UNIVERSIDAD DE MURCIA FACULTAD DE VETERINARIA
Ingredientes Funcionales en Fórmulas Infantiles que afectan al Equilibrio de
la Microbiota Intestinal del Lactante y a la Absorción y Disponibilidad de
Minerales.
Patricia Peso Echarri
2012
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE
LOS ALIMENTOS, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA.
FACULTAD DE VETERINARIA
TESIS DOCTORAL
“INGREDIENTES FUNCIONALES EN FÓRMULAS INFANTILES QUE AFECTAN
AL EQUILIBRIO DE LA MICROBIOTA INTESTINAL DEL LACTANTE Y A LA ABSORCIÓN Y DISPONIBILIDAD DE
MINERALES”
Patricia Peso Echarri
Directores: Carmen Martínez Graciá Carmen Frontela Saseta
Murcia, 2012
I
ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 1
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 5
III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 7
1. Nutrición del lactante ...................................................................................................... 7 1.1. Desarrollo y maduración gastrointestinal ........................................................................ 7 1.2. Digestión y absorción de proteínas .................................................................................. 9 1.3. Digestión y absorción de lípidos ..................................................................................... 10 1.4. Digestión y absorción de carbohidratos ......................................................................... 11 2. Lactancia artificial. Fórmulas infantiles ........................................................................ 12 2.1. Antecedentes históricos ................................................................................................. 12 2.2. Normativa actual ............................................................................................................ 14 2.3. Ingredientes funcionales y tendencias actuales en fórmulas infantiles ........................ 16 2.4. Componentes proteicos en fórmulas infantiles ............................................................. 18 3. α‐lactoalbúmina ............................................................................................................ 21 3.1. Funciones de la α‐lactoalbúmina .................................................................................. 22 3.2. Estructura la proteína α‐lactoalbúmina ......................................................................... 23 3.3. Bioactividad de la proteína α‐lactoalbúmina ................................................................. 25 4. Compuestos nitrogenados no proteicos: nucleótidos .................................................. 35 4.1. Bioactividad de los nucleótidos ...................................................................................... 37 5. Biodisponibilidad mineral ............................................................................................. 41 5.1. Métodos de estudio de la biodisponibilidad mineral ..................................................... 42 5.1.1. Métodos de estudios in vivo .......................................................................................... 43 5.1.2. Métodos de estudio in vitro ........................................................................................... 45 5.1.3. Métodos de estudio con líneas celulares ....................................................................... 45 5.2. Biodisponibilidad de calcio ............................................................................................. 47 5.2.1. Absorción y regulación del calcio ................................................................................... 47 5.2.2. Homeostasis de calcio en el recién nácido ..................................................................... 51 5.2.3. Deficiencia y exceso de calcio en la infancia .................................................................. 52 5.3. Biodisponibilidad de hierro ............................................................................................ 54 5.3.1. Absorción de hierro ........................................................................................................ 54 5.3.2. Homeostasis de hierro en el recién nácido .................................................................... 56 5.3.3. Patologías asociadas al desequilibrio del hierro en la infancia ...................................... 57 5.4. Biodisponibilidad de cinc ................................................................................................ 59 5.4.1. Absorción de cinc ........................................................................................................... 59 5.4.2. Homeostasis de cinc en el recién nácido ....................................................................... 63 5.4.3. Deficiencia de cinc en la infancia.................................................................................... 63 6. Evolución de la microbiota intestinal en lactantes....................................................... 65 6.1. Importancia de la microbiota intestinal en la salud del hospedador ............................. 67 6.2. Colonización de la microbiota intestinal en el neonato ................................................. 72 6.3. Factores que intervienen en la colonización .................................................................. 75
II
6.4. Perspectivas futuras en la modificación de la microbiota intestinal ............................. 79 IV. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 81
1. Diseño experimental ..................................................................................................... 81 2. Muestras: ingredientes, fórmulas infantiles y leche materna ..................................... 85 1.1. Ingredientes ................................................................................................................... 85 1.2. Fórmulas infantiles y leche materna .............................................................................. 85 3. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2. ............................................................. 88 3.1. Material, reactivos y equipos de laboratorio ................................................................. 88 3.2. Cultivo celular de la línea Caco‐2 ................................................................................... 89 3.2.1. Mantenimiento celular y subcultivo .............................................................................. 90 3.2.2. Recuento y viabilidad celular ......................................................................................... 91 3.2.3. Congelación ................................................................................................................... 92 3.2.4. Crecimiento y diferenciación celular .............................................................................. 92 3.2.5. Permeabilidad y toxicidad celular .................................................................................. 93 3.3. Estudio de captación retención y transporte mineral mediante el empleo de la línea celular Caco‐2 .............................................................................................................................. 95 3.4. Ensayo 1: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de soluciones patrón de minerales con y sin los ingredientes de estudio .......................................................................................... 96 3.4.1. Procesado de los ingredientes de estudio ..................................................................... 96 3.4.2. Soluciones estándar de minerales y su preparación ...................................................... 97 3.4.3. Procedimiento ................................................................................................................ 97 3.5. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil suplementada con ingredientes funcionales ............................................................................. 98 3.5.1. Muestras ......................................................................................................................... 98 3.5.2. Digestión gastrointestinal in vitro .................................................................................. 98 3.5.3. Acondicionamiento de la fracción soluble y adición de dicha fracción a la monocapa celular .......................................................................................................................................... 99 3.6. Destrucción de la materia orgánica y obtención de la fracción mineral ...................... 100 3.7. Determinación de Fe, Ca y Zn (EAA) ............................................................................ 100 3.8. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de nucleótidos ................................................................................................................................ 102 3.9. Análisis estadístico ....................................................................................................... 102 4. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de la fórmula infantil suplementada con suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA y de sus ingredientes. ........ 103 4.1. Reactivos, material y equipos de laboratorio .............................................................. 105 4.2. Ensayo 1: Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales sometidas a los ingredientes de estudio. Estudio preliminar ............................................................................. 107 4.1.1. Digestión gastrointestinal in vitro de los ingredientes ................................................ 107 4.1.2. Evaluación del crecimiento microbiano ..................................................................... 107 4.1.3. Procesado de los resultados y análisis estadístico ...................................................... 109 4.3. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal expuesta a los diferentes ingredientes objeto de estudio ..................................................................................................................... 109 4.3.1. Procesado de los ingredientes .................................................................................... 110
III
4.3.2. Preparación del inóculo fecal ....................................................................................... 110 4.3.3. Medio de cultivo e inoculación del mismo. ................................................................. 110 4.3.4. Estudio de la microbiota fecal mediante PCR cuantitativa .......................................... 112 4.3.5. Medida de pH .............................................................................................................. 115 4.3.6. Análisis de ácidos grasos de cadena corta .................................................................. 115 4.3.7. Análisis estadístico. .................................................................................................... 117 5. ESTUDIOS III y IV. Estudios in vivo............................................................................... 118 5.1. Ensayo clínico .............................................................................................................. 118 5.2. Aspectos éticos y consentimiento informado .............................................................. 119 5.3. Reactivos, material y equipos de laboratorio PCR en tiempo real .............................. 122 5.4. Participantes ................................................................................................................ 123 5.5. Fórmulas infantiles ...................................................................................................... 123 5.6. Recogida de las muestras fecales ................................................................................. 124 5.7. PCR cuantitativa ........................................................................................................... 124 5.8. Análisis estadístico ...................................................................................................... 127 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 129
1. Estudio I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación, transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2. ........................................................... 129 1.1. Viabilidad y crecimiento de la línea celular Caco‐2 vitro ............................................. 129 1.2. Diferenciación celular ................................................................................................... 131 1.3. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol ...................................... 132 1.4. Ensayo de toxicidad de los ingredientes utilizados en este estudio ........................... 133 1.5. Ensayo 1: Evaluación de la disponibilidad mineral de soluciones patrón de minerales. Efecto de los ingredientes de estudio ....................................................................................... 134 1.5.1. Calcio ............................................................................................................................ 135 1.5.2. 2.4.2. Hierro .................................................................................................................. 136 1.5.3. 2.4.3. Cinc ..................................................................................................................... 138 1.6. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil suplementada con ingredientes funcionales ............................................................................ 141 1.6.1. Calcio ............................................................................................................................ 141 1.6.2. Hierro ............................................................................................................................ 145 1.6.3. Cinc ............................................................................................................................... 147 1.7. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de nucleótidos ................................................................................................................................ 150 2. Estudio II: Evaluación de la actividad funcional de una fórmula infantil suplementada y de sus ingredientes ................................................................................................................ 152 2.1. Ensayo 1: Estudio preliminar. Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales expuestas a los ingredientes en el estudio ............................................................ 152 2.1.1. Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a los concentrados proteicos ............................................................................................................ 153 2.1.2. Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a dos concentraciones diferentes de un preparado de nucleótidos sometido o no a una digestión gastrointestinal ........................................................................................................................ 163 2.2. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal in vitro ..................................................... 171
IV
2.2.1. Evolución de la microbiota fecal expuesta a los ingredientes funcionales digeridos y sin digerir ....................................................................................................................................... 172 2.2.2. Evolución de la microbiota fecal expuesta a las fórmulas del estudio comparándolas con la leche materna ................................................................................................................ 188 3. Estudio III: Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados con leche materna, procedentes de dos regiones espalas ........................................................... 200 4. Estudio IV: Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA. ........................... 207 VI. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 225
VII. RESUMEN ..................................................................................................................... 229
VIII. SUMMARY .................................................................................................................... 233
IX. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 237
V
ÍNDICE DE FIGURAS
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Pág.
Figura 1. Concentración de α‐lactoalbúmina en leche de vaca, fórmulas estándar, fórmulas ricas en lactoalbúmina y en leche materna
22
Figura 2. Función bioquímica y nutricional de la α‐lactoalbúmina 23Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la α‐lactoalbúmina 24Figura 4. Estructura de la α‐lactoalbúmina humana. La hoja β (verde) y los dominios α (azul y rojo) (Rösne y Redfield, 2009)
25
Figura 5. Estructura de un nucleótido 35Figura 6. Diferentes métodos para evaluar la biodisponibilidad 43Figura 7 Absorción transcelular y paracelular del calcio 50Figura 8. Absorción intestinal de hierro no hemo 55Figura 9. Transporte de cinc a través del enterocito mediante la ruta transcelular….
61
Figura 10. Esquema del tejido linfoide asociado al intestino (Adlerberth y Wold, 2009)
68
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 11. Diseño experimental de los estudios in vitro I y II 83Figura 12. Diseño experimental de los estudios in vivo III y IV 84Figura 13. Visión al microscopio de los campos en los que se realiza el contaje celular
91
Figura 14. Reacción producida por las enzimas mitocondriales al reducir el MTT 94Figura 15. Pocillo bicameral, donde se pueden apreciar las dos cámaras y la monocapa
96
Figura 16. Diseño experimental del estudio II 104Figura 17. Procedimiento para el desarrollo del ensayo 1 del estudio II 108Figura 18. Condiciones de tiempo y temperatura para la amplificación de cada grupo microbiano.
114
Figura 19. Cromatograma del multipatrón a concentración 10mM 116Figura 20. Tríptico informativo y consentimiento informado del ensayo clínico que fue proporcionado a las madres antes del comienzo del estudio
121
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 21. Observación de la línea celular Caco‐2 en diferentes días de postsiembra mediante microscopio de contraste de fases y observación del testde micoplasmas. a) 2 días de cultivo, b) 5 días de cultivo, c) 7 días de cultivo, d)ausencia de micoplasmas
130
VI
Figura 22. Curva de crecimiento de la línea celular Caco‐2 131Figura 23. Imágenes de la monocapa en el microscopio electrónico de barrido (a: 5000X, b: 6000X)
131
Figura 24. a) Recta de calibrado de rojo fenol. b) Valores de la permeabilidad aparente a diferentes días de cultivo para evaluar la integridad de la monocapa
132
Figura 25. Porcentaje de viabilidad celular para cada grupo de estudio tras el ensayo de toxicidad
134
Figura 26. Imágenes de las células al microscopio electrónico de barrido a) sin exposición a nucleótidos, b) exposición 32 mg/L y c) 72 mg/L
150
Figura 27. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a los diferentes concentrados proteicos
153
Figura 28. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimientoL. gasseri en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio
155
Figura 29. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a diferentes sueros proteicos
156
Figura 30. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos.
157
Figura 31. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimientode B. longum en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio
158
Figura 32. Variación de pH en el cultivo de B. longum expuesto a los concentrados proteicos digeridos y sin digerir
159
Figura 33. Curvas de crecimiento de E. coli expuesto a los diferentesconcentrados proteicos.
160
Figura 34. Representación del incremento de densidad óptica en el crecimientode E. coli en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.
162
Figura 35. Variación de pH en el cultivo de Escherichi coli sometido a dos concentrados proteicos digeridos y sin digerir.
163
Figura 36. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
164
Figura 37. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de L. gasseri expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
165
Figura 38. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a dos concentraciones del preparado de nucleótidos digeridos y sin digerir.
165
Figura 39. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
166
Figura 40. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de B. longum expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
167
Figura 41. Variación de pH en el cultivo de B. longum sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.
168
Figura 42. Curvas de crecimiento de E. coli expuesta a los diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.
169
VII
Figura 43. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de E. coli expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
170
Figura 44. Variación de pH en el cultivo de E. coli sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.
171
Figura 45. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes sometidos o no a digestión.
179
Figura 46. Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.
180
Figura 47. Variación de pH en cada punto de muestreo para los diferentes grupos de estudio.
181
Figura 48. Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios en cada punto de muestreo para los ingredientes estudiados.
186
Figura 49. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a las fórmulas infantiles, control y suplementada, y a leche materna.
192
Figura 50. Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.
193
Figura 51. Variación de pH en cada punto de muestreo durante la evolución del inoculo fecal expuesto a las fórmulas infantiles y a la leche materna.
199
Figura 52. Evolución de las diferentes poblaciones bacterianas estudiadas en los dos grupos de lactantes.
202
Figura 53. Concentraciones de las diferentes poblaciones microbianas sin tener en cuenta la edad de los lactantes.
203
Figura 54. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 2 semanas de vida (primer muestreo).
216
Figura 55. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 4 semanas de vida (segundo muestreo).
217
Figura 56. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 7‐8 semanas de vida (tercer muestreo).
218
Figura 57. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 12 semanas de vida (cuarto muestreo).
219
VIII
ÍNDICE DE TABLAS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Pág.
Tabla 1. Composición de los preparados para lactantes según legislación. 15Tabla 2. Estudios in vitro realizados con α‐lactoalbúmina o suero proteico ylos efectos evidenciados.
32
Tabla 3. Estudios in vivo realizados con fórmulas infantiles enriquecidas con α‐lactoalbúmina o suero proteico y los efectos producidos.
34
Tabla 4. Estudios in vivo realizados en lactantes sanos y nácidos a término, relacionados con la adición de nucleótidos a fórmulas infantiles.
40
Tabla 5. Bacterias anaerobias predominantes en el intestino grueso y sus productos de la fermentación.
65
MATERIAL Y MÉTODOS.
Tabla 6. Composición nutricional de la fórmula control por 100 g y por 100 mlde fórmula reconstituida
86
Tabla 7. Composición nutricional de fórmula suplementada por 100 g y por100 ml de fórmula reconstituida.
87
Tabla 8. Concentraciones de calcio, hierro y cinc evaluadas en los ensayos decaptación retención y transporte.
97
Tabla 9. Condiciones del espectrómetro de absorción atómica. 101Tabla 10. Preparación de las soluciones patrón de calcio, hierro y cinc pararealizar la recta de calibrado.
101
Tabla 11. Bacterias intestinales utilizadas en las curvas de crecimiento. 107Tabla 12. Especies bacterianas utilizadas para realizar las curvas estándar en la cuantificación de los diferentes grupos microbianos.
113
Tabla 13. Oligonucleótidos utilizados en la investigación de la evolución de diferentes grupos microbianos a partir de un inóculo fecal.
114
Tabla 14. Condiciones cromatográficas para el análisis de AGCC. 116Tabla 15. Patrones de ácidos grasos utilizados. 117Tabla 16. Criterios de inclusión y exclusión del ensayo in vivo. 122Tabla 17. Especies bacterianas utilizadas para preparar las curvas estándarpara la cuantificación de los diferentes grupos microbianos.
125
Tabla 18. Primers utilizados en PCR cuantitativa. 127 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 19. Valores medios y desviación estándar de los minerales analizados en los ingredientes de estudio.
135
Tabla 20. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Calcio (10 y 30 mM) en los tres
139
IX
grupos de estudio Tabla 21. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Hierro (50 y 150 µm) en los tres grupos de estudio
140
Tabla 22. Retención, transporte y captación celular de calcio en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).
144
Tabla 23. Retención, transporte y captación celular de hierro en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).
146
Tabla 24. Retención, transporte y captación de cinc en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).
148
Tabla 25. Limites de detección, eficiencias y coeficientes de correlación de las PCR cuantitativas de cada grupo microbiano.
172
Tabla 26. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC).
184‐185
Tabla 27. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC).
197‐198
Tabla 28. Limites de detección, eficiencias y coeficientes de correlación de las PCR cuantitativas de cada grupo microbiano.
206
Tabla 29. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el primer muestreo que corresponde con la edad de dos semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).
210
Tabla 30. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el segundo muestreo que corresponde con la edad de cuatro semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).
212
Tabla 31. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el tercer muestreo que corresponde con la edad de 7‐8 semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).
214
Tabla 32. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el cuarto muestreo que corresponde con la edad de 12 semanas.
215
Tabla 33. Resultados cuantitativos para cada grupo microbiano estudiado sin tener en cuenta la edad de los lactantes
222
X
XI
ABREVIATURAS µg: microgramo
µl: microlitro
µm: micrómetro
µM: micromolar
°C: Grados centígrados
AA: ácido araquidónico
AGCC: ácidos grasos de cadena corta
AGPICL: ácidos grasos poliinsaturados
de cadena larga
ANOVA: análisis de la varianza.
ARNr: ácido ribonucleic
BAMLET: bovine alfa‐lactalbumin with
monomeric oleic acid
BHI: “Brain Heart Infusion”.
BLAST: “Basic Local Alignment Search
Tool”.
CECT: Colección Española de Cultivos
Tipo.
cels: células
CLA: Ácido linoleico conjugado
cm: centímetro
DHA: Ácido docohexaenoico
dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato.
ESPGHAN: European Society for
Pediatric Gastroenterology Hepatology
and Nutrition
ET: eficiencia de transporte.
EC: eficiencia de captación
FC: Fórmula control
FS: Fórmula suplementada
FOS: Fructo‐oligossacárido
g: gramos
GABA: ácido γ-aminobutirico
GOS: galacto‐oligossacáridos
FS: Fórmula suplementada
HAMLET: human alfa‐lactalbumin with
monomeric oleic acid
Nuc: Nucleótidos
LM: Leche materna
mg: miligramos
ml: mililitro
mM: milimolar
MRSC: Medio de Man Rogosa y Sharpe
con 0,25% de L‐cisteína HCl.
NCIMB: “National Collections of
Industrial and Marine Bacteria” (UK).
nm: nanómetros
NUC: preparado de nucleótidos
NUC dig: preparado de nucleótidos
digerido.
NUC 32: preparado de nucleótidos 32
mg/L
NUC 72: preparado de nucleótidos 72
mg/L
PCR: “Polymerase Chain Reaction”
PBS: “Phosphate Buffered Saline”.
p/v: Peso/volumen.
RCA: “Reinforced Clostridial Agar”.
rpm: Revoluciones por minuto.
SCFAs: “Short chain fatty acids”.
XII
SLα: suero lácteo rico en α‐
lactoalbúmina
SLβ: suero lácteo rico en β‐
lactoglobulina
TGI; Tracto Gastrointestinal.
ufc: Unidades formadoras de colonia.
UI: Unidades Internaciones.
v/v: Volumen/ volume
I. Introducción
1
I. INTRODUCCIÓN
La leche humana es el alimento ideal para el crecimiento y desarrollo de los
recién nácidos ya que aporta todos los nutrientes requeridos en unas proporciones
adecuadas, y está adaptada a las condiciones fisiológicas del aparato digestivo del
niño. Además, incrementa la relación afectiva entre la madre y el niño y contiene
compuestos que ejercen un efecto protector regulando el desarrollo del sistema
inmunitario (Alles et al., 2004). De hecho, los niños alimentados con leche materna
sufren menos episodios de infecciones gastrointestinales o respiratorias que los
alimentados con fórmulas infantiles (Pathirage et al., 2009; Lamberti et al., 2011). Sin
embargo la alimentación con leche materna no siempre es posible o deseable y por
eso es necesario desarrollar fórmulas infantiles que sustituyan a la lactancia natural
aportando los nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo óptimo del
lactante.
La composición de los preparados para lactantes ha evolucionado junto con el
conocimiento de la composición de la leche materna. Hoy en día, las empresas y
centros de investigación dedicadas a la preparación de este tipo de alimentos centran
sus esfuerzos en la mejora de la calidad de las fórmulas infantiles, no solo en adecuar
la concentración de macronutrientes y micronutrientes sino también la composición
de compuestos bioactivos. Estos compuestos constituyen un grupo amplio de
moléculas de diferente naturaleza (proteínas, péptidos, hidratos de carbono…) que se
encuentran presentes en la leche materna de forma natural, y que se empiezan a
adicionar como ingredientes, con el objetivo de alcanzar los efectos funcionales que se
producen en los niños alimentados con lactancia natural (Dorca 2008).
El contenido proteico de las fórmulas infantiles ha evolucionado introduciendo
cambios en su cantidad y calidad hasta llegar a ser lo más parecido al contenido
proteico de la leche humana (Lönnerdal, 2003). Se ha visto que el contenido de α‐
lactoalbúmina es mayor en la leche materna que en la de vaca y además se le han
2
atribuido numerosos efectos beneficiosos a esa proteína y a los péptidos que se
originan tras su digestión (Chatterton et al., 2006).
Otros ingredientes bioactivos de la leche materna son los nucleótidos y están
presentes en mayor concentración (aproximadamente 72mg/L) que en la leche de vaca
(Leach et al., 1995). Se ha sugerido que los nucleótidos tienen un papel fundamental
en el desarrollo de la función inmunitaria. Además intervienen en la maduración,
proliferación y activación de linfocitos (células T). También se ha sugerido su papel en
el desarrollo de la microflora intestinal, teniendo un posible efecto en el metabolismo
de las lipoproteínas y reduciendo el número de episodios de diarrea (Yau y col., 2003).
Algunas fórmulas infantiles han incorporado a su composición los ácidos grasos
poliinsaturados de cadena larga araquidónico y docosahexanoico (DHA) en cantidades
similares a las encontradas en la leche materna. La razón por la que se incorporan
estos ingredientes está en que los niños alimentados con fórmulas infantiles, tienen
una cantidad significativamente menor de araquidónico y DHA en plasma y en los
fosfolípidos de la membrana de los eritrocitos, y menos DHA en la corteza cerebral que
los alimentados con leche materna (Martín‐Aragón, 2005).
A pesar de que el desarrollo de fórmulas destinada a la alimentación infantil en
las distintas etapas del primer año de vida ha mejorado considerablemente en las
últimas décadas, todavía no se ha podido obtener un producto similar en su totalidad a
la leche materna, puesto que aunque se aporten componentes en cantidades
semejantes, éstos son utilizados de una forma distinta por el niño.
Respecto a los minerales, se sabe que su biodisponibilidad en la leche materna
es mayor que la en las fórmulas infantiles, y para compensar esas diferencias las
fórmulas son enriquecidas con minerales hasta obtener una concentración superior
que la presente en leche humana (Drago y Valencia 2004). De esta forma se intentan
prevenir los riegos de la deficiencia mineral, ya que una ingesta inadecuada de
minerales puede tener consecuencias inmediatas para la salud del recién nácido pero
también a largo plazo (Frontela et al., 2009a).
I. Introducción
3
Por otro lado, la composición de la microbiota intestinal puede relacionarse
directamente con la salud y enfermedad humana, y los efectos beneficiosos que
produce en el hospedador son los siguientes: mejora la función de la barrera intestinal,
induce función defensiva contra patógenos., refuerza la función inmune, aumenta la
protección en la enfermedad inflamatoria intestinal, regula la autoinmunidad, produce
diferentes metabolitos, reduce la obesidad e influye en la diabetes, e incluso inhibe
ciertos tipos de cáncer (Ha, 2011).
4
II. Objetivos
5
II. OBJETIVOS
1. Objetivo general:
Determinar el efecto sobre la absorción mineral y la microbiota intestinal de
una fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA, en
comparación con una fórmula estándar (sin ingredientes adicionales añadidos), y
observar si dicho efecto es similar al producido por la leche materna.
2. Objetivos específicos:
2.1. Estudiar, utilizando la línea celular Caco‐2, el efecto de los diferentes ingredientes
(suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la biodisponibilidad
mineral (Fe, Ca y Zn) a partir de soluciones patrón de los minerales.
2.2. Evaluar la disponibilidad mineral (Fe, Ca y Zn), determinando la captación,
retención y transporte mineral, de una fórmula infantil suplementada (α‐
lactoalbúmina, nucleótidos y DHA) comparándola con otra fórmula estándar y
tomando como referencia la leche materna.
2.3. Estudiar la influencia de ingredientes los funcionales (suero lácteo rico en α‐
lactoalbúmina, suero lácteo rico en β‐lactoglobulina y nucleótidos) sobre el
crecimiento de cultivos puros de diferentes bacterias intestinales.
2.4. Determinar, in vitro, el efecto de la fórmula suplementada (respecto de la
estándar) y de sus ingredientes sobre la microbiota intestinal, estudiando la
evolución de diferentes poblaciones microbianas de un inóculo fecal.
2.5. Determinar la existencia de posibles diferencias en la composición microbiana de
dos poblaciones de lactantes, alimentados exclusivamente con leche materna, y
procedentes de dos regiones diferentes de España (Asturias y Murcia).
II.Objetivos
6
2.6. Estudiar, in vivo, la evolución de la microbiota intestinal durante 12 semanas, y las
posibles diferencias debidas al tipo de alimentación (fórmula estándar, fórmula
suplementada y leche materna).
III. Revisión Bibliografica
7
1. NUTRICIÓN EN EL LACTANTE
El niño, al nacer, sólo puede alimentarse con leche ya que no ha desarrollado
todavía la capacidad de digerir ciertas proteínas o de soportar cargas osmolares
excesivas a nivel renal (Casado de Frías et al., 1993). El estómago del neonato es
pequeño con una capacidad media de 25‐40 ml en los primeros días, para ir
aumentando progresivamente durante el primer mes de vida. El tránsito
gastrointestinal a esta edad, es rápido variando la evacuación gástrica total entre 2 y 3
horas después de la ingesta.
El intestino del recién nácido es un órgano de nutrición con función de absorción,
de secreción y de motilidad adaptado a la dieta basada en leche materna. Forma
también parte del sistema inmune, ya que contiene elementos humorales y celulares
asociados al tejido linfoide, así como del sistema endocrino secretando hormonas
intestinales y paracrinas que regulan la adaptación intestinal y metabólica a la vida
extrauterina. El intestino también participa en la conservación de la homeostasis,
siendo además hábitat de diversas poblaciones bacterianas (Weaver, 1992).
La primera alimentación con calostro en el recién nácido, estimula el desarrollo
anatómico del intestino y el desarrollo funcional para acomodar el cambio de
alimentación a través del cordón umbilical a alimentación oral. El calostro es rico en
inmunoglobulinas y factores de crecimiento que contribuyen a la defensa
inmunológica y promueve el rápido crecimiento intestinal (Carver y Barness, 1996;
Commare y Tappenden, 2007). La ausencia de calostro en la primera alimentación del
recién nácido dificulta el completo desarrollo del intestino (Commare y Tappenden,
2007).
1.1. Desarrollo y maduración gastrointestinal
El tracto gastrointestinal del recién nácido se desarrolla durante el crecimiento en
distintas fases. La primera es una fase embriológica en la que se forma el tubo
intestinal, posteriormente en una etapa de citodiferenciación se organizan los
III. Revisión Bibliográfica
8
diferentes tipos de células. A continuación se producirá una etapa de crecimiento y
diferenciación intestinal, y finalmente la fase de adaptación enteral que sucede a la de
destete, por la transición de la dieta a base de leche a la dieta sólida (Weaver, 1992).
El completo desarrollo de la función gastrointestinal incluye la maduración
anatómica y la maduración de las funciones secretora, digestiva y de absorción.
La diferenciación anatómica del tracto gastrointestinal ocurre a las 20 semanas de
gestación, sin embargo la función secretora y la de absorción se desarrollarán en fases
posteriores. En el esófago las ondas propulsivas coordinadas no aparecen hasta las 72
horas de vida. El estómago está anatómicamente diferenciado en el momento del
nacimiento aunque la capa muscular es más delgada que en el adulto, y no es hasta el
tercer día cuando la motilidad de las ondas del fundus comienzan a ser eficaces. El
vaciamiento gástrico es lento en las primeras 24 horas de vida, no alcanzándose el
ritmo normal hasta los 8 ó 9 meses de edad. La velocidad de propagación a través del
intestino es lenta en el periodo neonatal con un periodo de tránsito tres veces superior
al adulto siendo, sin embargo, la motilidad del colon similar a la del adulto. Respecto a
las glándulas y órganos hay que destacar que el páncreas y el hígado son
anatómicamente completos desde el momento del nacimiento, mientras que la
vesícula biliar alcanza su madurez posteriormente (Martínez, 2001).
La capacidad funcional de los procesos de digestión y absorción en el recién nácido,
va a depender del desarrollo anatómico del sistema digestivo, de la actividad de las
enzimas de transporte del borde en cepillo, de la actividad de las hormonas digestivas,
de la motricidad intestinal, de la flora bacteriana y del tipo de nutrientes ingeridos
(Chevalier, 1997). La maduración de la función digestiva y de absorción de
carbohidratos, proteínas, grasas, minerales y vitaminas en el recién nácido se
determina en relación a la actividad de las enzimas amilasa, glicosidasa, lactasa,
proteasa y lipasa. Durante el tercer trimestre de gestación, el feto absorbe
activamente nutrientes procedentes del líquido amniótico. Los cambios que se
producen en el desarrollo de la capacidad del transporte de nutrientes después del
nacimiento, están influidos por varios factores como: cambios en la masa intestinal,
III. Revisión Bibliografica
9
propiedades fisicoquímicas de las membranas celulares y de los transportadores que
se expresan así como de sus características cinéticas (Berseth, 2006).
1.2. Digestión y absorción de proteínas
La secreción ácida del estómago está presente desde el nacimiento, pero los
valores de acidez son aproximadamente la mitad que los de un adulto (5,5‐7), mientras
que en niños a partir de seis meses y adultos es de 2‐3 (Hyman et al., 1985). Esta débil
respuesta secretora es paradójica, ya que en sangre se observan valores muy altos de
gastrina (hormona que estimula la secreción de ácido clorhídrico y pepsinógeno), lo
que puede indicar cierta resistencia a la gastrina durante el periodo neonatal. Por otro
lado, la secreción de pepsina es muy baja desde el nacimiento hasta los tres meses y
no alcanza los valores del adulto hasta los 18 meses de vida (Martínez, 2001).
La hidrólisis proteica debe comenzar en el ambiente ácido del estómago
continuando en el intestino debido a la acción de diferentes proteasas. Este ambiente
ácido favorece la ruptura de proteínas y además sirve como barrera para los
microorganismos (Hyman et al., 1985). El menor grado de acidez gástrica en el recién
nácido va a provocar que la pepsina no actúe correctamente produciéndose una
menor digestión proteica (Chevalier, 1997; Martínez, 2001). Esta insuficiente digestión
proteica hace que se favorezca el paso a la circulación de proteínas intactas. Del mismo
modo, la pepsina no actúan sobre la lactoalbúmina y lactoglobulina, por lo que la
menor producción de ácido y pepsinógeno puede ser la causa de que no se inactiven
las inmunoglobulinas y de que los antígenos sean reconocidos en el tubo digestivo del
recién nácido favoreciendo así el desarrollo del sistema inmune (Chevalier, 1997). Esto
sugiere que las proteínas hidrolizadas deberían ser mejor toleradas en los lactantes.
Así lo demuestran diversos estudios que comparan la tolerancia de fórmulas con
proteínas hidrolizadas y con proteínas sin hidrolizar (Mihatsch et al., 2002), sin
embargo, también se ha coprobado que las proteínas de la leche materna son bien
toleradas por los recién nácidos (Schanler, 2001).
III. Revisión Bibliográfica
10
Las proteasas del jugo pancreático tienen poca actividad durante las primeras
semanas, debido a la inmadurez del páncreas (Molina y Maldonado, 1993; Hernández
1999) y a la deficiente secreción de enteroquinasa que está reducida a un 25%
respecto a un adulto (Hernández 1999).
1.3. Digestión y absorción de lípidos
Las lipasas que participan en la digestión de las grasas incluyen la lipasa presente
en la leche humana (ausente en la leche de vaca) que comienza su actividad en el
intestino delgado en presencia de los ácidos biliares, la lipasa lingual que es secretada
por las glándulas en la base de la lengua y está involucrada en la lipólisis gástrica, y
otras lipasas que se producen en el estómago o en el páncreas (Hamosh, 1996). En la
boca del lactante las lipasas salival y lingual inician la digestión de los triglicéridos
ingeridos, actividad que continuará en el estómago. Las demás enzimas lipolíticas
tienen actividad reducida en el recién nácido alcanzando valores iguales a los adultos a
la edad de seis meses (Hernández 1999). La lipólisis gástrica en el lactante representa
el 10‐30 % y puede compensar los bajos niveles de lipasa pancreática que se producen
en el recién nácido (Molina y Maldonado, 1993).
Los ácidos biliares sintetizados en el hígado son claves para la digestión y absorción
de las grasas (Hamosh, 1996). Estos ácidos intervienen en la digestión intraluminal
emulsionando las grasas, favoreciendo así la acción de la lipasa y la solubilización
lipídica. Esta secreción es insuficiente durante las tres primeras semanas de vida
(Martínez, 2001). En el recién nácido existe una inmadurez de esta circulación
enterohepática debido a diversos factores, que tienen como consecuencia que la
digestión de las grasas en el neonato sesa difícil. La absorción intestinal tiene lugar en
todo el intestino delgado (Molina y Maldonado, 1993) y dependerá de la lipólisis, de la
solubilización de los productos generados en la misma y del tipo de leche ingerida
(Chevalier, 1997).
III. Revisión Bibliografica
11
1.4. Digestión y absorción de carbohidratos
La actividad de la enzima α‐amilasa salival, se detecta desde el momento del
nacimiento, sin embargo la actividad de la que es secretada por el páncreas es
prácticamente nula, siendo a los tres años de edad cuando alcanza los valores de un
individuo adulto (Martínez, 2001). Este hecho parece ser debido a que su secreción
está inducida por un sustrato que no aparece todavía en la dieta de los lactantes. Sin
embargo, esto no se convierte en un problema ya que la leche humana y
especialmente el calostro, son ricos en esta enzima y además en el intestino hay
glucoamilasas responsables de la hidrólisis de los polímeros de glucosa (Molina y
Maldonado, 1993; Ros 2009).
El desarrollo de los mecanismos de absorción de carbohidratos ocurre durante el
desarrollo embrionario. Las enzimas lactasa, sacarasa, maltasa, isomaltasa y
glucoamilasa son funcionales ya en el recién nácido, aunque la actividad lactasa está
bastante reducida lo cual permite la utilización de lactosa por las bacterias colónicas.
La microflora intestinal fermenta los hidratos de carbono no absorbidos produciendo
gas y ácidos grasos de cadena corta que son fácilmente absorbidos (Berseth, 2006;
Neu, 2007). La absorción de lactosa es dosis dependiente y si su ingesta es superior a
4,5 g/Kg/día será fermentada en el colon (Chevalier, 1997).
III. Revisión Bibliográfica
12
2. LACTANCIA ARTIFICIAL. FÓRMULAS INFANTILES
La leche humana proporciona al lactante todos los nutrientes necesarios en
proporciones equilibradas para su rápido y completo crecimiento y desarrollo.
Inicialmente, las fórmulas infantiles se desarrollaron para alimentar a los recién
nácidos cuyas madres no podían dar leche materna o elegían no darla, diseñándose
para asemejarse lo más posible a la leche humana y producir así respuestas fisiológicas
parecidas a las de los niños alimentados con lactancia materna (Lien, 2003).
El primer año de vida es una etapa caracterizada por un continuo crecimiento y
desarrollo del individuo por lo que los requerimientos nutricionales van a ser muy
elevados. Estos requerimientos se pueden determinar por el método observacional
tomando como referencia los niños alimentados con leche materna. El problema
principal es que la leche materna no es un alimento estático, sino que va cambiando
con el tiempo (Trabazo, 2005).
2.1. Antecedentes históricos
Ya en tiempos bíblicos la leche materna era considerada el mejor alimento para
el recién nácido. Sin embargo, las madres han necesitado en ocasiones buscar
alternativas para sus hijos ya que, en ocasiones, por cuestiones de salud u otras
circunstancias no es posible alimentar a los recién nácidos con leche materna (Barness,
1987).
Históricamente, se han considerado la leche de diferentes animales (cabra,
burra y vaca) como sustitutivas a la leche materna, pero fue la leche de vaca la que
prosperó como base de la actual lactancia artificial. Se analizó la composición de la
leche materna y se intentó adaptar la leche de vaca para que su composición fuera lo
más parecida posible a la materna. Las primeras adaptaciones fueron encaminadas a
diluir la leche de vaca para disminuir el contenido proteico y de electrolitos, aunque se
observó que el contenido graso se reducía demasiado (Paricio y Hernández, 2009).
III. Revisión Bibliografica
13
En 1952 aparecen las primeras leches en polvo para lactantes y ya en 1961, se
fijó una composición determinada para éstas: 3 g de proteínas y 1,5 g de lípidos por
cada 100 ml de leche. A comienzos de los años setenta se observó que esta
composición contenía un exceso de proteínas y sodio, lo que suponía una carga renal
alta para el recién nácido cuyo riñón no ha madurado completamente (Chevalier,
1997).
Posteriormente, aparecieron en el mercado leches industriales siguiendo unas
reglas nutricionales, a las que se les llamó “leches maternizadas”. En 1976 se reguló la
composición de leches para lactantes y a partir de este año se crearon leches
especiales para determinadas circunstancias fisiológicas. En 1993 se comienzan a
enriquecer con vitamina D y al año siguiente se publica la Reglamentación europea en
relación a la composición de estos alimentos (Chevalier, 1997).
En los últimos cincuenta años se han realizado numerosos cambios en el diseño
de fórmulas infantiles, lo que ha conducido a la mejora de estos productos. A
mediados del siglo XX las fórmulas infantiles estaban basadas en leche de vaca
exclusivamente (Carver, 2003), y actualmente, aunque la composición de estas
fórmulas no ha cambiado mucho cuantitativamente, ciertos cambios cualitativos han
hecho posible que se asemejen cada vez más a la leche materna (Heird, 2007). Hoy en
día existen, además, diversas alternativas para las necesidades especiales de cada
lactante, como fórmulas de soja, sin lactosa, con compuestos funcionales añadidos,
etc. Las fórmulas infantiles continúan desarrollándose para que los efectos que
producen en el lactante sean lo más parecido posible a los conferidos por la leche
materna (Carver, 2003).
La Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica en 2005
publicó los estándares para fórmulas infantiles, donde se refleja el nivel mínimo de
cada componente para que el desarrollo anatómico y funcional del niño sea el
correcto. Además, incluye también los niveles máximos permitidos con el fin de evitar
un exceso de nutrientes que puedan producir un efecto tóxico debido a la capacidad
III. Revisión Bibliográfica
14
limitada de los neonatos para digerir, absorber, procesar, regular y excretar ciertos
compuestos (Vásquez y Romero, 2008).
