i UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Determinación del porcentaje de recuperación de cuatro enzimas exógenas en dietas para animales de interés zootécnico, sometidas a diferentes procesos térmicos Trabajo de investigación presentado como requisito para la obtención del Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: Consuelo Maribel Muñoz Olmedo TUTOR: DR. Eduardo Fabián Aragón Vásquez Quito, 2019
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Determinación del porcentaje de recuperación de cuatro enzimas exógenas en dietas para animales de interés zootécnico, sometidas a
diferentes procesos térmicos
Trabajo de investigación presentado como requisito para la obtención del Título de Médico Veterinario Zootecnista
Dedico este trabajo a mi familia, a mi madre quien con su ayuda incondicional ha estado a mi lado en los momentos más difíciles y más importantes de mi vida, a mi padre que desde pequeña me enseñó el valor del trabajo y del esfuerzo. Para ti padre querido que veraz mi sueño cumplido desde el cielo.
A mis hijos que han sido el motor que me han dado la fuerza, el ánimo, y que son la principal razón para levantarme cada día con ganas de luchar.
A ti Manu que a pesar de las adversidades has sido más que mi compañero de vida, has sido mi motivación.
A mis hermanos, a mis sobrinas/os a todos que me han motivado con sus palabras de apoyo y más que familia han sido mis amigos mis confidentes.
Y por supuesto dedico a todas aquellas mujeres que creen que tener familia es un impedimento para cumplir tus metas.
A ustedes les dedico mi trabajo.
Maribel Muñoz
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AGRADECIMIENTOS
Los sueños se pueden alcanzar con perseverancia, esfuerzo y dedicación.
En primer lugar, agradezco a Dios porque me ha dado la capacidad, la
perseverancia, e inteligencia y ha permitido que la meta que me tracé algún
día se vea cumplida.
A mi familia que, con su confianza, paciencia y apoyo incondicional, han
sido un pilar fundamental que me ha sostenido en este camino para llegar
a culminar este primer paso de vida profesional, Gracias por creer en mí.
Agradezco a todos los docentes que han contribuido de una u otra manera
con sus enseñanzas y experiencia a lo largo de mis años de estudio. En
especial quiero agradecer a mi Tutor Dr. Eduardo Aragón, quien con su
apoyo y conocimiento supo ser mi guía en la elaboración de este trabajo.
Al Ingeniero Ramón Álvarez Gerente Regional de enzimas DSM Nutritional
Products. Que con su colaboración y experiencia en el área de Enzimas
supo guiarme en el desarrollo de mi investigación. A todos los que
contribuyeron y facilitaron los medios y recursos dentro de la empresa DSM
Nutritional Products Ecuador.
A todos mis más sinceros agradecimientos por haber sido parte de esta
historia.
vii
INDICE GENERAL
DERECHOS DE AUTOR........................................................................................................ ii
INFORME DE APROBACION DEL TUTOR ........................................................................... iii
INFORME DE APROBACION DEL TRIBUNAL ..................................................................... iv
DEDICATORIA .................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... vi
INDICE GENERAL .............................................................................................................. vii
INDICE DE TABLAS ............................................................................................................ ix
INDICE DE ILUSTRACIONES ................................................................................................ x
INDICE DE ANEXOS ........................................................................................................... xi
RESÚMEN......................................................................................................................... xii
ABSTRACT ....................................................................................................................... xiii
CAPITULO I ......................................................................................................................... 1
Anexos 3. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS EN ESTUDIO ....................... 43
Anexos 4. DEFINICION DE UNIDADES DE LAS ENZIMAS EXOGENAS. .......... 44
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
TITULO: “Determinación del porcentaje de recuperación de cuatro
enzimas exógenas en dietas para animales de interés zootécnico, sometidas a diferentes procesos térmicos”
Autor: Consuelo Maribel Muñoz Olmedo
Tutor: Dr. Eduardo Fabián Aragón Vásquez
RESÚMEN
Las enzimas son aditivos beneficiosos en la nutrición animal, que pueden
mejorar los procesos de absorción de nutrientes, así como la eliminación
de desechos que contaminan el medio ambiente. Al ser expuestas a
Procesos térmicos (temperatura/tiempo), se pueden desnaturalizar o
destruir y estar ausentes en el alimento peletizado o extruido. La
importancia del presente trabajo radica en la determinación de la presencia
de enzimas exógenas adicionadas a alimentos balanceados sometidas a
procesos térmicos de elaboración.
