 40 60 9467,66 0,2344
6 200 40 60 8835,83 0,2202
7 200 35 120 18419,84 0,4575
8 200 35 120 15300,05 0,3808
9 200 40 120 13681,98 0,3412
10 200 40 120 15133,59 0,3782
11 150 40 60 3176,16 0,0790
12 150 40 60 1214,43 0,0303
13 150 35 120 4989,33 0,1244
14 150 35 120 2528,22 0,0631
15 150 40 120 3087,56 0,0770
16 150 40 120 3150,21 0,0786
Donde:
Tratamiento
Réplica
QE= Quercetina Equivalente
48
3.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con
espectrometría de masa
3.4.1. Resultados de la caracterización por marchas fitoquímicas
Tabla 15. Identificación de flavonoides en el extracto
Metabolito
Secundario
Ensayo Observaciones Resultado
Flavonoides
Shinoda Coloración rojiza anaranjada
tenue y abundante espuma
+
Cloruro
férrico
Coloración verdosa tenue +
Reacción de
Cianidina
Sin cambio de coloración -
Donde: (+) Presencia de flavonoides
(-) Ausencia de flavonoides
3.4.2. Resultados de la caracterización por cromatografía de gases con
espectrometría de masa
Figura 19. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en etanol
49
Tabla 16. Compuestos identificados en el extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en etanol
Compuestos Identificados Tiempo de
retención
Porcentaje de área
relativo (%)
Estructura
molecular
9H-Fluoreno, 9-diazo- 23,710 1,164 C13H8 N2
Ácido n-hexadecanoico 29,372 11,912 C16 H32O2
Phytol 31,468 1,776 C20H40O
Ácido 9,12,15-
Octadecatrienoico
32,395 12,915 C18H30O 2
Ácido phthalico bis(2-etil
hexil)éster
38,358 12,803 C24H38O 4
Esqualeno 42,400 17,228 C30H50
δ-Tocopherol
43,935
45,238
46,234
3,128
1,100
2,658
C27H46O2
γ-Sitosterol 48,228 1,226 C29H50O
Simiarenol 48,895 24,013 C30H50O
Phytyl tetradecanoato 49,114 2,944 C34H66O2
β-Amyrin acetato 49,669 7,132 C32H52O2
Figura 20. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en cloroformo
50
Tabla 17. Compuestos identificados en el extracto de hojas de Kalanchoe pinnata
disuelto en cloroformo
Compuestos
Identificados
Tiempo de
retención
Porcentaje de área
relativo (%)
Estructura
molecular
Ácido hexadecanoico 30,747 27,596 C16H32O 2
Phytol 31,690 1,601 C20H40O
Ácido 9,12,15-
Octadecatrienoico
32,840 44,960 C18H30O2
Ácido eicosanoico 36,395 1,497 C20H40O2
Diisooctyl phthalate 38,439 0,424 C24H38O4
Tetracosanal 39,938 0,293 C24H48O
Heptacosano 40,495 0,439 C27H56
Esqualeno 42,590 7,830 C30H50
Hexacosanal 42,845 0,536 C26H52O
δ-Tocopherol 44,102 1,691 C27H46O 2
Vitamina E
45,337
46,443
1,456
2,935
C29H50O 2
(E)-24-
Propilidenocolesterol
49,014 6,940 C30H50O
β-Amyrin acetato 49,786 1,800 C32H52O2
3.5. Resultados para el análisis de Datos
Para analizar la significancia estadística de los factores y sus interacciones con respecto
al rendimiento y TFC del extracto de las hojas de Kalanchoe pinnata obtenidos por
extracción mediante fluido supercrítico CO2, se utilizó un análisis de varianzas con una
significancia de 0,05, para lo cual se planteó las hipótesis del efecto individual y en
conjunto de los factores para cada una de las variables respuesta, por ejemplo:
Ho: No existe diferencia significativa en el rendimiento promedio del extracto de las
hojas de kalanchoe pinnata por efecto del factor A.
Hi: Existe diferencia significativa en el rendimiento promedio del extracto de las hojas
de kalanchoe pinnata por efecto del factor A.