2.2. Normativa actual
El Real Decreto 867/2008 del 23 de mayo, define los preparados para lactantes
como los productos alimenticios destinados a la alimentación especial de los lactantes
durante los primeros meses de vida, que satisfagan por sí mismos las necesidades
nutritivas de estos lactantes hasta la introducción de una alimentación
complementaria apropiada. Además, en el artículo 10 del mismo, se expone la
información que debe aportarse a las mujeres embarazadas o madres lactantes sobre
la superioridad de la lactancia materna sobre las fórmulas infantiles. En la Tabla 1 se
resumen los requisitos que deben cumplir los preparados para lactantes según dicho
Real Decreto, y a continuación se especifican las cantidades a añadir de algunos
ingredientes cuya adición está permitida:
‐ Fructooligosacáridos y galacooligosacáridos: no deben superar los 0,8 g/100
ml de fórmula (90% oligogalactosil lactosa y 10% oligofructosil sacarosa).
‐ Respecto a los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPCL, 20‐22
átomos de carbono), su contenido no debe superar el 1% del contenido total graso
para AGPCL n‐3 ni el 2% del contenido total graso para AGPCL n‐6. El contenido en
ácido eicosapentaenoico (EPA) no debe ser superior al de docosahexaenoico (DHA) y el
contenido de este último no debe ser superior al de los AGPCL n‐6.
‐ Nucleótidos: su concentración total no será superior a 5 mg/100 Kcal y se
pueden añadir las siguientes cantidades como máximo (mg/100 Kcal): citidina 5’‐
monofosfato: 2,50; uridina 5’‐monofosfato: 1,75; adenosina 5’‐monofosfato: 1,50;
guanosina 5’‐monofosfato: 0,5; inosina 5’‐monofosfato: 1,00.
III. Revisión Bibliografica
15
Tabla 1: Composición de los preparados para lactantes según legislación (R.D. 867/2008)
Componentes Unidades Mínimo MáximoEnergía Kcal /100 ml 60 70 Proteínas Leche de vaca g /100 Kcal 1,8 3 Hidrolizados proteínas g /100 Kcal 1,8 3 Aislados proteína de soja g /100 Kcal 2,25 3 Lípidos Grasa total g /100 Kcal 4,4 6 Ácido linoleico g /100 Kcal 0,3 1,2 Ácido α‐linolénico g /100 Kcal 50 ‐ Linolénico/ α‐linolénico 5 15 Ácidos Laúrico + Mirístico % mat. grasa NS 20 Fosfolípidos g/l 2 Carbohidratos ‐Carbohidratos totales g /100 Kcal 9 14 Lactosa g /100 Kcal 4,5 ‐ Sacarosa < % CHT ‐ 20 Almidón g /100 ml (< % CHT) ‐ 2 (30) Vitaminas Vitamina A μg RE/100 Kcal 60 180 Vitamina D3 μg /100 Kcal 1 2,5 Vitamina E mg α‐TE /100 Kcal 0,5 5 Vitamina K μg /100 Kcal 4 25 Tiamina μg /100 Kcal 60 300 Riboflavina μg /100 Kcal 80 400 Niacina μg /100 Kcal 300 1500 Vitamina B6 μg /100 Kcal 35 175 Vitamina B12 μg /100 Kcal 0,1 0,5 Ácido Pantoténico μg /100 Kcal 400 2000 Ácido fólico μg /100 Kcal 10 50 Biotina μg /100 Kcal 1,5 7,5 Minerales y Elementos traza Hierro (proteínas de vaca e hidrolizados) mg /100 Kcal 0,3 1,3 Hierro (aislados proteínas de soja) mg /100 Kcal 0,45 2 Calcio mg /100 Kcal 50 140 Fósforo (proteínas de vaca e hidrolizados) mg /100 Kcal 25 90 Fósforo (aislados proteínas de soja) mg /100 Kcal 30 100 Calcio/Fósforo 1:1 2:1 Magnesio mg /100 Kcal 5 15 Sodio mg /100 Kcal 20 60 Cloro mg /100 Kcal 50 160 Potasio mg /100 Kcal 60 160 Manganeso μg /100 Kcal 1 100 Fluor μg /100 Kcal NS 100 Yodo μg /100 Kcal 10 50 Selenio μg /100 Kcal 1 9 Cobre μg /100 Kcal 35 100 Cinc mg/100 Kcal 0,5 1,5 Otras sustancias Colina mg /100 Kcal 7 50 Inositol mg /100 Kcal 4 40 L‐Carnitina mg /100 Kcal 1,2 NS Taurina mg /100 Kcal ‐ 12
III. Revisión Bibliográfica
16
2.3. Ingredientes funcionales y tendencias actuales en la elaboración de fórmulas infantiles
La Sociedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica y
la Federación Internacional de Sociedades en Pediatría, Gastroenterología,
Hepatología y Nutrición se unieron en el año 2005 con expertos altamente cualificados
en el área de nutrición infantil, para formar un grupo internacional de expertos y
definir las necesidades nutricionales en la infancia. Los datos de la composición de la
leche materna, de mujeres bien nutridas, proporcionan una guía para establecer la
composición de fórmulas infantiles. Sin embargo estos valores no deben ser tomados
en sentido estricto ya que la composición de la leche materna varía entre individuos y
con la etapa de lactación, habiendo además considerables diferencias en la
biodisponibilidad y efecto metabólico de nutrientes similares a la leche humana y
añadidos a las fórmulas infantiles. Por lo tanto una composición adecuada para una
fórmula infantil se conseguirá comparando los efectos fisiológicos (patrón de
crecimiento) bioquímicos (marcadores plasmáticos) y funcionales (respuesta inmune)
de la leche materna. Este grupo internacional de expertos concluye que la fórmula
infantil sólo debe contener ingredientes en las cantidades que sirvan para un propósito
nutricional o que aporten un beneficio (Koletzko et al., 2005).
Las últimas investigaciones en el diseño de fórmulas infantiles van encaminadas a
imitar en todo lo posible a la leche materna. No sólo han de aportar los nutrientes
necesarios para un óptimo crecimiento del lactante sino que deben ejercer, en la
medida de lo posible, los mismos efectos fisiológicos que la leche materna. Cada vez
que se identifican nuevos compuestos en la leche de mujer cambian las
recomendaciones para las fórmulas de inicio. Esto hace que las fórmulas infantiles
estén en una continua evolución, habiéndose realizado los siguientes avances:
reducción del contenido proteico y fósforo, adición de taurina, carnitina, nucleótidos,
ácidos grasos de cadena larga y oligosacáridos (Dorca 2008).
Los oligosacáridos están presentes en la leche humana en una concentración de 10
g/L y aparecen como moléculas libres o conjugadas (glicoproteínas, glicolípidos etc.).
Los monómeros de estas moléculas son D‐glucosa, D‐galactosa N‐acetilglucosamina, L‐
III. Revisión Bibliografica
17
fucosa y ácido siálico (Boehm y Moro, 2008). Los oligosacáridos de la leche materna
producen efectos beneficiosos en los lactantes debido a que poseen actividad
prebiótica, propiedades antiadhesivas que confieren protección al epitelio intestinal
frente al ataque de patógenos y pueden tener además una interacción con el sistema
inmune (Espinosa Tamez y Prieto, 2007).
En relación al contenido en ácidos grasos, el DHA y el ácido araquidónico (AA)
se pueden obtener directamente de la dieta, o bien por conversión endógena a partir
de sus precursores: el ácido linolénico y el ácido linoleico, respectivamente. El feto y el
recién nácido son capaces de llevar a cabo estos procesos de conversión; no obstante
son insuficientes para cubrir la alta demanda de ácidos grasos poliinsaturados de
cadena larga (AGPICL) (Lauritzen et al., 2001). Esto quiere decir, que durante las
primeras etapas de desarrollo, estos ácidos grasos serán dependientes de la ingesta de
DHA y AA en la dieta (Hornstra, 2000). La leche materna contiene AGPICL pero su
cantidad varía con la dieta de la madre, sin embargo las fórmulas infantiles no han sido
enriquecidas con estos compuestos hasta los últimos años. Estos ácidos grasos van a
jugar un papel importante en el crecimiento y desarrollo del recién nácido. Se sabe que
la deficiencia de AGPICL conduce a un retraso del crecimiento, siendo abundante su
contenido en cerebro y retina. Así se piensa que pueden tener un efecto positivo en la
función cerebral y desarrollo visual (Lauritzen et al., 2001). La suplementación de
fórmulas infantiles con DHA surgió de la observación de que los niños alimentados con
leche materna obtenían mejores resultados en el desarrollo que los alimentados con
fórmula infantil, atribuyéndose este efecto a los AGPICL. Sin embargo, Hadders, (2005)
revisó 20 estudios en los que se administraba AGPICL, normalmente DHA y AA, a recién
nácidos y observó que solo tres de estos estudios obtenían efectos positivos, uno
sobre el desarrollo cerebral y dos sobre el desarrollo visual. Este autor concluyó que en
los demás estudios no se encontraron efectos positivos debido a la edad de los
lactantes a los que se les realizó el ensayo, ya que suele ser necesario un largo periodo
de observación para obtener resultados favorables.
Las poliaminas (putrescina, espermidina y espermina) son compuestos alifáticos
presentes en la leche materna y prácticamente ausentes en la leche de vaca y, como
III. Revisión Bibliográfica
18
consecuencia, en las fórmulas infantiles. Estos compuestos han sido relacionados con
la maduración y desarrollo intestinal y con la actividad del sistema inmune (Sabater‐
Molina et al., 2009). A pesar de este hecho, las poliaminas todavía no se añaden a los
preparados para lactantes siendo necesarios más estudios.
En la revisión de la presente tesis nos centramos en los componentes proteicos
concretamente en la α‐lactoalbúmina y en los nucleótidos como compuestos
nitrogenados no proteicos ya que han sido los ingredientes objeto de las
investigaciones en este trabajo.
2.4. Componentes proteicos en fórmulas infantiles.
Una de las principales diferencias entre la leche de vaca y la leche humana es el
contenido y composición proteica. La leche humana aporta 14‐16 g de proteínas /L
durante los primeros días de lactación, 8‐10 g /L a los 3‐4 meses, y de 7 a 8 g/L a partir
del sexto mes (Lönnerdal, 2003), mientras que la leche de vaca contiene 32 g/L de
proteínas (Haug, et al., 2007). Casi todas las proteínas de la leche, a excepción de la
albúmina, son sintetizadas en la glándula mamaria. La concentración de estos
nutrientes en la leche humana es menor que en otras especies, por lo que los primeros
intentos para adaptar la leche de vaca al consumo de los neonatos se centraron en
diluirla (Heine, Klein y Reeds 1991) para reducir la cantidad de proteínas y minerales y
así disminuir la carga renal de solutos, lo cual constituía un factor limitante en la
alimentación del niño debido a la inmadurez de estos órganos (Rees, 2005).
Posteriormente, los estudios se centraron en el predominio de proteínas del
lactosuero en la leche materna en relación a las fórmulas infantiles, realizándose
intentos importantes para la adecuación de las fórmulas infantiles mediante la adición
de proteínas del lactosuero de origen bovino. En la mujer, la concentración de
proteínas del lactosuero es muy elevada en los primeros días de la lactación mientras
que la concentración de caseína es casi inapreciable. Con el avance de la lactación,
aumenta la síntesis de caseína, aumenta el volumen de leche producido por la glándula
mamaria disminuyendo la concentración total de proteínas del lactosuero. Por lo tanto
III. Revisión Bibliografica
19
se sabe que no existe una relación fija de proteínas del lactosuero con respecto a la
caseína en la leche humana sino que ésta varía a lo largo de la lactación adecuándose a
las necesidades del niño. El cociente proteínas del lactosuero:caseína más
frecuentemente citado en las referencias bibliográficas, es de 60:40, el cual es una
aproximación media, ya que hay que tener en cuenta que éste cambia desde 80:20 en
las primeras etapas de lactación hasta 50:50 al final de la misma (Lönnerdal, 2003). La
primera fórmula rica en proteínas del lactosuero se desarrolló en 1961 y se caracterizó
por su menor contenido proteico y mineral, por lo que también disminuían la carga
renal en el recién nácido. Aún así, la proporción de las proteínas del suero en estas
fórmulas seguía difiriendo de la que presenta la leche materna (Lien, 2003).
Otro factor a tener en cuenta en el diseño de fórmulas infantiles, es la diferente
composición de las proteínas del lactosuero de la leche bovina en relación a la
humana, incluso su composición aminoacídica. Este hecho parece ser crucial, ya que
supone un factor limitante en la nutrición de los neonatos debido a su rápido
crecimiento y a los procesos de maduración que se producen en esta etapa de la vida.
Algunas de las rutas de síntesis de aminoácidos no están desarrolladas completamente
en el recién nácido y además pueden tener una capacidad limitada temporalmente
para el catabolismo de los aminoácidos. Como consecuencia, los neonatos pueden
encontrarse en riesgo de deficiencia de algunos de estos aminoácidos esenciales, con
una sensibilidad particular a un exceso de aminoácidos.
Los aminoácidos que son esenciales para el lactante se establecieron teniendo
en cuenta el perfil aminoacídico de la leche materna. En este sentido, la concentración
de triptófano y cisteína es la mitad en la leche de vaca que en la humana cuando se
expresa como porcentaje de proteína total (Heine, Klein y Reeds 1991). El triptófano es
precursor de la serotonina y melatonina, neurotransmisores que regulan el apetito, el
humor, la percepción del dolor y el patrón de sueño (Yogman, 1982; Heine, Klein y
Reeds 1991). Para que el triptófano pueda ser captado por el cerebro, es necesario
que exista un equilibrio adecuado entre este aminoácido y otros aminoácidos neutros
como la leucina, isoleucina, valina, tirosina y fenilalanina, puesto que existe un solo
transportador que los conduzca desde la circulación periférica hasta el cerebro. Por
III. Revisión Bibliográfica
20
otro lado, la cisteína es un precursor del glutatión (sistema antioxidante) y de la
taurina, aminoácido que juega un papel importante en el desarrollo del cerebro (Lo,
1996).
En este sentido, la suplementación de las fórmulas con triptófano o cisteína
(como aminoácidos libres) no parece ser una manera efectiva de resolver estos
problemas, debido fundamentalmente a las dudas planteadas sobre la estabilidad de
estos aminoácidos añadidos a los alimentos como suplemento, y a que la absorción en
el organismo de aminoácidos libres o de di y tripéptidos como suplementos de la dieta,
puede ser demasiado rápida. Los aminoácidos libres requieren para su absorción un
sistema de transporte dependiente de sodio, mientras que los dipéptidos y tripéptidos
(principales productos de la digestión proteica intestinal) son absorbidos directamente
(Wenzel et al., 2001). Es importante tener en cuenta que, es posible que no sean
utilizados de forma eficiente para la síntesis de proteínas porque son absorbidos antes
que otros aminoácidos que constituyen la dieta. Además, la leche humana contiene
sólo un 5% de aminoácidos libres, principalmente ácido glutámico y taurina (Davies et
al., 2008).
Por otra parte, las concentraciones de metionina, lisina, fenilalanina y tirosina
son mayores en la leche de vaca que en la de mujer. La fracción del lactosuero de la
leche de vaca contiene mayores concentraciones de treonina, lisina, metionina e
isoleucina que la leche humana. Estos excesos también se reflejan en el patrón de
aminoácidos en plasma de los niños alimentados con fórmulas infantiles. Además, éste
patrón puede verse afectado por los cambios que se producen en la biodisponibilidad
de los aminoácidos debidos a los procesos tecnológicos utilizados en fabricación de las
fórmulas. Para compensar estas diferencias en la concentración de aminoácidos con la
leche materna, se aumentó el contenido proteico de las fórmulas con la intención de
cubrir los requerimientos de ingesta de aminoácidos (Rudolff, 1997). Sin embargo, en
varios estudios realizados con posteridad, se comprobó que el contenido de triptófano
en el plasma de niños alimentados con dichas fórmulas era menor que el de los
alimentados mediante lactancia natural (Hanning, et al., 1992; Fazzolari‐Nesci et al.,
III. Revisión Bibliografica
21
1992). Estas diferencias podemos eliminarlas introduciendo compuestos ricos en
triptófano como la α‐lactoalbúmina.
Así, el aumento del aporte de proteína en las fórmulas elaboradas a base de
leche de vaca, resultó en una elevación de los niveles de valina, fenilalanina y
metionina en plasma del lactante. Además, se ha observado que si se suplementan las
fórmulas con lactosuero de vaca, se produce un aumento en plasma de las
concentraciones de treonina, lisina leucina e isoleucina, incrementándose también el
nitrógeno ureico en plasma, lo cual indica que algún aminoácido de la dieta está en
exceso y se está catabolizando. Por el contrario, si disminuimos la cantidad de proteína
en las fórmulas, descienden los niveles de triptófano y taurina o cisteína. Las
consecuencias derivadas de estos desequilibrios no son conocidas hasta el momento y
probablemente varíen de un niño a otro (Heine, Klein y Reeds 1991).
Por todo ello, es necesaria más investigación en la búsqueda de métodos
adecuados para que los aminoácidos aportados por las fórmulas infantiles
proporcionen un patrón de aminoácidos en el lactante lo más parecido posible al que
obtienen los lactantes alimentados con leche materna, este objetivo se torna difícil de
conseguir cuando se parte de las proteínas de la leche de vaca. Uno de los principales
inconvenientes se debe a que la principal proteína del lactosuero bovino es la β‐
lactoglobulina (una proteína ausente en el lactosuero de la leche de mujer); siendo la
α‐lactoalbúmina, la principal proteína del lactosuero de la leche humana. Una de las
propuestas tecnológicas para mantener la calidad biológica de la proteína, se basa en
asegurar un buen aporte de triptófano y reducir el contenido de proteínas mediante el
enriquecimiento de la fórmula con alguna proteína rica en dicho aminoácido, como la
α‐lactoalbúmina (Lönnerdal, 2003).
3. α‐LACTOALBÚMINA
La proteína α‐lactoalbúmina se encuentra en la leche de vaca en una
concentración de 1 a 1,5 g/L (Figura 1), siendo aproximadamente el 3,4% de las
proteínas totales y el 20% de las proteínas del lactosuero (Swaisgood, 1995; Chatterton
III. Revisión Bibliográfica
22
et al., 2006). La α‐lactoalbúmina es en la leche humana la principal proteína del
lactosuero, aumentando su proporción desde un 21% hasta un 34% del día 1 al 14 de
la lactación. En la leche madura después del día 30, alcanza una concentración de 2,44
g/L (Jackson et al., 2004; Chatterton et al., 2006)
Figura 1. Concentración de α‐lactoalbúmina en leche de vaca, fórmulas estándar, fórmulas ricas en lactoalbúmina y en leche materna (Jackson et al., 2002; Lien, 2003).
3.1. Funciones de la proteína α‐lactoalbúmina
La proteína α‐lactoalbúmina posee una función bioquímica por su participación
en reacciones enzimáticas, y una función nutricional ya que forma parte de la
composición de la leche materna (Figura 2).
La función bioquímica de esta proteína en las células de la glándula mamaria es
de vital importancia en la lactogénesis ya que, junto a la galactosil‐transferasa forma el
complejo enzimático lactosa‐sintasa, que cataliza la síntesis de lactosa a partir de
glucosa y galactosa (Brodbeck et al., 1967; Permyakov et al., 1991; Lien, 2003). En
concreto, la α‐lactoalbúmina confiere a la galactosiltransferasa un incremento en la
afinidad por la glucosa (Hill y Brew, 1975; Musci y Berliner, 1985), en contraposición a
la formación de otros disacáridos que pueden ser sintetizados también por esta
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Leche bovina Fórmulas estándar
Fórmulas enriquecidas
Leche humana
α‐lactoalbúm
ina (g/L)
III. Revisión Bibliografica
23
enzima. La asociación de la proteína y la galactosiltransferasa en la superficie interna
del aparato de Golgi está catalizada por ciertos iones como el manganeso, cinc, cobalto
y calcio y la uridin difosfato galactosa.
Figura 2. Función bioquímica y nutricional de la α‐lactoalbúmina, (adaptada de Lien, 2003)
Por otro lado, una vez que se completa la síntesis de lactosa, la α‐lactoalbúmina
se disocia de la galactosiltransferasa (cuya unión es relativamente débil) y junto a otros
componentes de la leche es transportado a la superficie apical de las células de la
glándula mamaria, siendo descargada al lumen alveolar. La proteína es secretada a la
leche siendo una importante fuente de aminoácidos para el lactante, cumpliendo su
función nutricional (Lien, 2003). Su elevado contenido en aminoácidos esenciales (63%
del total), particularmente triptófano (5,9% del total de los aminoácidos), cisteína y
lisina, le confiere un importante valor nutricional para el lactante (Rees, 2005).
3.2. Estructura de la proteína α‐lactoalbúmina
La estructura completa de la α‐lactoalbúmina bovina y humana fueron
inicialmente definidas por Brew et al., (1970) y Findlay y Brew (1972),
respectivamente. Puesto que la función es semejante en ambas especies, sus
estructuras son muy similares. Ambas están formadas por una cadena de 123
aminoácidos con un 72% de homología en la secuencia. Esta estructura tan parecida
minimiza la posibilidad de que la α‐lactoalbúmina bovina tenga propiedades
Galactosiltransferasa
Función Bioquímica
Función Nutricional
α‐Lactoalbúmina
LactosaGalactosa+ Glucosa
Proteínas del lactosuero
III. Revisión Bibliográfica
24
antigénicas para el niño recién nácido, si la comparamos con otras proteínas lácteas
como la β‐lactoglobulina. En la Figura 3 se presenta la secuencia completa de la
proteína bovina.
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la α‐lactoalbúmina bovina.
Su estructura y su secuencia tienen cierta semejanza con la lisozima, enzima
presente en algunas secreciones corporales, aunque aparentemente no tienen relación
sus propiedades funcionales (Campbell, et al., 2006). La estructura nativa de la α‐
lactoalbúmina posee dos dominios; uno formado por una gran α hélice y otro por una
pequeña lámina β, estos se unen por un puente de cisteína entre los residuos 73 y 91
que forman el sitio de unión del calcio (Figura 4). Otro puente disulfuro conecta los dos
dominios en los residuos 61‐77 y toda la estructura es estabilizada por cuatro puentes
disulfuro (Permyakov y Berliner, 2000).
La α‐lactoalbúmina posee un sitio de fuerte unión al calcio, y esta unión va a
influir directamente en su estabilidad, aunque no es esencial para su actividad dentro
del complejo lactosa sintasa. Recientemente, se ha encontrado un sitio secundario de
unión al calcio en el que están implicados cuatro cationes Ca2+. La unión de calcio
produce cambios en la función y estructura terciaria de la proteína (Anderson, Brooks
y Berliner 1997). Además del calcio se pueden unir otros cationes como Mg2+, Mn2+, K+
Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-(Arg)-Glu-Leu-Lys-Asp-Leu-Lys-Gly-Tyr-Gly-Gly-(Val) Variante A
Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Trp-Val-Cys-Thr-Thr-Phe-His-Thr-Ser-Gly-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ala-
Ile-Val-Glu-Asn-Asn-Gln-Ser -Thr –Asp-Tyr-Gly-Leu-Phe-Gln-Ile-Asn-Asn-lys-ile-Trp-
Cys-Lys-Asn-Asp-Gln-Asp-Pro-His-Ser-Ser-Asn-Ile-Cys-Asn-Ile-Ser-Cys-Asp-Lys-Phe-
Leu-Asn-Asn-Asp-Leu-Thr-Asn-Asn-Ile-Met-Cys-Val-Lys-Lys-Ile-Leu-Asp-Lys-Val-Gly-
Ile-Asn-Tyr-Trp-Leu-Ala His-Lys-Ala-Leu-Cys-Ser-Glu-Lys-Leu-Asp-Gln-Trp-Leu-Cys-
Glu-Lys Leu
10
30
50
70
90
110
21
1
41
61
121
111
81
H.
.OH
III. Revisión Bibliografica
25
y Na+, que compiten por el sitio de unión con el calcio y cuando se unen a la proteína
producen cambios similares. La unión fuerte de calcio va a aumentar la estabilidad de
la proteína, y lo mismo ocurre con la unión de los otros cationes excepto el cinc que
posee varios sitios de unión en la proteína, y que disminuye la estabilidad térmica de la
α‐lactoalbúmina causando agregación y aumentando la susceptibilidad de digestión
por proteasas (Permyakov et al., 1991; Permyakov y Berliner, 2000). Esta proteína
también puede interaccionar con varios grupos orgánicos de bajo peso molecular.
Figura 4. Estructura de la α‐lactoalbúmina humana. La lámina β (verde) y los dominios α (azul y rojo) (Rösne y Redfield, 2009).
El enriquecimiento de las fórmulas infantiles con α‐lactoalbúmina permite
diseñar un producto con una composición proteica y aminoacídica más similar a la
leche humana, hecho que tiene una gran importancia en nutrición infantil, ya que la
amplia gama de proteínas que posee la leche materna la convierte en una fuente
idónea de aminoácidos y de actividad biológica beneficiosa para el recién nácido,
principalmente por su acción inmunoestimuladora y antimicrobiana (Chowanadisai et
al., 2005).
3.3. Bioactividad de la α‐lactoalbúmina
Los efectos sobre la salud que produce la α‐lactoalbúmina pueden dividirse en
tres grupos; aquellos relacionados con la proteína intacta, los producidos por los
III. Revisión Bibliográfica
26
péptidos obtenidos tras la hidrólisis parcial de la proteína, y por último los que
producen los aminoácidos libres que resultan de la digestión completa de dicha
proteína (Chatterton et al., 2006). La mayoría de las investigaciones se centran en este
último punto debido a que la α‐lactoalbúmina es particularmente rica en aminoácidos
esenciales; sin embargo, se debe destacar que existen otras funciones biológicas que
también derivan de la ingesta de α‐lactoalbúmina.
El hecho de que la proteína α‐lactoalbúmina de origen bovino sea realmente
digerida de forma efectiva por el neonato, ha sido cuestionado desde los años 80
(Janas et al., 1987) en los que se realizaron ensayos de digestibilidad in vitro con
proteínas puras; sin embargo, dichos estudios actualmente están poco valorados. En
este sentido, siguen faltando datos concluyentes procedentes de ensayos realizados
con mezclas proteicas, aunque de lo observado hasta ahora parece deducirse que la
digestibilidad de la α‐lactoalbúmina es tan alta como la de la caseína y superior a la de
la β‐lactoglobulina. Estas conclusiones son de gran importancia debido a la relación
que existe entre la antigenicidad de las proteínas y su tamaño tras la digestión.
Aunque, como ya se ha expuesto anteriormente, la estructura primaria de la α‐
lactoalbúmina bovina y humana es similar, actualmente se desconoce si se forman los
mismos péptidos antimicrobianos durante la digestión in vivo. Además, es importante
tener en cuenta que los procesos de purificación de esta proteína del lactosuero son
cruciales para mantener su estructura y su bioactividad. El tratamiento térmico altera
el patrón de uniones disulfuro entre proteínas y/o causa uniones cruzadas
intermoleculares. La α‐lactoalbúmina, sola o en presencia de otras proteínas del
lactosuero, induce la formación de uniones intermoleculares por puentes disulfuro
entre la proteína en sí, entre la α‐lactoalbúmina y la β‐lactoglobulina, o entre la α‐
lactoalbúmina y la albúmina sérica bovina, este hecho impediría la liberación de los
péptidos bioactivos con acción antimicrobiana.
III. Revisión Bibliografica
27
3.3.1. Importancia nutricional
El triptófano, es un aminoácido precursor de la serotonina cerebral y de la
melatonina. Ambos compuestos regulan una gran cantidad de reacciones como el
apetito, y la saciedad, la percepción del dolor, la depresión y el ritmo del sueño. En un
estudio realizado en adultos, Markus et al., (2000) compararon el efecto de la ingesta
de α‐lactoalbúmina y a la caseína sobre la respuesta al estrés, comprobando que entre
los individuos susceptibles al estrés, aquellos que habían tomado α‐lactoalbúmina
mostraban menos episodios de depresión que los que ingerían caseína, asociando este
hecho a un aumento de la concentración de triptófano en plasma. En un estudio
posterior Markus et al., (2002) ratificaron el aumento de triptófano en plasma tras el
consumo de una dieta rica en α‐lactoalbúmina respecto a la dieta control,
observándose en pacientes vulnerables al estrés un incremento en el triptófano y la
actividad de serotonina cerebral y por lo tanto una mejor función cognitiva
Los efectos beneficiosos de las fórmulas infantiles con concentraciones
aumentadas en α‐lactoalbúmina fueron mostrados por Heine, Klein y Reeds (1991) en
un estudio en el que una fórmula estándar rica en proteína (18 g/L) y baja en α‐
lactoalbúmina era comparada con otras dos fórmulas bajas en proteínas (13 g/L), y con
una concentración intermedia y alta de α‐lactoalbúmina. Sólo los recién nácidos que
recibían la fórmula con alta concentración de α‐lactoalbúmina mostraron una
concentración de triptófano sérico tan alto como los alimentados con leche humana.
Este estudio demostró que el desarrollo de fórmulas infantiles bajas en proteínas pero
enriquecidas con α‐lactoalbúmina, supone un importante avance en la creación de
fórmulas infantiles más parecidas en composición a la leche humana.
Sandström et al., (2008) realizaron un estudio en recién nácidos sanos
comparando un grupo alimentado con lactancia natural con otro alimentado con una
fórmula estándar a base de proteínas del lactosuero, y otras dos fórmulas ricas en α‐
lactoalbúmina (25%) con diferentes concentraciones de glicomacropéptidos (15% y
10% respectivamente). En dicho estudio, todas las fórmulas tenían la misma cantidad
III. Revisión Bibliográfica
28
de proteína; sin embargo, la fórmula con 25% de α‐lactoalbúmina contenían un 20%
más de triptófano que la leche materna o la fórmula estándar. Dicha fórmula dió lugar
a una concentración plasmática del aminoácido similar al obtenido en los niños
alimentados con leche materna. El nitrógeno ureico en sangre fue significativamente
mayor en todos los niños alimentados con fórmula en relación a los niños alimentados
con leche materna, y puesto que el crecimiento fue óptimo, estos autores propusieron
disminuir la cantidad total de proteína, siempre que ésta sea de alta calidad, ya que
elevados niveles de proteína pueden suponer una elevada carga renal. En este sentido
Lien, Davis y Euler (2004), llevaron a cabo un estudio en el que evaluaron una fórmula
con menor contenido proteico y enriquecida con α‐lactoalbúmina, observado un
patrón de crecimiento similar en los niños alimentados con la fórmula experimental y
con la fórmula control.
Son varios los estudios que profundizan en el efecto de las fórmulas infantiles
enriquecidas con α‐lactoalbúmina sobre el crecimiento de los lactantes y en todos los
casos los resultados obtenidos demuestran un patrón de crecimiento más parecido al
de los lactantes alimentados con leche materna que aquellos niños que son
alimentados con fórmulas estándar (Rochat et al., 2007; Sandström et al., 2008;
Trabulsi et al., 2011).
3.3.2. Absorción de minerales
La unión de minerales a péptidos procedentes de las proteínas del lactosuero es
menor y menos específica que la unión a péptidos originarios de la caseína, ya que
tienen cargas negativas que unen eficientemente cationes divalentes (Fe, Mg, Mn, Cu y
Se). Sin embargo los péptidos que se producen mediante hidrólisis in vitro o in vivo de
la proteína α‐lactoalbúmina, atrapan los minerales que se unen a sitios específicos y no
específicos. Por lo tanto esos péptidos pueden actuar de transportadores de varios
minerales aumentando o disminuyendo su biodisponibilidad (Kamau et al., 2010).
III. Revisión Bibliografica
29
En un estudio realizado en monos Rhesus, Kelleher et al., (2003) observaron
que las fórmulas adicionadas con α‐lactoalbúmina producen un aumento en la
absorción de cinc con respecto a los animales alimentados con leche materna. Estas
diferencias podrían estar relacionadas con cierta actividad temporal de esta proteína
que provocaría un aumento del cinc plasmático, lo cual debe ser estudiado en
profundidad, ya que no es recomendable un aumento excesivo del mineral en plasma
debido a que parece interferir con la función inmune. Por lo tanto, es posible que la α‐
lactoalbúmina mejore la absorción mineral, ya que cuando se produce la digestión
parcial de esta proteína, los péptidos generados pueden favorecer la absorción de
cationes divalentes. Estos autores observaron también un aumento de la absorción de
hierro pero sin diferencias estadísticamente significativas respecto del grupo control
que posiblemente se debieron a la alta variabilidad encontrada por los autores.
Sändstrom et al., (2008) también observaron un incremento en la absorción de
hierro en niños alimentados con fórmulas ricas en α‐lactoalbúmina (25%). Este
aumento se reflejó en los niveles de hierro sérico, sin aparecer modificaciones en la
ferritina sérica ni en el hematocrito. La concentración de minerales en las fórmulas es
superior a la de la leche materna, pero la adición de α‐lactoalbúmina podría, por lo
tanto, conseguir una mayor biodisponibilidad de cationes divalentes, siendo necesario
añadir una menor proporción del mineral a las fórmulas infantiles.
3.3.3. Actividad anticarcinogénica
La actividad de la proteína α‐lactoalbúmina fue estudiada durante al menos
tres décadas, hasta que en 1995 se observó una nueva actividad de esta proteína que
despertó cierto interés. Hakansson et al., (1995) encontraron una forma multimérica de
la α‐lactoalbúmina con actividad antitumoral selectiva. Posteriormente, fue
demostrado que esta proteína unida al ácido graso C18:1:9 cis (ácido oleico) (a lo que
se le llamó complejo HAMLET/BAMLET: Human or Bovine Alpha‐lactalbumin Made
LEtal to Tumor cells), también poseía actividad frente a los tumores celulares
(Knyazeva et al., 2008). Las formas proteicas humanas y bovinas inducen, in vitro,
apoptosis en una gran variedad de tumores. Además, recientemente se ha demostrado
III. Revisión Bibliográfica
30
in vivo el efecto terapéutico específico del complejo HAMLET sobre varios tumores
como glioblastomas humanos, tumores en glándulas mamarias de ratón y también
sobre el papiloma humano en el que se observó una reducción de las lesiones
causadas por dicho virus en un 100% de los pacientes tratados con el complejo
HAMLET (Gustafsson, et al., 2005). Sin embargo, hasta ahora los beneficios sobre la
salud de los neonatos de los productos derivados de la digestión de la leche, y la
posible formación los complejos HAMLET en alguna etapa determinada de la digestión,
permanece sin esclarecer (Chatterton et al., 2006).
3.3.4. Actividad sobre el sistema inmune
En dos recientes estudios in vitro, las proteínas del lactosuero mostraron tener
actividad sobre el sistema inmune, estimulando la respuesta del mismo (Saint‐Sauveur
et al., 2008; Jacquot et al., 2010). Además estudios realizados en cultivos celulares y en
estudios in vivo han demostrado que estas proteínas son capaces de aumentar la
respuesta inmune no específica y específica (Gómez et al., 2002; Saint‐Sauveur et al.,
2009). La alta concentración de aminoácidos precursores de glutatión parece ser la
causa de los efectos inmunológicos producidos (Madureira et al., 2007).
3.3.5. Actividad prebiótica
Según diversos autores, la α‐lactoalbúmina estimula el crecimiento de
Bifidobacterias. Este hecho fue observado por Kee et al., (1998) en un estudio in vitro
realizado con Bifidobacterium longum ATCC 15707 y los péptidos que se generaron de
la digestión de la α‐lactoalbúmina. Además, estos péptidos poseen un efecto
inhibitorio sobre Bacteroides, Clostridios y E. coli, llegando a ser la reducción de estas
bacterias potencialmente patógenas, semejante a la que se observa en recién nácidos
alimentados mediante lactancia natural (Brück, Graverholt y Gibson 2002). En un
estudio in vivo realizado por Brück et al., (2006a), se observó un ligero efecto
bifidogénico en la población de niños alimentados con fórmulas enriquecidas con α‐
lactoalbúmina sólo en aquellos casos en los que la población de bacterias beneficiosas
era en inicio muy baja (niños no alimentados con leche materna)
III. Revisión Bibliografica
31
3.3.6. Actividad antimicrobiana
Son diversos los estudios in vitro que demuestran la actividad antimicrobiana de los
péptidos que se producen tras la digestión de esta proteína. Pihlanto‐Leppälä et al.,
(1999) indicaron que tanto la pepsina como la tripsina liberan péptidos a partir de la α‐
lactoalbúmina que soncapaces de inhibir el crecimiento de Escherichia coli JM103,
mientras que la misma proteína sin ser sometida a hidrólisis carece completamente de
efecto. Se demostró el efecto antimicrobiano que ejerce la α‐lactoalbúmina, cuando es
añadida a fórmulas infantiles, frente a bacterias patógenas inoculadas en monos
rhesus (Escherichia coli enteropatógeno y Salmonella thypimurium) (Brück et al.,
2003a). Por otro lado, tres de los polipéptidos liberados tras la digestión (mediante la
acción de la tripsina y la quimotripsina) parecen tener efecto antimicrobiano frente a
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Streptococci y Candida albicans (Pelligrini et al., 1999).
Las células Caco‐2 tratadas con péptidos procedentes de la digestión tanto de la
proteína α‐lactoalbúmina como de glicomacropeptidos mostraron menor adhesión de
los pátógenos Eschechia coli enteopatógeno, Shigela flexneri y Salmonella
thiphymorium respecto de las células control (no tratadas) (Brück et al., 2006b).
3.3.7. Otras funciones
Entre otras funciones atribuidas a los péptidos procedentes de la digestión de esta
proteína se encuentra la actividad reductora de la presión sanguínea. Diversos estudios
demuestran que diferentes péptidos procedentes de la proteína α‐lactoalbumina
sometida a distintas enzimas, poseen actividad antihipertensiva (Pihlanto‐Leppälä et
al., 2000; Otte et al., 2007). Se ha demostrado también la capacidad antioxidante de
los péptidos obtenidos a partir de la digestión de la α‐lactoalbúmina (Hernandez‐
Ledesma, et al., 2005), así como las propiedades antiulcerativas y su actividad opioide
(Antila et al., 1991; Pihlanto‐Leppälä et al., 2001).
III. Revisión Bibliográfica
32
En las Tablas 2 y 3 se resumen algunos de los estudios que avalan los efectos
beneficiosos de la proteína α‐lactoalbúmina y de los péptidos procedentes de su
digestión, así como los relacionados directamente con la actividad funcional que puede
aportar la proteína cuando se adiciona a alimentos infantiles. La Tabla 2 hace
referencia a los estudios in vitro que demuestran actividades que posteriormente se
evalúan in vivo.
Tabla 2. Estudios in vitro realizados con α‐lactoalbúmina o proteínas del lactosuero y efectos evidenciados.
F (fórmula infantil) α‐LA (α‐lactoalbúmina), GMP (Glicomacropeptidos). * Reemplaza ese porcentaje sobre el contenido proteico. **Indican porcentaje de pureza
Estos estudios ponen de manifiesto la capacidad antimicrobiana de los péptidos
producidos tras la digestión de la proteína α‐lactoalbúmina, aunque un estudio
Grupos de estudio Efectos Referencia
α‐LA + tripsina α‐LA + quimiotripsina
α‐LA+ pepsina
2 péptidos mostraron actividad antimicrobiana 1 péptido mostró actividad antimicrobiana
Ningún péptido mostró actividad antimicrobiana
Pellegrini et al., 1999
α‐ LA + ácido oleico Actividad antimicrobiana contra Streptococcus pneumoniae Hakansson et al., 2000
α‐LA Peptidos inhiben crecimiento de Escherichia coli JM103 La proteína intacta no tuvo actividad antimicrobiana
Pihlanto‐Leppälä et al.,
2000
1% lactosa Leche materna F. 68% α‐LA* F. 68% GMP*
Disminuyen los recuentos de Escherichia coli después de 6 horas de incubación con α‐LA y GMP pero luego los niveles se igualan
con el control
Bruck et al., 2002
1% lactosa Leche materna F. 68% α‐LA* F. 68% GMP*
α‐LA y GMP inhiben el crecimiento de S. choleraesuis y E. coli α‐LA y GMP pueden tener efectos beneficiosos sobre la
microbiota intestinal
Brück Graverholt y Gibson 2003b
α‐LA humana 90%** α‐LA bovina 68%** α‐LA bovina 25%**
GMP 80%**
Las células Caco‐2 tratadas con las proteínas ensayadas intactas y digeridas (pepsina o pepsina + pancreatina) mostraron menor adhesión de los patógenos estudiados (EPEC, S. thyphimorium y
S. flexneri) respecto del control
Brück et al., 2006b
Proteínas lactosuero Aumenta actividad del sistema inmune Saint‐Sauveur et al., 2008
α‐LA camello + digestión α‐LA bovina + digestión
Mayor antioxidante de α‐LA de camello con respecto a la α‐LA bovina
Salami et al., 2009
α‐LA + digestión β‐LG+ digestión
Aumenta respuesta del sistema inmune Jacquot et al.,
2010
III. Revisión Bibliografica
33
realizado por Hakansson et al., (2000) obtiene el mismo resultado para una variante de
la proteína nativa. Otras de las actividades funcionales que se demuestran in vitro para
la α‐lactoalbúmina son los efectos positivos sobre el sistema inmune y la microbiota
intestinal son. A partir de las conclusiones obtenidas en estos estudios realizados in
vitro se cuenta con una base para seguir investigando los efectos beneficiosos in vivo,
ya que no debemos olvidar que en la metodología in vitro no se pueden reproducir las
condiciones fisiológicas exactas del organismo y que por lo tanto los efectos
demostrados in vitro deben tomarse con cautela al extrapolarlos a condiciones in vivo.