El objetivo de esta investigación fue determinar el mejor tratamiento térmico de cada enzima (Amilasa, Fitasa, Proteasa, Xilanasa) con una repetibilidad de cinco muestras por tratamiento. Se realizaron cuarenta pruebas de recuperación: seis pruebas para Amilasas, dieciséis pruebas para fitasas, ocho pruebas para proteasas, diez pruebas para xilanasas. De los resultados obtenidos se concluyó que existen procesos agresivos en los cuales las enzimas aun teniendo cubierta de protección pueden desnaturalizarse, se identificó bajo que tratamiento se obtuvo una mayor recuperación enzimática, la influencia de los procesos térmicos sobre el porcentaje de recuperación, y se dedujo que el efecto más marcado lo podría determinar el tiempo de exposición del alimento a la temperatura en los equipos de acondicionamiento o pos-acondicionamiento, pues al ser sometidas las muestras a altas temperatura, pero por corto tiempo la enzima es recuperada satisfactoriamente. PALABRAS CLAVES: ENZIMAS EXÓGENAS, PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN ENZIMÁTICA, PROCESOS TÉRMICOS, AMILASA, FITASA, XILANASA, PROTEASA.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TITULO: “Determination of the recovery percentage of four exogenous enzymes in diets for animals of zootechnical interest which underwent different thermal processes”
Autor: Consuelo Maribel Muñoz Olmedo
Tutor: Dr. Eduardo Fabián Aragón Vásquez
ABSTRACT Enzymes are beneficial additives in animal nutrition, which can improve the processes of absorption of nutrients, as well as the elimination of waste that pollutes the environment. When exposed to thermal processes (temperature / time), they can be denatured or destroyed and be absent in the pelleted or extruded food. The importance of this work lies in the determination of the presence of exogenous enzymes added to balanced foods, which are subjected to thermal processes during production. The objective of this investigation was to determine the best thermal treatment of each enzyme (Amylase, Phytase, Protease, Xylanase) with a repeatability of five samples per treatment. Forty tests of recovery were carried out: six tests for Amylases, sixteen tests for phytases, eight tests for proteases, ten tests for xylanases. From the results obtained, it was concluded that there are aggressive processes in which the enzymes can still be featured even having a protection cover. Also, the treatment with the greater enzymatic recovery was identified, and it was concluded that the most marked effect thermal processes on the percentage of recovery, and it was deduced that the most marked effect could be determined by the exposure time of the food to the temperature in the conditioning or post-conditioning equipment, because when the samples are subject to high temperature, but only a short time the enzyme is recovered satisfactorily.
KEYWORDS: EXOGENOUS ENZYMES, RECOVERY PERCENTAGE
OF ENZYMES, THERMAL PROCESSES, AMILASA, PHYTASA,
XYLANASA, PROTEASA
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CAPITULO I
INTRODUCCION
El crecimiento de la población mundial se ha convertido en uno de los más
grandes desafíos para las empresas que elaboran alimentos balanceados.
El rubro más alto dentro de un sistema de producción equivale al costo de
alimentación.
La presión para reducir costos, y aumentar los suministros ha dado lugar a
unidades de producción más eficientes, de mayor tamaño y con mayor
grado de integración productiva, junto a importantes mejoras en el potencial
genético de los animales, el manejo y la alimentación (Angel, 2007)
Los ingredientes como los cereales y las leguminosas tienen gran
participación en la fabricación del alimento, poseen variabilidad en sus
componentes y un alto porcentaje de factores antinutricionales que dificulta
la disponibilidad y la absorción de los nutrientes. La variabilidad de la soja
es menor, sin embargo, la diferencia se debe a las condiciones de
crecimiento, almacenaje, y variaciones en el procesado (Dudley, 2003)
Hoy en día el uso de enzimas exógenas permite que la alimentación animal
sea más eficiente, ya que optimizan el uso de las fuentes de fosforo, energía
y proteína para la alimentación animal, pueden influir en la rentabilidad de
una operación y a la vez mejorar la calidad del ambiente, tanto para los
animales como para los trabajadores a través de la reducción de las
emisiones de amoniaco y otros compuestos.
Es por esto que la inclusión de enzimas en las dietas de animales es una
de las estrategias que se han implementado para obtener mejores
resultados, ya que, aun habiendo sido probadas a lo largo de los años, los
resultados en campo no son aún uniformes y esto nos lleva a cuestionar si
en el proceso de elaboración del alimento hay elementos que afecten su
estabilidad.
Las enzimas comerciales con actividades validadas en la industria de la
nutrición animal tienen alta relevancia desde el punto de vista de
sostenibilidad en costos y sustentabilidad en el medio ambiente. Los
resultados del uso de enzimas y su impacto en las variables económicas y
medio ambientales están en función a las dosis recomendadas por los
fabricantes.
Rostagno (2003) mencionó que la cantidad de nutrientes y olores lanzados
al ambiente, que están asociados a la producción animal, pueden ser
alteradas a través de diferentes estrategias nutricionales.
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Es importante tener en cuenta que hay variaciones inherentes al proceso
productivo donde las temperaturas y tiempo de exposición son diferentes
para cada tipo de alimento balanceado e infraestructura de las plantas, se
debe determinar las pérdidas que se pueden generar bajo los diferentes
escenarios de maquila.
La metodología para validar el contenido de enzimas en un producto
determinado es la PRUEBA DE RECUPERACIÓN, mediante ésta se puede
hacer un reajuste de las dosis, considerando o no una posible pérdida, se
pueden cuantificar pérdidas que presentan las enzimas por proceso; validar
y ajustar las dosis de ser necesario, ya que aún no existe un método
estandarizado para obtener una eficiente recuperación. La importancia de
la prueba de recuperación de enzimas radica en que mediante esta
podremos asegurarnos de que el alimento al que se le ha adicionado una
enzima exógena y que es sometido a peletización, llegue al animal y realice
su actividad enzimática en el tracto gastrointestinal.