51
Tabla 18. Representación de los factores empleados en las hipótesis nulas y
alternativas
Factor Representación
Presión de extracción A
Temperatura de extracción B
Tiempo dinámico de extracción C
Presión y Temperatura de extracción AB
Presión y Tiempo de extracción AC
Temperatura y Tiempo dinámico de extracción BC
3.5.1. Análisis estadístico para el Rendimiento del extracto obtenido por EFS
Tabla 19. ANOVA para el rendimiento del extracto
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
A:PRESIÓN 1,29989 1 1,29989 105,27 0,0000
B:TEMPERATURA 0,16255 1 0,16255 13,16 0,0067
C:TIEMPO 0,425397 1 0,425397 34,45 0,0004
AB 0,076826 1 0,076826 6,22 0,0373
AC 0,29858 1 0,29858 24,18 0,0012
BC 0,0483011 1 0,0483011 3,91 0,0833
Bloques 0,0126169 1 0,0126169 1,02 0,3417
Error total 0,0987853 8 0,0123482
Total (corr.) 2,42294 15
R-cuadrada = 95,9229 porciento
La ecuación de regresión para el rendimiento (R) que mejor se ajusta a los datos es:
𝑹 = −𝟕, 𝟐𝟓𝟒𝟔 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟔𝟓 𝐀 + 𝟎, 𝟐𝟏𝟗𝟔 𝐁 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟎 𝐂 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟐 𝐀𝐁 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟐 𝐀𝐂
− 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟕𝐁𝐂 (𝟐𝟏)
52
El rendimiento máximo calculado a partir de las condiciones óptimas es 1,407%.
3.5.2. Análisis estadístico para el contenido total de flavonoides (TFC) de extracto
obtenido por EFS
Tabla 20:ANOVA para el contenido total de flavonoides (TFC) del extracto
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
A:PRESIÓN 0,199273 1 0,199273 114,43 0,0000
B:TEMPERATURA 0,00114582 1 0,00114582 0,66 0,4407
C:TIEMPO 0,0388484 1 0,0388484 22,31 0,0015
AB 0,00006642 1 0,00006642 0,04 0,8500
AC 0,0258888 1 0,0258888 14,87 0,0048
BC 0,0017264 1 0,0017264 0,99 0,3486
bloques 0,00026244 1 0,00026244 0,15 0,7080
Error total 0,0139317 8 0,00174146
Total (corr.) 0,281143 15
R-cuadrada = 94,9749 porciento
la ecuación de regresión que mejor se ajusta a los datos y relaciona las variables
estudiadas con el TFC es:
𝑻𝑭𝑪 = −𝟎, 𝟎𝟐𝟐𝟓 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟔 𝑨 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟑𝟒 𝑩 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟐𝟓 𝑪 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟑 𝑨𝑩 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟓 𝑨𝑪 −
𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟏𝟑 𝑩𝑪 (𝟐𝟐)
Reemplazando las condiciones operativas óptimas se obtiene el máximo TFC con un
valor de 0,406238.
53
4. DISCUSIÓN
4.1. Características y consideraciones en el tratamiento de las hojas de Kalanchoe
pinnata.
Las hojas de Kalanchoe pinnata fueron lavadas, secadas y trituradas durante la fase de
tratamiento, además en esta fase de la investigación se determinó los promedios del
porcentaje de humedad de las hojas frescas y secas como se muestra en la Tabla 21. El
valor de la humedad de trabajo fue el mismo para todos los análisis y se encuentra entre
los valores de humedad reportados en estudios relacionados con extracciones mediante
fluido supercrítico con valores de 3%, 6,93% y 10,5% del material vegetal que
garantizaron buenos resultados de extracción de compuestos activos y la conservación de
los mismos.