En la Tabla 3 se presentan exclusivamente los estudios realizados in vivo en
los que se evalúan fórmulas infantiles y concentrados proteicos. En las
investigaciones llevadas a cabo en animales de experimentación se observaron los
siguientes efectos beneficiosos: estimulación de la respuesta del sistema inmune,
composición de la microbiota intestinal parecida a la de los individuos alimentados
con leche materna y aumento de la absorción de cinc.
En los estudios realizados en humanos, se ha observado en lactantes un perfil
aminoácidico, crecimiento, desarrollo y composición de la microbiota intestinal
similar a los niños alimentados con leche materna, un aumento de la respuesta del
sistema inmune y una mayor absorción mineral (Tabla 3).
III. Revisión Bibliográfica
34
Tabla 3. Estudios in vivo realizados con fórmulas infantiles enriquecidas con α‐lactoalbúmina o suero proteico y los efectos producidos.
Grupos de estudio Efectos Referencia
F. estándar F. ↓Prot. 1/2[α‐LA] F. ↓Prot. ↑[α‐LA]
Perfil aminocídico parecido al de niños alimentados a pecho. Heine et al.,
1996
F. estándar F α‐LA F. GMP
Leche materna
Monos Rhesus alimentados con la F.+ α‐LA, mostraron una composición de la microbiota intestinal parecida a los
alimentados con leche materna.
Brück et al., 2003a
F. estándar F. caseína hidrolizada‐1 F caseína hidrolizada‐2 F. suero hidrolizado
Todas las fórmulas con proteínas hidrolizadas elevaron la concentración excesiva de aminoácidos en plasma.
El estatus de hierro fue menor en el grupo que recibió alguna de las fórmulas con caseína hidrolizada.
Hernell y Lönnerdal,
2003
F. estándar F. ↓Prot. ↑[α‐LA]
Patrón de crecimiento similar en los dos grupos de niños Mejor aceptación y tolerancia de la fórmula experimental
Lien, Davis y Euler ,2004
F. 11% α‐LA 14%GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP
Leche materna
No encontraron grandes diferencias en la microbiota intestinal debido a la alta variabilidad interindividual.
↓recuentos de clostridios.
Brück et al., 2006a
F. estándar F. GMP F. α‐LA
Leche materna
Monos alimentados con F. α‐LA presentaron un perfil aminoácido similar al de los alimentados con leche materna
↑absorción de cinc y en los grupos de alimentación enriquecida con GMP o α‐LA
Kelleher et al., 2003
F. 70% suero proteico Leche materna
Crecimiento, tolerancia y recuentos en la microbiota intestinal similares a los de los niños alimentados con LM
Rochat et al., 2007
F. estándar F. ↑[α‐LA]
Leche materna
↑Niveles de aminoácidos esenciales Tolerancia gastrointestinal parecida a niños alimentados con
LM
Davis et al., 2008
F. 11% α‐LA 14% GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP
Leche materna
Patrón de crecimiento parecido a niños alimentados con LM. Concentración de triptófano ↑ (F. Estandar vs. F ↑[α‐LA])
Sandström et al., 2008
Proteínas suero Aumenta repuesta sistema inmune de ratones infectados
con E.coli 0157:H7 Saint‐Sauveur et al., 2009
F. estándar F. ↑[α‐LA]+probiótico
F. experimental produce menores efectos gastrointestinales en bebes con cólico, además su crecimiento fue el esperado.
Dupont et al., 2010
F. 11% α‐LA 14% GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP
Leche materna
α‐LA y GMP no afectaron a la absorción de hierro Szymlek‐Gay et al., 2010
F. estándar F. ↓Prot. ↑[suero] Leche materna
El peso ganado en el grupo alimentado con la fórmula experimental se situó entre F. estándar y LM
Crecimiento similar al grupo de LM
Trabulsi et al., 2011
F: fórmula; Prot: proteína; GMP: glicomacropeptidos; α‐LA: α‐lactoalbúmina; LM: leche materna
III. Revisión Bibliografica
35
4. COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS: NUCLEÓTIDOS
Los nucleótidos son compuestos químicos de bajo peso molecular (300‐350
Da) que están formados por la unión de una pentosa, una base nitrogenada púrica
o pirimidínica y de 1 a 3 moléculas de fosfato (Figura 5).
Figura 5. Estructura de un nucleótido
El ser humano obtiene los nucleótidos mediante absorción intestinal o síntesis
de novo. En la luz intestinal, las nucleoproteínas (nucleótidos unidos a proteínas) y los
ácidos nucleicos de la dieta son degradados por las nucleasas y proteasas intestinales
que producen nucleótidos libres. Éstos son metabolizados por otras enzimas, como
fosfatasa alcalina y nucleotidasas que separan los grupos fosfato originando
nucleósidos. Los nucleósidos son absorbidos por la mucosa intestinal y/o son
degradados hasta formar ácido úrico, o bien son convertidos de nuevo en nucleótidos
(Millan, 2005).
Aproximadamente un 25% del nitrógeno de la leche humana es nitrógeno no
proteico e incluye sustancias como aminoácidos libres, ácidos nucleicos, poliaminas,
carnitina y nucleótidos. Los nucleótidos representan aproximadamente 2‐5% del
nitrógeno no proteico de la leche materna que consiste entre 30 y más de 70 mg/L
(Carver, 2003). Por otro lado, es importante destacar que la leche de vaca posee un
contenido muy bajo en nucleótidos y además, su perfil difiere bastante del que
Fosfato
Base púrica o pirimidínica
Pentosa
III. Revisión Bibliográfica
36
presenta la leche materna. Este hecho ha impulsado a suplementar las fórmulas
infantiles con nucleótidos.
Hasta hace pocos años, la cuantificación de los nucleótidos se refería a la
medida de nucleótidos libres, pero hoy en día es sabido que la digestión de la leche
materna por el lactante genera más nucleótidos o nucleósidos disponibles. Por esta
razón se desarrolló un método (Leach et al., 1995) para determinar nucleótidos totales
potencialmente disponibles que determinó el rango en la leche materna 82–402
μmol/L (Lerner y Shamir, 2001).
Los nucleótidos se han relacionado con algunos de los efectos positivos de la
leche materna, como acciones sobre el sistema inmune y sobre la reparación
crecimiento y diferenciación de las células del tracto gastrointestinal. Además, los
nucleótidos están relacionados con una menor incidencia de diarrea (Brunser et al.,
1994; Yau et al., 2003), por lo que se cree que tienen influencia sobre la microbiota
intestinal. Así, diversos estudios in vitro demuestran una estimulación del crecimiento
de Bifidobacterias por parte de los nucleótidos (Uauy, 1989) y de manera indirecta
pueden inhibir el crecimiento de microorganismos potencialmente patógenos, debido
al descenso del pH (Gil, 2002).
Se ha visto que varios sistemas enzimáticos involucrados en la digestión de
nutrientes no están completamente desarrollados en los niños recién nácidos, por lo
que tienen una eficiencia de utilización limitada. En este sentido, Thorell et al., (1996)
demostraron que existía actividad enzimática para la digestión de ácidos nucleicos,
nucleótidos o nucleósidos en el contenido intestinal de fetos de 22 semanas de
gestación. Por esta razón las fórmulas infantiles se pueden suplementar con
cualquiera de estos compuestos. La absorción de los nucleótidos aportados en la dieta
es complicada debido a la carga negativa de los grupos fosfato, pero después de la
actuación de las enzimas digestivas se van a producir nucleósidos que sí son de fácil
absorción (Sanderson, 1994, Yu, 1998). Aunque más del 90% de los nucleótidos
ingeridos son absorbidos como nucleósidos en el intestino delgado (Carver y Walker
III. Revisión Bibliografica
37
1995; Cosgrove, 1998) probablemente algunos pasan al colon donde pueden actuar
como promotores del crecimiento de Bifidobacterias (Singhal et al., 2008).
En individuos sanos sólo se utiliza el 5% de los nucleótidos de la dieta, ya que sus
necesidades son cubiertas endógenamente; pero, en ciertas condiciones, el cuerpo
requiere un suplemento adicional, por lo que será necesario el aporte exógeno de
nucleótidos. Estas condiciones especiales ocurren cuando existe un crecimiento rápido
del organismo como sucede en la infancia (Jyonouchi, 1994).
Los nucleótidos participan en diversos procesos biológicos esenciales (Cosgrove,
1998; Lawrence et al., 2007):
• Producción de ácidos nucleicos, ADN, ARN
• Metabolismo energético (ATP)
• Mediadores fisiológicos (AMPc, GMPc, ADP)
• Coenzimas en procesos metabólicos (NAD, CoA)
• Moléculas transportadoras en reacciones de síntesis (UDP, GDP,CMP)
No obstante, estos compuestos no se consideran nutrientes esenciales porque son
sintetizados y reciclados durante los procesos metabólicos.
4.1 Bioactividad de los nucleótidos
A continuación se describen los efectos beneficiosos que pueden producir los
nucleótidos y en la Tabla 4 se resumen los principales estudios realizados en este
sentido.
Parece ser que las fórmulas infantiles suplementadas con nucleótidos podrían
producir un aumento de la absorción de hierro en los lactantes. Esta idea surge
principalmente por un estudio llevado a cabo en ratas (Faelli y Esposito 1970). Debido
a que la leche materna posee concentraciones de nucleótidos mayores que las
fórmulas infantiles, se ha postulado que los nucleótidos intervienen en la mejora de la
absorción de hierro de la leche materna. Sin embargo Hernell y Lönnerdal (2002) en
III. Revisión Bibliográfica
38
un estudio realizado en lactantes alimentados con leche materna, fórmula estándar y
fórmula suplementada con nucleótidos no observaron ninguna mejora en el estatus
del hierro.
Varios estudios han demostrado que la suplementación de fórmulas infantiles
con nucleótidos, incrementa el crecimiento de Bifidobacterias y disminuye el de
Enterobacterias (Gil y Rueda, 2000). Las Bifidobacterias disminuyen el pH intestinal y
de esta manera impiden el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas como
las pertenecientes al género Bacteroides y Clostridium (Carver y Walker, 1995;
Cosgrove, 1998; Gil, 2002), reduciendo de este modo la incidencia de diarrea debido a
la inhibición de los grupos bacterianos citados anteriormente (Yau, 2003; Schaller,
Buck y Rueda, 2007). Sin embargo, son pocos los estudios realizados in vivo que
investigan el efecto de los nucleótidos sobre la microbiota intestinal. Además, los
resultados obtenidos hasta el momento son contradictorios, ya que algunos concluyen
que los nucleótidos promocionan el crecimiento de Bifidobacterias (Gil et al., 1986;
Uauy, 1989) mientras que en otros estudios se indica que lo restringe (Balmer, Hanvey
y Wharton, 1994). Esta contradicción puede ser debida a que el análisis de la
microbiota intestinal se realizó en ambos estudios mediante cultivos en placa y es
sabido que la variabilidad suele ser bastante alta para esta metodología, existiendo
además determinadas bacterias no cultivables.
Un estudio más reciente, realizado por Singhal (2008) en el que se analizó la
microbiota mediante técnicas moleculares, concluyó con un efecto positivo sobre el
balance de la microbiota intestinal, aunque no encontró un incremento del
crecimiento de Bifidobacterias. Además, no pudo relacionar el aporte de nucleótidos
con una menor incidencia de diarrea. En este sentido los resultados de los diferentes
estudios son contradictorios como podemos observar en la Tabla 4, ya que hay
ensayos que demuestran menor incidencia de diarrea incluso con concentraciones
bajas de nucleótidos (32 mg/L) mientras que en otros no se observan estos efectos
positivos suplementando la fórmula infantil con una mayor concentración de
nucleótidos (72 mg/L). Esta gran variabilidad puede ser debida a la diferente
metodología empleada en el análisis microbiano.
III. Revisión Bibliografica
39
La suplementación de fórmulas infantiles con nucleótidos podría mejorar el
crecimiento del individuo y su desarrollo, aunque no hay estudios concluyentes en
este sentido (Uauy 1989). Lo que si se ha observado es una mejora evidente en el
crecimiento en niños nácidos con bajo peso (Cosgrove et al., 1996). Sin embargo, un
estudio reciente realizado por Singhal et al., 2010 demostró la mejora del crecimiento
de lactantes nácidos con un peso normal alimentados con fórmulas infantiles
suplementadas con estos compuestos.
Numerosos trabajos han demostrado la capacidad de los nucleótidos para
estimular la respuesta del sistema inmune modulando la respuesta celular y humoral
(Gil y Rueda, 2002; Yau et al., 2003; Vasquez‐Garibay, 2004; Buck et al., 2004; Schaller
et al., 2004; Hawkes et al., 2006). Estos efectos también han sido observados en
lactantes alimentados con fórmulas infantiles a base de soja y suplementadas con
nucleótidos, en ellos se observa una respuesta inmunitaria e incidencia de diarrea
similares a los lactantes alimentados con leche materna durante 2 meses y
posteriormente con fórmula estándar (Ostrom et al., 2002; Cordle et al., 2002).
Además, un estudio reciente ha realizado un meta‐análisis corroborando el efecto
beneficioso de los nucleótidos sobre el sistema inmune (Gutierrez et al., 2007).
Estos compuestos poseen un papel importante en el crecimiento y
diferenciación del tracto gastrointestinal. El tejido intestinal de los animales a los que
se les suplementa la dieta con nucleótidos, tiene más proteína y ADN en la mucosa,
además de tener vellosidades más grandes, mayor actividad disacaridasa y mejor
capacidad para la reparación de la mucosa intestinal. LeLeiko et al., (1995)
demostraron que la dieta suplementada con nucleótidos afectaba a la expresión
génica de la enzimas gastrointestinales. Por otro lado, dietas suplementadas con
nucleótidos fueron relacionadas con un incremento en la actividad disacaridasa y en la
altura de las vellosidades (Uauy et al., 1990) y un aumento en el porcentaje del peso
del intestino delgado respecto del peso corporal (Carver, 1994). Los resultados
obtenidos en los estudios realizados hasta ahora, sugieren que los nucleótidos de la
dieta pueden ser importantes para el crecimiento y desarrollo intestinal en la vida
postnatal temprana (López‐Navarro et al., 1996).
III. Revisión Bibliográfica
40
Tabla 4. Estudios in vivo realizados en lactantes sanos y nácidos a término, relacionados con la adición de nucleótidos a fórmulas infantiles.
Bacteroides‐Porphyromonas‐Prevotella group (BPP). a fórmulas de soja con nucleósidos totales potencialmente disponibles 300mg/L. F: fórmula; LM: leche materna; NT: Nucleótidos.
Grupos de estudio
Dosis/duración Efectos Referencia
F. estándar F. NT
4 semanas ↑ Bifidobacterias Gil et al., 1986
F. estándar F. NT LM
33 mg /L 4 meses
mayor respuesta inmune en lactantes alimentados con F. NT
Carver et al., 1991
F. estándar F. NT LM
34 mg /L 7 semanas
Los nucleótidos no mostraron efectos beneficiosos sobre la microbiota intestinal ↓ Bifidobacterias, ↑Bacteroides y E. coli
Balmer, Hanvey,
Wharton, 1994
F. estándar F. NT
29,5‐37,7 mg/L Mejora del crecimiento Cosgrove et al.,
1996.
F. estándar F. NT LM
72 mg/L 12 meses
Menor incidencia de diarrea y mayor respuesta inmune en lactantes alimentados
con F. NT
Pickering et al., 1998
F. estándar F. NT LM
72 mg/L 6 meses (1‐3m)
↓ Incidencia de diarrea (F. NT). Merolla, 2000
F. estándar F. NT LM
40 mg /L 6 meses
No afectó a los depósitos de hierro Hernell y
Lönnerdal, 2002
F. soja F. soja NT
LM/F. estándar
72 mg/L 12 meses
La suplementación con nucleotidos mostró beneficios contra Haemophilus influenza b y
menores episodios de diarrea
aOstrom et al., 2002
F. soja F. soja NT
LM/F. estándar
72 mg/L 12 meses
respuesta del sistema inmune similar en F. soja NT y LM/F. estándar
aCordle et al., 2002
F. estándar F. NT
72 mg/L 12 meses
↑ respuesta del sistema inmune (F. NT.) ↓ incidencia de diarrea en el grupo (F. NT).
Yau et al., 2003
F. estándar F. NT LM
72 mg/L 12 meses
↑ la respuesta del sistema inmune (F. NT.) Schaller et al.,
2004
F. estándar F. NT LM
72 mg/L 12 meses
↑ la respuesta de anticuerpos y la inmunidad celular (F. NT.).
Buck et al., 2004
F. estándar F. NT LM
33,5 mg/L 7 meses
Se observaron pequeñas mejoras en la respuesta de anticuerpos.
Hawkes et al., 2006
F. estándar F. NT LM
31 mg /L 20 semanas
La fórmula infantil suplementada mejoró la composición de la microbiota intestinal ↓proporcion BPP/Bifidobacterium
Singhal et al., 2008
F. estándar F. NT
72 mg /L 1 año
No hubo efectos positivos en la incidencia de diarrea
Neri‐Almeida et al., 2009
F. estándar F. NT LM
31 mg /L 20 semanas
Los nucleótidos mejoraron el crecimiento de los lactantes.
Singhal et al., 2010
III. Revisión Bibliografica
41
5. BIODISPONIBILIDAD MINERAL
La ingesta inadecuada de minerales puede ser responsable de enfermedades en el
recién nácido que pueden tener consecuencias inmediatas, e incluso manifestarse en
la edad adulta (Frontela et al., 2009a). En este sentido, la deficiencia en hierro puede
ocasionar entre otras alteraciones un inadecuado desarrollo motor, la deficiencia en
calcio puede ser la causa de raquitismo y/o osteoporosis y la deficiencia en cinc puede
provocar retraso en el crecimiento y comprometer el sistema inmune del recién nácido
(Domellöf et al., 2004).
No todo el mineral que es ingerido a partir de un alimento estará disponible para
que el organismo lo utilice en los diferentes procesos bioquímicos y metabólicos.
Solamente una parte será absorbida a nivel intestinal y participará en dichos procesos
orgánicos. Por esta razón, antes de profundizar en la biodisponibilidad mineral, es
importante realizar una diferenciación entre los conceptos de biodisponibilidad y
bioaccesibilidad mineral.
‐ Biodisponibilidad mineral corresponde a la proporción de mineral ingerido que
puede ser utilizado en los procesos metabólicos del organismo (Greffeuille et al.,
2011).
‐ Bioaccesibilidad mineral se define como la proporción mineral de una matriz
alimentaria que se encuentra solubilizado en el lumen del tracto gastrointestinal y
que por lo tanto podría ser absorbida (Greffeuille et al., 2011).
En la biodisponibilidad mineral están involucradas tres fases: la disponibilidad del
nutriente en el lumen intestinal para su absorción (bioaccesibilidad), la absorción y/o
retención del nutriente en el organismo, y la capacidad del organismo para utilizarlo en
las funciones metabólicas (Farré, 201o). La primera fase depende de factores
relacionados con el alimento (factores extrínsecos como la fibra alimentaria,
determinadas vitaminas, presencia de antinutrientes como el ácido fítico y ácido
oxálico, etc.) mientras que las otras dos fases dependen de los mecanismos de
regulación homeostática y de las necesidades fisiológicas del individuo (factores
III. Revisión Bibliográfica
42
intrínsecos como el sexo, la edad, el tránsito intestinal, niveles de los depósitos del
mineral en el organismo, etc.) (Watzke, 1998).
La biodisponibilidad mineral de las fórmulas infantiles elaboradas a base de leche
de vaca es menor que la de la leche materna. La composición y concentración de la
caseína y de las proteínas del lactosuero de la leche vaca, las propiedades estructurales
de los fosfopéptidos formados durante la digestión y la concentración de algunos
minerales, han sido descritas entre otros factores como responsables de esta baja
biodisponibilidad (Bouhallab et al., 2002). Ésto ha hecho que la concentración de
algunos minerales añadidos a las fórmulas infantiles sea mayor que la concentración
de los mismos minerales en la leche materna. Para una adecuada fórmulación mineral
de las leches de inicio se debe conseguir que la cantidad de mineral absorbido sea
parecida a la cantidad absorbida de la leche materna (Drago y Valencia 2004).
La suplementación mineral de las fórmulas infantiles puede afectar a la
biodisponibilidad del resto de minerales, en este sentido se ha comprobado en
estudios in vitro que la adición de calcio puede afectar a la biodisponibilidad del hierro
(Perez‐Llamas et al., 2001). Además en un ensayo realizado en cereales reconstituidos
con fórmulas infantiles se observó que el calcio, presente en dicha fórmula, disminuía
la disponibilidad in vitro del hierro y cinc de los cereales (Frontela, Ros y Martínez
2009b).
5.1 Métodos de estudio de la biodisponibilidad mineral
La medida de la biodisponibilidad mineral se ve dificultada por el complejo proceso
de la digestión gastrointestinal, aunque se han desarrollado varios métodos que
intentan evaluarla reproduciendo las condiciones gastrointestinales del modo más fiel
posible. A continuación se enumeran y explican brevemente cada uno de estos
métodos. El método que utiliza cultivos celulares se expondrá con más profundidad e
el apartado 5.2.3., ya que es el que se desarrolla en esta tesis. En la Figura 6 se
muestra la clasificación de los métodos utilizados actualmente para evaluar la
biodisponibilidad.
III. Revisión Bibliografica
43
Figura 6: Diferentes métodos para evaluar la biodisponibilidad mineral.
5.1.1 Métodos de estudios in vivo
‐ Balances químicos:
En los métodos que utilizan balances químicos para medir la biodisponibilidad
mineral, se evalúa la cantidad ingerida del mineral y se relaciona con la cantidad
excretada del mismo durante un largo periodo de tiempo. Sus principales limitaciones
son el tiempo necesario para su desarrollo, posibles errores significativos en la
estimación de absorción debido a errores en la cantidad de ingesta y excreción, y por
último poder diferenciar si el mineral excretado proviene de la dieta o del
metabolismo endógeno (Van Campen y Glahn, 1999).
‐ Isótopos:
Actualmente, en los estudios in vivo realizados en humanos, los métodos más
utilizados son los que emplean isótopos para marcar la fuente dietética del mineral a
MÉTODOS PARA EVALUAR LA BIODISPONIBILIDAD MINERAL
IN VIVO
HUMANOS
BALANCES QUÍMICOS
ISÓTOPOS
ESTABLES RADIACTIVOS
ANIMALES
IN VITRO
SOLUBILIDAD DIALIZABILIDAD
LÍNEAS CELULARES
III. Revisión Bibliográfica
44
estudiar y realizan posteriormente la medida del mineral marcado en los distintos
órganos. Los isótopos utilizados en estos estudios pueden ser radioactivos o estables.
El análisis de las muestras se lleva a cabo mediante espectrometría de masas. En los
isótopos radiactivos se plantea un problema ético, ya que los individuos deben aceptar
la exposición a pequeñas dosis de radioactividad, mientras que en los métodos con
isótopos estables el problema planteado es económico, debido a su elevado coste
(Martínez et al., 1999).
Los isótopos estables de calcio, magnesio, cinc y hierro se han utilizado en
numerosos estudios clínicos con grupos de diferente edad y no se ha observado
ninguna complicación relacionada con su uso. Estos isótopos estables no causan
ningún cambio fisiológico ni riesgo cardiovascular en las dosis empleadas hasta ahora
en los estudios de cinética de absorción (Abrams, 2008).
‐ Modelos animales:
El uso de modelos animales para evaluar la biodisponibilidad mineral y realizar
una posterior extrapolación a seres humanos está limitado por las diferencias entre
especies utilizadas, tanto en la velocidad de crecimiento como en la actividad de
enzimas intestinales y microbianas, y en la fisiología y anatomía intestinal que difieren
en mayor o menor medida del organismo humano (Binaghi et al., 2008).
Por ejemplo es sabido que las ratas no son un buen modelo animal en el
estudio del hierro ya que sintetizan vitamina C que favorece la absorción de este
mineral (Reddy y Cook 1994). Patterson et al., (2008) señalaron al cerdo como un buen
modelo animal en el estudio de la disponibilidad de hierro, debido a que los niveles de
este mineral en cerdo son más fácilmente manipulables en el nacimiento. Por otro
lado, Zinn et al., (1999) pudieron observar que los niveles de hierro de los lechones
eran similares a los presentados por niños de 6 a 9 meses de edad.
III. Revisión Bibliografica
45
5.1.2 Métodos de estudio in vitro Se han desarrollado diversos métodos in vitro para evaluar la disponibilidad
mineral de un alimento como alternativa a los estudios in vivo, ya que estos últimos
requieren de más tiempo para su desarrollo y presentan elevados costes, además de
ser complicados de llevar a cabo y en ocasiones no son aprobados por los Comités
éticos. Con los métodos in vitro, en los que se simulan condiciones fisiológicas, se
puede estimar la biodisponibilidad de un nutriente y anticiparnos así a lo que ocurriría
en un modelo in vivo (Farré, 2010). Sin embargo, estos métodos sólo permiten realizar
estimaciones relativas de la biodisponibilidad ya que existen factores fisiológicos que
afectan a la absorción mineral (estado nutricional, secreción gastrointestinal,
interacciones con la mucosa, microbiota intestinal…) que no pueden ser reproducidos
(Martínez et al., 1999). Se consideran, por lo tanto, útiles para desarrollar hipótesis
pero no para tomar decisiones sobre fortificación de alimentos, para lo que son
necesarios estudios en humanos (Farré, 2010).
Los métodos in vitro más sencillosse basan en la evaluación del mineral soluble
y dializable a través de una membrana, previa simulación in vitro de la digestión
gastrointestinal. Esta fracción mineral soluble nos da una medida del mineral
bioaccesible, mientras que cuando evaluamos el mineral dializado a través de un
membrana semipermeable obtenemos valores extrapolables al mineral absorbido a
nivel intestinal y que pasa por lo tanto, al torrente sanguíneo (Frontela, Ros y
Martínez, 2009b).
5.1.3 Métodos de estudio con líneas celulares
El uso de líneas celulares humana para estudiar los procesos de absorción a
nivel intestinal requiere, en primer lugar, de la elección de la línea celular adecuada y
también el conocimiento de las condiciones fisiológicas idóneas de ese tipo celular al
simular las condiciones intestinales. Uno de los factores críticos a controlar es el pH ya
que juega un papel fundamental en la absorción de minerales (Frontela et al., 2011).
III. Revisión Bibliográfica
46
Una de las líneas celulares más utilizadas es la línea Caco‐2, procedente de
adenocarcinoma de colon humano que posee las características bioquímicas y
morfológicas de los enterocitos del intestino delgado y que han sido utilizadas en
numerosos estudios para estimar la biodisponibilidad mineral. En cultivo, estas células
son capaces de diferenciarse de forma espontánea para dar lugar a una monocapa
celular polarizada que posee muchas de las características funcionales y morfológicas
de los enterocitos humanos maduros (Álvarez‐Hernández et al., 1994). Estas células se
cultivan habitualmente sobre un soporte microporoso inserto en un sistema bicameral
de modo que pueden diferenciarse dos compartimentos: apical y basal, lo que permite
realizar la medida del mineral que es transportado a través de la monocapa de células.
Este mineral transportado a la cámara basal se estima como medida del mineral que
pasa al torrente circulatorio una vez que se ha absorbido (Frontela et al., 2009a). La
línea celular Caco‐2 ha sido ampliamente considerada como un sistema in vitro
adecuado para el estudio de absorción de nutrientes a nivel intestinal. Sin embargo,
presenta alguna limitación en la medida de ciertos minerales, debido a la baja
permeabilidad paracelular comparada con la que presenta el intestino delgado
humano (Atursson y Karlsson, 1991).
Los ensayos de biodisponibilidad mineral mediante la línea celular Caco‐2 han
sido correctamente correlacionados con estudios in vivo. No obstante, para el caso de
algunos minerales como el hierro, hay ensayos que han obtenido resultados variables
empleando esta línea celular atribuyéndolo a la ausencia de moco en la superficie
apical de las mismas (Laparra et al., 2009). En este sentido se ha propuesto la
utilización de líneas celulares alternativas como la HT29 (procedente de intestino) que
expuesta a metotrexano (HT29 MTX) producen mucus, con el fin de aproximar más los
ensayos a las condiciones fisiológicas (Frazer y Anderson, 2005; Laparra et al., 2009;
Mahler et al., 2009).
También debemos señalar las limitaciones que encontramos al realizar ensayos
con líneas celulares respecto a los ensayos in vivo. Por ejemplo, el área de transporte
es sólo una pequeña fracción de la correspondiente al intestino delgado y resulta
III. Revisión Bibliografica
47
imposible reproducir in vitro los movimientos peristálticos y la regulación
neuroendocrina (Frontela et al., 2011)
5.2 Biodisponibilidad de calcio
El calcio es un nutriente esencial para numerosos procesos bioquímicos como la
coagulación sanguínea, la contracción muscular, la transmisión de impulsos nerviosos,
la mitosis o la integridad de las membranas celulares, estando además involucrado en
muchas reacciones enzimáticas y forma parte del esqueleto (Pereira et al., 2009). El
calcio corporal se encuentra en dos compartimentos: en el esqueleto (99%) y en
fluidos extracorporales (1%). En éste último, se puede encontrar de tres formas, unido
a la albúmina, unido a aniones o en forma ionizada libre (Jain et al., 2010). El calcio de
los huesos forma parte de dos tipos de depósitos: un pequeño depósito de calcio
intercambiable de rápida y fácil movilización, y una reserva más estable y poco
intercambiable, que representa el 99% del calcio óseo (Pérez‐Llamas et al., 2010).
Es importante destacar que los requerimientos de calcio varían según la etapa
de la vida en la que se encuentre el individuo, existiendo grandes necesidades en los
periodos de rápido crecimiento, infancia y adolescencia, ya que en dichos periodos el
hueso crece e incrementa el depósito mineral (Pereira et al., 2009).
5.2.1 Absorción y regulación del calcio
En el intestino delgado se absorbe aproximadamente el 90% de calcio. La
permanencia del quimo en cada segmento del intestino delgado determina la cantidad
de calcio absorbida. Cuando la ingesta de calcio es normal o alta, la cantidad relativa
de calcio absorbido en el duodeno es pequeña comparada con la cantidad absorbida
en el íleon. Una mínima cantidad de calcio es absorbido en el intestino grueso,
cantidad que no excede de 10% (Bronner, 2008).
La cantidad de calcio ingerido con la dieta afecta a la eficiencia de la absorción del
mismo a nivel intestinal. Así, dietas bajas en calcio incrementan la absorción de este
III. Revisión Bibliográfica
48
mineral viéndose influenciada, al menos en parte, mediante la regulación de la
vitamina D y la composición lipídica y fluidez de las membranas celulares. También, las
necesidades fisiológicas influyen en la absorción de calcio intestinal de tal manera que
cuando los requerimientos aumentan y la ingesta es baja, la absorción mejora (Pérez et
al., 2008).
El calcio presente en los fluidos extracelulares e intracelulares debe estar
estrechamente regulado para poder ejercer su papel en las funciones citadas
anteriormente. El balance de calcio debe ser mantenido para asegurar la integridad
esquelética y este balance se lleva a cabo mediante el transporte coordinado entre
intestino, riñón y hueso en el que dos hormonas son las principales responsables de la
regulación del flujo de calcio, la hormona paratiroidea (PTH) y la 1,25‐dihidroxivitamina
D (1,25 (OH)2 D) (McKay, 2010).
La absorción del calcio a través del tejido epitelial, se realiza mediante dos
procesos, un movimiento transcelular que tiene lugar en el duodeno y un movimiento
paracelular que ocurre en el resto del intestino delgado.
‐ Transporte transcelular: La proporción de calcio absorbido mediante este
proceso es elevada cuando la ingesta de calcio es baja y en estados de crecimiento
rápido, decreciendo con la edad. Hay tres mecanismos involucrados en este tipo de
transporte (McKay, 2010):
a. Canales de calcio: las moléculas involucradas en la entrada apical de calcio son
dos canales llamados TRPV5 y TRPV6. En humanos las dos proteínas se
coexpresan en riñón e intestino y también en otros órganos o glándulas. Ambos
canales son permeables al calcio pero también lo son a otros cationes divalentes
e incluso a monovalentes en ausencia de divalentes. Estos canales se localizan
en el borde en cepillo del enterocito y es posible que sean los que limitan el
paso de entrada de la absorción activa del calcio (Pérez et al., 2008).
b. Calbindinas: son proteínas responsables del transporte del calcio de la cara
apical del enterocito a la basolateral (Tolosa de Talamoni, Perez y Alisio, 1998).
III. Revisión Bibliografica
49
Estas proteínas no solo transportan calcio sino que también proporcionan
protección frente a los niveles tóxicos de calcio durante el alto flujo del mismo,
ya que actúan sobre su regulación (Venyaminov et al., 2004).
c. La salida del calcio del enterocito está mediada por una bomba de calcio (PMCA)
localizada en las caveolas de la membrana celular que pueden encontrase
abiertas o cerradas. Otra molécula que interviene en la salida de calcio es un
intercambiador sodio calcio (NCX1) que es responsable aproximadamente del
20% de la extrusión de calcio y su actividad depende del gradiente creado por
Na+/K+‐ATPasa.
‐ Transporte paracelular: El epitelio está constituido por una capa continua de
células individuales y por estrechos espacios intercelulares, que permiten el paso de
pequeñas moléculas e iones a través de ellos. Esta ruta es regulada por el epitelio para
mantener su permeabilidad selectiva. Así, dependiendo de los requerimientos
funcionales, pasarán pequeñas o grandes cantidades de moléculas e iones a través de
las estrechas uniones celulares. Este proceso ha sido menos estudiado que el
transcelular; sin embargo, estudios recientes relacionan componentes moleculares del
transporte paracelular con determinadas enfermedades hereditarias (Hoenderop,
Nilius y Bindels, 2005). Cuando la ingesta de calcio es normal o alta, esta ruta comienza
a ser importante en la absorción del calcio. El movimiento de calcio a través de las
estrechas uniones es un proceso pasivo que depende en mayor parte del gradiente de
concentración del ion y del gradiente eléctrico a través del epitelio. Este no es un
transporte saturable y ocurre principalmente en el yeyuno e íleon (Pérez et al., 2008).
En la Figura 7 se presenta un esquema de las dos rutas de absorción del calcio;
El transporte paracelular se produce en las uniones estrechas (TJ) de las células
mediante gradiente electroquímico. En el transporte transcelular están involucrados
tres procesos, en primer lugar, la entrada apical de calcio a través de los canales TRPV5
y TRPV6. Posteriormente, una difusión en el citosol unido a calbindinas y por último
extrusión a través de la membrana basolateral mediante Ca2+‐ATPasa (PMCA1b) y el
intercambiador Na+/Ca2+ (NCX1). La 1,25‐dihidroxivitamina D se une a sus receptores
III. Revisión Bibliográfica
50
nucleares y el complejo interactúa con secuencias específicas de ADN induciendo la
transcripción y aumentando la expresión de los canales TRPV5 y TRPV6, las calbindinas
y los sistemas de extrusión.
Figura 7. Absorción transcelular y paracelular del calcio (adaptada de Hoenderop,
Nilius y Bindels, 2005)
El principal regulador de la absorción del calcio es la 1,25‐dihidroxivitamina D
(calcitriol, que es la forma activa de la vitamina D) aunque también algunas hormonas
y nutrientes participan en esta regulación. Por ejemplo, la hormona tiroidea posee un
papel importante en el mantenimiento de la concentración de calcio extracelular
(Mckay, 2010). Por otro lado, el papel de la calcitonina en la absorción intestinal es
poco conocido, aunque Yoshida et al., (1999) llegaron a la conclusión de que la
calcitonina producía un incremento de 1,25 dihidroxivitamina D. Otras hormonas que
intervienen en la regulación de este proceso son los estrógenos y los glucocorticoides.
Los hidratos de carbono incrementan su absorción, mientras que las proteínas no la
altera y los datos relacionados con los lípidos no son concluyentes. Se ha propuesto
igualmente que los probióticos influyen positivamente en la absorción del catión
debido a la producción de ácidos grasos de cadena corta que favorecen su absorción
(Pérez et al., 2008).
1,25(OH)2D3
Ca2+
Ca2+
NCX 1
PMCA 1bCalbindina
Ca2+Ca2+ Ca2+
Ca2+Ca2+
ATPCa2+
Ca2+
3Na+ Ca2+
mRNA
Lumen SangreEspacio intersticial
TRPV5/6
Síntesis proteínas
Ca2+
TJ
III. Revisión Bibliografica
51
Hay otros componentes en la dieta que pueden disminuir la absorción del calcio
formando complejos insolubles con él. Entre estos antinutrientes son de especial
relevancia los fitatos, taninos y oxalatos (Guéguen y Pointillart, 2000).
Se sabe también que no existe una regulación directa de la absorción paracelular.
Las uniones celulares juegan el mayor papel en la regulación de la permeabilidad
epitelial, por lo que los factores que afecten dicha permeabilidad afectarán al
movimiento paracelular de calcio (Bronner 2008).
La excreción del calcio ocurre a nivel renal y gastrointestinal. El calcio fecal puede
tener dos orígenes: exógeno (fracción no absorbida de la dieta) y endógeno (restos
celulares de la mucosa, jugos digestivos y bilis). Diversos estudios han recomendado
que las concentraciones de fosfato y calcio en sangre se mantengan en una proporción
1:1, ya que el exceso de alguno de los dos provocará un aumento de su excreción en
heces. La excreción urinaria de calcio se encuentra bajo regulación endocrina (Perez‐
Llamas et al., 2010).
5.2.2 Homeostasis de calcio en el recién nácido
Durante el último trimestre del embarazo el calcio es transferido de la madre al
feto a través de la placenta, acumulando 120‐150 mg por kilo de peso en el feto. En el
momento del nacimiento, los recién nácidos a término presentan aproximadamente
30 g de calcio en el organismo (Mckay, 2010). Tras el nacimiento se rompe el vínculo
materno que aportaba el calcio por lo que los niveles de calcio sérico en el recién
nácido comienzan a decrecer. Este descenso está relacionado con la aparición de
hipoparatiroidismo (ausencia de respuesta en la produción de PTH) desórdenes en el
metabolismo de la vitamina D y con un exceso de fósforo, magnesio y/o calcitonina.
Los niveles de la paratohormona van aumentando gradualmente durante 48 horas
tras el nacimiento volviéndose a encontrar niveles normales de calcio al tercer día (Jain
et al., 2010).
III. Revisión Bibliográfica
52
Los riñones del recién nácido juegan un papel importante en la homeostasis del
calcio y fósforo y en la regulación de las pérdidas de mineral por medio de la orina. En
circunstancias normales casi todo el calcio filtrado es reabsorbido en el túbulo renal,
aunque la excreción renal de calcio puede modificarse por factores locales y sistémicos
como la actividad de la hormona paratiroidea. Hasta el momento, se conoce poco la
capacidad de los lactantes para responder a dicha hormona (Hsu y Levine, 2004).