El presente trabajo determinó el porcentaje de recuperación de enzimas
exógenas adicionadas a dietas para animales de interés zootécnico
sometidos a diferentes procesos térmicos de peletizado o extrusión. Las
enzimas en las que se probó la termoestabilidad fueron FITASAS,
XYLANASAS, AMILASAS Y PROTEASAS que son enzimas mono-
componentes, es decir son enzimas que actúan específicamente sobre el
sustrato.
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CAPITULO II
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la cantidad de enzimas exógenas recuperadas en dietas
para animales de interés zootécnico sometidas a diferentes procesos
térmicos.
Objetivo Específico
Evaluar el porcentaje de recuperación de enzimas exógenas: fitasas, xylanasas, amilasas y proteasas, sometidas a tratamientos con diferentes tiempos y temperaturas aplicados sobre alimentos balanceados en procesos de extrusión y peletizado.
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CAPITULO III
MARCO TEORICO
ELABORACION DE ALIMENTOS:
La industria para la fabricación de balanceados con la finalidad de mejorar
aspectos relacionados con la calidad, apariencia, textura, palatabilidad,
eliminación de factores antinutricionales, o agentes infecciosos, ha
desarrollado una serie de procesos de elaboración de alimentos que en la
actualidad se encuentran implementados para la elaboración de
dietas.(Zacañino, 2012)
Varios de estos métodos de procesamiento aplican tratamientos térmicos
pudiendo o no ser complementados con humedad, vapor o presión, esto
aparentemente si las enzimas no cumplen con mecanismos de protección
podría reflejarse en una destrucción parcial o total de este tipo de proteínas.
El objetivo de la peletización en animales terrestres es el mejoramiento de
la calidad y la fluidez del alimento, disminución del desperdicio, mejora el
crecimiento y la conversión alimenticia, mejora la palatabilidad y
digestibilidad, (Joaquin, 2013)
Es importante determinar una temperatura y tiempo adecuado para obtener
un pellet de calidad y que no afecte los componentes del alimento. Joaquín
(2013) mencionó que los alimentos para aves se acondicionan en un rango
de temperatura entre 80 a 85 °C, con un tiempo de acondicionamiento entre
30 a 60 segundos.
Cruz-Suarez (2006) mencionaron que en el caso de camarones es
indispensable que el alimento sea en pellet, los beneficios son amplios sin
embargo existen factores que afectan la calidad de los pellets que son los
ingredientes de los que está compuesto, así como el proceso de
manufactura.
El procesamiento para elaboración de alimentos balanceados puede ser
esquematizado de la siguiente manera.
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PROCESO PARA ELABORACION DE ALIMENTOS BALANCEADOS
. Fuente (Zacañino, 2012)
Pesaje de macro y micro ingredientes Pesaje
Reduccion de las materias primas apartículas más pequeñas de acuerdo con lagranulometría de cada tipo de alimento quese desee fabricar, el tamaño de la partículadependerá del tipo de molino y de la cribaque se utilice.
Molienda
Homogenizacion de los macro y microingredientes ,durante un tiempo determinado.
El Coeficiente de Variación es una de laspruebas donde se analiza la buenahomogenizacion del alimento, el resultadodeseable es que no supere del 10%.
Mezclado
Proceso en que es inyectado al alimento en harinavapor a altas temperaturas y por un tiempodeterminado este contribuye a una gelatinizacionde los almidones para obtener una mejordigestibilidad,y destruir factores antinutricionales
Acondicionamiento
El pelletizado es el proceso donde se compactaráel alimento en harina mediante la compresión delalimento para formar un pellet de calidad y sindefectos.La extrusion combina procesos demezclado, coccion, la harina es comprimida y pasapor una pequeña abertura para formar el pellet.
Pelletizado y Extrusion
Realizado en máquinas enfriadoras, cuya misiónes reducir la temperatura del pellet para mejorarel almacenaje del alimento, y evitarcontaminaciones micoticas.
Enfriado
•Equipo que mantiene la temperatura del pellet por 5a 10 min , para lograr una mayor gelatinizacion de
los almidones.Pos
Acondicionamiento-
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ADITIVOS PARA LA ALIMENTACION
Los aditivos son sustancias que no aportan valor nutricional pero pueden
cumplir funciones específicas como promotores de crecimiento, alteración
de la textura o color del alimento, saborizantes, pigmentantes y son
adicionadas a la formulación a niveles bajos de inclusión (Ravindran, 2010).
Los más utilizados tienen la finalidad de favorecer el aprovechamiento de
la dieta entre ellos las enzimas destacan como una alternativa que
adicionalmente en algunos casos mejora, la asimilación de nutrientes en el
organismo.
Estos efectos son positivos, pues el resultado es una mejora en el bienestar
animal que repercute directamente en una mejora económica para el
productor.
Ravindran (2010) mencionó que los aditivos pueden tener diferentes
RSD r (repetibilidad) en piensos 10% 8,90% 4,1 a 7,2%,
RSD R (reproducibilidad ) en piensos 12% 11,70% 7-12,3% 5,1 a 13,6%,
R Rec (recuperación) 98 - 109 % 101% 97,80% 92,6 a 114,4%
European Union Reference Laboratory for Feed Additives
Fuente (Gizzi G, 2008), (EURL, 2010) (EURL, 2012)
En la Tabla 2 el resumen de la metodología utilizada en el laboratorio para
determinar la presencia de enzimas en muestras de alimentos balanceados
en harina y pellet.