Tabla 21. Características de las hojas de Kalanchoe pinnata
Características Kalanchoe pinnata
Humedad promedio hojas frescas 89,6030 (%)
Porcentaje de humedad promedio hojas secas 8,8933 (%)
Tamaño promedio del polvo de hojas 0,3046±0,1655 (mm)
Usualmente la humedad mejora la solubilidad y actúa como agente de arrastre del soluto
en el sistema de extracción; pero también puede dificultar el proceso afectando el
rendimiento mecánico debido a la obstrucción de ciertos elementos del equipo (Al-Rawi
et al., 2013), por esta razón el proceso de secado cumple un papel importante en este tipo
de extracciones que además de reducir la humedad, rompe las paredes celulares de la
matriz vegetal y permite el acceso del solvente al interior de la estructura mejorando el
flujo de transferencia de masa (Gavilan & Narda, 2016). No obstante, si el secado no se
lleva bajo control puede influir de manera negativa reduciendo el rendimiento de los
54
componentes requeridos. Arjona, Días, & Iriarte (2006) indican que uno de los procesos
de secado poco satisfactorio en cuestión de rendimientos es la exposición directa al sol al
contrario del uso de un secador solar tipo macrotunel y la liofilización que aumentaron el
porcentaje de rendimiento.
Por otra parte, dado que ciertos autores consideran al tamaño de partícula como uno de
los factores más influyentes en EFS y que la humedad de las hojas de Kalanchoe pinnata
es elevada se decidió trabajar con un tamaño de partícula menor o igual a 1 mm con el
objetivo de optimizar la materia prima y mejorar el rendimiento de extracción ya que si
el tamaño es demasiado grande la partícula tiene menor área de superficie, por ende la
difusión del solvente en el interior de las células vegetales presenta más resistencia
mientras que, si es demasiado pequeño se produce la canalización del fluido supercrítico
llegando solo a ciertas partes del lecho y no uniformemente por lo cual el valor
recomendado en algunas investigaciones es 0,45 mm (Priyanka & Khanam, 2018) (Al-
Rawi et al., 2013).
El Anexo A muestra la distribución de los tamaños de partícula que presentan las muestras
del polvo de las hojas de Kalanchoe pinnata, gracias al análisis granulométrico además
se puede observar que el valor medio se aproxima al valor recomendado y sobre todo se
encuentra dentro del rango especificado en el diseño experimental.
El flujo de CO2 que se aplicó en el diseño experimental fue obtenido gracias a
experimentaciones previas en las que se determinó que a mayor cantidad de solvente
mayor es el rendimiento del extracto , tomando en cuenta que el incremento fue
moderado; este comportamiento también se observó en la extracción de aceite esencial
de la raíz de cúrcuma donde hubo un incremento del rendimiento de 5 a 10 (g/min) de
flujo de solvente mientras que disminuyó cuando incrementó a 15 (g/min) dado a un
menor tiempo de contacto soluto-solvente (Priyanka & Khanam, 2018), además durante
las experiencias se observó que a 10 (L/min) la aguja de la válvula de salida del extracto
se congelaba formando cristales e interrumpiendo la salida continua del extracto; por este
motivo se optó por trabajar con un valor de 5 (L/min) que no ocasionó inconvenientes
durante el proceso de extracción.
55
A continuación, se muestra la Figura 21 donde se observa el aumento de rendimiento del
extracto de hojas de Kalanchoe pinnata a medida que se altera el flujo de CO2 de forma
creciente manteniendo los valores de presión, temperatura, diámetro de partícula, tiempo
estático y tiempo dinámico constantes.
Figura 21. Efecto del Flujo de CO2 sobre el rendimiento de extracción
El co-solvente empleado y su relación en masa con respecto al fluido supercrítico CO2
fueron tomados de información bibliográfica, donde los resultados obtenidos indicaron
un aumento del rendimiento de extracción por efecto del incremento de la relación en
masa de 0 al 15%, además el co-solvente empleado fue una mezcla agua-etanol que fue
reportado como una mezcla de gran potencial para la extracción de compuestos polares
con capacidad antioxidante (Pérez-Coello, Marchante, Díaz-Maroto, Alarcón, & Alañón,
2017). La relación (v/v) con la que se trabajó fue al 48%.