El calcio soluble o unido a diferentes moléculas orgánicas como fosfopéptidos
puede ser absorbido en el intestino. Además de la forma química en la que se
encuentre el calcio, otros factores van a influir también en su absorción, por ejemplo la
relación calcio: fósforo, citada anteriormente (Bronner & Pansu, 1999). En la absorción
de calcio intestinal aparecen tanto el transporte pasivo como los mecanismos de
transporte activo dependientes de la vitamina D. Es importante tener en cuenta que el
estatus de dicha vitamina en el recién nácido está directamente relacionado con el de
la vitamina D de la madre. Así, neonatos con madres deficientes en vitamina D,
tendrán comprometido el estatus de dicha vitamina. Los niveles séricos de 25‐
hidroxivitamina D en recién nácidos alimentados con leche materna no se
correlacionan con la concentración de vitamina D y sus metabolitos en la leche
humana, por lo que el aporte en estos lactantes se produce mediante síntesis
endógena después de la exposición a la luz solar o mediante suplementación. La
maduración de los mecanismos de absorción dependientes de vitamina D determina
en gran medida la capacidad del neonato para transportar de forma activa el calcio en
el tracto gastrointestinal para ser absorbido (Hsu y Levine, 2004).
5.2.3 Deficiencia y exceso de calcio en la infancia.
La hipocalcemia o bajos niveles de calcio, es un desorden común en el recién
nácido y ocurre cuando el calcio sérico total es menor de 1,75 mmol/L o la forma
ionizada menor que 1 mmol/L en recién nácidos prematuros, y 2 mmol/L o 1,2 mmol/L
respectivamente en recién nácidos a término (Jain et al., 2010). Los síntomas clínicos
de la hipocalcemia se relacionan principalmente con afecciones en el sistema cardiaco
III. Revisión Bibliografica
53
y neuromuscular (Mckay, 2010). Dependiendo del momento de aparición de la
hipocalcemia tras el nacimiento se pueden distinguir dos tipos:
a). Una hipocalcemia temprana en el recién nácido que puede ser debida a diversos
factores como prematuridad, diabetes materna, asfixia perinatal e hiperparatiroidismo
materno (Jain et al., 2010).
b) La aparición de hipocalcemia tardía en el neonato es menos común que la
temprana y ocurre normalmente al final de la primera semana de nacimiento (Jain et
al., 2010). Una hiperfosfatemia y como consecuencia una hipocalcemia, están
asociadas a altas ingestas de fósforo, que suele ocurrir en lactantes alimentados con
fórmulas infantiles que contienen más fosforo que la leche materna. Las convulsiones
en el recién nácido son a menudo consecuencia de una hipocalcemia, sin embargo
semanas después se produce, en general, una espontánea recuperación de la
homeostasis mineral. También puede revertir la hipocalcemia suplementando con
calcio la alimentación del recién nácido en suficiente cantidad para lograr una
adecuada relación de calcio/fosforo (Hsu y Levine, 2004).
La deficiencia en vitamina D en recién nácidos también puede manifestarse como
hipocalcemia después de unos pocos días del nacimiento cuando la absorción
intestinal de calcio se produce por transporte activo dependiente de esta vitamina
(Hsu y Levine, 2004).
La hipercalcemia o exceso de calcio neonatal no es muy común pero, cuando
ocurre, la causa más frecuente suele ser un incremento en la movilización del calcio
esquelético. También se han descrito casos de hipercalcemia por una administración
excesiva del mismo a través de la dieta o suplementos. La hipercalcemia no es
fácilmente reconocible ya que los primeros síntomas son inespecíficos y pueden ser
confundidos con otros procesos comunes como anorexia, vómitos, estreñimiento, etc.,
lo que supone un gran problema cuando se produce ya que su dificultad en
reconocerla puede ocasionar daños mayores al recién nácido (Hsu y Levine, 2004).
III. Revisión Bibliográfica
54
5.3 Biodisponibilidad de hierro
La principal función del hierro es fijar de forma reversible el oxígeno para su
transporte o almacenamiento, así como aceptar y liberar electrones para generar
fuentes inmediatas de energía (Monteagudo y Ferrer, 2010). Además, este elemento
participa en múltiples procesos metabólicos, ya que se encuentra como componente
de enzimas y otros complejos moleculares. Dentro de sus funciones principales se
pueden mencionar: transporte de oxígeno a los tejidos a través de la hemoglobina,
síntesis de ADN al formar parte de la enzima ribonucleotido reductasa, y transporte de
electrones, por tener la capacidad de aceptarlos y donarlos (West y Oates, 2008). En el
sistema nervioso, el papel del hierro es muy importante ya que parece intervenir en la
síntesis, degradación y almacenamiento de neurotransmisores, serotonina, dopamina
y ácido gammaaminobutírico (GABA). La distribución del GABA y la dopamina en el
organismo coinciden aproximadamente con la de este metal, por lo que se ha sugerido
que debe existir alguna participación del hierro en las funciones dopaminérgicas y
gabaminérgicas (Suárez, Cimino y Bonilla 1985).
5.3.1 Absorción de hierro
La mayoría de los alimentos contienen dos formas diferentes de hierro: hierro
no hemo (o inorgánico) presente fundamentalmente en vegetales y hierro hemo que
forma parte de la hemoglobina y mioglobina de la carne (Zhang y Enns, 2009). Estas
dos formas de hierro se absorben mediante rutas diferentes y por lo tanto tienen una
eficiencia de absorción distinta. El hierro hemo es más soluble que el hierro no hemo y
además, la absorción de este último se ve afectada por otros factores,
fundamentalmente dietéticos como la presencia de proteínas, por lo que nuestro
organismo utiliza de manera más eficiente el hierro hemo (Haro et al., 2005). La única
fuente de alimento para los recién nácidos es la leche materna o la fórmula infantil, en
este sentido es importante destacar que la leche humana no contiene hierro hemo,
por lo que el hierro no hemo unido a las proteínas de la leche o a otras sustancias de
bajo peso molecular será la principal fuente de hierro para los lactantes (Collard,
III. Revisión Bibliografica
55
2010). El hierro puede absorberse a lo largo del todo el intestino pero
fundamentalmente lo hace en el duodeno, cuya absorción se ve aumentada de 3 a 4
veces en caso de existir una deficiencia en el organismo.
Respecto a la absorción de hierro no hemo; la mayoría del hierro dietético se
encuentra en la forma férrica (Fe3+), pero antes de ser transportado debe ser reducido
en el lumen, concretamente en la parte apical del enterocito. La enzima responsable es
una hemoproteína asociada con los enterocitos de la membrana apical, denominada
Dcytb (Duodenal cytochrome b), la cual tiene actividad ferrireductasa parecida a la del
citocromo b (McKie et al., 2001). Ya en la forma ferrosa (Fe2+), será transportado al
enterocito por el transportador DMT‐1, que también puede transportar otros cationes
divalentes como el Cu2+ y Zn2+ (Collard, 2010). El hierro en el citosol del enterocito
puede ser almacenado como ferritina o exportado al plasma mediante la ferroportina,
y la hefastina que son proteínas transportadoras. Así el hierro pasará a formar parte de
la transferrina (Zhang y Enns, 2009). Este proceso de absorción de hierro descrito se
puede observar detalladamente en la Figura 8.
Figura 8. Absorción intestinal de hierro no hemo (adaptada de Collard, 2009)
Los factores que incrementan la absorción de hierro no hemo a nivel intestinal
son la vitamina C que cambia el estado de oxidación del hierro a una forma más
soluble, el pH ácido, un aumento en la eritropoyesis, la presencia de carne y de
pescado por su contenido proteico, los azúcares y los aminoácidos. Mientras que los
Fe3+
Fe2+
Fe3+
Fe2+
H+
H+
Na+
e‐
Ferritina
Fe2+
Ferroxidasa
Dcytb
Fe3+
TransferrinaLUMEN ENTEROCITO
PLASMA
DMT‐1
FPN
III. Revisión Bibliográfica
56
factores que disminuyen la absorción de hierro son los siguientes: hipoclorhidria, los
oxalatos, la fibra, el calcio, los fosfatos, los fitatos y los polifenoles (Zimmermann y
Hurrel, 2007).
La hipótesis de la captación de hierro hemo mediante un receptor mediado por
endocitosis fue propuesta en 1979 con el descubrimiento de una proteína que se unía
a esta forma de hierro en las microvellosidades del enterocito en el intestino delgado
de cerdos y humanos (Grasbeck et al., 1979). Una vez dentro, el hierro es
metabolizado y liberado en las vesículas como hierro no hemo, siendo entonces
transportado por el DMT‐1 al citoplasma. El hierro hemo, también puede ser
catabolizado a no hemo en el retículo endoplasmático. Otra vía de entrada del hierro
hemo al citoplasma del enterocito es mediante el transportador HCP1 (heme carrier
protein 1) y desde la membrana basolateral a la sangre lo llevará el transportador
FLVCR (West y Oates, 2008).
La hormona hepcidina es la principal reguladora de la absorción de hierro y de
su distribución a los tejidos. Esta hormona es sintetizada principalmente en los
hepatocitos aunque también se expresa en niveles bajos en otras células y órganos
como macrófagos, adipocitos y cerebro. La producción de hepcidina es regulada por
los niveles de hierro; de este modo cuando el hierro es abundante, la producción de
esta hormona es estimulada, limitando la absorción de hierro y la liberación de las
moléculas de almacén. El mecanismo de acción de esta molécula se basa en su unión a
la ferroportina, proteína situada en la membrana basal del enterocito y que regula la
salida de hierro desde el enterocito dependiendo del estatus de este mineral en el
organismo (Ganz y Nemeth, 2011).
5.3.2 Homeostasis de hierro en el recién nácido
El feto muestra avidez por el hierro y lo va acumulando progresivamente, sobre
todo en el tercer trimestre de embarazo, almacenando aproximadamente 250 mg de
hierro que será utilizado durante la lactancia ya que ésta sólo proporciona 0,15 mg/día
del hierro absorbido, siendo los requerimientos de 0,55 mg/día (Zimmermann y Hurrel,
III. Revisión Bibliografica
57
2007). Por lo tanto, la leche materna no podrá satisfacer los requerimientos de hierro
del lactante, sin embargo las reservas del mineral que posee el recién nácido
proporcionan el hierro necesario durante los primeros meses de vida. Entre los 6 y 12
meses de vida, en lactantes alimentados con leche materna, más del 90% de los
requerimientos de hierro son satisfechos mediante la alimentación complementaria,
disminuyendo así el riesgo de desarrollar una deficiencia en hierro o incluso una
anemia ferropénica, que está asociada con efectos adversos en el desarrollo
neurológico (Domellöf, 2007). Los factores determinantes de las reservas de hierro en
el recién nácido son: madurez gestacional y estado nutricional, estado nutricional del
hierro de la madre, perdidas prenatales y pérdidas perinatales (Monteagudo y Ferrer,
2010).
Dube et al., (2010) realizaron un estudio retrospectivo, en el que se demostró la
hipótesis de que un niño alimentado con leche materna está protegido contra la
aparición de anemia deficiente en hierro durante los primeros meses de vida. Sin
embargo, también se observó que entre los niños que habían sido alimentados
exclusivamente con leche materna durante los 4 primeros meses de vida, un 21%
presentaron deficiencia en hierro y un 6% anemia deficiente hierro en la segunda
mitad de su infancia. Estos porcentajes fueron mayores a los encontrados en los
alimentados con fórmula infantil, por lo que estos autores remarcaron la necesidad de
incorporar la alimentación complementaria con fuentes de hierro de elevada
biodisponibilidad en edades tempranas (4‐6 meses).
5.3.3 Patologías asociadas al desequilibrio del hierro en la infancia
El hierro juega un papel importante en numerosos procesos bioquímicos y sus
requerimientos van a ser mayores en los periodos de rápido crecimiento y
diferenciación celular como son la última etapa de embarazo y el periodo neonatal.
Por esta razón, deficiencias durante estos periodos pueden provocar importantes
desórdenes en el desarrollo del niño (Collard, 2010).
III. Revisión Bibliográfica
58
Niveles inadecuados de hierro en los tejidos reducen la eritropoyesis y el
transporte de oxígeno. Además, el sistema nervioso parece ser susceptible a la
deficiencia y al exceso de hierro sobre todo, en etapas de rápido desarrollo como
puede ser en el recién nácido (Fredriksson, 2000). El mecanismo por el cual la
deficiencia en hierro tiene efectos negativos en el cerebro no ha sido completamente
dilucidado. Sin embargo, se cree que el exceso del mismo puede producir efectos
negativos al generar radicales libres mediante las reacciones Fenton y Heber‐Weiss. Se
ha comprobado también que el exceso de hierro también puede favorecer la
colonización bacteriana (Collard, 2010).
Según datos de la OMS se estima que un 24,8% de la población padece anemia,
y en su mayoría es de tipo ferropénico (De Benoist et al., 2008), siendo la prevalencia
de este tipo de anemia en lactantes de entre 2‐4,3%.
La deficiencia nutricional de hierro surge cuando los requerimientos fisiológicos
no pueden ser cubiertos mediante la absorción del hierro de la dieta, siendo el riesgo
de deficiencia mayor cuando los requerimientos de hierro son superiores al ingreso de
hierro al organismo. Esta situación ocurre en lactantes, niños, adolescentes y en
mujeres en edad reproductiva y embarazadas (Zimmermann y Hurrel, 2007).
El flujo cerebral del hierro es muy lento, por lo tanto, las deficiencias
producidas en etapas tempranas de la vida son muy difíciles de corregir y tienden a
persistir (Suárez, Cimino y Bonilla, 1985). Además, el hierro es imprescindible para la
mielinización de las neuronas (Guyton y Hall, 2006). También se ha relacionado la
presencia de este mineral con la actividad del hipocampo y ciertas áreas de la
memoria. De hecho muchas enfermedades degenerativas cerebrales como Parkinson o
la demencia, parecen tener su origen en alteraciones del metabolismo del hierro
(Friedman et al., 2006, Oakley et al., 2007).
Así mismo, se ha correlacionado la falta de hierro con la “pica”, trastorno de la
conducta alimentaria en el que se produce un consumo constante e inadecuado de
sustancias no nutritivas durante un período de al menos un mes. Aunque la causa de la
III. Revisión Bibliografica
59
pica aún es desconocida, algunos estudios epidemiológicos y clínicos la relacionan con
una deficiencia en hierro y cinc. Se ha descrito pica y déficit de hierro en mujeres
embarazadas, niños y en personas con pérdidas sanguíneas digestivas entre otros. La
administración de hierro parece resolver este transtorno en muchos casos, incluso
antes de verse corregida la anemia (Viguria y Miján de la Torre, 2006).
5.4 Biodisponibilidad de cinc
El cinc es un elemento que forma parte de varias enzimas y metaloproteinas, y que
posee funciones de vital importancia como la participación en la reparación del ADN,
en el crecimiento celular y replicación, en la expresión génica, en el metabolismo
proteico y lipídico, en el sistema inmune y en la actividad hormonal (Haug, Høstmark y
Harstad, 2007). De hecho, este elemento es requerido por más de 300 enzimas que
participan en numerosos funciones metabólicas. Además más de 2000 factores de
transcripción que regulan la expresión génica necesitan cinc para mantener su
integridad estructural y unirse al ADN (Murakami y Hirano, 2008).
El contenido en cinc en el cuerpo de un humano adulto oscila entre 1,5 y 2,5 g. La
mayor proporción de cinc corporal se encuentra en el músculo esquelético (60%),
también hay una importante cantidad en el hueso (25‐30%), aunque en el recién
nácido a término puede llegar a un 40% (Olivares et al., 2010). La cantidad total de cinc
en el cuerpo que se reduce durante la depleción, no es la misma en todos los tejidos.
Por ejemplo, en el músculo esquelético, piel y corazón, se mantiene mientras que los
niveles de cinc disminuyen en hueso, hígado, testículos y plasma. Por el momento, no
se conocen bien las señales que permiten que se mantenga los niveles de cinc en unos
tejidos y que en otros se libere (IZINCG, 2004).
5.4.1 Absorción de cinc
La eficiencia de absorción de cinc en adultos oscila normalmente entre un 15 y
un 35% y depende de la cantidad ingerida de cinc y de la presencia de otros factores
dietéticos que puedan inhibir su absorción como el ácido fítico, ácido oxálico u otros
III. Revisión Bibliográfica
60
minerales (Hess et al., 2009). La homeostasis del cinc se mantiene mediante la
regulación de la absorción y la excreción. La absorción media de cinc en recién nácidos
a término se encuentra entre un 20 y un 60%, pero es mayor en los niños alimentados
de modo natural (50‐60%) que en los alimentados con fórmulas infantiles (Domellöf et
al., 2009).
La captación de cinc intestinal ocurre mediante dos mecanismos, uno saturable
en el que participa un transportador específico y otro no saturable que se realiza por
difusión (Wang y Zhou, 2010). El transporte activo es mayor que el pasivo cuando la
ingesta de cinc es baja o normal, mientras que el pasivo ocurrirá cuando la ingesta es
elevada (Hess et al., 2009).
El Transporte transcelular es un proceso saturable y muy eficiente tras un consumo
bajo de cinc y depende de receptores y proteínas intracelulares que lo transportan.
Recientemente, se han descubierto dos familias de transportadores de cinc, las
proteínas ZIP y las proteínas ZnT. La primera familia de proteínas (ZIP) transporta el
cinc desde el espacio extracelular al interior de la célula o de las organelas al
citoplasma celular, llamándose proteínas importadoras de cinc. Hasta ahora se sabe
que el genoma humano codifica 14 proteínas diferentes de la familia ZIP, siendo las
más importantes la ZIP‐4, que tiene un papel clave en el transporte de cinc al interior
de la célula, y la ZIP‐5 que se expresa en la membrana basolateral del enterocito,
donde, en determinadas situaciones (bajo condiciones de repleción), puede ser el
responsable del transporte de cinc desde la circulación al enterocito (Hess, et al.,
2009). ZIP‐4 y ZIP‐5 sufren endocitosis por la membrana plasmática en situaciones de
repleción y depleción de cinc respectivamente (Wang y Zhou, 2010)
La segunda familia (ZnT) consta de 9 transportadores que están involucrados
principalmente en la captación de cinc por las organelas de la célula, disminuyendo así
la concentración citoplasmática (Hess et al., 2009). Las metalotioneínas son proteínas
pequeñas ricas en cisteína que se unen al cinc y a otros iones metálicos, siendo
responsables de la regulación intracelular de la concentración de cinc y de la
detoxificación de metales pesados no esenciales. Cuando la concentración de cinc
III. Revisión Bibliografica
61
alcanza un determinado umbral, se induce la activación de estas proteínas que
secuestran a los iones de cinc (Murakami y Hirano, 2008).
En la Figura 9 se muestran las tres fases del proceso de la absorción del cinc en el
enterocito mediante transporte activo. La primera consiste en la captación de cinc y su
introducción en la célula. La siguiente fase es el transporte en el interior de la célula.
La última etapa muestra la incorporación de cinc a la circulación sanguínea. La
asignación de los transportadores a cada organela está basada en estudios de co‐
localización en cultivos celulares. No obstante, todavía hay muchos aspectos que
definir en la absorción del cinc, la dirección del transporte y la exocitosis.
Figura 9. Transporte de cinc a través del enterocito mediante la ruta transcelular (adaptada de Wang y Zhou, 2010).
Aparato de Golgi
ZIP7ZnT5
ZnT6
ZnT7 ZnT2
Vesículas
ZnT5ZIP4
ZnT1
ZIP5
ZnT6
ZnT4
? Exocitosis
? Exocitosis
III. Revisión Bibliográfica
62
Se han descrito diversos factores que pueden afectar a la absorción de cinc y se
enumeran a continuación:
‐ Cantidad de cinc en la dieta: si el contenido en cinc es demasiado alto su
absorción se verá disminuida en relación a la cantidad ingerida. Este hecho, fue
demostrado por Sandström y Cederblad (1980) en un estudio in vivo, y se debe a la
absorción mayoritaria del cinc mediante un mecanismo saturable.
‐ La matriz en la que vaya disuelto el mineral también es importante. Se sabe que
se absorbe menor cantidad de cinc en la ingesta de un alimento sólido que en la
ingesta de un alimento con alto contenido en agua y en el que el cinc está solubilizado
(Lönerdal, 2000).
‐ Algunos antinutrientes presentes en la dieta como el ácido fítico pueden inhibir
de forma significativa la absorción de cinc. Este compuesto puede formar complejos
insolubles con diferentes minerales impidiendo su absorción (Hurrell et al., 1992). Este
factor no es importante para los lactantes menores de 4 meses ya que su alimentación
se basa únicamente en leche.
‐ Otro factor que puede inhibir la absorción de cinc es la cantidad de calcio
ingerida ya que diversos estudios in vitro han demostrado una correlación negativa en
la absorción de estos dos minerales (Frontela et al., 2009a).
‐ Cantidad y calidad proteica: la absorción se ve incrementada con el aumento de
la cantidad de proteína en la dieta (Sandström, 1992), aunque también hay que
destacar que los alimentos ricos en proteína son también una fuente de cinc por lo que
también se incrementa la ingesta de este mineral. Por otro lado, se ha observado que
la proteína animal contrarresta el efecto inhibidor del ácido fítico en la absorción de
este micronutriente, ya que favorece la solubilidad del cinc (Sandström y Cederblad,
1980). Lönerdal, (1984) en un estudio in vivo realizado en adultos, comparó dos
fórmulas infantiles que diferían en la relación caseína:lactosuero, concluyéndose que
III. Revisión Bibliografica
63
se producía un aumento significativo en la absorción de cinc en la fórmula rica en
proteínas del lactosuero.
5.4.2 Homeostasis de cinc en el recién nácido
Los recién nácidos a término poseen importantes almacenes hepáticos de cinc,
no ocurre lo mismo en prematuros en los que esas reservas son bajas. Por esta razón,
la alimentación de los lactantes prematuros debe ser reforzada con cinc, incluso
cuando reciben leche materna. Sin embargo todavía se desconocen las consecuencias
fisiológicas y la duración óptima de la suplementación con cinc, lo que es motivo de
preocupación no solo por la deficiencia en cinc sino que también por los posibles
efectos tóxicos que podría producir un exceso de este mineral (Klein, 2002).
En adultos, la homeostasis de cinc se consigue principalmente a través de un
equilibrio entre la absorción intestinal y la excreción endógena. La absorción intestinal
de cinc en adultos esta inversamente relacionada con la cantidad ingerida de cinc. Por
el contrario, en recién nácidos se encontró una correlación positiva entre la absorción
de cinc y sus niveles en la dieta (Krebs et al., 2003). Todo esto sugiere que la regulación
de cinc en los lactantes no está tan estrechamente regulada como en adultos y la alta
capacidad de absorción de este mineral puede inducir toxicidad potencial, por lo que
los mecanismos que regulan la homeostasis de cinc dependen de la maduración
intestinal (Jou et al., 2010).
5.4.3 Deficiencia de cinc en la infancia
Los mecanismos para mantener el equilibrio corporal de cinc son muy eficientes,
pero se sabe que ingestas bajas, determinados estímulos fisiológicos o patológicos, o
defectos genéticos pueden alterar ese equilibrio y causar desórdenes en los tejidos
comprometiendo el sistema inmune y la función neuronal (Wang y Zhou, 2010).
III. Revisión Bibliográfica
64
La deficiencia de cinc después del parto puede deberse a diferentes factores que
incluyen, un aumento de las necesidades nutricionales de cinc, una ingesta
inadecuada, una absorción reducida, o un aumento de pérdidas de cinc endógeno
(Krebs et al., 2006).
La deficiencia en cinc es común en recién nácidos y niños de países en desarrollo, y
va a producir un retardo en el crecimiento, un incremento en el riesgo de infección y
un neurodesarrollo deficiente (Domellöf et al., 2009). En humanos, la acrodermatititis
enteropática es un desorden congénito debido a la mala absorción de cinc. Los
pacientes que sufren este desorden tienen los síntomas clásicos de deficiencia en cinc
incluyendo, dermatitis, diarrea, retardo en el crecimiento, disfunción inmune, y
ocasionalmente alteraciones neuronales. El gen que codifica el transportador ZIP4 ha
sido identificado como el responsable de esta enfermedad (Wang y Zhou, 2010).
III. Revisión Bibliografica
65
6 EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOTA INTESTINAL EN LACTANTES
Existen aproximadamente 1000 especies diferentes de bacterias autóctonas
presentes en el intestino grueso de un individuo adulto, lo que supone 1014 ufc/g heces
(Dethlefsen et al., 2006). En la Tabla 5 se presenta un resumen de algunos de los
grupos principales que habitan el intestino de adultos, así como sus productos de
fermentación.
Tabla 5: Bacterias anaerobias predominantes en el intestino grueso y sus productos de la fermentación (Salminen et al., 1998).
En general, las bacterias intestinales se pueden clasificar según ejerzan efecto
beneficioso o perjudicial sobre la salud del hospedador (Gibson y Roberfroid, 1995).
Así decimos entonces que E. coli y algunas especies de Clostridios son patógenos
potenciales pudiendo provocar diarrea y desórdenes gastrointestinales en el
hospedador. La mayoría de bacterias del colon son anaerobias obligadas y la energía la
obtienen de los procesos de fermentación. Los principales sustratos utilizados en estos
procesos de fermentación, son los carbohidratos y las proteínas que no se digieren en
Log10ufc/g Productos de fermentación
Bacteroides 11,3 (9,2‐13,5) Acetato, Propionato, Succinato
Eubacteria 10,7 (5‐13,3) Acetato, Butirato, Lactato
Bifidobacteria 10,2 (4,9‐13,4) Acetato, Lactato, Formato, Etanol
Clostridia 9,8 (3,3‐13,1) Acetato, Propionato, Butirato, Lactato, Etanol
Lactobacillus 9,6 (3,6‐12,5) Lactato
Fusobacteria 8,4 (5,1‐11,0) Butirato, Acetato, Lactato
Ruminococci 10,2 (4,6‐12,8) Acetato
Peptostreptococci 10,1 (3,8‐12,6) Acetato, Lactato
Peptococci 10,0 (5,1‐12,9) Acetato, Butirato, Lactato
Propionibacteria 9,4 (4,3‐12,00) Acetato, Propionato
Actinomyces 9,2 (5,7‐11,1) Acetato, Lactato, Succinato
Streptococci 8,9 (3,9‐12,9) Lactato, Acetato
Escherichia 8,6 (3,9‐12,3) Mezcla ácidos orgánicos
Desulfovibrios 8,4 (5,2‐10,9) Acetato
Methanobrevibacter 8,8 (7,0‐10,5) Metano
III. Revisión Bibliográfica
66
el intestino delgado y llegan intactos al colon. En el colon proximal encontramos un
ambiente sacarolítico y es ahí donde los carbohidratos son fermentados, el digerido se
va trasladando en dirección al colon distal donde disminuye la disponibilidad de
hidratos de carbono mientras que predomina la de proteínas y aminoácidos que sirven
como fuente de energía para las bacterias de esta región (Macfarlane, Gibson y
Cummings, 1992).
Aunque el principal sustrato para el crecimiento bacteriano son los carbohidratos,
algunos de ellos son preferiblemente fermentados por Bifidobacterias (FOS: fructo‐
oligosacáridos, GOS: galacto‐oligosacáridos y lactulosa) y otros por toda la flora
colónica (almidones resistentes). Los principales productos de la fermentación de estos
sustratos son los ácidos grasos de cadena corta (acetato, propionato y butirato) y otros
metabolitos como lactato, piruvato, etanol, succinato y gases (H2, CO2, CH4 y H2S)
(Levitt et al., 1995). Las proteínas y aminoácidos son también fermentables por la flora
del colon, siendo las principales especies proteolíticas Bacteroides y Clostridios
(Macfarlane y Macfarlane, 1997). La fermentación de proteínas va a producir ácidos
grasos de cadena corta pero diferentes a los producidos en la fermentación de
hidratos de carbono, predominando isobutirato, isovalerato y otros compuestos
nitrogenados, algunos de los cuales pueden ser tóxicos (amonio, aminas y compuestos
fenólicos) (Macfarlane y Macfarlane, 1995). Una excesiva fermentación proteica en el
colon distal se ha relacionado con determinados tipos de cáncer como el de colon.
Actualmente se sabe que la actividad bacteriana en el colon está directamente
relacionada con la aparición de determinadas enfermedades.
El estudio de la composición de la microbiota intestinal en heces, tanto cuantitativa
como cualitativamente, ha sido frecuentemente llevado a cabo mediante técnicas
dependientes de cultivo (Gueimonde y de los Reyes‐Gavilán, 2009). Sin embargo,
muchas bacterias son difíciles de cultivar e incluso algunas pueden no ser cultivables,
además, los medios de cultivo a menudo no son verdaderamente específicos o
selectivos para determinadas bacterias, y es imposible estudiar y comparar
ecosistemas completos mediante técnicas dependientes de cultivo. Actualmente ya
existen herramientas moleculares para el estudio de la microbiota intestinal
III. Revisión Bibliografica
67
(Bezirtzoglou et al., 2011). Entre estas técnicas destacamos la PCR en tiempo real
cuantitativa ya que es un método exacto, sensible y especifico que cada vez se utiliza
más para el estudio de las diferentes poblaciones bacterianas que habitan en el
intestino (Chen, Cai y Feng, 2007)
6.1 Importancia de la microbiota intestinal en la salud del hospedador.
La composición de la microbiota normal juega un papel importante en la salud del
hospedador ya que está involucrada en la nutrición, patogénesis e inmunología del
mismo (Bezirtzoglou et al., 2011). La presencia de bacterias en el intestino, tiene una
gran influencia en la expresión génica en las células de la mucosa. Así, se ha visto que
la colonización de ratones libres de gérmenes por Bacteroides thetaiotamicron, que es
un microorganismo común en la microbiota intestinal, induce la expresión de genes
implicados tanto en la defensa del organismo y la regulación de la función intestinal de
barrera como en la vascularización del epitelio y la digestión/absorción de nutrientes
(Hooper y Macpherson, 2010).
Los estudios de colonización intestinal controlada han identificado tres funciones
principales de la microbiota intestinal (Guarner, 2011):
‐ Función de nutrición y metabolismo: es el resultado de la actividad bioquímica
de la microbiota e incluye entre otros procesos recuperación de energía en
forma de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), producción de vitaminas y
efectos favorables sobre la absorción del calcio y el hierro.
‐ Función de protección: previene la invasión de agentes infecciosos o el
sobrecrecimiento de especies bacterias potencialmente patógenas.
‐ Funciones tróficas: la microbiota intestinal está involucrada en la proliferación y
diferenciación del epitelio intestinal y sobre el desarrollo y modulación del
sistema inmune.
La causa de diversos desórdenes no intestinales que incluyen, alergias, asma,
diabetes, obesidad, cáncer y alguna neuropatía, han sido asociados con cambios en la
composición de la microbiota intestinal (Gill y Finlay, 2011).
III. Revisión Bibliográfica
68
6.1.1 Sistema inmune
El tracto gastro‐intestinal es el primer lugar de interacción entre el sistema
inmune del hospedador y microorganismos tanto simbióticos como patógenos. En
todos los mamíferos, inmediatamente después del nacimiento comienza el proceso de
colonización por microorganismos del medio ambiente circundante (Round y
Mazmanian, 2009). La asociación de tejido linfoide al intestino nos protege de las
bacterias intestinales, lo que comprende nódulos linfoides mesentéricos, placas de
Peyer, folículos linfoides aislados en el intestino delgado, células inmunes en la lámina
propia de la mucosa y linfocitos intraepiteliales (Figura 10).
Figura 10: Esquema del tejido linfoide asociado al intestino
(Adlerberth y Wold, 2009).
El tracto gastro‐intestinal de un humano adulto comprende un complejo
ecosistema bacteriano, en el que las bacterias simbióticas aportan diversos beneficios
al hospedador. Sin embargo, la microbiota normal de un individuo también incluye
Lumen intestinal
Placas de Peyer
linfocito Tlinfocito B
Nódulo linfoide mesentérico
célula de Paneth
célula de plasmamacrófago
célula dendrítica
vellosidad
mucusbacteria
células MLamina propialinfocito
Linfocitointraepitelial
Cripta
Centro germinal
III. Revisión Bibliografica
69
microorganismos que producen inflamación bajo determinadas condiciones. Por lo
tanto, la microbiota posee la capacidad de producir respuesta anti‐inflamatoria pero
también inflamatoria estando la composición de las poblaciones bacterianas
intestinales íntimamente relacionada con el funcionamiento del sistema inmune
(Round y Mazmanian, 2009).
Varios estudios de colonización selectiva, realizados en laboratorio con
animales libres de gérmenes, observaron que la microbiota intestinal podía ejercer
diferentes efectos sobre el sistema inmune del hospedador. Estos animales mostraron
defectos en el tejido linfoide asociado al intestino y en la producción de anticuerpos,
además, sus placas de Peyer y nódulos linfoides mesentéricos fueron menores en
número y más pequeños comparando con animales colonizados (Round y Mazmanian,
2009).
Los antibióticos y la dieta están asociados con el desarrollo de alergias y asma,
pero también son factores que influyen en la composición de la microbiota intestinal.
Hasta ahora la evidencia de que la microbiota intestinal influía en las alergias, se
basaba en estudios epidemiológicos. Numerosos estudios indican que la microbiota
intestinal es diferente en individuos atópicos en relación a los no atópicos (Bjorksten et
al., 2001). Se ha observado también que niños alérgicos procedentes de dos países
diferentes, uno con baja incidencia de alergias (Estonia) y otro con alta incidencia
(Suecia) poseen composiciones similares de microbiota intestinal (Bjorksten et al.,
1999). Los niños alérgicos tienen mayores niveles de microrganismos aerobios y
menores de anaerobios y anaerobios facultativos, especialmente del genero
Lactobacillus.
6.1.2 Protección contra patógenos
Los microorganismos del tracto gastrointestinal constituyen una barrera
ocupando un espacio o nicho ecológico, de forma que no lo pueda ocupar un
microorganismo extraño. Además un equilibrio en la composición de la microbiota
intestinal asegura que bacterias oportunistas, presentes en el intestino, no proliferaren
III. Revisión Bibliográfica
70
causando enfermedad. Además, la función de barrera se debe también a la capacidad
de algunas bacterias para producir sustancias antimicrobianas que inhiben la
proliferación de otras y por la competición por los nutrientes (Lievin et al., 2000).
6.1.3 Obesidad
La actividad metabólica de la microbiota intestinal facilita la extracción de
calorías de los alimentos ingeridos, ayudando a almacenar dicha energía en el tejido
adiposo del hospedador para su posterior utilización, y proporcionando, al mismo
tiempo, combustible y nutrientes necesarios para el crecimiento y proliferación
microbiano. Además, parece ser que la microbiota de una persona posee una
eficiencia metabólica específica y que ciertas características de su composición podrían
predisponer a la obesidad (Backhed et al., 2005).
Estudios recientes como el llevado a cabo por Ley, (2006) sugieren que existen
diferencias en la composición de la microbiota intestinal entre ratones obesos y con
normopeso. En este sentido un estudio realizado en niños, reveló que los niveles de
Bifidobacterias eran superiores en los niños con peso normal respecto a los niños con
sobrepeso u obesidad (Kalliomäki et al., 2008).
6.1.4 Producción de metabolitos
Las interacciones mutualistas entre la microbiota entérica y el hospedador son
esenciales para el mantenimiento de la salud. Los microorganismos presentes en el
intestino pueden secretar moléculas que inhiben a patógenos y pueden producir
sustancias bioactivas como el ácido linoleico conjugado (CLA), ácidos grasos de cadena
corta (AGCC) y ácido γ‐aminobutírico (GABA) que pueden jugar un papel de protección
contra enfermedades causadas por el estilo de vida (cáncer, obesidad, y enfermedad
cardiovascular). La microbiota intestinal también interviene en rutas bioquímicas que
el ser humano no es capaz de llevar a cabo como son, la fermentación de polisacáridos
no digeribles, el metabolismo de proteínas complejas y la síntesis de determinadas
vitaminas. Además, la colonización bacteriana del intestino y la interacción entre las
III. Revisión Bibliografica
71
diferentes poblaciones de microorganismos, juegan un importante papel en la
maduración del sistema inmune en los primeros días de vida del niño (Marques et al.,
2010).
El CLA es una mezcla de isómeros conjugados del ácido graso esencial ”linoleico”, y
es producido por los siguientes grupos bacterianos: Lactobacillus, Propionibacterium,
Bifidobacterium, Pediococcus, Enterococcus y Lactococcus (Ross et al., 2010). Este
compuesto ha demostrado tener propiedades anticarcinogénicas, anti‐inflamatorias e
inmunomoduladoras (Bhattaacharya et al., 2006)
Los AGCC (ácidos grasos de cadena corta) son los productos finales de la
fermentación bacteriana de diferentes sustratos en el intestino, principalmente
hidratos de carbono pero también proteínas. Éstos son rápidamente absorbidos en el
colon, rescatando una energía que podía haber sido perdida en la excreción a través de
las heces. Los AGCC poseen un papel importante en la estimulación de la absorción de
agua y sodio, previenen la diarrea disminuyendo el pH luminal que evita el crecimiento
y proliferación de bacterias potencialmente patógenas y protege contra la
carcinogénesis en el colon disminuyendo la biodisponibilidad de aminas toxicas (Knol
et al., 2005; Puccio et al., 2007). Este descenso de pH también ha sido relacionado con
una mayor absorción mineral (Weaver et al., 2011). Un estudio reciente ha
demostrado que estos ácidos se pueden unir a un receptor (GPR43) y su interacción
influye en el sistema inmune y la respuesta inflamatoria (Maslowski et al., 2009).
Además, el ácido butírico es la principal fuente de energía de los colonocitos (Marques
et al., 2010). Por otro lado el patrón de AGCC refleja una determinada actividad
metabólica en el colon, por lo que cambios en dicho patrón a menudo indican cambios
en la composición de la microbiota intestinal (Knol et al., 2005).
El ácido γ‐aminobutírico es un aminoácido no proteico que actua como neuro
transmisor en el sistema nervioso central y ejerce varias funciones como inducción de
hipotensión y diuresis (Komatsuzaki et al., 2008). Es producido principalmente por
Lactobacillus (Forsythe et al., 2010) y ha sido utilizado en el desarrollo de productos
III. Revisión Bibliográfica
72
funcionales como carne fermentada, queso (Komatsuzaki et al., 2008) y yogurt (Park y
Oh, 2007).
Además la microbiota intestinal ha sido reconocida como fuente de vitaminas que
no pueden ser sintetizadas por mamíferos y deben ser obtenidas mediante la
absorción intestinal. Entre las vitaminas producidas por las bacterias comensales que
componen la microbiota intestinal se encuentran la vitamina K y la mayoría de
vitaminas hidrosolubles del grupo B, incluyendo la biotina, el ácido nicotínico, los
folatos, la riboflavina, la tiamina, la piridoxina, el ácido pantoteico y la cobalamina
(Rossi, Amaretti y Raimondi, 2011). La vitamina K2 (menaquinona), es importante para
el hueso y la salud vascular (Greer, 2010). La vitamina B12 (cobalamina), es importante
en la vida fetal y la infancia durante el rápido crecimiento que se produce y en el
desarrollo del sistema nervioso (Hay et al., 2008). La vitamina B9 (ácido fólico) que
interviene en numerosas rutas metabólicas, su deficiencia se ha relacionado con
determinados tipos de cáncer y es esencial en el desarrollo fetal (Rossi, Amaretti y
Raimondi, 2011).
6.2 Colonización de la microbiota intestinal en el neonato
La composición y cantidad de grupos microbianos a lo largo del tracto
gastrointestinal es diferente en cada región del intestino debido a las características
fisicoquímicas de cada una de ellas (Macfarlane et al., 1997). La colonización está
influenciada en primer lugar por el pH luminal y por el lento tránsito del alimento hacia
el colon. El movimiento del digerido a través del estómago y el intestino delgado en el
niño es rápido (4‐6 h) cuando lo comparamos con el tránsito colónico en adultos (48‐
70 h) (Macfarlane y Gibson, 1994). En la boca, donde el pH es alcalino, encontramos
que el número de células es de aproximadamente 108 cels/ml, este valor va ir
disminuyendo en el estómago y duodeno debido al pH ácido y comienza a aumentar
de nuevo en el íleon para llegar a 1012 células/ml en el colon (Macfarlane y McBain,
1999).