Las enzimas recuperadas fueron amilasa, fitasa, xilanasa, proteasa, que
estuvieron incluidas al alimento y homogenizadas en la mezcladora junto
con los macronutrientes a dosis establecidas por el técnico en campo.
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ANÁLISIS ESTADISTICO.
Para este estudio se propusieron las siguientes hipótesis.
Hipótesis 0 Nula
La temperatura y el tiempo aplicados sobre alimentos que contienen
enzimas exógenas no afectan el porcentaje de recuperación en procesos
de extrusión y peletizado.
Hipótesis 1 Alternativa
La temperatura y el tiempo aplicados sobre alimentos que contienen
enzimas exógenas afectan el porcentaje de recuperación en procesos de
extrusión y peletizado.
MÉTODOS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Para la evaluación de los resultados se aplicaron 4 tipos de análisis con la
finalidad de determinar la influencia de las variables (Temperatura/Tiempo)
sobre el porcentaje de recuperación enzimática.
A continuación, la descripción de cada análisis realizado:
1.-Analisis para discriminación de datos
Se ingresó los datos de promedios de recuperación de cada enzima al
diagrama de caja y bigote (Box Plot) que mostró la distribución de las
observaciones mediante sus cuartiles, para la posterior discriminación de
datos atípicos.
En la ilustración 4 se observa el resultado del análisis donde se puede
apreciar la dispersión de los datos para cada enzima.
2.- Análisis del porcentaje de recuperación de cada enzima mediante
estadística descriptiva
Cada enzima fue evaluada por separado y se determinó la influencia del tipo de tratamiento. Para amilasa, se realizaron seis tratamientos por tres semanas, para fitasa dieciséis tratamientos por ocho semanas, para xilanasa se evaluaron diez tratamientos por cinco semanas, para proteasa se realizaron ocho
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tratamientos por cuatro semanas. Todas con una frecuencia de toma y envío de muestras de dos pruebas por semana Se realizó una base de datos, con los valores de cada ensayo y sus
recuperaciones.
Los valores de la enzima obtenida tanto en harina como en pellet fueron
analizados mediante estadística descriptiva para determinar las medias, y
el porcentaje de recuperación, mediante la siguiente ecuación.
%𝑅 =Promedio (P)x100
Promedio (H)
Dónde:
%R=Porcentaje de Recuperación de la enzima
P=Pellet (cantidad de enzima conseguida en el pellet)
H=Harina (cantidad de enzima conseguida en la harina)
3.- Análisis de influencia de variables mediante el paquete
estadístico R
Los resultados por tratamiento fueron sometidos a un análisis de varianza
utilizando el paquete estadístico R, para efectuar comparaciones de las
variables independientes (Temperatura, Tiempo) frente a la variable
dependiente (Recuperación de Enzimas exógenas).
Mediante el Análisis de Varianza se pudo determinar la variable con mayor
influencia sobre la recuperación de enzimas.
4.- Análisis de influencia de las variables mediante regresión
Mediante el análisis de regresión corrido en Excel, se corroboró los
resultados obtenidos en el software estadístico R, el cual confirma la
variable que tiene un efecto más marcado sobre la recuperación
enzimática.
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CAPITULO V
RESULTADOS
1. ANALISIS BOX PLOT (DISCRIMINACION DE DATOS)
Mediante el diagrama de Box Plot se pudo discriminar datos que difieren
ampliamente de la media de recuperación. Estos datos atípicos se
encontraban fuera de rango.
Tabla 3. Medias de porcentaje de recuperación enzimática
RECUPERACION AMILASA (KNU)
RECUPERACION FITASA(FYT)
RECUPERACION PROTEASA(PROT)
RECUPERACION XILANASA(FXU)
79,93% 85,05% 74,59% 85,93%
81,24% 84,14% 85,60% 66,32%
72,68% 85,14% 63,04% 84,27%
66,57% 95,78% 90,31% 69,18%
81,62% 86,94% 83,85% 96,29%
87,74% 43,71% 77,71% 84,37%
68,00% 86,30% 79,22%
65,38% 58,44% 0,00%
90,99% 94,97%
83,89% 63,61%
84,89%
0,00%
55,10%
74,18%
95,78%
59,72%
KNU: KILO NOVO UNIT, FYT: FITASA UNIT, PROT: PROTEASA UNIT, FXU: FUNGAL
XYLANASE UNIT (Anexo 4)
En la Tabla 3 se muestra el resultado del porcentaje de recuperación por
enzima con la respectiva discriminación de datos.
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Ilustración 4. Recuperación de enzimas con discriminación de datos
En la Ilustración 4, el análisis de fitasa y Xilanasa donde se observa datos
atípicos de 0% de recuperación, estos datos siguen un comportamiento
normal puesto que fueron muestras sometidas a procesos de pos-
acondicionamiento (Proceso utilizado en la elaboración de alimentos con el
que cuentan ciertas plantas, en el cual el pellet es expuesto a condiciones
extremas de temperatura 65°c por 30 min) en este ensayo pudimos verificar
que las enzimas fitasa y xilanasa NO resistieron al tratamiento efectuado,
por tal motivo su recuperación es del 0%.