4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. Pinnata y
determinación del rendimiento
4.2.1. Resultados del rendimiento de extracción
En la Tabla 10 se muestra los rendimientos del extracto del polvo de las hojas de
kalanchoe pinnata obtenidos por extracción con fluido supercrítico CO2, para cada uno
de los tratamientos del diseño experimental y su réplica, obteniendo valores entre 0,22 y
1,59%.
0,2850,323
0,354
0,0000,0500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,400
3 5 10
Ren
dim
ien
to (
%)
Flujo de CO2(L/min)
56
El experimento 7 y la réplica 10 presentaron las cantidades más altas de rendimiento con
valores de 1,59% y 0,93%, para ambos datos la presión de extracción y el tiempo
dinámico fueron 200 bar y 120 min, mientras que la temperatura aumentó de 35 a 40°C
respectivamente, un incremento de temperatura de extracción disminuye
considerablemente el valor del rendimiento del extracto; este efecto también fue
reportado para ciertos intervalos de temperatura en las extracciones con fluido
supercrítico de aceite de nuez moscada y aceite volátil de Achillea millefolium L. de
Macedonia (Villanueva-Bermejo et al., 2017) debido al aumento de la presión de vapor
de ciertos compuestos a extraer lo que conduce a la creciente volatilidad y evaporación
de los mismos.
Además, se puede observar que un incremento de presión de 150 a 200 bar manteniendo
fijas la temperatura y el tiempo dinámico de extracción aumenta la cantidad de extracto
obtenido debido al aumento de la solubilidad de los compuestos en el disolvente en estado
supercrítico por aumento de la densidad (Bishr et al., 2017).
4.2.2. Optimización del rendimiento del extracto obtenido mediante fluido
supercrítico CO2
La Tabla 19 muestra el cálculo ANOVA del rendimiento del extracto del polvo de las
hojas de Kalanchoe pinnata obtenido mediante extracción por fluido supercrítico con
CO2, donde se analizó la diferencia entre las medias de los factores y sus interacciones a
un nivel de significancia de 0,05, probando que el efecto individual de los 3 factores
estudiados influye significativamente, así como también la interacción de presión-
temperatura y presión-tiempo en la variable respuesta.
Además, se observa que existe un 95,92 % de varianza en el rendimiento de extracción
afectado por las variables presión, temperatura y tiempo dinámico.
57
Figura 22. Diagrama de pareto estandarizado para el rendimiento del extracto
En el diagrama de pareto se puede apreciar que el factor presión es la variable operativa
con mayor influencia en el proceso de extracción seguido del efecto del tiempo y la
interacción presión-tiempo. Se incluye además el gráfico de efectos principales que
muestra como influyen estos factores en el rendimiento del extracto al pasar de su nivel
bajo, a su nivel alto, como se muestra en la figura 23.
En la Figura 23 se puede observar que la relación que existe entre el rendimiento del
extracto y los factores presión y tiempo es directamente proporcional, es decir que el
incremento de la presión de 150 a 200 bar y del tiempo de 60 a 120 min aumenta la
cantidad de extracto obtenido; por el contrario la temperatura tiene una relación inversa
con la variable respuesta disminuyendo el rendimiento durante el incremento de 35 a
40ªC, por lo tanto al variar el nivel de la temperatura de bajo a alto, el rendimiento del
extracto decrece.
Figura 23. Gráfica de efectos principales para el rendimiento del extracto obtenido
por extracción con fluido supercrítico CO2
Diagrama de Pareto Estandarizada para Rendimiento
0 2 4 6 8 10 12
Efecto estandarizado
BC
AB
B:Temperatura
AC
C:Tiempo
A:Presión +
-
Presión
150 200
Temperatura
35 40
Tiempo
60 120
Gráfica de Efectos Principales para Rendimiento
0,31
0,41
0,51
0,61
0,71
0,81
0,91
Ren
dim
ien
to
58
Con el objetivo de optimizar el proceso de extracción se empleó la metodología de
superficie de respuesta, que reportó los valores óptimos para la obtención experimental
del máximo rendimiento del extracto mediante CO2 supercrítico, de esta forma se observó
que una presión de 200 bar, un tiempo de 120 min y una temperatura de 35 ºC, fueron las
condiciones operacionales que generan el mayor rendimiento del extracto.