III. Revisión Bibliografica
73
Hasta hace poco, se creía que el feto se desarrollaba en un ambiente estéril en el
útero, y con la rotura de membranas en la iniciación del nacimiento comenzaba la
exposición a un ambiente nuevo colonizado por microorganismos (Tiihonen et al.,
2010). Sin embargo la colonización bacteriana del intestino humano es un complejo
proceso que parece comenzar a pequeña escala durante el periodo fetal (Jiménez et
al., 2008b, Martín, et al., 2012). En el momento del nacimiento ocurre la colonización
más importante microbiana del tracto gastrointestinal. Las superficies mucosas
estériles (digestivas, urogenitales, naso‐bucal y respiratorias) constituyen una serie de
nichos ecológicos que favorecen el establecimiento de las diferentes poblaciones
microbianas. La microbiota materna es normalmente la que comienza a colonizar, pero
recientemente, se han detectado microorganismos en el líquido amniótico, placenta y
cordón umbilical (Pettker et al., 2007), lo que sugiere que estas bacterias también
pueden formar parte de la primera colonización del tracto gastro‐intestinal del recién
nácido (Wall et al., 2009). En ausencia de los sofisticados mecanismos del adulto, el
tracto digestivo del recién nácido es un ambiente especialmente permisivo para la
colonización microbiana, alcanzando niveles de 1011 ufc/g de heces de un modo rápido
(Dore y Corthier, 2010).
Las bacterias anaerobias facultativas van a ser las primeras en habitar el tracto
gastrointestinal, mientras que las bacterias anaerobias estrictas no colonizan de un
modo inmediato el intestino debido a la presencia de oxígeno. Más concretamente
podemos decir que especies pertenecientes a las familias Enterobacteriaceae
(Escherichia coli) y Enterococcaceae (Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium) son
las primeras bacterias en colonizar el intestino de neonatos (Adlerberth y Wold, 2009).
Los niveles poblacionales de estas bacterias en niños recién nácidos podrían ser de
1010 ufc/g de heces, sin embargo en adultos se encuentran en menor concentración,
106‐108 ufc/g de heces. Mientras que otras bacterias pertenecientes a los géneros
Klebsiella y Enterobacter (familia Enterobacteriaceae) son comunes en la microbiota
intestinal de los lactantes pero no en la de adultos. Otras bacterias facultativas que
frecuentemente colonizan el intestino durante la primera etapa de la vida, son los
Estafilococos coagulasa negativos, mientras que la colonización por Staphylococcus
aureus es rara (Adlerberth y Wold, 2009).+
III. Revisión Bibliográfica
74
La colonización por levaduras en recién nácidos ha sido poco estudiada. Adlerberth
y Wold, (2009) observaron en un estudio, que durante la primera semana de vida
ningún niño era colonizado por levaduras, mientras que menos de un 15% lo era el
primer mes, llegando a un porcentaje de colonización del 50% a los cuatro meses. Los
niveles de levaduras en los niños de esta edad oscilan entre 103 y 105 ufc/ g de heces.
Los microorganismos anaerobios facultativos consumen el oxígeno, reduciendo el
ambiente, que en poco tiempo será colonizable por anaerobios estrictos. Es en este
momento cuando los géneros Bifidobacterium, Bacteroides y Clostridium spp.
comienzan a colonizar el intestino de los lactantes durante la primera semana de vida.
Estudios basados en técnicas moleculares, corroboran la dominancia de estos tres
géneros y la gran variabilidad que existe entre individuos durante los primeros meses
de vida lo que puede explicarse por la continua exposición y recolonización de
bacterias ambientales (Reinhardt et al., 2009).
La colonización intestinal de Lactobacilos en recién nácidos ha sido un aspecto
controvertido ya que los resultados obtenidos en diversas investigaciones conducen a
conclusiones diferentes. La mayoría de estudios han mostrado bajos porcentajes de
colonización de Lactobacilos en lactantes de países occidentales, mientras que otros
estudios observaron altos niveles (107‐9 ufc/g heces) de este género microbiano. Lo
que ha sido demostrado en numerosos estudios es que el nivel de Bifidobacterias es
superior al de Lactobacilos (Chen, Cai y Feng, 2007).
Con el tiempo un gran número de especies anaerobias se establecen en el intestino
del neonato, y comienzan a expandirse y a competir con las bacterias anaerobias
facultativas que disminuyen su población respecto a los anaerobios estrictos hasta la
proporción 100‐1000:1 en el individuo adulto (Adlerberth y Wold, 2009).
En el nacimiento, como hemos dicho anteriormente, comienza la colonización del
intestino del niño cuya microbiota no es estable, sin embargo es aproximadamente a
los dos años cuando su microbiota será compleja y más estable, lo que impidedirá la
III. Revisión Bibliografica
75
colonización por ciertas bacterias. A esta edad se introducen los alimentos sólidos y la
microbiota es más parecida a la de un adulto (Marqués et al., 2010).
6.3 Factores que intervienen en la colonización
Son muchos los factores que influyen en la colonización microbiana del tracto
gastrointestinal de los recién nácidos. A continuación se describen algunos de ellos:
6.3.1 Tipo de parto (vaginal o cesárea)
La primera y principal fuente de bacterias que comienzan a colonizar el tracto
gastrointestinal de los niños nácidos mediante parto vaginal es la de la madre, la
microbiota de su tracto gastrointestinal, de la vagina y de la piel. Otra fuente
importante es el ambiente que rodea al parto. Los niños nácidos por cesárea no son
inmediatamente expuestos a la microbiota de madre y sí lo son al ambiente
hospitalario (Buddington y Sangild, 2011). Un parto por cesárea está asociado a un
prolongado retraso de la colonización de Bifidobacterium, Escherichia coli y
Bacteroides y a una colonización oportunista de las bacterias potencialmente
patógenas (Clostridium difficile) (Adlerberth y Wold, 2009; Marques et al., 2010).
Por lo tanto se considera demostrada la influencia del tipo de parto en el patrón
de la colonización microbiana intestinal. La relación entre microorganismos anaerobios
y anaerobios facultativos resulta ser menor en niños nácidos por cesárea que por parto
vaginal en un estudio realizado por Adlerberth et al., (2007). Además, Huurre et al.,
(2008) demostraron que el tipo de parto influía no sólo en la colonización intestinal
sino que ejercía un gran efecto sobre la función inmune del recién nácido.
6.3.2 Administración de antibióticos
Los recién nácidos que por diversos motivos (enfermedades, bajo peso,
prematuridad…) deben permanecer en el hospital, presentan cambios notables en la
colonización bacteriana intestinal y en parte es debido a la administración de
III. Revisión Bibliográfica
76
sustancias antimicrobianas. Éstos compuesos también pueden ser administrados a los
niños que se encuentran ya en sus casas pero afectados por diversas infecciones.
El uso de antibióticos en el recién nácido o en la madre, altera el equilibrio de la
flora intestinal de forma negativa, induciendo un descenso en las poblaciones de
anaerobios estrictos. Su microbiota intestinal estará entonces dominada por
Estafilococos coagulasa negativa, Enterococos y Enterobacterias, además de levaduras
debido a que esas bacterias pueden ser seleccionadas por su resistencia a compuestos
microbianos de amplio espectro (Adlerberth y Wold 2009). Sin embargo, el efecto
observado difiere entre antibióticos y normalmente la mayoría de familias y géneros
microbianos intestinales volverán a sus niveles tras unas semanas de exposición a los
agentes antimicrobianos (Marques et al., 2010).
En un estudio reciente, llevado a cabo por Savino et al., (2010) en el que
compararon la microbiota intestinal de lactantes alimentados exclusivamente con
leche materna antes y después de ser sometidos a tratamientos antibióticos durante
cinco días, observaron que la composición de la microbiota se modificaba
significativamente. La antibioterapia produjo un descenso en Enterobacteriaceae,
Enterococci, Lactobacilli y bacterias totales.
6.3.3 Tiempo de gestación
La flora de niños nácidos de forma prematura es diferente a la de los que llegan al
término del embarazo. Esto es debido a la inmadurez del intestino del recién nácido, al
largo tiempo en la unidad de cuidados intensivos del hospital y al uso de antibióticos
de amplio espectro (Marques et al., 2010). Arboleya et al., (2012) en un estudio
comparativo entre recién nación prematuros y a término, observaron un incremento
en los microorganismos anaerobios facultativos (Enterobacteriaceae, Enterococcaceae
y en el grupo Lactobacillus) y un descenso en anaerobios.
III. Revisión Bibliografica
77
6.3.4 Condiciones sanitarias que rodean el momento del parto y la estancia en el
hospital.
Los niños que nacen bajo condiciones sanitarias deficientes y/o de hacinamiento
en países en desarrollo son colonizados antes por E. coli y otras Enterobacterias,
Enterococos y Lactobacilos que los niños nácidos en la sociedad occidental (Adlerberth
y Wold 2009). Actualmente, las condiciones de higiene durante el parto son más
estrictas, se ha reducido la exposición bacteriana que ha provocado cambios en el
patrón de colonización siendo el género Staphylococccus el primero en colonizar, en
lugar de la familia Enterobacteriaceae (Marques et al., 2010).
6.3.5 Estructura y ambiente familiar
Son varios los estudios que relacionan el ambiente familiar en el que nace el niño
con la composición de la microbiota. En un estudio llevado a cabo por Penders et al.,
(2006) demostraron que los niños con hermanos mayores tuvieron menores recuentos
de bacterias totales, y además, estos niños presentaron mayores proporciones de
Bifidobacterias. En este estudio, no pudieron confirmar un efecto en la microbiota
intestinal por la presencia de mascotas en casa.
Adlerberth et al., (2007) también evaluaron la influencia de tener hermanos
mayores en la composición de la microbiota intestinal, y observaron que los niños que
no tenían hermanos presentaban mayores recuentos de Enterobacterias diferentes de
E. coli y Clostridios y una menor relación de anaerobios/bacterias facultativas. Este
hecho sugiere que los niños sin hermanos tenían un patrón de colonización menos
maduro, mostrando una cierta semejanza con los niños nácidos por cesárea. Estos
autores tampoco encontraron relación entre la posesión de mascotas en casa y
diferencias en la microbiota intestinal.
III. Revisión Bibliográfica
78
6.3.6 Diferencias geográficas
Recientemente en un estudio comparó la microbiota intestinal de niños nácidos en
diferentes países europeos pero con características similares, encontrándose
diferencias en la composición de la microbiota. Los niños nácidos en países del norte
de Europa presentaron mayores niveles de Bifidobacterias (Fallani, et al., 2010).
6.3.7 Alimentación
Tradicionalmente se ha considerado que la microbiota intestinal de los lactantes
alimentados con leche humana estaba dominada por Bifidobacterias y en menor
cantidad por Lactobacilos, Estreptococos, Estafilococos, Enterococos y Enterobacterias.
No ocurría lo mismo con la microbiota intestinal de niños alimentados con fórmulas
infantiles, su microbiota era más diversa e incluía bacterias de los grupos Bacteroides,
Clostridium y Enterobacteriaceae (Penders et al., 2006). Sin embargo, actualmente,
que los lactantes alimentados con leche materna tengan niveles más altos de
Bifidobacterias es objeto de controversia, ya que algunos estudios no han encontrado
diferencias entre los dos tipos de alimentación (Palmer et al., 2007; Adlerberth y Wold
2009).
En el estudio llevado a cabo por Penders et al., (2006) en el que se evaluaron
posibles factores que influyen en la composición de la microbiota intestinal, la
alimentación del niño resultó ser el más importante. La leche humana es una fuente
importante de bacterias comensales, mutualistas o probióticas para el intestino del
niño. La leche de cada madre tiene una composición bacteriana única como ocurre con
la flora intestinal de niños y adultos. Entre las bacterias predominantes destacan
diversas especies de los géneros estafilococcos, estreptococos y bacterias lácticas.
Estas bacterias pueden desempeñar un papel importante en la prevención de algunas
enfermedades y en la maduración del sistema inmune (Rodríguez et al., 2008). Se
estima que el lactante ingiere 800 ml de leche al día y con ella 105 y 10 7 bacterias
(Hekkilä y Saris, 2003; Martín et al., 2003)
III. Revisión Bibliografica
79
6.4 Perspectivas futuras en la modificación de la microbiota intestinal
En apartados anteriores de la presente tesis doctoral se han descrito las funciones
de la microbiota intestinal, comprendiendo su importancia en la defensa contra
microorganismos, en el sistema inmune, en la obesidad y en procesos alérgicos e
incluso en la prevención de algunos tipos de cáncer. Mantener un balance adecuado
de las poblaciones presentes en la microbiota intestinal confiere numerosos beneficios
al hospedador, por lo que varios estudios han centrado sus objetivos en la
investigación de estrategias para modificar la microbiota intestinal hasta conseguir un
equilibrio entre poblaciones. Probióticos y prebióticos son utilizados en diferentes
estudios como suplemento en fórmulas infantiles habiendo comprobado su eficacia
sobre la composición de la microbiota al estimular el crecimiento de Bifidobacterias.
(Marques et al., 2010).
Los prebióticos son ingredientes no digeribles y fermentables por las bacterias
colónicas que pueden afectar al hospedador por estimulación selectiva del crecimiento
de determinadas bacterias mejorando así la salud del hospedador (Gibson y
Roberfroid, 1995). Por otra parte, los probióticos son microorganismos vivos que,
ingeridos en cantidad adecuada, ejercen efectos beneficiosos para la salud más allá de
sus propiedades puramente nutricionales (WHO, 2002).
Son numerosos los estudios que demuestran los efectos beneficiosos de los
prebióticos y probióticos, sin embargo una publicación reciente de la sociedad Europea
de Pediatría, Gastroenterología, Hepatología y Nutrición (ESPGHAN) (2011) concluye
con que los datos científicos disponibles sugieren que la suplementación de fórmulas
infantiles con probióticos y/o probióticos evaluados en lactantes sanos no alcanzan los
parámetros exigidos en seguridad respecto al crecimiento y efectos adversos. La
seguridad y los efectos clínicos de un producto no deben ser extrapolados a otro
producto. En este momento se disponen de pocos datos para recomendar el uso
rutinario de probióticos y/o prebióticos en fórmulas infantiles, por lo que el Comité de
dicha asociación consideró que este es todavía un amplio campo de investigación. Es
necesario plantear nuevos ensayos cuidadosamente diseñados, con adecuados
III. Revisión Bibliográfica
80
criterios de inclusión y exclusión y suficiente tamaño de muestra. En estos estudios se
deberá definir la dosis óptima del producto, el tiempo de administración y deberán
proporcionar también información sobre los efectos a largo plazo sobre el organismo
(ESPGHAN, 2011).
IV. Matrial y Métodos
81
V. MATERIAL Y MÉTODOS
1. Diseño experimental
Para alcanzar los objetivos planteados en la presente tesis, el trabajo experimental se
desarrolló en cuatro estudios, que se presentan en las Figuras 11 y 12.
En el estudio I se evaluó la disponibilidad mineral in vitro de las fórmulas infantiles
mediante el empleo de la línea celular Caco‐2. En primer lugar, se realizó un ensayo con
distintas concentraciones de soluciones patrón de hierro calcio y cinc y los diferentes
ingredientes de estudio (suero lácteo rico en lactoalbúmina y un preparado de nucleótidos) a
fin de evaluar su efecto sobre la absorción mineral. En un segundo ensayo, se evaluó la
absorción mineral de una fórmula infantil estándar (FC) y otra enriquecida con ingredientes
funcionales (FS), previa simulación de una digestión gastrointestinal adaptada para niños
menores de 6 meses.
En el estudio II se evaluó la capacidad prebiótica de los diferentes ingredientes
objeto de estudio. En un primer ensayo, se realizaron las curvas de crecimiento de diferentes
bacterias a las que se les suplementó el medio de cultivo con los ingredientes a estudiar. En
el segundo ensayo, se estudió la evolución de la microbiota de un inóculo fecal expuesto a
los ingredientes digeridos y sin digerir y a las fórmulas infantiles o leche materna igualmente
sometidas o no a una digestión previa. Se realizó el análisis de la microbiota fecal mediante
PCR a tiempo real así como el análisis de los ácidos grasos de cadena corta producidos.
El objetivo del estudio III fue evaluar posibles diferencias en la composición de la
microbiota intestinal debidas al lugar de nacimiento de los individuos del estudio. Éste
consistió en un ensayo comparativo de la microbiota intestinal de lactantes procedentes de
dos regiones diferentes de España, Asturias y Murcia. Los individuos de los dos grupos
comparados cumplieron los mismos criterios de inclusión (leche materna, parto vaginal, no
administración de antibióticos). Se realizaron tres muestreos para el análisis de la
composición microbiota de la fecal mediante PCR a tiempo real.
IV. Material y Métodos
82
Por último en el estudio IV se investigó, in vivo la evolución de 9 grupos microbianos
en heces de lactantes alimentados con leche materna (LM), fórmula estándar (FC) y fórmula
enriquecida con los ingredientes funcionales (FS). Se realizaron 4 muestreos; a las 2, 4, 7‐8 y
12 semanas de edad de los lactantes. El análisis de la microbiota se realizó mediante PCR a
tiempo real en una estancia realizada en el Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA‐
CSIC).
Figura 11. Diseño experimental de los estudios in vitro I y II.
Biodisponibilidadmineral in vitro. Captación, transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2.
Línea celular Caco‐2
Análisis mineral (espectrofotometría de
absorción atómica, EAA)
FeCaZn
Actividad funcional de las fórmulas infantiles y de sus ingredientes
Estudio I
Estudio II
Ensayo 2: Evolución microbiota fecal
Ensayo 1: Curvas de crecimiento
Medio de cultivo base+
Ingredientes Fórmulas inicio
0, 6, 12, 24 ,36, 48 y 72 h
Estándar (FC)Suplementada (FS)Leche materna (LM)
Suero lácteo (SLα)Nucleótidos
Muestreo cada 2 horas durante 14 h
Inóculo cultivo puro
pH
ufc/ml
DO600
MRS/ BHI+
Sueros lácteos (SLα y SLβ)/nucleótidos
pH
Poblaciones microbianas
Ácidos grasos de cadena corta
Inóculo fecal
Ensayo 1: Ingredientes
Muestreos p
p
Ensayo 2:Fórmulas inicio/Leche materna
IV. Material y M
étodos
83
Figura 12. Diseño experimental de los estudios in vivo III y IV.
Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con una fórmula suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA.Estudio IV
Fórmula estándar(n= 14)
Fórmula funcional(n= 14)
Leche materna(n=33)
Grupos microbianos
AtopobiumBacteroides
Bifidobacterium
Clostridium coccoides
Enterobacteriaceae
Staphylococcus
Lactobacillus
Clostridium leptumEnterococaceae
Estudio III Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados con leche materna, procedentes de dos regiones españolas
20 lactantesHospital Universitario Virgen
de la ArrixacaMurcia
20 lactantesHospital de Cabueñes
Asturias
40 lactantes sanos
días de vida
Muestras fecales
8, 30, 90
Extracción ADN
AtopobiumBacteroides
Bifidobacterium
Clostridium coccoides
Enterobacteriaceae
Staphylococcus
Lactobacillus
Clostridium leptumEnterococaceae
CUANTIFICACIÓN DE POBLACIONES MICROBIANAS
Muestras fecales
2, 4, 7-8, 12Semanas de vida
Extracción ADN
CUANTIFICACIÓN DE POBLACIONES MICROBIANAS
IV. Material y M
étodos
84
IV. Material y Métodos
85
2. Muestras: ingredientes, fórmulas infantiles y leche materna
2.1. Ingredientes
‐ Suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα): proteínas de suero con alto
contenido en α‐lactoalbúmina (45% del contenido total de proteínas), Arla Food
(Denmark).
‐ Suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (SLβ): proteínas de suero con alto contenido
en β‐lactoglobulina (32% del contenido total de proteínas), Arla Food (Denmark).
‐ Nucleótidos (Nuc):
• GMP: guanosina 5’‐monofosfato disodio (Ajinomoto, Hamburg,
Alemania).
• CMP: Citidina 5’‐monofosfato acid (Pharma Waldhof GMBH, Dusseldorf,
Alemania).
• AMP: adenosine 5’‐monofosfato acid (Pharma Waldhof GMBH,
Dusseldorf, Alemania).
• UMP: Uridina 5’‐monofosfato disodio (Pharma Waldhof GMBH,
Dusseldorf, Alemania).
2.2. Fórmulas infantiles y leche materna
Se evaluaron dos fórmulas infantiles de inicio de la marca comercial Hero España S.A:
una fórmula estándar (sin suplementar) a la que llamamos fórmula control (FC) y una
fórmula suplementada con suero proteico rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA a la
que llamamos fórmula suplementada (FS). La fórmula suplementada contiene 5,1 g de suero
lácteo, de los cuales un 28% aproximadamente son de suero enriquecido con α‐
lactoalbúmina. El contenido total de α‐lactoalbúmina en la fórmula suplementada fue
aproximadamente de 2 g/L y el de nucleótidos de 32 mg/L. La composición detallada de
dichas fórmulas se muestra en las Tablas 6 y 7.
IV. Material y Métodos
86
Tabla 6. Composición nutricional de la fórmula control por 100 g y por 100 ml de fórmula reconstituida. Por 100 g de
fórmula en polvo Por 100 ml de fórmula
reconstituida VALOR ENERGÉTICO KJ/Kcal 2184/ 522 285/ 68 NUTRIENTES
Proteínas g 10,2 1,3 Caseína g 5,1 0,7 Suero lácteo g 5,1 0,7
Hidratos de Carbono g 55,2 7,2 Grasas g 29,0 3,8
Ácido linoleico mg 4510,0 586,3 Ácido α‐linolénico mg 430,0 55,9 Relación 10,5 10,5
MINERALES Sodio mg 130,0 16,9 Potasio mg 497,0 64,6 Cloro mg 366,0 47,6 Calcio mg 392,0 51,0 Fósforo mg 220,0 28,6 Relación Ca/P 1,8 1,8 Magnesio mg 42,0 5,5 Hierro mg 6,3 0,8 Cinc mg 4,2 0,5 Cobre µg 314,0 40,8 Yodo µg 78,0 10,1 Selenio µg 7,0 0,9
VITAMINAS Vitamina A µg 523,0 68,0 Vitamina D µg 7,8 1,0 Vitamina E mg 7,8 1,0 Vitamin K µg 52,0 6,8 Vitamina C mg 52,0 6,8 Vitamina B1 µg 523,0 68 Vitamina B2 µg 785,0 102,0 Niacina mg 5,2 0,7 Vitamina B6 µg 523,0 68,0 Ac. Fólico µg 78,0 10,1 Biotina µg 2,1 0,3 Ac. Pantoténico µg 16,0 2,1
OTROS 2353,0 305,9 L‐Carnitina mg Taurina mg 7,8 1,0 Inositol mg 42,0 5,5 Colina mg 26,1 3,4
IV. Material y Métodos
87
Tabla 7. Composición nutricional de fórmula suplementada por 100 g y por 100 ml de fórmula reconstituida Por 100 g de
fórmula en polvo Por 100 ml de fórmula
reconstituida VALOR ENERGÉTICO KJ/Kcal 2159/516 281/ 67 NUTRIENTES
Proteínas g 10,2 1,3 Caseína g 5,1 0,7 Suero lácteo g 5,1 0,7 α‐lactoalbúmina g 1,4 0,2
Hidratos de Carbono g 56,9 7,4 Grasas g 27,5 3,8
Ácido linoleico mg 4067,2 528,7 Ácido α‐linolénico mg 335,5 43,6 Relación 12,1
MINERALES 12,1 Sodio mg 154 21 Potasio mg 495 67 Cloro mg 326 44 Calcio mg 387 52 Fósforo mg 246 33 Relación Ca/P 1,6 1,6 Magnesio mg 47 6,4 Hierro mg 6,6 0,9 Cinc mg 4,2 0,5 Cobre µg 314 40,8 Yodo µg 78 11 Selenio µg 7,0 0,9
VITAMINAS Vitamina A µg 523,0 68,0 Vitamina D µg 7,8 1,0 Vitamina E mg 7,8 1,0 Vitamin K µg 52,0 6,8 Vitamina C mg 52,0 6,8 Vitamina B1 µg 523,0 68 Vitamina B2 µg 785,0 102,1 Niacina mg 5,2 0,7 Vitamina B6 µg 523,0 68,3 Ac. Fólico µg 78,0 10,1 Biotina µg 16,0 2,1 Ac. Pantoténico µg 2353,0 305,1
OTROS L‐Carnitina mg 8,1 1,1 Taurina mg 44,1 6,0 Inositol mg 29,3 4,0 Colina mg 60,2 8,2 Adenosin 5’‐monofosfato mg 3,6 0,5 Citidina 5’‐monofosfato mg 12,4 1,6 Uridina 5’ monofosfato mg 6,5 0,8 Guanosina 5’‐monofosfato mg 2,1 0,3
IV. Material y Métodos
88
Como referencia se utilizó leche materna (LM), en el estudio de disponibilidad
mineral en fórmulas infantiles y en el de evaluación de la funcionalidad de las fórmulas
infantiles, ya que se considera el alimento ideal para el recién nácido. Ésta fue donada por
cuatro madres diferentes, que se encontraban entre el segundo y cuarto mes de lactación.
Las muestras de leche se obtuvieron de forma estéril y fueron congeladas hasta su
utilización. Esta leche se utilizó como máximo a las tres semanas de su recogida. El día del
experimento se mezclaron las diferentes muestras de leche de forma estéril.
3. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación transporte y retención de
calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2
3.1 Material, reactivos y equipos de laboratorio
‐E‐MEM (Eagle minimum essential medium; Gibco BRL Life Technologies, Rockville,
MD, USA).
‐Suero bovino fetal (Sigma St Louis, MO, USA)
‐Penicilina‐Estreptomicina (Sigma St Louis, MO, USA)
‐Glutamina (Sigma St Louis, MO, USA)
‐Aminoácidos no esenciales (Sigma St Louis, MO, USA)
‐Solución de tripsina‐EDTA (0,25 mg/mL)
‐Azul tripán, CI 23850 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)
‐Bromuro de 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5 difeniltetrazolio (MTT) (Sigma, St Louis, MO,
USA)
‐Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA).
‐Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) CA 0192 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España)
‐Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O) HI0336 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona,
España)
‐Ácido clorhídrico (HCl) 30% (Suprapur Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)
‐Ácido nitrilotriacético extrapuro AC 1606 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España)
‐Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) ACS, C10207 (Scharlau Chemie S.A.,
Barcelona, España)
‐Citrato sódico (C6H5O7Na3.2H2O) (GMBH&Co Riedel‐de Häen, Seelze, Alemania)
IV. Material y Métodos
89
‐Cloruro sódico (NaCl) (Merck KGA Darmstadt, Alemania)
‐Cloruro potásico (KCl) (Merck KGA Darmstadt, Alemania)
‐Cloruro de lantano hidrato (LaCl3) (Fluka Chemie GmbH, Austria)
‐Sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), MA0080 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona,
España)
‐1‐ácido piperazinetanosulfónico 4‐(2‐hidroxietil) sal monosódica (HEPES), H7006
(100 g) (Sigma‐Aldrich, St. Louis, MA, USA)
‐D(+)‐Glucosa monohidrato (Merck KGA Darmstadt, Alemania)
‐PBS (solución tampón fosfato salino) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)
‐Cabina de flujo laminar vertical (Teslar, serie V‐30170)
‐Baño termostático (Selecta, Barcelona, España)
‐Estufa de incubación (Binder, Tuttlingen, Alemania)
‐Microscopio invertido de contrate de fases (Motic)
‐Cámara de recuento Neubauer, Boeco (Neubauer, Hamburgo, Alemania)
‐Lector de placas Labsystem multiskan MCC/340 microplate reader (Termo Electrón
Corporation, Barcelona, España)
‐Placas de 6 y 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca)
‐ Filtros de policarbonato 0,4µm, 24mm de diámetro (Nunc, Roskilde, Dinamarca)
‐Rascador de células, 25 cm (Sarstedt, Inc., NC, USA)
‐Frascos 75 cm2 de poliestireno, 83.1811.002 (Sarstedt, Inc., NC, USA)
‐Crisoles de porcelana C‐4 (KPM, Berlín, Alemania)
‐Espectrofotómetro de absorción atómica mod. 3100 (Perkin‐Elmer, Norwalk, U.S.A)
‐Horno mufla, mod. S27 (Naberthem Bremen, Alemania)
‐Micro‐Osmómetro Automatic Type 13/13DR‐Autocal (Roebling, Berlin, Alemania).
3.2. Cultivo celular de la línea Caco‐2
El trabajo realizado con cultivos celulares se desarrolló en los laboratorios del Servicio
de apoyo a la investigación (SAI) de la Universidad de Murcia. Las instalaciones de estos
laboratorios están certificadas como Laboratorios de Nivel de Bioseguridad 2. y están
equipados con cabinas de flujo laminar vertical de tipo II, donde obtuvimos condiciones de
esterilidad para la manipulación de la línea celular. Antes de comenzar a trabajar, se conectó
IV. Material y Métodos
90
la lámpara ultra violeta durante 15 minutos y después se encendieron los ventiladores
durante otros 15 minutos a fin de obtener un flujo laminar de aire estable. La superficie de la
cabina se limpió con alcohol al 70%.
La línea celular Caco‐2 fue obtenida por primera vez en 1977 a partir de un
adenocarcinoma colorrectal procedente de un hombre de 72 años de edad (Pinto et al.,
1983). Son células adherentes con morfología epitelial, con la característica de que cuando
alcanzan el estado de confluencia dejan de proliferar, se diferencian espontáneamente
desarrollando una monocapa de células polarizadas en las que destaca el borde en cepillo
apical propio de la mucosa intestinal. Las células Caco‐2 utilizadas en este estudio procedían
de la European Collection of Cell Cultures (ECACC; número 86010202, Salisbury, UK). Se
recibieron congeladas en nitrógeno líquido y en el pase número 16. Todos los ensayos con
células Caco‐2 se realizaron entre los pases 18 y 35.
3.2.1. Mantenimiento celular y subcultivo
El medio de cultivo utilizado fue EMEM (Eagle Minimum Essential Medium) con rojo
fenol al que suplementamos con 10% de suero bovino fetal, 1% de aminoácidos no
esenciales, 1% de glutamina y 1% de antibióticos (estreptomicina y penicilina). El medio de
cultivo ya reconstituido se mantuvo a 4º C, no más de siete días, hasta su uso.
El mantenimiento de la línea celular se realizó en frascos de 75 cm2 y el crecimiento
de la misma se observó por microscopía invertida de contraste de fases. El medio de cultivo
se cambió en días alternos. Las células se incubaron a 37ºC, a una presión parcial de CO2 del
5% y con una humedad relativa del 95%. El cultivo se mantuvo hasta un 80% de confluencia,
momento en el que se realizó el subcultivo.
Para subcultivar las células utilizamos tripsina‐EDTA (0,25%), que actúa digiriendo las
proteínas de adherencia, que son dependientes de calcio y magnesio. A este nivel interviene
el EDTA secuestrando los cationes divalentes libres que intervienen en las uniones.
IV. Material y Métodos
91
Transcurridos 3 minutos, se inactivó la tripsina mediante la adición de de EMEM
completo, la suspensión se centrifugó a 1200 rpm durante 10 minutos, descartando el
sobrenadante. El sedimento de células se resuspendió en caldo nuevo.
3.2.2. Recuento y viabilidad celular
A partir de la suspensión celular obtenida, se realizó el contaje del número de células
presentes utilizando una cámara de Neubauer. Para ello se realizó una dilución 1:1 de la
suspensión celular y el colorante azul tripán. Esta tinción permite diferenciar las células
viables de las muertas, ya que en las células muertas el colorante penetra al estar la
membrana está alterada (Figura 13).
Figura 13. Visión al microscopio de los campos en los que se realiza el contaje celular utilizando una cámara Neubauer.
La relación entre el número de células muertas y el número de células vivas nos
indica la viabilidad celular:
%Número de células vivasNúmero total de células 100
La densidad celular de siembra para el mantenimiento del cultivo celular fue de
30.000 cels/cm2 en el presente trabajo.
IV. Material y Métodos
92
3.2.3. Congelación
Las células se mantuvieron congeladas hasta la realización de los experimentos, en
nitrógeno liquido (‐196ºC) en criotubos de 1,5 mL conteniendo 1 mL de medio de cultivo y un
10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector, para prevenir el daño físico, que pueda
causar la formación de cristales y el daño osmótico debido a un descenso de la solubilidad de
solutos.
Para realizar la congelación, se procedió del mismo modo que se describe para
realizar un subcultivo, Ajustando posteriormente la concentración de células (con viabilidad
mayor del 85%) a 2‐ 4∙106 cels/ml.
3.2.4. Crecimiento y diferenciación celular
a. Curva de crecimiento
Para la realización de una curva de crecimiento celular, las células Caco‐2 se
sembraron en una placa de 12 pocillos (4 cm2 de superficie), con una densidad de 30.000
células/cm2. El medio se cambió cada 2 días hasta llegar al 90% confluencia, momento a
partir del cual se cambió todos los días.
Los días 2, 4, 7, 11, 14 y 18 postsiembra, las células se separaron de la superficie con
tripsina‐EDTA 0,25% y se evaluó su recuento en cámara de Neubauer y su viabilidad del
modo descrito en el apartado 2.5.
b. Diferenciación celular
Según la bibliografía consultada, las células Caco‐2 alcanzan el estado diferenciado a los
19‐21 días de postsiembra (Frontela et al., 2009a), el cual se caracteriza por el desarrollo de
microvellosidades en la superficie apical de las células.
IV. Material y Métodos
93
A fin de confirmar la presencia de microvellosidades en las células, éstas fueron
sembradas sobre un cubreobjetos de vidrio y transcurridos 21 días, se analizaron con
microscopio de barrido en el servicio de microscopia del SAI (servicio de Apoyo a la
Investigación de la Universidad de Murcia).
3.2.5. Permeabilidad y toxicidad celular
a. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol
La integridad de la monocapa se puede evaluar mediante la medida del paso de ciertos
compuestos como es el rojo fenol (Pm; 354 Da) a través de los espacios intercelulares de la
misma. Para ello, se preparó una disolución de concentración 1 mM de rojo fenol en EMEM
sin rojo fenol. Se lavó la monocapa celular al menos 3 veces con EMEM sin rojo fenol a 37ºC
con el fin de de eliminar cualquier residuo del colorante procedente del medio de cultivo en
el que se han mantenido las células hasta el momento del experimento.
Se realizó una curva de calibración con diferentes concentraciones de rojo fenol: 40, 20,
10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 y 0,3125 µM a partir de la disolución madre. Medimos la absorbancia a
560 nm en un espectrofotómetro de absorción molecular de 900 µl de cada una de las
concentraciones.
Para el desarrollo de los experimentos, las células fueron sembradas en filtros de
policarbonato insertos en pocillos bicamerales, a una densidad de 30.000 células/cm2
realizándose el experimento a los 5, 8, 12, 15, 18 y 21 días postsiembra. Se añadieron 500 µl
de la disolución rojo fenol 1 mM en la cámara apical y el mismo volumen de EMEM sin rojo
fenol en la cámara basolateral. Incubamos las células durante una hora a 37º C y 5% de CO2.
Transcurrido el periodo de incubación se recogió el contenido de la cámara basolateral y se
le añadieron 100 µl de NaOH 0,1 N.
A partir de los valores obtenidos se calculó la permeabilidad aparente que es indicativo
del desarrollo de las uniones intercelulares estrechas.
IV. Material y Métodos
94
0CdtdC
AV
×=
Donde:
V (cm3): volumen cámara basolateral.
A (cm2): área del filtro.
t (s): tiempo.
C0: concentración de rojo fenol en la
cámara apical a tiempo 0.
C: concentración de rojo fenol en la
cámara basolateral a tiempo t.
b. Ensayo de toxicidad celular: ensayo MTT
Para evaluar la toxicidad de los diferentes ingredientes y disoluciones patrón de
calcio, hierro y cinc utilizadas en este estudio sobre las células Caco‐2 se realizó un ensayo
cuantitativo colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células en fase de
proliferación activa. Las sales de tetrazolio se utilizan para evaluar la actividad celular,
porque su reducción está principalmente catalizada por las oxidoreductasas presentes en la
cadena de transporte mitocondrial. Una de las más utilizadas es el MTT (bromuro de 3‐(4,5‐
dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐ difeniltetrazolium) que se basa en la formación de cristales de
formazán de un color azul intenso que son insolubles en agua después de la rotura de la sal
de tetrazolium (Figura 14).
Figura 14. Reacción producida por las enzimas mitocondriales al reducir el MTT.
Amarillo MTT Azul MTT
ReductasaMitocondrial
IV. Material y Métodos
95
La formación de los cristales sólo se puede producir en células viables mediante la
enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa. Los cristales se solubilizan con un solvente
orgánico (DMSO) y la densidad óptica de los cristales disueltos se puede medir
espectrofotométricamente. El valor de absorbancia obtenido correlaciona de forma directa
con el número de células metabólicamente activas presentes en el cultivo celular.
Se siguió el protocolo descrito por Mosmann (1983). Para ello se preparó una
disolución de MTT a una concentración de 5 mg/ml en medio de cultivo sin rojo fenol,
teniendo en cuenta que el MTT es fotosensible. Las células fueron sembradas a una
densidad de 5000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (superficie: 2 cm2/pocillo). Las
células se mantuvieron en la placa durante 19‐21 días, transcurrido este tiempo se incubó
cada pocillo con cada ingrediente de estudio o la solución patrón de calcio, hierro o cinc
durante una hora a 37ºC. Posteriormente se retiró la muestra y se añadieron 200 μL de
EMEM libre de suero y 50 μl de solución de MTT (5 mg/ml). Se incubó durante 4 horas,
observándose un precipitado violáceo que se encuentra en el interior de las células. Se retiró
el medio y se añadieron 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) en cada pocillo a fin de solubilizar
el formazano. Se leyó la absorbancia empleando un lector de placas a una longitud de onda
de 570 nm. Dos de las columnas de la placa de 24 pocillos no fueron tratadas con ningún
ingrediente, dándoles un valor de 100% de viabilidad.
3.3. Estudio de captación retención y transporte mineral mediante el empleo de la línea
celular Caco‐2
Se realizaron ensayos de captación, retención y transporte mineral a partir de
soluciones patrón de calcio, hierro y cinc a diferentes concentraciones, con cada uno de los
ingredientes objeto de estudio. Se evaluó el efecto de la adición de suero proteico rico en α‐
lactoalbúmina o nucleótidos (descrito anteriormente) sobre la absorción de dichos
minerales. Se realizaron también ensayos con las dos fórmulas infantiles objeto de estudio
de la presente tesis doctoral y con leche materna, previamente digeridas, para evaluar la
absorción mineral de cada una de ellas tomando como referencia la biodisponibilidad
mineral de la leche materna (Figura 11).
IV. Material y Métodos
96
Para realizar estos ensayos, las células se sembraron sobre pocillos bicamerales de
policarbonato con 0,4 µm de diámetro de poro y 3,8 cm2 de superficie (Figura 15). La
densidad de siembra fue de 30.000 cels/cm2, manteniéndose hasta alcanzar la diferenciación
celular (19‐21 días), y cambiando el medio de cultivo en días alternos.
Figura 15. Pocillo bicameral, donde se pueden apreciar las dos cámaras y la monocapa celular
3.4. Ensayo 1: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de soluciones patrón de
minerales con y sin los ingredientes de estudio
3.4.1. Procesado de los ingredientes de estudio
En este ensayo se evaluaron el suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα) y los
nucleótidos (Nuc). El suero lácteo se disolvió en el tampón de captación cuya composición
fue: 0,75% de NaCl, 0,074% de cloruro potásico, 0,012% de sulfato de magnesio, 0,09% de
glucosa y 1,3% de HEPES en agua milli‐Q, ajustando el pH a 7 con ácido clorhídrico 30%. Se
calentó a 60ºC para su completa disolución y se añadió en cantidad suficiente para obtener
la misma concentración que la presente en la fórmula infantil.