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2. ANALISIS DE TRATAMIENTOS APLICADOS A CADA ENZIMA
Tabla 4. TABLA DE TIEMPO Y TEMPERATURA PARA
TRATAMIENTOS DE AMILASAS
Tabla 4, tratamientos para amilasas, con sus respectivos tiempos y
temperaturas, con los valores de enzimas presentes en las muestras de
harina después del proceso de mezclado, valores de enzimas encontrados
en las muestras de pellet después de haber sido sometidos a los
tratamientos, junto con el porcentaje de recuperación enzimática de
amilasas obtenidos
Ilustración 5. Presencia de enzima tanto en harina como en pellet junto con el % de recuperación.
Tratamiento Tiempo/seg Temperatura°C Media Harina (KNU) Media Pelle (KNU) %Recuperacion
TIA 90 100 116,6 93,2 79,93
T2A 90 70 181,2 147,2 81,24
T3A 7 105 118,6 86,2 72,68
T4A 7 105 66,4 44,2 66,57
T5A 7 105 64,2 52,4 81,62
T6A 60 84 93 81,6 87,74
0
50
100
150
200
TIA T2A T3A T4A T5A T6A
RECUPERACION AMILASA
MEDIA HARINA MEDIA PELLET %RECUPERACION
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En la ilustración 5 se puede observar la recuperación de 6 tratamientos de
Amilasa, en el que se puede determinar que el mejor tratamiento para
amilasa es T6A (tiempo de 60 segundos a 84°centigrados de temperatura)
con una recuperación del 87,74%. Seguido por los tratamientos T5A
(tiempo de 7 segundos por 105°centigrados) que equivale a un proceso
donde interviene expander, y con una recuperación del 81,62%, el
tratamiento T2A (tiempo de 90 segundos por a 70°centigrados de
temperatura) con una recuperación de 81,24%, y el tratamiento T1A
(tiempo de 90 segundos a 100°centigrados) con una recuperación del
79,93%.
Tabla 5. Tabla de las medias de enzima encontrada tanto en harina como en pellet, junto con el % de recuperación para fitasa
En la Tabla 5 la recuperación de 16 tratamientos para fitasas, con los
respectivos tiempos y temperaturas aplicados, así como los valores de la
enzima encontrada en la harina después del proceso de mezclado, y los
valores de enzimas hallados en alimento en pellet después de haber sido
sometidos al tratamiento térmico, peletizado o extrusión, junto con los
porcentajes de recuperación enzimática obtenidos.
Tratamiento Tiempo/seg Temperatura°C Media Harina (FYT) Media Pellet (FYT) %Recuperacion
T1F 90 82 1728,2 1469,8 85,05
T2F 23 84 1325,4 1115,2 84,14
T3F 20 80 2849,8 2200,8 85,14
T4F 90 100 1402,6 1343,4 95,78
T5F 90 70 1770,2 1539 86,94
T6F 50 83 1101,4 481,4 43,71
T7F 7 105 1441,4 980,2 68,00
T8F 20 80 1440,4 941,8 65,38
T9F 46 82 1342,4 1221,4 90,99
T10F 7 105 1798,8 1509 83,89
T11F 7 105 4562,6 3985 84,89
T12F 1800 65 1339,4 0 0,00
T13F 60 84 959,4 528,6 55,10
T14F 100 81 1107,6 821,6 74,18
T15F 35 75 819,6 785 95,78
T16F 100 81 977,6 583,8 59,72
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Ilustración 6. Enzima presente en harina, así como en pellet junto con el % de recuperación de fitasa
En la Ilustración 6 se puede observar que los mejores tratamientos para
fitasas son T4F (tiempo de 90 segundos a 100°centigrados), T15F (tiempo
de 35 segundos a 75°centigrados, T9F (tiempo de 46 segundos por
82°centigrados) tienen el más alto porcentaje de recuperación, sobre el
90%, es decir en un rango de tiempo de (35-90 segundos), y un rango de
temperatura de (75°C-100°C) para las enzimas fitasas tienen una óptima
recuperación.
En el 37,5% de los tratamientos se obtuvo una recuperación sobre el 80%,
el 31,25% de los tratamientos tuvo una recuperación sobre el 50%, no
obstante en el T6F se observó una recuperación con el menor porcentaje
esperado al parecer por algún error en el proceso de obtención de
muestras, probablemente por una mala homogenización de las muestras;
el T12F cuenta con una recuperación del 0% ya que es un dato en el que
la respuesta obtenida proviene del tipo de proceso al que fue sometida la
Tabla 6. TABLA DE TIEMPOS Y TEMPERATURAS PARA TRATAMIENTOS DE XILANASAS
En la Tabla 6 se observan los tratamientos para Xilanasas, con los
respectivos tiempos y temperaturas aplicados, así como las medias de los
enzimas encontrados después del proceso de mezclado en las muestras
de harina, y los valores de enzimas encontrados en el alimento después de
haber sido sometidos al proceso térmico de peletizado o extrusión, junto
con el porcentaje de recuperación obtenido.
Ilustración 7. Comparación de los tratamientos para Xilanasas.