En el gráfico que se presenta a continuación se mantuvo la temperatura constante en su
valor óptimo de 35 ºC ya que como muestra el diagrama de Pareto este factor, aunque es
significativo es el que menos influencia tiene de las tres variables.
Figura 24. Gráfico de superficie de respuesta estimada a temperatura constante
4.2.3. Comparación entre la extracción por maceración y mediante fluido
supercrítico CO2
Un estudio preliminar a la investigación actual obtuvo el extracto metanólico de las hojas
de kalanchoe pinnata por maceración, método empleado usualmente para la extracción
de esta planta. La extracción se llevó acabo con 2 L de metanol al 60% por un tiempo de
(7 a 15) días con agitación. El macerado se rotaevaporó a 40°C obteniendo un líquido
oscuro con un rendimiento del 2,97% (Chávez, 2017)
Superficie de Respuesta Estimada
Temperatura=35,0
150 160 170 180 190 200
Presión
6070
8090
100110
120
Tiempo
0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ren
dim
iento
59
Tabla 22. Características y rendimientos de los extractos de las hojas de k. pinnata
obtenidos por diferentes tipos de extracción
Tipo de extracción Maceración EFS
Rendimiento (%) 2,97 1,59
Tiempo de extracción 15 días + 7 días
de evaporación
200 min
Color Oscuro Amarillo claro
Aroma Sin aroma Aroma dulce
Textura Viscoso Sólido
Solvente Metanol
60% (2L)
Solución etanol-agua
48% (60,52 mL)
Figura 25. Comparación de los rendimientos de extracción por maceración y EFS
En la Tabla 22 se observa las características y rendimientos de los extractos de las hojas
de k. pinnata obtenidos por maceración y extracción mediante fluido supercríticos CO2
con el objetivo de establecer una comparación y constatar las ventajas y desventajas de la
EFS frente a extracciones convencionales.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Maceración EFS
2,97
1,59
Ren
dim
ien
to (
%)
Método de extracción
60
La Figura 25 muestra el rendimiento expresados como un porcentaje del material extraído
con respecto al peso de las hojas de chiriryuyo empleado, hay una visible diferencia
indicando que la extracción por maceración obtiene mejores rendimientos de extracción,
pero no necesariamente de selectividad como lo indica Gavilan & Narda (2016) en la
extracción de capsaicinoides de las venas de ají panca.
Por otro lado, los tiempos de extracción demuestran que la extracción por maceración es
más lenta que la EFS y que puede generarse la degradación de compuestos durante la
rotaevaporación. Por último, el color oscuro del extracto puede indicar presencia de
pigmentos o impurezas, asimismo la cantidad de metanol usado es elevado y dado que es
un solvente tóxico hace que la técnica por maceración no sea muy conveniente.
4.3. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en el extracto de las hojas
de Kalanachoe Pinnata
4.3.1. Resultados de la estimación del TFC
La Tabla 14 muestra que los valores de presión 200 bar, temperatura 35°C y tiempo 120
min son los niveles de los parámetros que maximizaron el contenido total de flavonoides,
obteniendo 0,4575 (mg QE/g muestras seca); de esta forma el efecto del aumento de la
presión es buena debido a una mayor capacidad de solvatación del CO2 en estado
supercrítico.
Además, se observó que un aumento de temperatura disminuye ligeramente el TFC
posiblemente debido a pérdidas de compuestos a temperaturas más altas. Por último,
mientras mayor sea el tiempo dinámico de extracción aumenta el contenido total de
flavonoides en el polvo de hojas de kalanchoe pinnata debido a que durante el tiempo
dinámico la renovación del solvente es continua evitando la saturación del fluido
supercrítico y mejorando la eficiencia de extracción.