Se prepararon las soluciones de nucleótidos a ensayar tomando el volumen adecuado de
una disolución madre para alcanzar una concentración final igual a la de la fórmula de
estudio. Como disolvente en las disoluciones estudiadas se empleó el tampón de captación,
descrito anteriormente, con el objetivo de que el pH y la osmolaridad fueran fisiológicos
evitando así la lisis celular (pH: 7 y osmolaridad: 310‐330 mOsm/Kg). El contenido total de
IV. Material y Métodos
97
nucleótidos fue de 32mg/L, suponiendo un 44% del aporte de nucleótidos de la leche
materna.
3.4.2. Soluciones estándar de minerales y su preparación.
Se realizaron disoluciones madre de los tres minerales en las concentraciones que se
especifican a continuación; 10 mM de CaCl2 para el calcio, de 10 mM de FeCl3⋅6H2O (con
ácido nitriloacético 20 mM de y ácido clorhídrico 1 mM) para el hierro y 1 mM de
ZnSO4⋅7H2O para el cinc. A partir de estas soluciones se prepararon las distintas
concentraciones de minerales a utilizar en los ensayos para cada uno de los minerales en
una solución tampón de captación empleada como blanco. Las diferentes concentraciones
estudiadas para cada mineral se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: Concentraciones de calcio, hierro y cinc evaluadas en los ensayos de captación retención y transporte.
Calcio (CaCl2) Hierro (FeCl3.6H2O) Zinc (ZnSO4.7H2O)
10 mM 50 µM 5 µM
30 mM 150 µM 10 µM
Los ensayos fueron realizados con cada una de las soluciones estándar de minerales y
con los ingredientes a evaluar, nucleótidos y suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina. Estos
ingredientes se añadieron en la misma concentración presente en la fórmula infantil de
inicio. Todas las disoluciones fueron preparadas inmediatamente antes de realizar cada
ensayo.
3.4.3. Procedimiento.
En cada ensayo se sembraron las células Caco‐2 en los filtros de policarbonato a una
densidad de 30.000 células/cm2, insertos en pocillos formando un sistema bicameral en
placas de 6 pocillos. Cinco pocillos fueron empleados para el estudio con los patrones de
hierro, calcio o cinc sólo o junto con los ingredientes objeto de estudio. El sexto pocillo fue
utilizado como blanco (tampón de captación).
IV. Material y Métodos
98
Tras retirar el medio de cultivo, se lavó la monocapa 3 veces con PBS a 37ºC para
eliminar restos del medio de cultivo y del metabolismo de las células. A continuación, se
añadió 1 ml de cada una de las disoluciones de los patrones de minerales (Tabla 8) con o sin
el ingrediente de estudio a la cámara apical del inserto en el que se encontraban las células
ya diferenciadas. En la cámara basolateral se añadió 1 ml del tampón de captación,
incubándose las células durante una hora a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa.
Transcurrida la incubación se recogió el contenido de las cámaras basolateral y apical,
se lavó la monocapa con el tampón de captación a 4ºC para evitar modificaciones y
desprendimientos en las células, se añadió 0,5 ml de agua milli‐Q, con el objetivo de producir
la lisis celular y con la ayuda de unos rascadores se recogieron las células que estaban
adheridas a los filtros. El contenido de la cámara apical, basolateral y las células recogidas se
congelaron a ‐80ºC hasta su análisis.
3.5. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de las fórmulas infantiles que
difieren en su contenido en ingredientes funcionales y de leche materna
3.5.1. Muestras
Para llevar a cabo este ensayo de la presente tesis doctoral, se utilizaron las fórmulas
infantiles elaboradas a base de leche vaca: una fórmula control (FC) sin suplementar y otra
fórmula suplementada (FS) con α‐lactoalbúmina y nucleótidos como ingredientes
funcionales (Tabla 6 y 7). Como referencia utilizamos leche materna madura, descrita en el
apartado 2.2. Fórmulas infantiles y leche materna donada por tres madres diferentes en la
misma fase de lactancia, (entre 2 y 3 meses). Se mezclaron las tres muestras, de forma
estéril, con el objetivo de minimizar las diferencias entre individuos.
3.5.2. Digestión gastrointestinal in vitro
Se siguió el procedimiento descrito por Frontela et al., (2009a) para ello 13,5 gramos de
la fórmula se disolvieron con 100 ml agua milli‐Q templada según instrucciones del
fabricante. Para la digestión gástrica se ajustó el pH a 4 con HCl 6 N, y tras 15 minutos se
IV. Material y Métodos
99
volvió a ajustar en caso de ser necesario. Se añadieron 0,02 g de la solución de pepsina por
gramo de muestra (1,6 g de pepsina en 10 ml de HCl 0,1 N) incubando a 37ºC en agitación
durante 2 horas. Posteriormente, se detuvo la actividad enzimática sumergiendo las
muestras en hielo durante 10 minutos.
A continuación, se inició la digestión intestinal ajustando el pH del digerido gástrico a 5
empleando NaHCO3 1 M. Tras 15 minutos se reajustó cuando fue necesario. Preparamos una
disolución de pancreatina (0,2 g) y sales biliares (1,25 g) en NaHCO3 0,1 N (50 ml). Se añadió
suficiente cantidad de dicha disolución para proporcionar 0,005 gramos de pancreatina y
0,03 g de sales biliares por gramo de muestra. Incubamos a 37ºC en agitación durante 2
horas. Detuvimos la actividad enzimática sumergiendo las muestras en hielo durante 10
minutos. El pH de la muestra se ajustó a 7 añadiendo NaOH 5 M, reajustando cuando fue
necesario. Para asegurar la inactividad enzimática, la muestra se mantuvo a 100ºC durante 4
minutos.
Para la obtención de la fracción soluble, alícuotas del digerido intestinal se centrifugaron
a 3500 g durante 1 hora a 4ºC. Se recogió el sobrenadante (fracción soluble) y se congeló a
‐20ºC para su posterior determinación del contenido mineral.
3.5.3. Acondicionamiento de la fracción soluble y adición de dicha fracción a la monocapa
celular.
La fracción soluble se añadió sobre la monocapa celular previo acondicionamiento de la
misma ajustando los valores de pH y de osmolaridad de la siguiente manera:
‐ Se añadió glucosa y HEPES hasta una concentración final de 5 mM y 50 mM
respectivamente.
‐El pH se ajustó a 7,2‐7,4 con HCl 30%.
‐ La osmolaridad se corrigió añadiendo agua milli‐Q hasta un valor de 310 ± 10 mOsm/kg
a fin de alcanzar valores fisiológicos que no dañen la monocapa.
Se retiró el medio de de cultivo, se lavó la monocapa 3 veces con PBS a 37°C para
eliminar restos del medio de cultivo, del mismo modo como se procedió en el trabajo con
soluciones patrón. Se añadió 1 ml de la fracción soluble acondicionada sobre la monocapa
IV. Material y Métodos
100
celular tras 21 días de cultivo y 1 ml del tampón de captación en la cámara basaly se
mantuvo durante 1 hora a 37°C, 5% de CO2 y con un 95% de humedad relativa.
Transcurrida la incubación se recogió el contenido de la cámara basolateral y apical,
siguiendo la metodología descrita en el apartado 2.9 y posteriormente se procedió a su
análisis mineral o a su congelación.
3.6. Destrucción de la materia orgánica y obtención de la fracción mineral
El contenido de las cámaras apical, basal y las células obtenidas en los ensayos se
incineraron durante 24 horas en horno‐mufla a 450°C, empleando una rampa de subida de
temperatura de 30 minutos hasta alcanzar la temperatura final. Sobre las cenizas obtenidas
se adicionó 1 ml de ácido nítrico 65% que fue evaporado en placa calefactora, y se incineró
de nuevo a 450°C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se adicionaron 2 ml de HCl
fumante 37%, a cada crisol conteniendo la muestra y se cubrieron con vidrios de reloj
manteniéndolos durante 4 horas en la placa calefactora. Se añadieron a continuación, de
nuevo 2 ml del mismo ácido manteniéndolos en placa calefactora hasta reducción del
volumen a 1 ml. Este volumen fue entonces completado hasta 7 ml con agua bidestilada
desionizada, conteniendo cloruro de lantano (0,2%) para evitar posibles interferencias entre
calcio y fósforo.
3.7. Determinación de Fe, Ca y Zn por Espectrofotometría de absorción atómica (EAA)
El contenido mineral de las muestras se midió por espectrofotometría de absorción
atómica. La diferencia entre el contenido del mineral obtenido de la monocapa incubada con
la solución patrón de cada mineral y el contenido de la monocapa no expuesta (blanco) nos
da una estimación de la retención mineral. El transporte es estimado como la diferencia
entre la cantidad de mineral presente en la cámara basal y la solución tampón empleada
como blanco. La captación mineral se determinó a partir de es la suma del mineral retenido
y transportado. Se calculó el porcentaje de mineral retenido y transportado así como la
eficiencia de transporte y captación mineral (Perales et al., 2005). A continuación se
muestran las ecuaciones utilizadas en los cálculos de disponibilidad.
IV. Material y Métodos
101
ó 100 ñ
100
ñ
ó 100
ñ
100
ó ó
100
En la Tabla 9 se muestran las condiciones aplicadas al espectrofotómetro de absorción
atómica y que fueron aplicadas a lo largo del estudio.
Tabla 9. Condiciones del espectrómetro de absorción atómica
Longitud de onda(nm)
Apertura rendija(mm)
Sensibilidad de verificación (mg/L)
Calcio 422,7 0,5 5Hierro 248,3 0,2 4Zinc 213,9 0,2 1
Para la realización de los diferentes concentraciones patrones utilizados en la rectas de
calibrado, se partió de un patrón comercial de 100 ppm de cada uno de los tres minerales
(Tabla 10).
Tabla 10. Preparación de las soluciones patrón de calcio, hierro y cinc para realizar la recta de calibrado.
[Calcio] [Hierro] [Zinc] Patrón 1 0,5 0,25 0,125
Patrón 2 1 0,5 0,25
Patrón 3 2 1 0,5
Patrón 4 5 2 1
Patrón 5 10 5 2
RECTA y=0,0168x‐0,0030 Y=0,0426x+0,0013 y=0,1886x+0,0062
R2 0,9994 0,9998 0,9993
IV. Material y Métodos
102
3.8. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de
nucleótidos
Las células fueron sembradas sobre cubres previamente esterilizados con etanol a
una densidad de 30.000 cels/ml. Se mantuvieron en cultivo durante 19‐21 días. A partir del
día 8 comenzamos a estimular a las células todos los días con dos concentraciones distintas
de nucleótidos (32 mg/L y 72 mg/L). Al grupo control se le cambió el medio de cultivo de
modo paralelo. El experimento se realizó por duplicado.
Transcurrido el periodo de diferenciación las células se enviaron al departamento de
microscopia del servicio de Apoyo a la investigación (SAI) para su procesado y su posterior
observación al microscopio electrónico de barrido. El objetivo fue evaluar el efecto de los
nucleótidos sobre la morfología y características externas de la línea celular Caco‐2.
3.9. Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como el valor medio y la desviación estándar como
medida de dispersión. Se realizó una comparación de los valores medios de los diferentes
parámetros de biodisponibilidad de calcio, hierro y cinc de los tres grupos de estudio
mediante un análisis de la varianza (ANOVA) con el fin de comprobar si existían diferencias
debidas a la adición los ingredientes objeto de estudio o de la fórmula infantil suplementada.
Contrastamos la normalidad y la homogeneidad de varianzas, y aquellas variables que no
siguieron una distribución normal fueron transformadas mediante logaritmo en base 10. El
análisis estadístico se realizó usando el paquete estadístico SPSS para Windows (SPSS versión
15.0 Inc., Chicago, IL).
IV. Material y Métodos
103
4. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de la fórmula infantil
suplementada con suero lácteo rico en α-lactoalbúmina, nucleótidos y DHA y de sus
ingredientes.
Antes del comienzo del estudio sobre la evolución de la microbiota fecal expuesta a
diferentes ingredientes, se realizó una valoración preliminar de los mismos exponiendo
diferentes cultivos puros de bacterias intestinales a los ingredientes objeto de estudio. De
esta forma, obtuvimos una idea general del efecto de los ingredientes funcionales
ensayados sobre el crecimiento de determinadas bacterias. Una vez finalizado el estudio
preliminar, se llevó a cabo el estudio de la evolución de los diferentes grupos microbianos
de un inoculo fecal expuesto a los diferentes ingredientes y a las fórmulas de inicio. En la
Figura 16 se presenta el diseño experimental del estudio II.
Figura 16. Diseño experimental del estudio II
Estudio II: Evaluación de la actividad funcional de fórmulas infantiles y sus ingredientes
Muestreo cada hora durante 14h
Ensayo 1: Evaluación del crecimiento de diferentes especies bacterianas expuestas a los ingredientes de estudio
2 ó 3 colonias en caldo de cultivo e incubación
6‐18 horas
Siembra en medio sólido
Ensayo 2: Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes de estudio
Inoculamos 2% (v/v)Medio de cultivo + ingrediente
Inoculo fecal 2% v/v
Muestreo 0, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas
p
Ácidos grasos de cadena corta
Evolución microbiota fecal
Medio de cultivo base
ControlNucleótidosNucleótidos digeridosSuero lácteo αSuero lácteo α digeridoSuero lácteo βSuero lácteo β digerido
Leche maternaLeche materna digeridaFórmula controlFórmula control digeridaFórmula suplementadaFórmula suplementada digerida
+Cisteína
+
ppHpH
Ufc/mlDO600
IV. Material y M
étodos
104
IV. Material y Métodos
105
4.1. Reactivos, material y equipos de laboratorio
a. Cultivos puros y crecimiento microbiano
‐ Man Rogosa Sharpe. (Oxoid, Hampshire, England)
‐ Agar cerebro corazón (Oxoid, Hampshire, England)
‐ Cisteína‐HCl (Fluka, Steinhein, Alemania)
‐ Agar‐agar (Merck, Darmstadt, Alemania)
‐ Solución tampon fosfato (PBS) (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Generadores de anaerobiosis (Oxoid, Hampshire, England)
‐ Tubos de 1,5 y 10 ml (Daslab, Barcelona, España)
‐ Pipetas de 1 y 10 ml (BD Falcom, Le Pont De Claix, Francia)
‐ Asas de siembra en triple estría y de digralski (Merck, Darmstadt, Alemania)
‐ Puntas de 100 y 1000 µl (Daslab, Barcelona, España)
‐ Cubetas para espectrofotometría (Daslab, Barcelona, España).
‐ Jarras de anaerobiosis (Biomereux, Marcy lEtoile, Francia)
‐ Vortex (Merck, Darmstadt, Alemania)
‐ pH metro (Crison, Barcelona, España)
‐ Espectrofotómetro Evolution 600 UV‐Vis (Thermo Scientific, Cambridge, Reino
unido)
‐ Cabina de flujo laminar (Telstar, Barcelona, España)
‐ Autoclave (Selecta, Barcelona, España).
b. Cultivos fecales
Procesado del inóculo y cultivos
‐PBS (solución tampón fosfato salino) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)
‐Homogenizador (IUL intruments, Barcelona, España)
‐Bolsas para el homogenizador (Seward, Sussex, Inglaterra)
‐Jarras de anaerobiosis (Biomereux, Marcy lEtoile, Francia )
‐Pipetas de 1 y 10 ml (BD Falcom, Le Pont De Claix, Francia)
‐Cabina de flujo laminar (Telstar, Barcelona, España)
‐Generadores de anaerobiosis (Oxoid, Hampshire, England)
‐Autoclave (Selecta, Barcelona, España).
‐Tubos de 1,5 y 2 ml (Daslab, Barcelona, España)
III. Revisión Bibliográfica
106
PCR (polymerase chain reaction) cuantitativa
‐ QIAmp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania)
‐ Etanol para Biología Molecular (Merck, Darmstadt, Alemania)
‐ SensiMix SYBR No‐ROX kit (Bioline, London, Reino Unido)
‐ Agua para biología molecular (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Primers (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Puntas de 1000, 200, 20 y 10 µl estériles y libres de DNAasa yRNAasa (QSP)
‐ Placas de 96 pocillos (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)
‐ Film para las placas (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)
‐ Termociclador CFX96 (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)
Análisis de los ácidos grasos de cadena corta
‐ ‐Metanol (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ ‐Hexano (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Ácido fórmico (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Patrón comercial de ácidos grasos de cadena corta (Supelco, Estados Unidos).
‐ Ácido acético (Fluka, Steinhein, Alemania)
‐ Ácido Láctico (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Viales eppendorff (Daslab, Barcelona, España).
‐ Micropipetas 100‐1000 µL (Thermo Scientific, Cambridge, Reino Unido)
‐ Viales de 0,2 mL (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos)
‐ Microjeringas de 50‐2500 µL (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos)
‐ Matraces aforados de vidrio (Daslab, Barcelona, España)
‐ Centrífuga (Eppendorff, Hamburg, Alemania)
‐ Cromatógrafo de gases 7890A GC System de Agilent Technologies, equipado con
un inyector automático 7683B Series Inyector (Agilent Technologies, Santa Clara,
Estados Unidos)
‐ Columna NukolTM (referencia 24107, Sigma‐Aldrich, St. Luis, Estados Unidos).
‐ Filtros de policarbonato 0,2 µm de diámetro de poro (Merck, Darmstadt,
Alemania)
‐ Jeringas desechables de 1ml (BD Plastipak, Madrid, España)
IV. Material y Métodos
107
4.2. Ensayo 1: Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales
sometidas a los ingredientes de estudio. Estudio preliminar
4.2.1. Digestión gastrointestinal in vitro de los ingredientes.
Se realizó una solución madre al 10% de los dos concentrados proteicos; suero
lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα) y suero lácteo rico el β‐lactoglobunina (SLβ) y por
otro lado de los nucleótidos en la misma proporción que en la fórmula pero diez veces
concentrada utilizando como disolvente agua milli Q. Para conseguir una completa
disolución de los ingredientes se calentó a 60ºC.
La digestión de los ingredientes se llevó a cabo sobre dicha solución madre
siguiendo el mismo protocolo que en el estudio I , realizando los cálculos para la
adición de enzimas según el peso de muestra seca. La solución madre de las enzimas
se realizó 10 veces más concentrada con el objetivo de minimizar la dilución de estos
compuestos.
4.2.2. Evaluación del crecimiento microbiano
Se seleccionaron tres especies bacterianas características de la flora intestinal
que fueron expuestas a los ingredientes de las fórmulas infantiles. Dos de las especies
seleccionadas pertenecen al grupo de bacterias lácticas y una a la familia
Enterobacteriaceae, a fin de poder determinar si el comportamiento de dichas
bacterias era diferente debido a los ingredientes. Se decidió estudiar la evolución de
Bifidobacterium longum, Lactobacillus gasseri y Escherichia coli. Esta última fue aislada
en nuestro laboratorio a partir de heces humanas y fue codificada con el nombre del
grupo de investigación (Tabla 11).
Tabla 11. Bacterias intestinales utilizadas en las curvas de crecimiento
Especie bacteriana Origen
Bifidobacterium longum CCTELactobacillum gasseri DSMZ 20077
Escherichia coli Colección NUTBRO
III. Revisión Bibliográfica
108
Para la realización de las curvas de crecimiento de B. longum y L. gasseri el
medio de cultivo utilizado fue caldo MRS (Man Rogosa Sharpe) con cisteína (0,05%).
Para el estudio del crecimiento de E. coli se empleó caldo BHI (infusión de cerebro
corazón). En primer lugar, se sembró la bacteria en medio de cultivo sólido (15 g/L
agar), y posteriormente se inocularon 2 ó 3 colonias en caldo y se incubó durante la
noche a 37°C y en condiciones de anaerobiosis. Transcurrido el tiempo de incubación,
a partir de la suspensión bacteriana crecida durante la noche, se inocularon al 2% (v/v)
diferentes tubos con y sin ingrediente a estudiar. Los concentrados proteicos se
prepararon a una concentración final de 1% v/v. Los nucleótidos se añadieron en
volumen suficiente para que en el medio de cultivo obtuviéramos la concentración de
la fórmula de estudio (32 mg/L fórmula). Además, se ensayó otra concentración
superior citada en la bibliografía para enriquecer fórmulas infantiles (72 mg/L fórmula)
(Schaller et al., 2004; Buck et al., 2004; Neri‐Almeida et al., 2009). Se llevó a cabo por
separado el estudio de las bacterias expuestas a los sueros proteicos y expuestas a los
nucleótidos. Cada se ingrediente evaluó por triplicado (Figura 17).
Figura 17. Procedimiento para el desarrollo del ensayo 1 del estudio II
1 2 3 4 5Control SLα SLα
digeridoSLβ SLβ
digerido
1 2 3 4 5Control Nucleótidos
32mg/LNucleótidos 32mg/L digerido
Nucleótidos72mg/L
Nucleótidos72mg/L digerido
Inoculo al 2% v/v
Incubación 6‐18 horas a 37C en anaerobiosis
Tomamos 2ó 3 colonias del medio sólido e inoculamos
en medio líquido
IV. Material y Métodos
109
En cada punto de muestreo (0‐14 h cada dos horas y a las 24 h) se tomó 1 ml
para la medida espectrofotométrica de su densidad óptica a 600 nm. Cuando la
densidad óptica obtenida fue mayor de 1 se realizó una dilución 1:10 y se repitió la
medida. Igualmente se tomó una alícuota para realizar el recuento de viables y la
medida de pH.
4.2.3. Procesado de los resultados y análisis estadístico
Una vez obtenidos los resultados de los recuentos de viables para cada
microorganismo y según el ingrediente utilizado, se ajustaron las curvas de
crecimiento a partir de las que se calculó, el tiempo de adaptación al medio de cultivo
(λ), la tasa de crecimiento en la fase exponencial (µ) y los recuentos máximos. Para
ajustar los modelos de crecimiento se utilizó la macro de Excel ® DMfit. Para evaluar
las posibles diferencias estadísticas (P<0,05) debidas al ingrediente añadido al medio
de cultivo, se llevó a cabo un Análisis de Varianza (ANOVA) y la comparación por
parejas se realizó mediante el test de Tukey. El tratamiento estadístico se realizo con
SPSS 15.0.
4.3. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal expuesta a los diferentes
ingredientes objeto de estudio
Existen diferentes métodos para evaluar la actividad prebiótica de un
compuesto. Se pueden realizar ensayos en fermentadores estáticos donde el sustrato
es añadido a concentración conocida. Los tubos de fermentación que contienen un
medio de cultivo basal inoculado con una suspensión fecal se incuban a 37ºC en
anaerobiosis durante un corto periodo de tiempo (24‐48h) y se toman muestras
regularmente. En las fermentaciones cerradas en las que el sustrato es limitado, el
cultivo sigue una curva típica de crecimiento. Para simular las condiciones intestinales,
se llevan a cabo estudios en fermentadores que trabajan en continuo. En ellos se
controlan diversos parámetros y se alimenta el sistema con medio de cultivo nuevo
(Gibson y Fuller, 2000). Los modelos in vitro del tracto grastrointestinal han sido
utilizados en numerosos estudios para investigar el efecto de la fermentación de
III. Revisión Bibliográfica
110
distintos sustratos (carbohidratos y proteínas) sobre la flora intestinal (Wang y Gibson,
1993; Sghir, Chow y Mackie; 1998, Brück, Graverholt y Gibson, 2002 y 2003b; Al‐
Tamimi,. 2006).
4.3.1. Procesado de los ingredientes
Los ingredientes utilizados para este experimento se describen en el apartado
2.1. de la presente tesis. La simulación de la digestión gastrointestinal de los mismos
se realizó sobre la solución madre al 10% y siguiendo el protocolo descrito en el
ensayo anterior de este mismo estudio (apartado 3.11). Por otro lado, la digestión de
las fórmulas infantiles y la leche materna se llevó a cabo según el procedimiento
explicado en el primer estudio (apartado 3.12 b). Terminada las digestiones de las
fórmulas y los ingredientes, las alícuotas se mantuvieron a 100° C durante 4 minutos
para la desnaturalización de las enzimas utilizadas.
4.3.2. Preparación del inóculo fecal
Las heces se obtuvieron de 3 lactantes sanos de entre 2 y 4 meses de edad que
no habían tomado antibióticos y con alimentación mixta (los niños recibían leche
materna y fórmula infantil). Para la preparación del inóculo fecal, se pesó 1 gramo de
heces en condiciones de esterilidad y se le añadieron 9 ml de PBS (10% w/v)
homogeneizándose en un Stomacher. La composición de PBS fue 8 g/L de NaCl, 0,2 g/L
de KCl, 1,15 g/L de Na2HPO4 y 0,2 g/L de KH2PO4 (pH 7,3). Posteriormente, 10 ml de
esta suspensión se añadieron a 90 ml del medio de cultivo basal (su composición se
indica en el siguiente apartado). Se incubó durante toda la noche en anaerobiosis a 37°
C para estabilizar la suspensión fecal antes de proceder a la inoculación.
4.3.3. Medio de cultivo e inoculación del mismo.
El medio de cultivo basal utilizado estaba compuesto por: agua de peptona (2
g/L), extracto de levadura (2 g/L), cloruro sódico (0,1 g/L) fosfato dipotásico (0.04 g/L),
sulfato de magnesio (0,01 g/L), cloruro cálcico hexahidratado (0,01 g/L), carbonato
IV. Material y Métodos
111
sódico (2 g/L) L‐cisteína (2,5 g/L), sales biliares (0,5 g/L), tween 80 (2 ml), hemina (50
mg/ml) Se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos y posteriormente se
añadió vitamina K (10 µl) (Salazar et al., 2008).
El volumen final para llevar a cabo esta experiencia fue de 20 ml, y el inóculo
fecal se realizó al 10% (v/v). En primer, lugar se les añadió a todos los tubos un 1% de
lactosa (w/v) ya que es el azúcar mayoritario de la leche. Los concentrados de
proteínas de lactosuero se añadieron también en un 1% (v/v), por otra parte los
nucleótidos se añadieron en suficiente cantidad para que la concentración final fuera
la misma que en la fórmula infantil (32 mg/L) tal y como se ha descrito anteriormente.
De esta forma obtuvimos para cada hora de muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72
horas) dos tubos con los siguientes ingredientes:
• 1% lactosa (Control).
• nucleótidos (32 mg/L).
• nucleótidos digeridos (32 mg/L).
• 1% suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα).
• 1% suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina digerido (SLα dig).
• 1% suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (SLβ).
• 1% suero lácteo rico en β‐lactoglobulina digerido (SLβ dig).
Por otro lado, se prepararon distintos tubos conteniendo 18 ml de las fórmulas
infantiles o la leche materna, a las que previamente se les añadió 0,5 g/L cisteína como
agente reductor del medio (Bruck et al., 2003b), quedando para cada hora de
muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72 horas) dos tubos de las siguientes muestras:
• Fórmula de inicio control (FC).
• Fórmula de inicio control digerida (FC dig).
• Fórmula de inicio suplementada (FS).
• Fórmula de inicio suplementada digerida (FS dig).
• Leche materna (LM).
• Leche materna digerida (LM dig).
III. Revisión Bibliográfica
112
Los tubos con el medio de cultivo y los ingredientes (nucleótidos y proteínas de
lactosuero) o con las fórmulas infantiles y leche materna, se incubaron durante toda la
noche a 37° C en anaerobiosis. Al día siguiente, se inocularon todos los tubos con 2 ml
de la suspensión fecal y se incubaron a 37° C en anaerobiosis. Se tomó muestra a las 0,
6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas y se midió el pH. Recogimos 1 ml de suspensión en cada
muestreo y se centrifugó a 14000 rpm durante 15 minutos. El precipitado se congeló
inmediatamente a ‐80º C para la posterior extracción de ADN, y el sobrenadante se
filtró a través de 0,2 µm de diámetro de poro, congelándose a ‐80º C para el análisis de
los ácidos grasos de cadena corta.
4.3.4. Estudio de la microbiota fecal mediante PCR cuantitativa
Se investigaron los siguientes grupos microbianos: Atopobium (Atopobium‐
Collinsella), Bacteroides (Bacteroides‐Prevotella‐Porphiromonas), Enterobacteriaceae,
Enterococcaceae, Clostridia IX (Clostridium leptum‐ Faecalibacterium praustnitzii),
Clostridia IVa (Clostridium cocoides‐Eubacterium rectale) Bifidobacterium,
Lactobacillus y bacterias totales en los cultivos fecales incubados en anaerobiosis a
37ºC para cada uno de los puntos de muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72 horas).
a. Cepas, condiciones de crecimiento y curvas estándar
Se realizaron distintas curvas estándar con las diferentes especies que se
indican en la Tabla 12 para cada grupo microbiano. Se cultivaron los microorganismos
entre 6 horas y toda una noche (dependiendo de su velocidad de crecimiento). Cuando
se obtuvo suficiente crecimiento (controlamos la densidad óptica) del microorganismo,
realizamos diluciones decimales y sembramos en medio sólido para hacer recuentos
que se expresaron como logaritmos decimales de las unidades formadoras de colonia
por mililitro (ufc/ml). Por otro lado, 1 ml de la suspensión bacteriana se centrifugó
para extraer el ADN del precipitado. Se realizaron 4 diluciones decimales del ADN
extraído para realizar las curvas de calibrado. La eficiencia de cada ensayo de PCR
viene determinada por la pendiente obtenida en la recta de calibrado.
IV. Material y Métodos
113
Tabla 12. Especies bacterianas utilizadas para realizar las curvas estándar en la cuantificación de los diferentes grupos microbianos
Línea Origen Lactobacillus gasseri DSMZ 20077
Bifidobacterium longum CECT 4503 Clostridium coccoides DSMZ 7935 Clostridium leptum DSMZ 753
Bacteroides tetaiotaomicron DMSZ 2079 Collinsella intestinalis DSMZ 13280
Escherichia coli Colección NUTBRO Enterococcus faecalis DSMZ2478
b. Extracción del ADN
El ADN se extrajo a partir del precipitado bacteriano obtenido de la
centrifugación de 1 ml del cultivo fecal, mediante el kit para heces QIAmp de Qiagen
siguiendo las instrucciones del fabricante. El procedimiento de extracción del ADN
comprendió 2 etapas:
1‐ lisado de las células para la extracción del ADN
2‐ purificado del mismo mediante la adsorción de impurezas y diferentes
lavados una vez quedaba retenido en las columnas QIAamp.
c. Oligonucleótidos
Los primers fueron elegidos a partir de la bibliografía consultada (Tabla 14). Para
comprobar la especificidad, las secuencias fueron comparadas con las secuencias
disponibles en la base de datos BLAST (Gueimonde et al., 2004).
d. Amplificación
Los primers utilizados para la amplificación de cada grupo microbiano así como sus
condiciones de anillamiento y la referencia bibliográfica se presentan en la Tabla 13. La
amplificación se llevó a cabo empleando las condiciones experimentales que se
muestran en la Figura 18 para las siguientes etapas: desnaturalización, 40 ciclos de
III. Revisión Bibliográfica
114
desnaturalización y anillamiento y por último se realizó una curva de disociación para
comprobar que solamente obteníamos un único producto de amplificación.
Tabla 13. Oligonucleótidos utilizados en la investigación de la evolución de diferentes grupos microbianos a partir de un inóculo fecal.
Grupo bacteriano Primer Secuencia Tª
anillamiento Referencia
Atopobium cluster AtopgroupF GGGTTGAGAGACCGACC
55ºC Matsuki et al.,
2004 AtopgroupR CGGRGCTTCTTCTGCAGG
Lactobacillus LbF AGCAGTAGGGAATCTTCCA
60ºC Rinttila et al.,
2004
LGralR CATGGAGTTCCACTGTCCTC *
Enterococcus EnterocoF CCCATCAGAAGGGGATAACACTT
60ºC Matsuda et al., 2007 EnterocoR ACCGCGGGTCCATCCATC
Enterobacteriaceae EnterobacF TGCCGTAACTTCGGGAGAAGGCA
60ºC Matsuda et al., 2007 EnterobacR TCAAGGACCAGTGTTCAGTGTC
Bacteriodes‐Prevotella
BacteroF GAGAGGAAGGTCCCCCAC
60ºC
Layton et al., 2006
BacteroR CGCKACTTGGCTGGTTCAG Ramírez‐
Farias et al., 2009
Clostridia XIVa CloscoF CGGTACCTGACTAAGAAGC
55ºC Rinttila et al.,
2004 CloscoR AGTTTYATTCTTGCGAACG
Clostridia IV CloslepF TTAACACAATAAGTWATCCACCTGG
60ºC Ramírez‐
Farias et al., 2009 CloslepR ACCTTCCTCCGTTTTGTCAAC
Bifidobacterium Bif GATTCTGGCTCAGGATGAACGC
60ºC Gueimonde et
al., 2004 Bif CTGATAGGACGCGACCCCAT
Bacterias totales UniF GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA
60ºC Fuller et al.,
2007 UniR ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC
* diseñado en el IPLA
Figura 18. Condiciones de tiempo y temperatura para la amplificación de cada grupo microbiano.
95º C 95º C 55‐60º C
10 min 15 seg
60 seg
40 ciclos
AnillamientoDesnaturalizaciónDesnaturalización Disociación
95º C
60º C
IV. Material y Métodos
115
4.3.5. Medida de pH
El pH se midió inmediatamente después de tomar las alícuotas para los análisis
de PCR y AGCC. Esta medida se realizo por triplicado realizando una medida directa
con el pH‐metro, en el tubo donde se produjo el crecimiento microbiano.
4.3.6. Análisis de ácidos grasos de cadena corta
Se realizó a partir de 1 ml de la suspensión bacteriana obtenida en cada punto
de muestreo (0, 6, 12, 24, 36 y 72 horas) que fue centrifugado a 14.000 rpm durante
15 minutos. Al sobrenadante se le adicionó 2 mg/L 2‐ etilbutírico (estándar interno) a
razón de 1:6,5 y posteriormente se filtró (0,22 µm) y se analizó por cromatografía de
gases (adaptado de Salazar et al., 2008).
El equipo utilizado fue en un cromatógrafo de gases (Agilent 7890A) con una
columna NukolTM (30 m x 0,25 x 0,25 µm), un detector de ionización de llama y un
inyector automático (7683B). Los diferentes ácidos orgánicos fueron identificados
según los tiempos de retención y las concentraciones fueron calculadas a partir de una
recta de calibrado para cada ácido graso. En Tabla 14 se recogen las condiciones
cromatográficas del método analítico empleado.
Los datos cromatográficos se procesaron con el software ALS Controller Utility de
Agilent Technologies. En la Figura 19 se muestra el cromatograma de los ácidos grasos
de cadena corta analizados a partir de la solución patrón de concentración 10 mM
III. Revisión Bibliográfica
116
Tabla 14. Condiciones cromatográficas para el análisis de AGCC
Parámetros instrumentales Condiciones
Método de elución Presión inyector constante
Flujos
Helio 25 ml/min. (gas portador)
Aire 400 ml/min.
Hidrógeno 30 ml/min.
Modo inyección Splitless
Volumen de inyección 2 µL
Columna NukolTM 30 m x 0,25 x 0,25 µm
Temperatura horno 80 °C
Rampa de temperatura 80 °C durante 5 min.
5 ºC/min. hasta 185 ºC
Temperatura inyector 220 °C
Temperatura detector 220 °C
Presión inyector 58.99 kPa
Figura 19. Cromatograma del multipatrón a concentración 10mM.
La recta de calibrado se preparó a partir de un multipatrón comercial Supelco de
AGCC (descrito en la Tabla 15) de concentración 10 mM. Por otro lado se prepararon
patrones individuales de ácido acético con mayor concentración, ya que las muestras
min12 14 16 18 20 22 24
pA
0
50
100
150
200
250
300
Acético (12.60)
Propionico
(13.96)
Isobutírico(14.80)
Butírico (16.46)
Isovalérico(17.34)
Valérico
(18.85)
Isocaproico(20.22)
Caprocico(21.10)
Heptanoico(23.56)
PI (19,27)
IV. Material y Métodos
117
presentaron valores superiores a 10 mM. Las soluciones estándar de ácidos grasos
fueron procesadas igual que las muestras.
Tabla 15. Patrones de ácidos grasos utilizados para la elaboración de las rectas de calibrado Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Patrón 6
Multipatrón 10 mM 5 mM 2 mM 1 mM 0,5 mM 0,25mM
Acético 200 mM 100 mM 50 mM 10 mM 5 mM 2 mM
4.3.7. Análisis estadístico.
Los resultados de la cuantificación de las poblaciones microbianas, de los ácidos
grasos de cadena corta y de la evolución del pH, se mostraron como media ±
desviación estándar y mediana. Para determinar la existencia de diferencias
estadísticamente significativas debidas a los diferentes ingredientes añadidos al medio
de cultivo o a la exposición del inóculo fecal a las fórmulas y leche materna, se realizó
el test de Kruskal Wallis, tras contrastar la normalidad (test de Shapiro Wilk) y la
homogeneidad de varianzas (Test de Levene). Por otro lado para comprobar posibles
correlaciones entre las diferentes variables estudiadas (grupos microbianos, ácidos
grasos y pH) se realizó el test de Sperman. El análisis estadístico se realizó utilizando el
paquete estadístico SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)
III. Revisión Bibliográfica
118
5. ESTUDIOS III y IV. ESTUDIOS IN VIVO
Con el objetivo de facilitar el diseño del estudio in vivo de la presente tesis, éste
se dividió en: comparación de la microbiota intestinal de lactantes procedentes de
diferentes regiones españolas alimentados con leche materna (estudio III), y
caracterización de la flora de lactantes mediante PCR cuantitativa (estudio IV) (Figura
8).
Para el estudio III se eligieron 20 participantes alimentados con leche materna
que también formaron parte del estudio IV. Se realizó la comparación de la microbiota
intestinal de lactantes alimentados con leche materna procedentes de dos regiones
españolas diferentes, Asturias y Murcia. En total se incluyeron 40 lactantes nácidos a
término (20 de cada región) mediante parto vaginal, que no hubieran recibido
tratamiento antibiótico (lactantes y madres) y cuya alimentación fuera exclusivamente
leche materna. El diseño del ensayo y la metodología llevada a cabo en ambas regiones
fue similar y se detalla en los siguientes apartados.
En el estudio IV se estudia la influencia de la alimentación (suero lácteo rico en
lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la microbiota intestinal de lactantes tomando
como referencia la microbiota de los lactantes alimentados con leche materna. A
continuación detallamos el ensayo clínico correspondiente a este estudio, en el que
están incluidos los 20 participantes del ensayo III procedentes de la región de Murcia.
5.1. Ensayo clínico
Se realizó un ensayo clínico prospectivo, comparativo, doble ciego y aleatorizado
para las fórmulas objeto de estudio, realizado en paralelo en 3 grupos de individuos.
Se incluyeron en el estudio 61 recién nácidos a término y sanos, que cumplían los
criterios de inclusión (Tabla 16). Grupo FC: alimentados con fórmula de inicio
estándar, sin suplementar (n=14), Grupo FS, alimentados con fórmula rica en
ingredientes funcionales, (n=14) y Grupo LM, alimentados con leche materna (n=33).
IV. Material y Métodos
119
El periodo de tratamiento fue de 12 semanas, iniciándose entre los días 8 y 14 de vida
del niño.
Para limitar la posibilidad de la aparición de desequilibrios en la asignación de
tratamientos, la aleatorización se realizó en bloques equilibrados de 4 individuos. Una
vez generada la secuencia de aleatorización, se prepararon sobres cerrados que
contenían una tarjeta con el código que indicaba el tipo de fórmula y que serviría para
identificar al participante. A los niños alimentados con leche materna se les asignó un
número para ser identificados junto a sus iniciales.
Tanto el participante como el pediatra desconocían la fórmula asignada a cada
individuo estando sólo en conocimiento del coordinador del proyecto la
correspondencia entre el número de aleatorización y el tipo de fórmula. Para asegurar
que las madres voluntarias no pudieran identificar los productos estudiados, las
fórmulas se envasaron en envases idénticos.
El análisis se realizó “por protocolo” teniendo en cuenta sólo a los participantes
que fueron alimentados, durante el periodo de estudio, exclusivamente con la fórmula
asignada en el proceso de aleatorización y acudieron al total de las visitas programadas
entregando muestras en cada una de dichas visitas.