En la Ilustración 7 se aprecia que el T5X (23 segundos por 84°centigrados)
y el T9X (60 segundos por 84°centigrados) son los mejores tratamientos
para Xilanasa, ya que al parecer los rangos de tiempo y temperaturas
aplicados no influyen en la recuperación del 90% con el que cuentan estos
tratamientos.
Tratamiento Tiempo/seg Temperatura°C Media Harina(FXU) Media Pellet(FXU) %Recuperacion
T1X 23 84 176,2 151,4 85,93
T2X 90 100 190,6 126,4 66,32
T3X 90 70 199,6 168,2 84,27
T4X 7 105 228,4 158 69,18
T5X 23 84 178 171,4 96,29
T6X 7 105 93,4 78,8 84,37
T7X 7 105 107,8 85,4 79,22
T8X 1800 65 145,2 0 0
T9X 84 60 135,2 128,4 94,97
T10X 90 82 288 183,2 63,61
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
0
50
100
150
200
250
300
350
T1X T2X T3X T4X T5X T6X T7X T8X T9X T10X
Recuperacion Xilanasa
MEDIA HARINA MEDIA PELLET %RECUPERACION
26
El 30% de los tratamientos (T1X, T6X, T3X) son tratamientos con una
recuperación sobre el 80%, el 40% de los tratamientos (T7X, T4X, T2X,
T10x) presentan recuperaciones entre el 63 y el 79%, el tratamiento T8X,
presenta 0% de recuperación puesto que en el resultado interviene el
proceso al que fue sometida la muestra.
Tabla 7. Tabla de tiempos y temperaturas para tratamiento de Proteasas
Tabla 7 se observa 8 tratamientos de Proteasa con los tiempos y
temperaturas aplicados, así como los valores de enzimas encontrados
tanto después del proceso de mezclado del alimento en harina, así como
después del tratamiento térmico en del alimento en pellet, junto con el
porcentaje de recuperación para cada tratamiento.
Ilustración 8. Medias de la enzima encontrada tanto en muestras de harina, como en las muestras en pellet y % de recuperación realizados para Proteasas
En la Ilustración 8 se demuestra que el mejor tratamiento en este estudio
para proteasa fue el T4PR (46 segundos por 86 centígrados) ya que se
obtuvo el 90,31% de recuperación enzimática. El 37,5% de los tratamientos
(T7PR, T2PR, T5PR) tuvieron recuperaciones sobre el 80%, el 50% de los
tratamientos (T8PR, T3PR, T1PR, T6PR) recuperaciones que van desde el
58% hasta el 77,71%, que son porcentajes aceptables.
Tratamiento Tiempo/seg Temperatura°C Media Harina(PROT) Media Pellet (PROT) %Recuperacion
T1PR 20 80 19534 14571 74,59
T2PR 90 70 16523 14143 85,6
T3PR 7 105 24922 15712 63,04
T4PR 46 86 15209 13736 90,31
T5PR 20 80 4911,6 4118,6 83,85
T6PR 7 105 8460,6 6574,4 77,71
T7PR 7 105 8545,2 7374,2 86,3
T8PR 1800 65 34943 20422 58,44
0
20
40
60
80
100
0
10000
20000
30000
40000
T1PR T2PR T3PR T4PR T5PR T6PR T7PR T8PR
Recuperacion Proteasa
MEDIA HARINA MEDIA PELLET
%RECUPERACION
27
3.- ANALISIS ESTADISTICO EN R
Para establecer la significancia en el estudio el error aceptable es de 0,05.
Resultados del Efecto del Tiempo sobre la recuperación
En el recuadro se observa los resultados obtenidos, en el que se revela que
el tiempo tiene influencia estadísticamente significativa sobre la
recuperación, con una Probabilidad menor de 0,0001(en amarillo***)
comparada con la probabilidad del error (0,05), por tanto, se rechaza la
Hipótesis Nula y se acepta la Hipótesis Alternativa.
Ilustración 9.Figura de la influencia del tiempo sobre la recuperación.
En la Ilustración 9 los datos que responden a logaritmo 1 equivale al menor
tiempo que es de 7 segundos, sin embargo, el mayor grupo de datos se
encuentran agrupados entre logaritmos 1.5-2.0 que equivale a tiempos que
van desde 20 segundos a 90 segundos de exposición, datos fuera de la
28
agrupación que corresponden a 1800 segundos de muestras sometidas a
pos-acondicionador.
Resultados del efecto de la temperatura sobre la
recuperación
Resultados del análisis de temperatura versus % de recuperación.
En el recuadro se observa que la Probabilidad de que la temperatura influya
en el resultado obtenido es de 0,00119 (en amarillo**) que es menor que el
error establecido de (0,05). Por tanto, se rechaza la hipótesis nula y se
acepta la hipótesis alternativa, ya que la temperatura también tiene un
efecto sobre la recuperación enzimática, aunque con menor significancia
que el efecto del tiempo.
Ilustración 10. Figura de la influencia de la temperatura sobre el porcentaje de recuperación.
En la Ilustración 10, se observa la mayor agrupación de datos entre 80-90
grados centígrados de todas las enzimas y con porcentajes de
F-statistic: 134.2 on 2 and 197 DF, p-value: < 2.2e-16
30
3. ANALISIS DE REGRESION
Tabla 8. Análisis de Regresión entre el Tiempo en relación con el
porcentaje de recuperación enzimática.