61
4.3.2. Optimización del contenido total de flavonoides en las hojas de Kalanchoe
pinnata
La tabla de ANOVA para el contenido total de flavonoides exhibe que el valor P del factor
presión (p=0,0000), tiempo (p=0,0016) y la interacción presión-tiempo (p=0,0050) son
estadísticamente significativos en el TFC. Mientras que la variable temperatura no tiene
influencia significativa en el contenido total de flavonoides
Figura 26. Diagrama de Pareto estandarizado para el TFC
El diagrama de Pareto indica que 3 de los 6 efectos estudiados son significativos, siendo
el factor presión el de mayor influencia en el TFC, seguido por el efecto del tiempo
dinámico, también muestra que el factor temperatura es uno de los factores que menos
influencia tiene en la variable respuesta
Figura 27. Efectos principales para el TFC
Diagrama de Pareto Estandarizada para TFC
0 2 4 6 8 10 12
Efecto estandarizado
AB
B:Temperatura
BC
AC
C:Tiempo
A:Presión +
-
Gráfica de Efectos Principales para TFC
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
TF
C
Presión
150 200
Temperatura
35 40
Tiempo
60 120
62
En la Figura 27 se puede observar que la presión y el tiempo tienen relación directa con
la variable dependiente, es decir al pasar el nivel del factor de bajo a alto el TFC
incrementa, mientras que la temperatura tiene relación inversa con el contenido total de
flavonoides por lo cual, un incremento de temperatura modifica la variable respuesta de
forma decreciente.
Por último, el gráfico de superficie de respuesta identifica el nivel óptimo de cada factor
para obtener el mayor TFC posible. En el gráfico 29 se mantuvo constante el tiempo
dinámico en su valor óptimo de 120 min.
Figura 28. Gráfico de superficie de respuesta estimada a tiempo dinámico
constante
4.4. Resultados para la caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía
de gases con espectrometría de masa del extracto de K. pinnata
4.4.1. Caracterización mediante marcha fitoquímica
La caracterización por marchas fitoquímicas es un método simple y rápido para la
identificación de metabolitos secundarios. En la Tabla 15 se observó la identificación de
flavonoides para los extractos obtenidos mediante CO2 supercrítico a partir de las hojas
de k. pinnata. Dado a que hubo cambios de coloración y formación de espuma durante la
experiencia los resultados fueron positivos para las reacciones de shinoda y cloruro
férrico, mientras que la prueba de cianidina dio resultados negativos. (Anexos D, E y F)
Superficie de Respuesta Estimada
Tiempo=120,0
150160
170 180190
200
Presión
35
36
37
38
39
40
Temperatura
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
TF
C
63
4.4.2. Caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa
(CG-EM)
Para la caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa se utilizó
los extractos que se generaron a las condiciones óptimas en cuanto a rendimiento y TFC,
se empleó como fase móvil dos solventes: etanol y cloroformo que dieron como resultado
cromatogramas similares. Aunque los cromatogramas eran muy similares se observó
mejor resolución usando como solvente etanol
Un estudio químico y biológico de Kalanchoe pinnata (Lam.) que crecen en Bangladesh
reportó ciertos compuestos también obtenidos por CG-EM mencionados en esta
investigación (Sharker et al., 2012b).
.
64
5. CONCLUSIONES
Mediante extracción con fluido supercrítico CO2 se obtuvo un extracto puro con
compuestos activos a partir de las hojas de Kalanachoe pinnata.
Se comprobó que las variables independientes estudiadas presión, tiempo dinámico y
temperatura tuvieron influencia significativa sobre el rendimiento del extracto,
mientras que para el contenido total de flavonoides solo la presión y el tiempo
dinámico fueron estadísticamente significativas.
Se determinó que las condiciones óptimas de extracción con respecto al rendimiento
de extracción y contenido total de flavonoides fueron presión 200 bar, temperatura
35°C y tiempo dinámico 120 min, con valores de 1,59 % de rendimiento y 0,4575(mg
QE/g muestra seca) respectivamente.
Al comparar los rendimientos de extracción por el método de maceración y fluido
supercrítico se evidenció que el método convencional tiene mayor rendimiento de
extracto, pero fue más largo el tiempo de maceración y la extracción del solvente más
complejo.