5.2. Aspectos éticos y consentimiento informado
Este estudio se realizó de acuerdo con las Normas de Helsinki y las ICH Guidelines
establecidas en cuanto a la realización de estudios clínicos en seres humanos. Además,
siguió las directrices publicadas por la EFSA para la preparación y presentación de
aplicaciones, alimentos o ingredientes para autorización de propiedades saludables. El
estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital
Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) y por el Comité Ético de la Universidad de
Murcia.
III. Revisión Bibliográfica
120
Los voluntarios que aceptaron participar en el estudio recibieron, para su lectura
y estudio y posterior firma, el “consentimiento informado” (Figura 20). Igualmente se
solicitó su autorización para incluir sus datos en un fichero sometido a las garantías de
Conforme al Proyecto de Ley de Servicios de la Sociedad de la Información y de
Comercio Electrónico (la LSSI‐CE) recientemente aprobado por el parlamento español
(LSSI 34/2002 11 julio artículo 21) y de la vigente Ley Orgánica 15 13/12/1999 de
Protección de Datos española.
Esta documentación fue aportada por el Servicio de Pediatría del Hospital
Universitario Virgen de la Arrixaca. Se programaron controles médicos coincidentes
con la toma de muestras de heces y sangre, así como con la recogida de información.
Durante el estudio se requirió que los lactantes no participaran en otro estudio, y
recibieron las fórmulas infantiles y la atención médica de forma gratuita. Todas las
madres participantes gozaban de buena salud y no tomaron medicación con agentes
antimicrobianos ni antifúngicos, ni con bismuto, laxantes u otros medicamentos que
pudieran suprimir la secreción ácido‐gástrica. No obstante, se les informó que podían
retirarse voluntariamente en cualquier momento del estudio o bien por cualquiera de
las siguientes causas:
‐ Cumplimiento insuficiente de los protocolos definido como: “No acude a las
visitas del estudio, no facilita los datos que se registran en diarios sobre la
alimentación/tolerancia, se permite que el bebé ingiera alimentos o
fórmulaciones distintas de las del estudio”.
‐ Vómitos, diarreas y/o constipación debido a una enfermedad diagnosticada.
‐ Aparición de alguna dolencia orgánica, sistémica o de otro tipo que pueda
dificultar la valoración de la respuesta del recién nácido a la formulación del
estudio.
‐ Cualquier enfermedad que exija un cambio en la dieta durante más de 24 horas.
‐ Administración de medicamentos.
IV. Material y Métodos
121
Figura 20. Triptico informativo y consentimiento informado del ensayo clínico que fue proporcionado a las madres antes del comienzo del estudio.
En la Tabla 17 se muestran los criterios de inclusión y exclusión que se tuvieron
en cuenta para la participación en el estudio in vivo.
III. Revisión Bibliográfica
122
Tabla 16. Criterios de inclusión y exclusión del ensayo in vivo
Criterios de inclusión Criterios de exclusión
Consentimiento firmado por los padres y compromiso de completar los formularios, realizar la recogida de muestras y acudir a las visitas previstas en el estudio.
Niños alérgicos a la proteína de leche de vaca o con historia familiar de alergia a la proteína de leche de vaca.
No tener antecedentes familiares de intolerancia a la proteína de leche de vaca.
Parto mediante cesárea.
Recién nácidos a término. Edad gestacional 37‐42 semanas. Percentil al nacer en peso y altura entre 10 y 90. Test Apgar ≥ 8 a los cinco minutos del nacimiento.
Recién nácidos con episodios de diarrea desde el nacimiento.
Las madres lactantes tendrán buena salud, y no tomarán ninguna medicación con agentes antimicrobianos ni antifúngicos, laxantes o medicamentos que supriman la secreción ácido‐gástrica.
Recién nácidos con infecciones sistémicas o congénitas, desórdenes cardiacos, respiratorios, hematológicos y gastrointestinales.
Los padres están de acuerdo en no administrar al recién nácido ninguna mediación, suplementos minerales o vitamínicos (excepto vitamina D) y en alimentar al niño sólo con las fórmulas en estudio durante la duración del mismo.
Niños que han recibido suplementos de hierro, agentes antimicrobianos, medicación antifúngica, supositorios, medicamentos con bismuto o cualquier otra medicación que pudiera neutralizar o suspender la secreción ácido gástrica.
5.3. Reactivos, material y equipos de laboratorio PCR en tiempo real (cuantitativa).
‐ Master mix SYBR Green Ref. 4334368577G (Applied Biosystems, Madrid,
España)
‐ Agua para biología molecular Ref. W4502 (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ Cisteína (Sigma, Steinhein, Alemania)
‐ MRS broth CM 0359 Oxoid (Oxoid, Hamshire, England)
‐ Agar‐agar (Merck, Darmstadt, Germany)
‐ QIAmp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania)
‐ Etanol para Biología Molecular (Merck, Darmstadt, Alemania)
‐ Tubos Eppendorf de 1 ml y 2 ml (Daslab, Barcelona, España)
‐ Tubos 5 ml fondo cónico estériles (Deltalab, Barcelona,España).
‐ Puntas de pipetas QSP, 100,200 y 1000 (Bioline, London, UK)
‐ Placas de 96 twin.tec para PCR pocillos incoloros Ref. 0030128.575.
(Eppendorf Hamburgo, Alemania)
‐ Jarras de anaerobiosis 2,5 L (Biomereux, Marcy lEtoile, France).
IV. Material y Métodos
123
‐ Láminas para el termosellado de placas (Applied Biosystem, Foster city,
USA)
‐ Termociclador Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster city, USA)
‐ Centrífuga 5415R (Eppendorf, Hamburg, Alemania)
‐ Autoclave (Selecta, Barcelona, España)
‐ Micropipetas (Thermo, Cambridge, Reino Unido)
‐ TissueRuptor y sondas(QIAGEN, Hilden, Alemania)
5.4. Participantes
Los participantes fueron reclutados en la unidad Materno‐Infantil del Hospital
Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) durante la estancia de las madres tras el
parto. Los pediatras fueron los encargados de informar a los padres de los objetivos y
desarrollo del ensayo, entregándoles el tríptico informativo (Figura 20). Debido a que
en mayoría de los casos, la decisión de participar la tomaron una vez obtenida el alta
hospitalaria, previamente se les asignó y entregó, una de las fórmulas objeto de
estudio. Una vez tomada la decisión se les indicaba la fecha de la primera visita
durante la cual firmarían el consentimiento informado.
Para el desarrollo del ensayo clínico se programaron 4 visitas al pediatra durante
las cuales se realizaron las diferentes evaluaciones y se recogieron las muestras
fecales. En cada visita se les entregó el material de toma de muestras de heces para
que pudieran recogerlas en casa y entregarlas a los pediatras en la siguiente visita
programada. Igualmente, eran las pediatras las encargadas de entregarles la fórmula
asignada en cantidad suficiente para alimentar a sus bebés durante el periodo de
tiempo transcurrido entre visitas.
5.5. Fórmulas infantiles
Evaluamos dos fórmulas infantiles de inicio de la marca comercial Hero España S.A
ya descritas en las Tablas 6 y 7, una fórmula estándar sin suplementar con ingredientes
III. Revisión Bibliográfica
124
funcionales a la que llamamos Fórmula control (FC) y una fórmula suplementada con
alfa‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA a la que llamamos Fórmula suplementada (FS).
Como referencia se analizaron también las heces de recién nácidos cuya alimentación
fue exclusivamente leche materna (LM).
5.6. Recogida de las muestras fecales.
Las muestras de heces fueron recogidas el mismo día de la visita, aunque cuando
esto no fue posible, el niño fue estimulado por los pediatras durante la cita. La muestra
se almacenó a 4°C y se mantuvo en condiciones de esterilidad y anaerobiosis con el
material proporcionado por el pediatra hasta su recepción en el laboratorio (antes de 4
horas después de la recogida).
El transporte de las muestras al hospital se realizó en neveras portátiles y una vez
entregadas al pediatra, fueron codificadas con la identificación del sujeto
manteniéndose en las mismas condiciones de temperatura (4 °C). Se realizó el
transporte inmediato al laboratorio del Departamento de Nutrición y Bromatología de
la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, lugar donde se congelaron a ‐
80 °C hasta la posterior realización de los análisis.
5.7. PCR cuantitativa
Se analizaron los siguientes grupos microbianos de 164 muestras fecales
pertenecientes a 61 lactantes pertenecientes a los tres grupos del estudio (FC, FS, LM):
Atopobium, Bifidobacterium, Bacteroides, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae,
Clostridia XIVa (C. coccoides), Clostridia IV (C. leptum), Lactobacillus y Staphylococcus.
El ADN extraído, se transportó al Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA‐CSIC)
para su posterior análisis.
IV. Material y Métodos
125
5.7.1. Extracción de ADN
Las muestras fecales fueron congeladas a ‐80 ºC inmediatamente después de su
llegada al laboratorio y se conservaron así hasta su procesado para la posterior
extracción de ADN mediante el kit para heces QIAmp de Qiagen®. El procedimiento de
extracción del ADN se detalla en el apartado 4.3.4.2 del ensayo 2, en el que se estudia
la evolución de la microbiota fecal in vitro. Para el procesado de las muestras de heces,
0,2 g de muestra congelada, se mezclaron con 1,4 ml del tampón ASL del kit de
extracción, y se homogenizó con un Tissuerruptor durante un minuto. Una vez extraído
el ADN, se congeló a ‐80 ºC hasta la realización de la PCR cuantitativa.
5.7.2. Cepas, condiciones de crecimiento y curvas estándar
Las cepas utilizadas para el desarrollo de esta técnica se muestran en la Tabla
17. El crecimiento de las bacterias se realizó primero en un medio de cultivo sólido y a
partir de las colonias obtenidas, se inoculó un medio líquido para preparar la curva de
calibración. L. casei y B. longum fueron cultivadas en caldo MRS, E.coli en caldo BHI
(caldo cerebro‐corazón) y las demás bacterias en el medio de cultivo GAM (Gifu
Anaerobic Médium).
Tabla 17. Especies bacterianas utilizadas para preparar las curvas estándar para la cuantificación de los diferentes grupos microbianos
Línea Origen Lactobacilus casei Colección IPLA
Bifidobacterium longum NCC 2705Clostridium coccoides DSMZ 7935Clostridium leptum DSMZ 753
Bacteroides Tetaiotaomicron DMSZ 2079Collinsella intestinalis DSMZ 13280
Escherichia coli LH6 2072Enterococcus faecalis Colección IPLA
Staphylococcus epidermis Colección IPLA
Para la realización de las curvas de calibrado, se inoculó el microorganismo en
cuestión en el caldo de cultivo especificado anteriormente para cada microorganismo,
III. Revisión Bibliográfica
126
incubándose toda la noche. Al día siguiente se sembró en medio solido para realizar
recuentos, por otro lado se centrifugó 1ml de la suspensión bacteriana para extraer el
ADN. Se realizaron diluciones decimales a partir del ADN extraído de los cultivos puros
de los que previamente hicimos recuentos en placa. La extracción del ADN de los
cultivos puros, se realizó con el mismo kit de extracción de ADN utilizado para heces.
5.7.3. Oligonucleótidos y PCR cuantitativa
Para comprobar la especificidad de los primers se consultó la bibliografía y las
secuencias fueron comparadas con las secuencias disponibles en la base de datos
BLAST (Gueimonde et al., 2004). Los primers utilizados se muestran en la Tabla 18.
5.7.4. Condiciones de amplificación
Las muestras se analizaron en un volumen final de 25 μl, que contenía Power
SYBR® Green PCR Master Mix 1X, primers 0,2 μM y 1 μl de la muestra. Las reacciones
se llevaron a cabo en placas ópticas de 96 pocillos. Las condiciones de PCR fueron 10
minutos 95º C, 40 ciclos 15 s 95°C, 1 minuto Tª de anillamiento (correspondiente para
cada primer), curva de disociación, 15 segundos 95°C, T anillamiento 1 minuto, 15
segundos 95ºC. Todos los análisis se realizaron por duplicado y cuando el coeficiente
de variación era cercano a 10 se realizó un tercer análisis.
Calculamos la eficiencia de los ensayos de PCR cuantitativa mediante la siguiente
fórmula (Rinttila et al., 2004):
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡−=
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −
1101
slopeE
IV. Material y Métodos
127
Tabla 18. Primers utilizados en PCR cuantitativa
Grupo bacteriano Primer Secuencia Tª
anillamiento Referencia
Atopobium cluster AtopgroupF GGGTTGAGAGACCGACC
55ºC Matsuki et al.,
2004 AtopgroupR CGGRGCTTCTTCTGCAGG
Lactobacillus LbF AGCAGTAGGGAATCTTCCA
60ºC
Rinttila et al., 2004
LGralR CATGGAGTTCCACTGTCCTC *
Enterococcus EnterocoF CCCATCAGAAGGGGATAACACTT
60ºC Matsuda et al.,
2007 EnterocoR ACCGCGGGTCCATCCATC
Enterobacteriaceae EnterobacF TGCCGTAACTTCGGGAGAAGGCA
60ºC Matsuda et al.,
2007 EnterobacR TCAAGGACCAGTGTTCAGTGTC
Bacteriodes BacteroF GAGAGGAAGGTCCCCCAC 60ºC Layton et al., 2006
BacteroR CGCKACTTGGCTGGTTCAG
Ramírez‐Farias et al., 2009
Clostridia XIVa CloscoF CGGTACCTGACTAAGAAGC
55ºC Rinttila et al.,
2004 CloscoR AGTTTYATTCTTGCGAACG
Clostridia IV CloslepF TTAACACAATAAGTWATCCACCTGG
60ºC Ramírez et al.,
2008 CloslepR ACCTTCCTCCGTTTTGTCAAC
Bifidobacterium Bif GATTCTGGCTCAGGATGAACGC
60ºC Gueimonde et al.,
2004 Bif CTGATAGGACGCGACCCCAT
Staphylococcus StaphyF ACGGTCTTGCTGTCACTTATA
60ºC Matsuda et al.,
2007 StaphyR TACACATATGTTCTTCCCTAATAA
* diseñado en el IPLA
5.8. Análisis estadístico.
Debido a que los grupos de estudio no siguieron una distribución normal (test
de Shapiro Wilk) y no cumplieron la condición de homogeneidad de varianzas (test de
Levene), se aplicaron pruebas no paramétricas para evaluar la influencia de la
alimentación en la composición de la microbiota fecal .Los resultados de la
cuantificación de las poblaciones microbianas en heces de lactantes se representaron
en diagramas de cajas. Se realizó el test de Kruskal Wallis sobre las medianas de los
tres grupos de estudio y múltiples test de Mann Witney por pares corrigiendo la
significación por el método de Bonferroni (α/n). Se repitieron las mismas pruebas para
analizar posibles diferencias en general sobre la microbiota debidas a la alimentación
recibida sin tener en cuenta los muestreos. Para contrastar los porcentajes de
muestras positivas para cada grupo microbiano en los tres grupos de estudio, se llevó a
cabo un test de Fisher. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el
paquete estadístico SPSS para Windows (SPSS versión 15.0 Inc., Chicago, IL).
V. Resultados y Discusión
129
V. RESULTADOS Y DISCUSION
1. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación, transporte y retención de
calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2.
1.1. Viabilidad y crecimiento de la línea celular Caco‐2
La viabilidad celular evaluada mediante la tinción con azul tripán puso de
manifiesto aquellas células con las membranas rotas y por lo tanto estaban muertas.
Esta prueba se realizó cada vez que se llevó a cabo un subcultivo, antes de congelar y
después de descongelar a fin de determinar la viabilidad que presentaban las células.
En todos los casos la viabilidad celular fue superior al 90 %.
La línea celular Caco‐2 fue mantenida en frascos de 75 cm2 hasta alcanzar el 70‐
80% de confluencia momento en que se realizó su subcultivo. Para poner de
manifiesto las modificaciones del crecimiento celular, se observó el cultivo al 2º, 5º y
7º día de postsiembra empleando un microscopio de contraste de fases (Figura 21a, b
y c).
La línea celular utilizada en este estudio mostró estar libre de micoplasmas en
los ensayos realizados (Figura 21d). La contaminación en cultivos celulares por
micoplasmas puede inducir efectos citogenéticos, disminución en las concentraciones
de nutrientes, alteración de la morfología celular, modulación de la respuesta inmune
e incluso interrupción del metabolismo celular (Rivera, Castillo y Sánchez, 2011).
V. Resultados y Discusión
130
Figura 21. Imagen de la línea celular Caco‐2 en diferentes días de postsiembra mediante microscopio de contraste de fases y observación del test de micoplasmas. a) 2 días de cultivo, b) 5 días de cultivo, c) 7 días de cultivo, d) ausencia de micoplasmas.
En una curva de crecimiento celular teórica se pueden observar tres fases, una
primera fase de latencia o adaptación al medio en la que las células no se dividen y
comienzan a adherirse al sustrato. En la segunda fase, llamada logarítmica, las células
se dividen con una alta tasa de crecimiento hasta llegar a una fase estacionaria en la
que ya no existe división celular y comienza la diferenciación.
Para realizar la curva de crecimiento se sembró una placa de 12 pocillos que se
mantuvo en cultivo durante 21 días. En la Figura 22 se muestra la curva de crecimiento
de la línea celular de este estudio, en ella se pueden diferenciar las dos últimas fases
de crecimiento, la exponencial del día 2 al 14 y la estacionaria del día 14 al 21,
resultados que coinciden con los obtenidos por Jovani et al., (2001) excepto que en
nuestro caso no se observó fase de latencia, debido a que nuestro primer punto de
muestreo fue el 2º día de postsiembra y las células ya se habían adaptado al medio.
V. Resultados y Discusión
131
Figura 22. Curva de crecimiento de la línea celular Caco‐2.
1.2. Diferenciación celular
El estado de diferenciación celular de la línea Caco‐2, se caracteriza por el
desarrollo de una monocapa de células polarizadas con un fenotipo absortivo en el que
destaca el borde en cepillo, con altos niveles de expresión de enzimas hidrolasas como
la fosfatasa alcalina y sacarasa‐isomaltasa (Pinto et al., 1983).
Figura 23. Imágenes de la monocapa en el microscopio electrónico de barrido (a: 5000X, b: 6000X)
Según Frontela et al., (2009ab), las células se encuentran diferenciadas tras 19‐
21 días de cultivo, por lo que decidimos realizar los ensayos en esta fase. Para
comprobar que, efectivamente las células se habían diferenciado en este tiempo, éstas
fueron sembradas en un cubre y se mantuvieron en cultivo hasta que se realizó la
a b
V. Resultados y Discusión
132
fijación de las mismas (19‐21 días) para su posterior observación al microscopio
electrónico de barrido. En la Figura 23 se muestran las imágenes tomadas y en ellas se
puede observar el desarrollo de las microvellosidades apicales.
1.3. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol.
La evaluación de la integridad de la monocapa se evaluó mediante la
determinación del paso transepitelial de rojo fenol, ya que esta molécula, sólo utiliza
como vía de transporte la ruta paracelular. Esta medida es importante, porque el
transporte mineral no sólo ocurre a través de la célula (vía transcelular), sino que
también sucede a través de los espacios intercelulares. Si la monocapa no se forma
correctamente y quedan espacios entre las células, el mineral atravesará el epitelio de
un modo que no permite el correcto estudio siendo incorrectos los datos que se
obtengan del ensayo.
Figura 24. a) Recta de calibrado de rojo fenol. b) Valores de la permeabilidad aparente en diferentes días de cultivo para evaluar la integridad de la monocapa.
Para realizar esta prueba, en primer lugar se construyó una recta de calibrado
con diferentes concentraciones de rojo fenol relacionándolas con un valor de
absorbancia a 560 nm (Figura 24a). A partir de esta recta se calculó la concentración de
rojo fenol de la cámara basolateral y la permeabilidad aparente, cuyos resultados se
muestran en la Figura 24b.
En los resultados de permeabilidad aparente se pudo observar como ésta va
disminuyendo conforme incrementan los días en cultivo, siendo el valor más bajo a los
Días en cultivo
Absorbancia (560nm)
Rojo Fenol (µM)
Permeabilidad Aparente (cm/s)
8 0,1749 3,56 2,02∙10‐4
12 0,1574 3,18 1,80∙10‐4
15 0,1222 2,42 1,37∙10‐4
18 0,1061 2,07 1,17∙10‐4
21 0,0663 1,20 6,82∙10‐5
V. Resultados y Discusión
133
21 días de postsiembra. Este descenso del paso del rojo fenol, indica una correcta
formación de las uniones intercelulares y por lo tanto una adecuada integridad de la
monocapa para poder realizar los experimentos de absorción mineral. Los resultados
obtenidos en el presente estudio, indican que la monocapa está correctamente
formada desde los 8 días hasta 21 días a los que la permeabilidad aparente es mínima
(6,82∙105 cm/s) y el porcentaje de rojo fenol que atraviesa la monocapa es del 0,12%.
En relación a estos resultados, hay autores que describen un descenso del paso de rojo
fenol desde el día siguiente a la siembra (24 ± 1%) hasta que se produce la confluencia
celular (6%) (Halleux & Schneider, 1991) y otros que determinan que en condiciones
óptimas de formación de la monocapa celular, el porcentaje del paso de ese
compuesto durante una hora de incubación con la solución de rojo fenol, debe ser: 0,6
% (Reeves et al., 1996) y 0,24 % (Ekmekcioglu et al., 1999).
Esta técnica para evaluar la integridad de la monocapa se relacionó con la
resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en diversos estudios y actualmente es este
método el más utilizado.
1.4. Ensayo de toxicidad de los ingredientes utilizados en este estudio. Ensayo MTT
Con el objetivo de comprobar que los ingredientes del presente estudio y las
soluciones patrón de los minerales empleados no eran tóxicos para las células se
evaluó la funcionalidad mitocondrial de la línea celular Caco‐2, mediante un test de
toxicidad (ensayo MTT) cuyos resultados se muestran en la Figura 25. El test se llevó a
cabo después de 21 días de cultivo y la exposición de la monocapa a cada una de las
muestras se realizó durante 1 hora, para simular las mismas condiciones a las que se
realizarán los experimentos con soluciones patrón de los tres minerales ensayados.
En todos los casos se obtuvieron valores de porcentajes de viabilidad celular
mayores del 90% a excepción de la solución de calcio con concentración 30 mM, que
mostró unos valores ligeramente inferiores. Estos resultados nos indican que los
ingredientes y las diferentes concentraciones de los minerales no son tóxicas para las
células Caco‐2 y por lo tanto pueden ser utilizadas en los ensayos.
V. Resultados y Discusión
134
Figura 25. Porcentaje de viabilidad celular para cada grupo de estudio tras el ensayo de toxicidad.
1.5. Ensayo 1: Evaluación de la disponibilidad mineral de soluciones patrón de
minerales. Efecto de los ingredientes de estudio.
El objetivo de este ensayo fue, evaluar el efecto de los diferentes ingredientes
de estudio (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y nucleótidos) en la disponibilidad
mineral. Para ello las células fueron sembradas sobre membranas semipermeables
insertas en pocillos bicamerales y finalizado el tiempo de exposición, el contenido
mineral de las células y de la cámara basolateral fue analizado para calcular el
porcentaje de retención, transporte y captación celular.
Fueron ensayadas dos concentraciones de una solución patrón de cada mineral
sobre los tres grupos de estudio: i) grupo control al que sólo se le añadió la solución
patrón del mineral, ii) grupo al que se le añadió la solución patrón y el preparado de
nucleótidos (Nuc) y por último iii) grupo al que se le añadió la solución patrón y el
suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα).
Los resultados obtenidos de la medida del contenido mineral de los
ingredientes ensayados en el presente trabajo (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y
0
20
40
60
80
100
120
Control Nuc SLα Fe 50 µM Fe 150µM Ca 10mM Ca 30 mM Zn 5 µM Zn 10µM
% Viabilidad
V. Resultados y Discusión
135
nucleótidos) se muestran en la Tabla 19. En ella podemos observar que la cantidad de
mineral aportada por los ingredientes era muy baja, por lo que no se tuvo en cuenta al
hacer los cálculos de los parámetros de disponibilidad mineral de las disoluciones
patrón de calcio, hierro y cinc ensayados.
Tabla 19. Valores medios y desviación estándar de los minerales analizados en los ingredientes de estudio
Nucleótidos Suero lácteo
Calcio µg/g ingrediente 31,79±0,71 388,85 ± 24,71
µg/ ml solución final 1∙10‐3±0,00 8,1∙10‐1± 5,2∙10‐2
Hierro µg/g ingrediente 24,27±5,01 24,56±5,10
µg/ ml solución final 8∙10‐4±2∙10‐5 5,2∙10‐2±1∙10‐2
Cinc µg/g ingrediente 25,11±0,77 2,69±0,09
µg/ ml solución final 8∙10‐4±0,00 5,6∙10‐3± 2∙10‐3
Los resultados de retención, transporte y captación del calcio y hierro se
muestran en la Tabla 20 y la Tabla 21 respectivamente, como valores medios y
desviación estándar de cada uno de los parámetros analizados o calculados.
1.5.1. Calcio
En la tabla 20 se puede observar que la cantidad de calcio retenido cuando se
utilizó una solución patrón a concentración 10 mM, fue mayor en las células a las que
se les añadió el preparado de nucleótidos (Nuc) que en las que fueron expuestas al
lactosuero rico en α‐lactoalbumina (SLα) o al grupo control (C) (21,31 µg/pocillo vs
7,69 y 7,25 µg/pocillo respectivamente). Como consecuencia, el porcentaje de
retención de calcio también fue mayor en las células a las que se les adicionó
nucleótidos, mostrando tanto la cantidad de calcio retenida como el porcentaje de
retención, diferencias significativas con respecto a los otros grupos. Sin embargo el
transporte de calcio fue menor en las células con mayor retención, mostrando el grupo
control un incremento significativo de calcio transportado y por lo tanto mayor
porcentaje de transporte comparado con los otros dos grupos de estudio. A partir de
los datos de calcio retenido y transportado se calculó el captado por las células,
obteniéndose los valores más altos para el grupo al que se le añadieron nucleótidos
V. Resultados y Discusión
136
respecto de los otros dos. Los resultados del porcentaje de captación observados en
este estudio cuando se añadieron a la monocapa 0,4 mg de calcio/pocillo, fueron
superiores a los obtenidos por Jovaní et al., (2001) que añadió 0,56 mg. La causa de la
gran diferencia entre estos valores podría ser atribuido a la metodología, ya que
nosotros utilizamos insertos bicamerales para estudiar retención, transporte y
captación y estos autores realizaron el ensayo en frascos por lo que sólo cuantificaron
el mineral retenido por las células expresado como mineral captado.
De los resultados del ensayo realizado con la concentración 30mM de calcio se
debe destacar que el porcentaje de calcio retenido, transportado y captado por las
células no aumentó con la cantidad añadida, sino que fue menor. Este hecho pudo ser
debido probablemente a una saturación del mecanismo de transporte transcelular del
calcio que también ocurrió en un ensayo de captación llevado a cabo por Frontela et al
(2009a) en el que añadió 2 mg de calcio a las células. La cantidad de mineral retenido y
el porcentaje de retención fueron similares para los tres grupos de estudio (control,
nucleótidos y α‐lactoalbúmina), sin embargo el porcentaje de calcio transportado fue
significativamente menor en el grupo al que se le añadió α‐lactoalbúmina.
Según los resultados obtenidos, parece ser que 10 mM es la concentración de
calcio óptima a la cual la disponibilidad del mineral, ensayada con soluciones patrón,
es más alta. Además, al estudiar la disponibilidad mineral de esta concentración, el
grupo de estudio al que se le añadió nucleótidos presentó un aumento significativo de
la captación del calcio. Actualmente, no hay estudios que corroboren estos resultados,
por lo que se plantea la necesidad de llevar a cabo más investigaciones a este respecto.
1.5.2. Hierro
Los resultados de la evaluación de retención, transporte y captación celular de
hierro a partir de soluciones patrón de este mineral, utilizando la línea Caco‐2 expuesta
a los ingredientes de estudio se muestra en la Tabla 21.
V. Resultados y Discusión
137
Los resultados obtenidos con la solución patrón 50µM, muestran diferencias
significativas en la cantidad de hierro retenido y el porcentaje de hierro retenido, entre
los tres grupos de estudio, siendo superiores los valores obtenidos por los grupos a los
que se les adicionó los ingredientes funcionales (SLα y Nuc). Los valores de hierro
transportado y su porcentaje fueron mayores en el grupo al que se le añadió α‐
lactoalbúmina aunque sin diferencias estadísticas respecto a los otros dos grupos. Este
hecho se pudo deber a la alta variabilidad encontrada entre las muestras. Los
parámetros de captación mineral, mostraron una tendencia similar a los parámetros
de transporte. Por lo tanto podemos afirmar que los ingredientes evaluados en las
concentraciones del estudio mejoran la disponibilidad del hierro.
Para la concentración 150 µM no encontramos ninguna diferencia significativa
en los parámetros estudiados aunque de nuevo, se observaron valores mayores para la
retención, transporte y captación en el grupo expuesto al concentrado proteico. Los
valores encontrados en los otros dos grupos (control y nucleótidos) fueron similares.
En este sentido, Sändstrom et al., (2008) observaron un incremento en la absorción de
hierro en niños alimentados con fórmulas ricas en α‐lactoalbúmina (25%) respecto de
los alimentados con fórmulas estándar. Por otro lado, Kamau et al., (2010)
describieron que los péptidos resultantes de la hidrólisis in vitro o in vivo de la proteína
α‐lactoalbúmina eran capaces de unir minerales y por lo tanto de actuar de
transportadores.
La cantidad y el porcentaje de hierro retenido, transportado y captado fue
mayor cuando añadimos la solución patrón con concentración más alta, excepto para
el porcentaje de captación en el grupo al que se le añadió nucleótidos, cuyos valores
resultaron similares para las dos concentraciones ensayadas. Frontela et al., (2009a),
en un ensayo de captación en frascos de cultivo, evaluaron una cantidad de hierro
intermedia a las ensayadas en el presente trabajo observando una porcentaje
captación mineral de (16,9%) inferior al obtenido en nuestro estudio con cualquiera de
las dos concentraciones ensayadas (22,01‐27,03%).
V. Resultados y Discusión
138
En un estudio realizado en lactantes en los que se evaluó una fórmula infantil
suplementada con nucleótidos, no observaron una mejora del estatus de hierro
(Hernell y Lönnerdal 2002)
1.5.3. Cinc
Los resultados obtenidos con las soluciones patrón de cinc no se pueden reflejar
numéricamente en este estudio debido a que los valores observados en las monocapas
empleadas como blanco presentaron unos elevados niveles de cinc, similares a las
células expuestas a las diferentes soluciones patrón. Nosotros atribuimos la causa, de
detectar niveles tan bajos, a la pequeña cantidad de cinc añadida a las células. Esta
situación ha sido igualmente descrita en un ensayo llevado a cabo por Jovaní et al.,
(2001) con soluciones patrón y en los que evalúan la captación. Sin embargo cuando
realizan estos ensayos con fórmulas infantiles si logran cuantificar la cantidad de cinc
por lo que concluyen que son diversos los factores dietéticos que deben intervenir en
la disponibilidad este mineral, entre ellos la matriz del alimento
Tabla 20. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Calcio (10 y 30 mM) en los tres grupos de estudio.
Solución patrón (mM)
Mineral añadido
(mg/pocillo)
Mineral retenido
(µg/pocillo)
Retención (%)
Mineral transportado(µg/pocillo)
Transporte (%)
Mineral captado
(µg/pocillo)
Captación (%)
Control 10 0,4 7,25±1,53b 1,81±0,38b 16,16±0,56a 4,04±0,14a 23,41±2,07ab 5,85±0,52ab
30 1,2 17,99±4,14 1,50±0,34 22,36±4,47a 1,86±0,37a 40,35±7,89 3,36±0,66
Nucleotidos 10 0,4 21,31±4,79a 5,33±1,20a 8,72±1,33b 2,18±0,32b 30,04±5,48a 7,51±1,37a
30 1,2 23,29±1,83 1,94±0,16 17,25±1,83b 1,43±0,15a 40,54±3,40 3,37±0,28
α‐
lactoalbúmina
10 0,4 7,69±0,70b 1,92±0,17b 9,52±3,24b 2,38±0,81b 17,21±3,18b 4,31±0,80b
30 1,2 19,33±3,92 1,61±0,33 10,54±1,53b 0,88±0,09b 29,87±5,00 2,49±0,59
a,b,c Diferentes letras en la misma columna para cada concentración mineral, indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
V. Resultados y Discusión
139
Tabla 21. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Hierro (50 y 150 µm) en los tres grupos de estudio
Solución
patrón (µM)
Mineral añadido
(µg/pocillo)
Mineral retenido
(µg/pocillo)
Retención (%)
Mineral transportado(µg/pocillo)
Transporte (%)
Mineral captado
(µg/pocillo)
Captación (%)
Control 50 2,8 0,19±0,03c 6,73±1,09c 0,43±0,12 15,27±4,26 0,62±0,13 22,01±4,82
150 8,4 0,56±0,03 6,69±0,39 1,71±0,37 20,33±4,36 2,27±0,38 27,03±4,49
Nucleótidos 50 2,8 0,37±0,01a 13,27±0,47a 0,40±0,05 14,16±1,87 0,77±0,06 27,43±2,17
150 8,4 0,55±0,11 6,54±1,26 1,79±0,36 21,37±4,24 2,34±0,26 27,91±3,13
α‐
lactoalbúmina
50 2,8 0,28±0,01b 10,05±0,02b 0,52±0,10 18,43±3,74 0,80±0,10 28,62±3,63
150 8,4 0,67±0,14 7,96±1,71 2,42±0,33 28,87±3,95 3,09±0,47 36,83±5,65
a,b,c Diferentes letras en la misma columna para cada concentración mineral, indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
V. Resultados y Discusión
140
V. Resultados y Discusión
141
1.6. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil
suplementada con ingredientes funcionales
La disponibilidad mineral se evaluó tras simular una digestión gastrointestinal y
añadiendo la fracción soluble acondicionada a la línea celular Caco‐2, sembrada en un
sistema bicameral. De esta forma se calculó el mineral retenido, transportado y
captado para estimar la eficiencia de transporte y captación.
1.6.1. Calcio
En la Tabla 22 se presentan los resultados obtenidos sobre la disponibilidad del
calcio de las tres muestras estudiadas (Leche materna: LM, Fórmula control: FC,
Fórmula suplementada: FS)
En dicha Tabla, se puede observar que la cantidad de calcio de la leche materna fue
significativamente inferior (p<0,05) a la de las fórmulas de inicio. Aunque, los valores
de la concentración de calcio en la leche materna, obtenidos en el presente trabajo
(28,00 ± 3,00 mg/100ml) fueron similares a los obtenidos en los estudios realizado por
Roig et al., (1999) (29,0 ± 1,4 mg/100ml)) y Bosscher (2001a) (27,0 ± 0,6 mg/100ml)).
Sin embargo, la solubilidad de calcio obtenida en este estudio (25,28 ± 0,99) resultó ser
más baja que la publicada en un trabajo llevado a cabo por Roig et al., (1999) (69,4 ±
2,0%). Esta diferencia es probablemente debida a la metodología utilizada, ya
que la incubación de la fase gástrica en nuestro estudio fue a pH 4 (para niños
menores de seis meses) y esos autores utilizaron la pH 2 (para adulto), provocando
este pH más ácido un aumento en la solubilidad mineral (Bosscher et al., 2001b).
Como consecuencia de la menor cantidad de calcio de la leche materna respecto de
las fórmulas, también se obtuvo una baja cantidad de calcio en su fracción soluble
(p<0,05). Sin embargo cuando calculamos el porcentaje de solubilidad resultó ser
similar en las tres muestras (LM: 25.28%, FC: 27.15%, FS: 23.41%). Los valores
obtenidos para el porcentaje de solubilidad fueron menores que los observados por
otros autores (Roig et al., 1999; Perales et al., 2005). Este hecho pudo deberse al
V. Resultados y Discusión
142
método empleado, ya que en nuestro caso la metodología de digestión in vitro incluye
algunas modificaciones adaptadas a las condiciones intestinales de niños menores de 6
meses. En este sentido Bosscher et al., (2001b) realizaron un estudio en condiciones
similares a las nuestras y concluyeron que la disponibilidad mineral varía con el pH
utilizado en la digestión gástrica e intestinal y con el tiempo de incubación. Además,
Perales et al., (2007) remarcaron la dificultad de comparar sus resultados con otros
debido a diferencias en la metodología, cantidad de enzimas, valores de pH y tiempos
de incubación en la digestión gástrica e intestinal e incluso variaciones en la velocidad
de centrifugación en el caso de la solubilidad.
Partiendo de los datos anteriores la cantidad de calcio añadida a la monocapa de
células, a partir de la leche materna fue inferior que en el caso de la fórmulas
infantiles. La cantidad de calcio retenido a nivel de la monocapa mostró diferencias
estadísticamente significativas entre la leche materna y las fórmulas infantiles,
presentando la leche materna los valores más altos (LM: 4,94±1,13, FC: 1,80±0,80 y FS:
2,69±0,61 µg). Estos resultados también se reflejaron en los porcentajes de retención,
presentando la leche materna unos valores nueve veces superiores a los mostrados
por las fórmulas infantiles. Por otro lado, comparando las dos fórmulas infantiles,
pudimos observar que, aunque sin diferencias estadísticamente significativas, la
fórmula infantil suplementada (FS) presentó unos valores mayores en la retención
celular del mineral.
La cantidad de calcio transportado fue similar en las tres muestras, pero cuando
calculamos el porcentaje de calcio transportado, observamos diferencias
estadísticamente significativas entre los tres grupos, mostrando la leche materna los
valores más altos (20,36%), seguidamente la fórmula suplementada (11,47%) y por
último la fórmula control (7,08%). Los valores de calcio retenido y el porcentaje de
transporte de calcio para las fórmulas fueron superiores a los encontrados por Perales
et al., (2005). Sin embargo la cantidad de mineral transportado y la eficiencia de
transporte para la fórmula control (FC) resultaron ser similares.
V. Resultados y Discusión
143
Los valores del porcentaje de captación celular de calcio fueron
significativamente (p<0,05) más altos en la leche materna (32,79%) respecto a las
fórmulas infantiles. Además, encontramos diferencias estadísticas entre las dos
fórmulas, siendo inferiores en la fórmula control (FC: 8,97%, FS: 15,33%). Los valores
de captación de este estudio fueron superiores a los obtenidos por en un estudio
similar llevado a cabo por Perales et al., 2005 en fórmulas infantiles utilizando la línea
celular Caco‐2.
En otro estudio llevado a cabo por los mismos autores, se observó que en leche
enriquecida con calcio, se obtienen porcentajes de captación celulares similares a los
encontrados en nuestro estudio para la fórmula control (Perales et al., 2006b).
Nuestros resultados relacionados con el porcentaje de transporte de calcio en
la leche materna siguen la misma tendencia que los observados por Roig et al., en
1999 en estudios de dializabilidad. No obstante es necesario tener en cuenta que
aunque ambas metodologías son una medida de disponibilidad mineral, los resultados
no son directamente comparables.
En último lugar se calcularon la eficiencia del transporte y de la captación
celular de calcio teniendo en cuenta la solubilidad. En este sentido, pudimos observar
una mayor eficiencia de transporte de calcio en la leche materna respecto a ambas
fórmulas de inicio. Sin embargo las dos fórmulas no mostraron diferencias
significativas entre ellas.
Según estos resultados, en relación a la disponibilidad del calcio se debe
destacar la superioridad de la leche materna respecto a las fórmulas infantiles aunque
los valores obtenidos en los parámetros de disponibilidad de la fórmula suplementada
fueron superiores y por lo tanto más parecidos a los de la leche materna.