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de correlación múltiple 0,745
Coeficiente de determinación R^2 0,555
R^2 ajustado 0,553
Error típico 13,991
Observaciones 200,000
Ilustración 11. Tendencia de la influencia del tiempo sobre el porcentaje de recuperación enzimática.
En la ilustración 11 se muestra la tendencia de los datos de Recuperación-
tiempo en esta no se aprecia una marcada tendencia sin embargo
matemáticamente es claramente demostrable, la variable tiempo explica
mejor la variación o los cambios en la recuperación.
31
Tabla 9. Análisis de regresión de la Temperatura en relación con el porcentaje de recuperación.
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de correlación múltiple 0,228
Coeficiente de determinación R^2 0,052
R^2 ajustado 0,047
Error típico 20,431
Observaciones 200,000
Ilustración 12. Tendencia de la recuperación enzimática comparada con la temperatura.
En la Ilustración 12 se muestra la tendencia de los datos de recuperación
en relación con la temperatura, y en la que se explica que a mayor
temperatura hay una menor recuperación enzimática.
32
DISCUSIÓN
De acuerdo con el estudio realizado se pudo comparar los resultados de
las enzimas que presentan un mejor valor de recuperación al ser sometidas
a proceso térmicos.
Tabla 10.Resúmen de los mejores resultados de recuperación por enzima.
En la Tabla 10 se describen los mejores resultados de recuperación, y los
procesos al que fueron sometidos.
Para Amilasa la mejor recuperación se obtuvo al someter a las muestras a
84 grados centígrados por un tiempo de 60 segundos (1min). Amilasa tiene
una menor recuperación en comparación al resto de enzimas estudiadas.
Para Fitasa, los porcentajes de recuperación son altos y se ha determinado
que, a temperaturas entre los 75°c y 100°c, con tiempos entre 35 y 90
segundos la recuperación es óptima sobre el 90%.
(Erpel, Restovic, & Arce-Johnson, 2016) mencionaron que la fitasa se la ha
manipulado genéticamente para que resista a las condiciones del tracto
gastrointestinal a pH que van desde 2,5 a 5,5 reaccionando de manera
óptima a un pH de 3,8. Esta enzima cuenta con extensas investigaciones y
ha sido muy probada en avicultura, con mayores modificaciones para
obtener una mayor termo resistencia, más estabilidad y que no se degrade.
Sin embargo existen especies animales dentro de la acuacultura que aún
no han sido beneficiados con el empleo de fitasas en su nutrición, ya que
se requiere que estas posean estabilidad a temperaturas empleadas en el
proceso de manufactura.(Olazarán, Blanco, Ma, & Salvadó, 2007). Por tal
motivo en este estudio al probar la estabilidad de Fitasa en plantas que
poseen pos acondicionador para alimentos acuícolas no se obtuvieron
resultados favorables.
Para Xilanasa la mejor recuperación se obtuvo al someter a las muestras a
temperaturas del 84°C por un tiempo entre 23-60 segundos y se obtuvo
AMILASA PROTEASA
Temperatura °C 84°C 100°c 75°c 82°c 84°c 84°c 86°c
Tiempo/seg. 60 seg 90 seg 35 seg 46 seg 23seg 60seg 46seg
%RECUPERACION 88% 96% 96% 91% 96,00% 95% 90,31%
XILANASAFITASA
ENZIMASVARIABLES
33
recuperación del 95-96%, Xilanasa tiene recuperaciones altas con
temperatura estable, y con tiempos que varían levemente.
Para Proteasa la mejor recuperación se obtuvo con 86°C por 46 segundos,
con una recuperación del 90,31%. Las proteasas son enzimas en las que
se obtuvo recuperaciones aun siendo sometidas a procesos de pos
acondicionador en la elaboración de alimentos para acuacultura.
El proceso térmico para obtener una adecuada presencia de la enzima en
el pellet no es aún estandarizado, se ha mencionado que el tiempo optimo,
es el que se requiere para que el calor y la humedad ingresen al centro de
las partículas (Markus Kenny y Dan Rollins, 2007). En el acondicionador se
desintegra la estructura del almidón y se produce la gelatinización, al
aumentar el tiempo en el acondicionador, mayor será la gelatinización y
compactación del pellet.
Para (Soares, 2012) las temperaturas usualmente utilizadas en la
peletización van de 60-85°C, sin embargo, en este estudio se pudo
comprobar que existen recuperaciones aun sobre los 100° centígrados,
pero con un bajo tiempo de exposición.
En este estudio se ha utilizado enzimas con una cobertura multicapa que
contribuye a una mejor termoestabilidad, que mejora su recuperación
enzimática y permite que estén libre de polvo, contiene fibras de celulosa
que aportan estabilidad física, además los desarrollos en cuanto a
ingeniería genética, permite tener un producto mejor preparado para resistir
condiciones térmicas, para Soto (2016) la termoestabilidad es esencial para
poder resistir las altas temperaturas durante la elaboración del alimento sin
tener que recurrir a un recubrimiento, ya que para este autor ralentizaría la
actividad en el estómago.