65
6. RECOMENDACIONES
Tomando en cuenta que en varias investigaciones de extracciones con fluido
supercrítico donde se trabaja con más de dos niveles de las variables
independientes, se observan rangos de la variable respuesta se ve afectada de
manera positiva por estas; mientras que en otros influyen negativamente. Se
recomienda para futuras investigaciones trabajar con más de dos niveles de las
variables estudiadas para de esta manera analizar mejor el efecto y
comportamiento de estos factores.
Dado que el efecto de la variable tiempo dinámico favorece el rendimiento de
extracción y el contenido total de flavonoides a medida que pasa de su nivel bajo
al alto, se recomienda hacer una cinética de extracción que permita encontrar el
tiempo de extracción donde ya no se obtiene extracto de las hojas de Kalanchoe
pinnata.
66
CITAS BIBLIOGRAFICAS
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72
ANEXOS
73
ANEXO A. Análisis granulométrico del polvo de las hojas de K. pinnata
74
ANEXO B. Mediciones de absorbancias de los diferentes extractos obtenidos por EFS
Tabla B. Mediciones de las absorbancias de cada muestra a 415 (nm)
EXP Señales de absorbancias Absorbancia promedio
1 0,058 0,0581 0,0581 0,0581 0,058 0,0582 0,0582 0,0595 0,0582 0,0582 0,0583
2 0,0582 0,0582 0,0583 0,0583 0,0582 0,0587 0,0584 0,0582 0,0583 0,0584 0,0583
3 0,0869 0,0869 0,087 0,087 0,0871 0,0871 0,087 0,087 0,087 0,087 0,0870
4 0,1323 0,1303 0,1305 0,1305 0,1306 0,1305 0,1305 0,1307 0,1305 0,1306 0,1307
5 0,128 0,128 0,1278 0,1279 0,1279 0,1281 0,1281 0,128 0,1281 0,1281 0,1280
6 0,1223 0,1211 0,1242 0,1201 0,1197 0,1222 0,12 0,1199 0,1199 0,12 0,1209
7 0,2278 0,228 0,2286 0,2281 0,2278 0,2279 0,2279 0,228 0,2282 0,228 0,2280
8 0,1931 0,1932 0,1929 0,1932 0,1931 0,1932 0,1931 0,1932 0,1932 0,1935 0,1932
9 0,1749 0,1749 0,1752 0,1751 0,1751 0,1751 0,175 0,175 0,1752 0,1754 0,1751
10 0,1893 0,1909 0,1968 0,2007 0,1893 0,1892 0,1891 0,1894 0,1893 0,1891 0,1913
11 0,0587 0,0589 0,0572 0,0574 0,0574 0,0578 0,0571 0,0572 0,0578 0,0575 0,0577
12 0,0426 0,0359 0,0349 0,0348 0,0347 0,0347 0,0347 0,0348 0,0351 0,0356 0,0358
13 0,0773 0,0785 0,0774 0,0757 0,0731 0,0791 0,0797 0,0797 0,0795 0,0796 0,0780
14 0,0505 0,0505 0,0504 0,0504 0,0506 0,0505 0,0504 0,0505 0,0503 0,0505 0,0505
15 0,0566 0,0566 0,0568 0,0565 0,0567 0,0567 0,0568 0,0568 0,0568 0,0568 0,0567
16 0,0573 0,0577 0,0574 0,0573 0,0575 0,0573 0,0573 0,0574 0,0575 0,0574 0,0574
75
ANEXO C. Marcha Fitoquímica: Reacción de Shinoda
Figura C.1. Muestra del extracto sin reactivos
Figura C.2. Muestra del extracto con reactivos
76
ANEXO D. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cloruro Férrico
Figura D.1. Muestra del extracto sin reactivos
Figura D.2. Muestra del extracto con reactivos
77
ANEXO E. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cianidina
Figura E.1. Muestra del extracto sin reactivos
Figura E.2. Muestra del extracto con reactivos