De acuerdo con el estudio realizado no solo se pudo identificar el mejor
proceso térmico para cada enzima, sino que adicionalmente se determinó
que variable tiene más influencia en una adecuada presencia de enzimas,
pues se demostró por el análisis de regresión que el 55,3% de los datos en
el estudio pudieron dar variaciones en relación con el tiempo, y que tan solo
el 4,7% pudo producir variaciones en la recuperación en relación con la
temperatura sin que esta sea menos importante que la variable del tiempo.
Se identificó que la variable tiempo tiene mayor influencia en la
termoestabilidad de las enzimas exógenas, este tiene un importante efecto
sobre el pellet, pues un mayor tiempo de acondicionamiento contribuye a
que los pegamentos naturales se compriman fuertemente y adhieran entre
sí (Markus Kenny y Dan Rollins, 2007).El tiempo de retención en el
acondicionador es una de las variables que tiene gran influencia al
momento de elaborar alimentos balanceados, en una investigación
realizada por (Covaleda, 2012) se mencionó que el tiempo de exposición
34
o retención del alimento en el acondicionador es necesario para un buen
desdoblamiento del almidón y mayor durabilidad del pellet, sin embargo, no
se especifica el tiempo adecuado de este proceso
35
CAPITULO VI
CONCLUSIONES.
Los resultados demostraron que las enzimas en estudio si pueden ser
afectadas en la cantidad de recuperación enzimática (% de recuperación)
al ser sometidas a diferentes procesos de manufactura con diferentes
tiempos y temperaturas.
La literatura disponible que describa la influencia de los tratamientos
térmicos al que se someten muestras de alimentos para verificar eficiencia
de recuperación enzimática, es escasa y no se ha determinado un
tratamiento térmico que asegure una recuperación optima, pues cada
planta de alimentos cuenta con equipos diferentes que pueden ser
variables que afecten en mayor grado la presencia de enzima en el
alimento peletizado o extruido, y por tanto repercutiría en una deficiente
llegada de las mismas al animal para que realicen la acción esperada.
En muestras sometidas a altas temperaturas, por corto tiempo, el
porcentaje de recuperación es óptimo, mientras que en muestras a
temperaturas bajas por tiempo prolongado el porcentaje de recuperación
no es el esperado y en plantas con pos acondicionador la recuperación es
nula, salvo en la enzima proteasa que se obtuvo recuperación sobre el
50%, el motivo por el que esta enzima resiste más a procesos agresivos
podría ser motivo de otros estudios.
36
RECOMENDACIONES
Para conseguir óptimos resultados se recomienda establecer protocolos de
pruebas periódicas, con planes de trabajo definidos con la finalidad de
estandarizar los procesos para optimizar los tiempos de producción y evitar
pérdidas. Uno de los procedimientos que se debería implementar en las
plantas de alimentos periódicamente es el análisis de Coeficientes de
Variación para determinar la homogenización del alimento en la mezcladora
y comprobar que los micro ingredientes están distribuidos adecuadamente
en el alimento.
La industria busca la manera de conseguir un pellet de calidad que cumpla con las características deseadas de resistencia, pero que no destruyan elementos como las enzimas que son sensibles a procesos térmicos agresivos, el proceso de peletizado y extrusión son los procesos más adecuados para lograr una mejora en la presentación del alimento una mayor compactación y una disminución de finos, se debe conseguir una estabilidad de la enzima que resista la desnaturalización mediante estrategias como, la aspersión pos-pellet, la cubierta multicapas, y mediante la mejora en la biotecnología que puede estar influenciada por el tipo de microorganismo del que fue sintetizada la enzima.
37
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with section II.
40
ANEXOS
Anexo 1. TOMA DE MUESTRAS
Imagen 2 Imagen 3
Planta de alimentos balanceados y equipo acondicionador y
peletizadora.
Imagen 4
Monitoreo del control de operación del proceso de elaboración de
alimentos
41
Imagen 5
Equipo de almacenamiento de microingredientes.
Imagen 6
Toma de muestras.
42
Anexos 2. Embalado y Etiquetado de muestras, con orden de análisis
para el laboratorio.
Imagen 7
Muestras enviadas por plantas de alimento.
Imagen 8
43
Anexos 3. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS EN ESTUDIO
Imagen 9
Enzimas utilizadas en el estudio visualizadas al microscopio.
Imagen 10
44
Anexos 4. DEFINICION DE UNIDADES DE LAS ENZIMAS EXOGENAS.
ENZIMA UNIDADES DESCRIPCION DEFINICIÓN
FITASA FYT FYTASE UNIT
Una FYT, se define como la cantidad de enzima que libera, 1 μmol de fosfato inorgánico a partir de fitato, por minuto en condiciones de reacción con un fitato.
XYLANASA FXU FUNGAL
XYLANASE UNIT
Una unidad FXU es la cantidad de endo-1,4- β - xilanasa que libera 7,8 micromoles de azúcares reductores (equivalentes de xilosa).
AMILASA KNU KILO NOVO UNIT
Una unidad de KNU se define como la cantidad de enzima que libera 6 μmol de p-nitrofenol por minuto.
PROTEASA PROT PROTEASE UNIT
Una unidad de PROT es la cantidad de serina proteasa que libera 1 μmol de para-nitroanilina (pNA).