Tabla 22. Retención, transporte y captación celular de calcio en los tres grupos de estudio.
a,b,c Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
Leche Materna (LM) Fórmula Control (FC) Fórmula Suplementada (FS)
Concentración calcio: (mg/ ml)
0,28±0,03 0,50± 0,06 0,44± 0,01
Fracción soluble (mg/ ml) 0,07±0,004 0,14±0,003 0,10±0,004
Solubilidad % 25,28 ±0,99 27,15 ± 1,5 23,41 ± 2,2
Mineral añadido (mg) 0,04 0,09 0,07
Mineral retenido (µg) 4,94±1,13a 1,80±0,82b 2,69±0,61b
Retención % 12,44±2,84a 1,89±0,86b 3,86±0,88b
Mineral transportado (µg) 8,09±1,16 6,75±1,75 7,99±0,91
Transporte % 20,36±2,92a 7,08±1,84c 11,47±1,31b
Mineral captado(µg) 13,03±1,33a 8,55±1,45c 10,68±1,22b
Captación % 32,79±3,35a 8,97±1,52c 15,33±1,74b
Eficiencia de transporte % (ET) 5,15±0,74a 1,92±0,50b 2,68±0,30b
Eficiencia de captación % (EC) 8,29±0,85a 2,44±0,41c 3,59±0,41b
V. Resultados y Discusión
144
V. Resultados y Discusión
145
1.6.2. Hierro
En la Tabla 23 se presentan los resultados obtenidos para la retención, transporte y
captación de hierro mediante el empleo de la línea celular Caco‐2, se muestra
igualmente la estimación de la disponibilidad a través de los valores de las eficiencias
de transporte y captación.
La leche materna mostró un contenido en hierro muy bajo (0,42 µg/ml) respecto a
las fórmulas infantiles (6,76‐7,32 µg/ml), en este sentido son muchos los estudios que
describen que la leche humana es deficiente en hierro. La concentración de hierro de
la leche materna de nuestro estudio (lactancia 2‐4 meses), se encontraron dentro del
rango publicado por Picciano (2001) para leche materna madura (0,3‐0,9 mg/L) y
además fue similar a la obtenida por Rodríguez‐Rodríguez, Sanz‐Alaejos y Díaz‐Romero
(1999). La solubilidad de este mineral no mostro diferencias estadísticamente
significativas entre los tres grupos estudiados (LM, FC y FS).
Los parámetros de disponibilidad mineral estudiados no pudieron ser evaluados en
el caso de la leche humana debido a su bajo contenido en hierro. Ya que la cantidad
final de hierro añadida a la cámara apical fue tan baja (0,23 µg) que los resultados
obtenidos a partir las células expuestas eran parecidos a los obtenidos en las
monocapas utilizadas como blanco (no expuestas).
De esta forma, sólo pudimos comparar las dos fórmulas infantiles estudiadas (FC y
FS), cuyo contenido en hierro y la solubilidad de dicho mineral fue similar en ambos
casos. No se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en la retención, transporte
y captación del mineral, ni en la eficiencia de transporte y captación entre las dos
fórmulas infantiles estudiadas. Los resultados obtenidos en este estudio fueron en
todos los casos superiores a los obtenidos por Perales et al., (2007) en fórmulas
infantiles con la misma fuente hierro (sulfato de hierro). La metodología semejante en
ambos estudios, a excepción de los valores de pH gástrico (4 vs. 2).
Tabla 23. Retención, transporte y captación celular de hierro en los tres grupos de estudio.
nd: no detectado. a, b, c Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
Leche Materna (LM) Fórmula Control (FC) Fórmula Suplementada (FS)
Concentración hierro: (µg/ ml)
0,42 ± 0,03 7,32 ± 0,09 6,76 ± 0,18
Fracción soluble (µg/ ml) 0,41 ± 0,02 7,32 ± 0,55 6,90 ± 0,98 Solubilidad % 99,11 ± 4,70 99,93 ± 5,60 102,10 ± 5,40
Mineral añadido (µg) 0,23 5,15 4,7
Mineral retenido (µg) nd 0,47 ± 0,12 0,40 ± 0,08
Retención % nd 9,10 ± 2,30 8,54 ± 1,60
Mineral transportado (µg) nd 0,39 ± 0,11 0,37 ± 0,09
Transporte % nd 7,57 ± 2,16 7,79 ± 1,97
Mineral captado (µg) nd 0,86 ± 0,17 0,74 ± 0,08 Captación % nd 16,67 ± 3,35 15,62 ± 1,64
Eficiencia de transporte (ET)% nd 7,57 ± 2,16 7,94 ± 2,02
Eficiencia de captación (EC)% nd 16,65 ± 3,35 15,95 ± 1,66
V. Resultados y Discusión
146
V. Resultados y Discusión
147
1.6.3. Cinc
Los resultados de disponibilidad in vitro de cinc se resumen en la Tabla 24. En ella
podemos observar el bajo contenido de este mineral obtenido en la leche materna
(LM) respecto a las fórmulas infantiles (FC y FS). La concentración de cinc en la leche
materna de este estudio (1.51 µg/ml) resultó ser inferior a la encontrada por
Rodríguez, Sanz‐Alaejos y Díaz‐Romero (1999) y superior a la publicada por Bosscher et
al., (2001)
En este sentido, debemos destacar que aunque en la declaración nutricional del
fabricante sobre el contenido de cinc en las dos fórmulas era el mismo (FC y FS: 5,67
µg/ml), el análisis en nuestro laboratorio mostró valores inferiores de cinc en la
fórmula suplementada que en la fórmula control (FC: 6,04±0,07 vs FS: 3,86±0,09
µg/ml).
El porcentaje de solubilidad de cinc de la leche materna fue significativamente
superior (p<0.05) que el de las fórmulas infantiles. Aunque estos valores nos indican
accesibilidad del mineral y no disponibilidad y además, no siempre un aumento de
solubilidad va acompañado de un aumento de su disponibilidad. Si fue así en nuestro
estudio ya que observamos un aumento significativo de todos los parámetros de
disponibilidad mineral en la leche materna respecto a los otros dos grupos de estudio
(FC y FS).
Los resultados obtenidos en los porcentajes y eficiencias de transporte y captación
de cinc para la fórmula control se correspondieron con los obtenidos por Perales et al.,
(2006) en fórmulas infantiles de inicio. Sin embargo, la fórmula suplementada presentó
un aumento significativo en los porcentajes de retención (LM: 14,06±3,12 FC:
2,84±0,52, y FS: 9,81±1,67%) y de captación de cinc (LM: 35,16±2,76 FC: 13,59±2,47, y
FS: 20,73±1,14%) y además en los valores de la eficiencia de captación (LM: 35,16±2,76
FC: 13,59±2,47, y FS: 20,73±1,14), acercándose la disponibilidad de cinc de esta
fórmula infantil a la de la leche materna.
Tabla 24. Retención, transporte y captación de cinc en los tres grupos de estudio.
Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
Leche Materna (LM) Fórmula Control (FC) Fórmula Suplementada (FS)
Concentración de cinc (µg/ ml)
1,51±0,63 6,04±0,07 3,86±0,09
Fracción soluble (µg/ ml) 1,10±0,01 3,82±0,24 2,31±0,25
Solubilidad % 72,59±3,42a 63,19±3,29b 60,02±2,89b
Mineral añadido (µg) 0,64 2,68 1,58
Mineral retenido (µg) 0,09±0,02b 0,08±0,01b 0,15±0,02a
Retención % 14,06±3,12a 2,84±0,52c 9,81±1,67b
Mineral transportado (µg) 0,13±0,02b 0,28±0,07a 0,18±0,02b
Transporte % 21,09±3,87a 10,75±2,41b 11,31±1,54b
Mineral captado (µg) 0,22±0,02 a 0,36±0,07 b 0,33±0,02 b
Captación % 35,16±2,76a 13,59±2,47c 20,73±1,14b
Eficiencia de transporte % (ET) 15,31±2,81a 6,80±1,55b 6,79±0,93b
Eficiencia de captación % (EC) 25,52±2,00a 8,60±1,56c 12,44±0,69b
V. Resultados y Discusión
148
V. Resultados y Discusión
149
Para evaluar la interacción que pude existir entre los diferentes minerales
estudiados, se llevó a cabo un análisis de correlación de Pearson a partir del cuál
se obtuvieron algunas diferencias estadísticas que es importante mencionar. En
primer lugar, se observó una correlación negativa entre la cantidad de calcio
añadida y todos los parámetros de disponibilidad evaluados para este mineral
(ET; r=‐0,909, p= 0,000; EC r=‐0,933, p=0,000). Este hecho era previsible ya que,
como se ha mencionado anteriormente los mecanismos de transporte del calcio
a nivel intestinal, son saturables. También debemos señalar una relación
negativa de la cantidad de calcio añadida sobre los porcentajes de retención (r=‐
0,920, p=0,000), transporte (r=‐0,793, p=0,000) y captación (r=‐0,950, p=0,000)
celulares de cinc, y sobre las eficiencias de transporte y captación del mismo (r=‐
0,803, p=0,000 y r=‐0,950, p=0,000 respectivamente). Este hecho ha sido descrito
también por Perales et al., (2006) y Frontela et al., (2009a) en ensayos con
metodología y muestras similares, en el que encontraron que el calcio ejerce un
efecto negativo sobre la disponibilidad del cinc. Por otro lado, todos los
parámetros de disponibilidad de calcio, considerando también su porcentaje de
solubilidad, estuvieron negativamente correlacionados con la solubilidad de
hierr, así como con los parámetros celulares de disponibilidad calculados, esta
tendencia también fue observada por et al., (2009a) en un estudio de
disponibilidad mineral de papillas infantiles utilizando la línea Caco‐2.
Tanto la cantidad de hierro añadida a las células Caco‐2, como su
solubilidad resultaron ejercer un efecto negativo sobre todos parámetros de
disponibilidad del cinc (ET: r=‐0,914, p=0,000 y EC: r=‐0,973, p=0,000), lo cual
demuestra la interacción existente entre los diferentes minerales debido,
probablemente, a que comparten rutas y factores de absorción y transporte a
nivel intestinal (Lind et al., 2003)
Por otro lado, observamos una relación negativa entre la cantidad de cinc
añadida a la monocapa y todos los parámetros de medida de su disponibilidad
estudiados.Este hecho no se puede atribuir a una saturación en los
V. Resultados y Discusión
150
transportadores del mineral ya que la mayor disponibilidad de este mineral la
presentó la leche materna que a su vez mostró el contenido más bajo en cinc.
1.7. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos
concentraciones de nucleótidos.
En la Figura 26 se presentan las imágenes obtenidas en el examen de la
monocapa celular con el microscopio electrónico de barrido tras exponer a
dichas células a diferentes concentraciones de un preparado de nucleótidos. La
Figura 26 a) corresponde al grupo control (C), el cual no fue expuesto a estos
compuestos, la 26 b) al grupo expuesto a 32 mg/L (Nuc32) y por último la 26 c) al
grupo expuesto a 72 mg/l (Nuc 72).
Figura 26. Imágenes de las células al microscopio electrónico de barrido a) sin exposición a nucleótidos, b) exposición 32 mg/L y c) 72 mg/L.
c)
b)
a)
V. Resultados y Discusión
151
Como se puede observar en dicha Figura los grupos a los que se les expuso
al preparado de nucleótidos presentaron mayor densidad de microvellosidades
respecto al grupo control. Estos resultados eran de esperar ya que son varios los
autores que afirman una mayor maduración de las células intestinales debida a la
suplementación con nucleótidos. En este sentido LeLeiko et al., (1995)
demostraron que la dieta suplementada con nucleótidos afectaba a la expresión
génica de la enzimas gastrointestinales.
Por otro lado, estudios realizados en animales observaron que una dieta
exenta de nucleótidos producía menor cantidad de proteína, DNA, RNA, y menor
actividad de disacaridasas en el intestino. Sin embargo, los animales que fueron
alimentados con una dieta suplementada con nucleótidos presentaron mayor
contenido proteico y de ácidos nucleicos en el intestino, así como mayor altura
de vellosidades y mayor actividad maltasa (Uauy et al., 1990; López‐Navarro et
al., 1996)
V. Resultados y Discusión
152
2. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de una fórmula infantil
suplementada y de sus ingredientes.
2.1. Ensayo 1: Estudio preliminar. Crecimiento de diferentes especies
bacterianas intestinales expuestas a los ingredientes en el estudio.
El objetivo principal de este ensayo fue realizar un estudio preliminar del
efecto que ejercen los ingredientes en el estudio sobre diferentes bacterias
intestinales. Se realizaron las curvas de crecimiento de las siguientes especies
bacterianas, Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium longum y Escherichia coli. Se
evaluaron dos concentrados proteicos de suero lácteo: uno rico en α‐
lactoalbúmina (SLα) y otro rico en β‐lactoglobulina y glicomacropéptidos (SLβ);
así como dos concentraciones de un preparado de nucleótidos (32 y 72 mg/L)
para añadirlo a fórmulas infantiles. Estos ingredientes también se evaluaron
después de haberlos sometido a una digestión gastrointestinal in vitro.
Todas las curvas de crecimiento se realizaron a partir de los recuentos
realizados en placa en cada punto de muestreo (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 24
horas) mediante el modelo matemático de Gomperzt con el programa DMfit,
por lo que las representaciones gráficas se refieren a los datos ajustados. A
partir del ajuste de estas curvas pudimos obtener tres parámetros que definen
el crecimiento bacteriano: i) La fase de adaptación (λ) que, como su propio
nombre indica, es el tiempo que tarda la bacteria en adaptarse al medio en el
que va a crecer. ii) La tasa de crecimiento especifico (µ), que es la velocidad con
la que se divide, y por último, iii) la concentración máxima (MR) que alcanza
dicha bacteria en las condiciones del estudio.
V. Resultados y Discusión
153
a) Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a los
concentrados proteicos
En la Figura 27 se presentan los resultados ajustados en el crecimiento de
Lactobacillus gasseri, expuesto a los diferentes concentrados proteicos (SLα y
SLβ) antes y después de la digestión, así como los parámetros cinéticos
obtenidos a partir de las curvas crecimiento.
Figura 27. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).
En esta Figura se puede apreciar que a partir de las 6 horas de crecimiento,
los grupos expuestos a los concentrados proteicos mostraron los valores más
altos y los mantuvieron durante toda la fase estacionaria. Concretamente, los
grupos SLα dig, SLβ y SLβ dig alcanzaron concentraciones del microorganismo
superiores a los otros dos grupos (Control y SLα). Respecto a los valores
obtenidos para los parámetros cinéticos, no se encontraron diferencias
Lactobacillus gasseri
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25
Log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
Control SLα SLα dig SLβ SLβ digλ 3,07±0,46 2,77±0,14 2,84±0,13 3,16±0,44 2,56±0,32µ 0,50±0,09 0,59±0,03 0,48±0,01 0,60±0,12 0,52±0,01MR 9,16±0,02b 9,27±0,10b 9,5 ±0,04a 9,59±0,02a 9,55±0,02a
R2 0,988 0,997 0,998 0,990 0,992
Control SL α SL α dig SL β SL β dig
V. Resultados y Discusión
154
significativas en la fase de adaptación y tampoco en la tasa de crecimiento. Aún
así, pudimos apreciar menor tiempo de adaptación y mayor tasa de crecimiento
cuando expusimos al microorganismo a los dos concentrados proteicos sin
digerir (SLα y SLβ). Las tasas de crecimiento encontradas para este
microorganismo son similares a las descritas por Cardelle‐Cobas et al., (2011) y
Corzo‐Martínez et al., (2012) para Lactobacillus reuteri cultivado en MRS con
lactosa en el primer caso y con glucosa en el segundo caso.
Por otro lado, se observaron diferencias estadísticas entre los grupos
estudiados para los máximos recuentos encontrados. La concentración
bacteriana fue significativamente superior en los grupos SLα digerido, SLβ y SLβ
digerido respecto del grupo control y del SLα sin digerir
En la Figura 28 se representan las densidades ópticas para cada punto de
muestreo en los grupos de estudio. Cabe destacar la alta densidad óptica que
alcanzaron los grupos a los que se les añadió los concentrados proteicos
digeridos o sin digerir, respecto al grupo control. No obstante, este resultado no
se reflejó, en la misma medida, en el recuento de viables. En este sentido es
necesario tener en cuenta que la absorbancia es una medida de turbidez y no
sólo varía con el crecimiento microbiano en sí, sino también con los productos
del metabolismo bacteriano. Este hecho conduce a pensar que los concentrados
proteicos provocan que L. gasseri produzca alguna sustancia que es la
responsable de tan alta turbidez. Una hipótesis que nos planteamos es que esa
sustancia puede ser un exopolisácarido. De ser así, lo consideraríamos un buen
resultado puesto hay estudios recientes que muestran su influencia en la
capacidad de adhesión de bacterias probióticas y patógenas (Ruas‐Madiedo et
al., 2006) y también se ha demostrado, la actividad prebiótica de determinados
exopolisacaridos producidos por diferentes microorganismos (Salazar et al.,
2008). Otra hipótesis podría ser que el crecimiento de este lactobacilo, provoque
un descenso en el pH del medio provocando que las proteínas precipiten.
Debido a estos resultados, estimamos que no debíamos caracterizar el
V. Resultados y Discusión
155
crecimiento de esta bacteria con el parámetro de absorbancia por lo que no se
realizó tampoco un análisis estadístico de estos resultados.
Figura 28: Representación del incremento de densidad óptica para el crecimiento L. gasseri en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.
Brück, Graverholt y Gibson (2003b) realizaron un estudio in vitro,
evaluando la evolución de la microbiota de un inóculo fecal expuesto a leche
materna, o a fórmula infantil suplementada, con α‐lactoalbúmina o
glicomacropéptidos, observando que dichas proteínas, sometidas a digestión in
vitro, producían un incremento en el crecimiento de lactobacilos.
Corzo‐Martínez et al., (2012) evaluaron el crecimiento de diferentes
bacterias lácticas expuestas a conjugados de proteínas e hidratos de carbono
previamente sometidos a digestión. Estos autores no observaron crecimiento en
ninguno de los microorganismos estudiados cuando la única fuente de carbono
fue la β‐lactoglobulina. Del mismo modo, observaron que los digeridos de
glicoconjugados con galactosa fueron fermentados de modo significativo por
Bifidobacterium y Lactobacillus.
El pH fue medido en cada punto de muestreo y en la Figura 29 se
representan las unidades de pH que descienden de un punto a otro de muestreo
(variación de pH como descenso). Todos los puntos de muestreo, excepto a las 4
2
4
6
8
10
12
14
24
Tiem
po (h
oras)
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
V. Resultados y Discusión
156
horas, mostraron diferencias estadísticamente significativas repitiéndose la
misma tendencia. A partir de las 6 horas, el descenso de pH fue mayor en todos
casos para el cultivo con los concentrados proteicos sin digerir, encontrándose la
máxima diferencia a las 10 horas en el cultivo al que se le añadió suero lácteo
rico en β–lactoglobulina (2,10 ± 0,03) y suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina
(1,99 ± 0,03) respecto de los demás grupos (1,80‐1,90 ± 0,01‐0,02).
Figura 29. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a diferentes sueros proteicos. * Indica diferencias signficativas (p<0,05) entre los diferentes grupos de estudio.
Este descenso de pH nos indica una actividad metabólica bacteriana
mayor y, posiblemente, un aumento en la producción de ácidos grasos de
cadena corta y ácido láctico.
En la Figura 30 se presentan las curvas de crecimiento y los parámetros
cinéticos calculados a partir del ajuste de los datos de recuentos de viables para
Bifidobacterium longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos (SLα
y SLβ), digeridos y sin digerir. Respecto a los parámetros cinéticos, el tiempo de
adaptación al medio de cultivo fue inferior en aquellos medios a los que se les
añadió el ingrediente digerido, aunque no se obtuvieron diferencias
significativas (p<0,05). Bifidobacterium longum presentó tasas de crecimiento
superiores cuando el medio de cultivo se suplementó con los concentrados
proteicos digeridos o sin digerir, aunque tampoco esta vez se obtuvieron
0
0,5
1
1,5
2
2,5
2 4 6 8 10 12 14 24
Variación de pH
Tiempo (horas)
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
*
**
*
* *
V. Resultados y Discusión
157
diferencias significativas. Sin embargo, el suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina
(SLα) digerido mostró recuentos máximos significativamente (p<0,05) superiores
a los presentados por el grupo control o los grupos suplementados con suero
rico en β‐lactoglobulina (SLβ) digerido o sin digerir.
Figura 30. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).
En la Figura 31 se representan los incrementos de la densidad óptica en
cada punto de muestreo para el crecimiento de B. longum. En ella se puede
observar que este parámetro aumenta con el crecimiento de la bacteria, sin
embargo el incremento es mayor en los grupos suplementados con ambos
concentrados proteicos sometidos a digestión o no, hecho que se aprecia
especialmente a las 24 horas. Al igual que en el crecimiento de L. gasseri se
obtuvieron unos valores de densidad óptica muy altos y aunque se
correspondieron con pequeños aumentos en los recuentos de viables,
planteamos las mismas hipótesis que para el lactobacilo estudiado. La bacteria
Bifidobacterium longum
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25
Log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
Control SLα SLα dig SLβ SLβdigλ 2,45±0,11 2,45±0,60 2,18±0,22 2,59±0,25 1,81±1,07µ 0,39±0,01 0,50±0,06 0,41±0,02 0,52±0,03 0,44±0,02MR 9,29±0,08b 9,42±0,03ab 9,47±0,01a 9,28±0,04b 9,11±0,01c
R2 0,958 0,989 0,982 0,983 0,984
Control SL α SL α dig SL β SL β dig
V. Resultados y Discusión
158
puede estar produciendo alguna sustancia, un exopolisacárido por ejemplo, que
aumente la densidad óptica o el crecimiento microbiano produce un descenso
en el pH que a su vez hace que las proteínas precipiten.
Figura 31. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimiento de B. longum en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.
Son varios los estudios que evalúan el efecto de los concentrados
proteicos sobre la microbiota intestinal, sin embargo, ninguno de ellos observó
modificaciones en los recuentos de bifidobacterias. Este hecho se reflejó, en un
estudio in vitro realizado con inóculos fecales, llevado a cabo por Brück
Graverholt y Gibson (2002) y en el que evaluaron una fórmula infantil
suplementada con lactoalbúmina y otra con glicomacropeptidos. Este grupo de
investigación realizó in vivo otros dos estudios, uno en monos Rhesus (Brück et
al., 2003a) y otro en lactantes humanos (Brück et al., 2006a) y tampoco
pudieron observar modificaciones en la concentración de bifidobacterias
En relación a los resultados de la variación del descenso del pH mostrada
durante el crecimiento de este microorganismo (Figura 32), es importante
destacar que la mayor variación se atribuye al suero lácteo rico en β‐
lactoglobulina (SLβ) mientras que no se corresponde con los mayores recuentos
como sería previsible, ya que el descenso de pH se debe a la actividad
2
4
6
8
10
12
14
24
Tiem
po (h
oras)
control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
V. Resultados y Discusión
159
metabólica del microorganismo, concretamente a la producción de ácidos
grasos de cadena corta. Se puede resumir, de una forma general, que el grupo
control y suplementado con suero lácteo, rico en α‐lactoalbúmina, digerido o sin
digerir, obtuvieron valores similares entre sí, e inferiores a los presentados por
el grupo suplementado con el suero lácteo β. Los dos muestreos con las
diferencias más marcadas fueron las 8 y 10 horas, el grupo control obtuvo los
siguientes valores: 1,33 ± 0,03 y 1,70 ± 0,02 respectivamente y el grupo SLβ 1,42
± 0,01 y 1,78±0,01 unidades de pH respectivamente.
Figura 32. Variación de pH en el cultivo de B. longum expuesto a los concentrados proteicos digeridos y sin digerir. * Indican diferencias estadísticas (p<0,05) en los resultados observados para cada muestreo
En la Figura 33 se pueden observar las diferentes curvas de crecimiento y los
parámetros cinéticos obtenidos para Escherichia coli expuesta a los dos
concentrados proteicos digeridos y sin digerir. Si se comparan las curvas de
crecimiento de E. coli con las obtenidas para L. gasseri y B. longum se aprecia
que estas dos últimas son de crecimiento más lento. De modo general, se
observa una menor fase de adaptación y que la fase estacionaria comienza antes
(a las 6‐8 horas). Se observa también como el grupo control y suero lácteo rico
0
0,5
1
1,5
2
2 4 6 8 10 12 14 24
Variación de
pH
Tiempo (horas)
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
*
** *
*
V. Resultados y Discusión
160
en α‐lactoalbúmina evolucionan a la vez y sus recuentos son superiores a los
otros tres grupos desde las 4‐6 horas de crecimiento.
Figura 33. Curvas de crecimiento de E. coli expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).
Respecto a los parámetros cinéticos se debe destacar que los tres
resultaron ser diferentes significativamente entre los grupos de estudio. En
relación al tiempo de adaptación del microorganismo al medio de cultivo con o
sin ingrediente añadido, los dos concentrados proteicos digeridos mostraron los
valores menores aunque sólo presentó diferencias significativas el grupo SLβ
respecto del grupo SLβ digerido. E. coli tardó menos tiempo en adaptarse al
medio de cultivo con los péptidos resultantes de la digestión del suero rico en β‐
lactoglobulina. La tasa de crecimiento también fue menor en los grupos
expuestos a los sueros digeridos respecto de los grupos expuestos a
concentrados proteicos sin digerir. Además, los valores de recuentos máximos
resultaron menores significativamente (p<0,05) en el caso de los grupos
Escherichia coli
Tiempo(horas)
0 5 10 15 20 25
Log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
λ 1,49±0,12ab 1,51±0,07ab 1,10±0,24ab 1,56±0,14a 0,88±0,17b
µ 0,49±0,03abc 0,58±0,05a 0,44±0,01bc 0,52±0,02ab 0,37±0,02c
MR 8,88±0,01a 8,94±0,02a 8,73±0,04bc 8,74±0,01b 8,65±0,01c
R2 0,961 0,981 0,987 0,991 0,972
Control SL α SL α dig SL β SL β dig
V. Resultados y Discusión
161
expuestos a los sueros lácteos digeridos y al suero lácteo rico en β‐lactoglobulina
(SLβ). Estos resultados confirman los obtenidos al realizar el análisis estadístico
de los recuentos obtenidos en cada muestreo y conducen a afirmar que los
péptidos resultantes de la digestión de ambos sueros poseen actividad
antimicrobiana frente a E.coli.
Según estos resultados podemos afirmar que los dos concentrados
proteicos digeridos (SLα dig y SLβ dig) tienen un ligero efecto inhibitorio del
crecimiento de E. coli. Es previsible que se produzca un efecto más claro si el
inóculo inicial hubiera sido más bajo, ya que partimos de aproximadamente 7
unidades logarítmicas.
En un ensayo in vitro llevado a cabo por Pihlanto‐Lappälä et al., (1999)
observaron que la hidrólisis de α‐lactoalbúmina producía péptidos con
propiedades bacteriostáticas. En este sentido, Brück, Graverholt y Gibson
(2003b) realizaron un ensayo in vitro, en el que expusieron un inóculo fecal a
leche materna, y fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina o
glicomacropéptidos y obtuvieron que dichas proteínas, sometidas a digestión
gastrointestinal in vitro, poseían efecto bactericida o bacteriostático contra E.
coli enteropatógena y contra Salmonella typhimurium. Estos autores ya habían
visto con anterioridad cierto efecto antimicrobiano contra E.coli intestinal
(Brück, Graverholt y Gibson, 2002). Sin embargo, al evaluar dicho efecto sobre
una cepa patógena de E. coli pudieron observar una actividad antimicrobiana
más evidente. En nuestro estudio, el efecto de dos concentrados proteicos, se
evaluó sobre una cepa de E. coli no patógena aislada de heces humanas y
pudimos observar sólo un ligero efecto antimicrobiano aunque estadísticamente
significativo.
En la Figura 34 se muestran los incrementos de densidad óptica durante
el crecimiento de la bacteria. En ella se puede observar como desde el primer
punto de muestreo, el grupo control y el suplementado con suero rico en α‐
lactoalbúmina (SLα) presentaron valores similares de absorbancia mientras que
V. Resultados y Discusión
162
los valores de los grupos SLα dig, SLβ, y SLβ dig fueron menores. Este hecho se
corresponde con los resultados obtenidos para el recuento de viables. En las dos
especies de bacterias lácticas estudiadas no se realizó el análisis estadístico de
los resultados de densidad óptica por los motivos explicados anteriormente, y
por esa razón tampoco se realizó para esta bacteria.
Figura 34. Representación del incremento de densidad óptica en el crecimiento de E. coli en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.
Los resultados obtenidos en el descenso de pH se presentan en la Figura
35, en ella se observa como en todos los puntos de muestreo, excepto a las 2
horas, aparecen diferencias estadísticas entre los grupos de estudio, es decir
dependiendo del ingrediente al que era expuesto el microorganismo. El grupo
control y al que se le añadió suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina,
proporcionaron los valores más altos en la variación de pH (valores menores de
pH) seguido por el grupo SLβ digerido.
La medida de este pH en el crecimiento de bacterias lácticas, nos indica la
actividad de su metabolismo fermentativo y que una mayor acidez puede inhibir
el crecimiento de determinados microorganismos como los potencialmente
patógenos. Sin embargo, en este caso que el descenso de pH es menor, lo único
que nos indica es crecimiento.
2
4
6
8
10
12
14
24
Tiem
po (h
oras)
Control SLα SLα dig SLβ SLα dig
V. Resultados y Discusión
163
Figura 35. Variación de pH en el cultivo de Escherichi coli sometido a dos concentrados proteicos digeridos y sin digerir.
b) Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a dos
concentraciones diferentes de un preparado de nucleótidos sometido o no a
una digestión gastrointestinal.
En la Figura 36 se puede observar las curvas de crecimiento de L. gasseri, a
partir de los datos ajustados, y también los parámetros cinéticos calculados a
partir de dichas curvas. En ella se observa que todos los grupos de estudio
presentaron una evolución similar en el crecimiento. Hecho que queda probado
al analizar los parámetros cinéticos (fase de adaptación, tasa de crecimiento y
recuentos máximos) en el ajuste de las curvas de crecimiento con el programa
DMFIT. La exposición de Lactobacillus gasseri a dos concentraciones de la
mezcla de nucleótidos digerida y sin digerir no mostró cambios en ninguno de
los parámetros analizados.
0
0,5
1
1,5
2
2 4 6 8 10 12 14 24
Variación de
pH
Tiempo (horas)
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
* * * *
V. Resultados y Discusión
164
Figura 36. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).
Sauer et al., 2010 evaluaron el crecimiento de diferentes especies de
Lactobacillus en un estudio in vitro, sin encontrar diferencias significativas en su
crecimiento debidas a la adición de nucleótidos. Sin embargo en un estudio in
vivo, en lechones, llevado a cabo por Mateo, Dave y Stein (2004) si observaron
un incremento significativo en el recuento de lactobacilos.
La densidad óptica, presentada en la Figura 37, tampoco mostró
diferencia alguna entre los grupos de estudio. El incremento de densidad óptica
fue similar para los cinco grupos de estudio en cada punto de muestreo. Se
observó un aumento en el tiempo que indica el crecimiento bacteriano
Lactobacillus gasseri
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25
Log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
Control Nuc32 Nuc32dig Nuc72 Nuc72digλ 3,10±0,07 3,00±0,14 2,85±0,25 2,68±0,53 2,87±0,15µ 0,654±0,09 0,63±0,06 0,60±0,06 0,56±0,10 0,62±0,07MR 9,09±0,01 9,15±0,05 9,08±0,01 9,11±0,01 9,07±0,05R2 0,991 0,986 0,993 0,989 0,986
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
V. Resultados y Discusión
165
Figura 37. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de L. gasseri expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos
En cuanto al descenso de pH cuyos resultados se muestran en la Figura
38, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos estudiados en
ninguno de los puntos de muestreo. No obstante, a las 8, 10, 12 y 24 h se pudo
observar que los grupos suplementados con nucleótidos mostraron los valores
más altos en el descenso de pH (p=0,077, 0,075, 0,074, y 0,089,
respectivamente)
Figura 38. Descenso de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a dos concentraciones del preparado de nucleótidos digeridos y sin digerir.
2
4
6
8
10
12
14
24
Tiem
po (h
oras)
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
0
0,5
1
1,5
2
2 4 6 8 10 12 14 24
Variación de
pH
Tiempo (horas)
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
V. Resultados y Discusión
166
En la Figura 39 se muestran las curvas de crecimiento obtenidas de los
datos ajustados y los parámetros cinéticos calculados a partir de dichas curvas.
El grupo control y los dos grupos a los que se les suplementó con 32 mg/L del
preparado de nucleótidos mostraron curvas similares. Sin embargo, los
recuentos de los grupos suplementados con 72 mg/L sometidos o no a digestión
fueron superiores desde el punto de muestreo de las 8‐10 horas hasta el final
del crecimiento.
Figura 39. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).
Respecto a los parámetros cinéticos calculados a partir de los datos
ajustados, los grupos suplementados con 32mg/L de nucleótidos digeridos y con
72 mg/L de nucleótidos sin digerir presentaron los mayores tiempos de
adaptación, aunque sus tasas de crecimiento fueron superiores a los otros
grupos, es importante destacar que ninguno de estos dos parámetros presentó
diferencias significativas. No ocurrió lo mismo con los recuentos máximos para
los que el grupo al que se le adicionó 72 mg /L mostró un incremento
Bifidobacterium longum
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25
log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
Control Nuc32 Nuc32 dig Nuc72 Nuc72 digλ 2,23±0,13 2,09±014 2,62±0,10 2,54±0,01 2,01±0,46µ 0,32±0,02 0,34±0,01 0,35±0,01 0,36±0,01 0,32±0,01MR 9,37±0,01b 9,37±0,01cb 9,34±0,01cb 9,47±0,01a 9,41±0,01b
R2 0,997 0,990 0,991 0,989 0,995
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
V. Resultados y Discusión
167
significativo (9,41‐9,47 ±0,01 Log ufc/ml) respecto de los demás grupos de
estudio (9,34‐9,37 ± 0,01 Log ufc/ml).
En la Figura 40 se presentan los resultados obtenidos para la variación de
densidad óptica en los puntos de muestreo realizados durante el crecimiento de
Bifidobacterium longum. En ella se puede observar que la densidad óptica
mostró valores similares en todos los grupos de estudio.
Figura 40. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de B. longum expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos
La variación de pH (Figura 41) fue similar en los grupos estudiados,
aunque a las 8 y 10 horas presentaron diferencias significativas, los valores de
los diferentes grupos eran prácticamente iguales. En este sentido podemos
afirmar que la actividad metabólica del microorganismo estudiado expuesto a
diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir es similar.
2
4
6
8
10
12
14
24
Tiem
po (h
oras)
control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
V. Resultados y Discusión
168
Figura 41. Variación de pH en el cultivo de B. longum sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.
La suplementación del medio de cultivo con 72 mg/L de nucleótidos
estimuló el crecimiento de Bifidobacterium longum. En este sentido, son varios
los estudios que obtuvieron resultados positivos relacionados con la
suplementación de fórmulas infantiles con estos compuestos, bien por un
aumento de Bifidobacterias (Gil et al., 1986), un descenso en la relación
Bacteroides/Bifidobacterias (Singhal et al., 2008) o una menor incidencia de
diarrea (Pickering et al., 1998, Merolla, 2000, Yau et al., 2003). No obstante, se
debe tener en cuenta que Balmer, Hanvey y Wharton (1994) observaron efectos
negativos sobre la microbiota intestinal tras la adición de nucleótidos a la
fórmula infantil mientras que Neri‐Almeida et al., (2009) no apreciaron una
menor incidencia de diarrea tras la suplementación de una fórmula infantil con
nucleótidos. Debido a estos resultados contradictorios es necesaria la realización
de investigaciones adicionales con el fin de dilucidar el verdadero efecto de la
suplementación de fórmulas infantiles con nucleótidos.
En la Figura 42 se presentan las curvas de crecimiento y los parámetros
cinéticos de Escherichia coli expuesta a diferentes concentraciones de
nucleótidos digeridos y sin digerir. En ella se puede observar cómo la evolución
de los 5 grupos de estudio es similar, excepto para el grupo expuesto a los
0
0,5
1
1,5
2
2 4 6 8 10 12 14 24
Variaciación
de pH
Tiempo (horas)
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
*
*
V. Resultados y Discusión
169
productos resultantes de la digestión de 72 mg/L de nucleótidos que parece
obtener mayores valores en los recuentos entre las 4 y 8 horas
Figura 42. Curvas de crecimiento de E. coli expuesta a los diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.
En los parámetros cinéticos calculados a partir de las curvas de crecimiento
aunque no mostraron diferencias estadísticas, se pudo observar como el periodo
de adaptación, la tasa de crecimiento y los recuentos máximos obtuvieron sus
valores mayores en los grupos expuestos a los nucleótidos digeridos o sin
digerir, especialmente el grupo al que se le suplementó el medio de cultivo con
72 mg/L de nucleótidos digeridos.
En relación a los resultados obtenidos, debemos señalar que en un estudio
llevado a cabo por Sauer et al., (2010) en el que evaluaron diferentes
concentraciones de nucleótidos individuales (AMP, CMP, GMP, y UMP) sobre
diferentes bacterias intestinales (patógenas y no patógenas), observaron que
estos compuestos eran capaces de modificar el crecimiento de las bacterias
estudiadas dependiendo de la cepa y de la concentración ensayada. De este
Escherichia coli
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25
Log
ufc/
ml
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
Control Nuc32 Nuc32dig Nuc72 Nuc72digλ 1,16±0,15 1,40±0,07 1,30±0,11 1,33±0,02 1,55±0,10µ 0,53±0,05 0,61±0,01 0,60±0,01 0,60±0,03 0,72±0,12MR 8,97±0,03 8,98±0,02 9,02±0,01 9,01±0,04 9,03±0,07R2 0,995 0,991 0,997 0,996 0,997
Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig
V. Resultados y Discusión
170
modo, pudieron observar como el crecimiento de una de las cepas patógenas de
E. coli disminuía frente al cultivo control (sin nucleótidos) mientras que otras
cepas (una patógena y otra no) incrementaban su crecimiento cuando se
exponían a determinadas concentraciones de nucleótidos.
Los resultados obtenidos durante el crecimiento de E. coli para la densidad
óptica (600 nm) se muestran en la Figura 43. No se observaron diferencias entre
los grupos suplementados con nucleótidos, sometidos o no a digestión y el
grupo control. La densidad óptica aumento con el crecimiento del
microorganismo hasta el muestreo de las 6 horas, a partir del que se mantuvo
constante.
Figura 43. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de E. coli expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.
Los valores de la variación de pH se muestran en la Figura 44 como se
aprecia, no encontramos diferencias significativas debidas a la concentración de
nucleótidos digeridos o sin digerir. Como se ha mencionado anteriormente la
medida de pH en este caso sólo nos indica actividad metabólica del
microorganismo y por lo tanto crecimiento. El descenso del pH fue mucho
menor que en el caso de las bacterias lácticas que producen ácidos grasos de
cadena corta y/o ácido láctico
V. Resultados y Discusión
171
Figura 44. Variación de pH en el cultivo de E. coli sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir
2.2. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal in vitro
Dentro del segundo ensayo, debemos diferenciar dos experiencias con
objetivos diferentes. Por un lado se estudió la evolución de la microbiota fecal
expuesta a los ingredientes objeto de estudio, digeridos y sin digerir y por otro
lado el comportamiento de diferentes grupos microbianos intestinales
expuestos a las fórmulas infantiles o leche materna sometidas o no a digestión.
A lo largo de este apartado los resultados numéricos que aparezcan en el
texto, se expresarán como medianas del Log nº cels/ml (referentes a la
composición de la microbiota intestinal) o como medianas de la concentración
(mM) en el caso de ácidos grasos de cadena corta, ya que los test estadísticos
aplicados fueron no paramétricos.
Los resultados de los límites de detección, los coeficientes de regresión (R2) de
las rectas de calibrado y las eficiencias de las PCR cuantitativas para cada grupo
microbiano analizado se presentan en la Tabla 25 observándose, una eficiencia
mayor del 90% en todos los grupos microbianos estudiados. En las muestras
analizadas que obtuvieron valores por debajo del límite de detección se les
asignó el límite de detección para realizar el análisis estadístico.
0
0,5
1
1,5
2
2 4 6 8 10 12 14 24
Variación
de pH
Tiempo(horas)
Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig
V. Resultados y Discusión
172
Tabla 25. Limites de detección, eficiencias y coeficientes de correlación de las PCR cuantitativas de cada grupo microbiano.
Limite detección
Eficiencia (%) R2 (cels /g)
Atopobium 8∙104 91,22±1,64 0,999
Bacteroides 1∙103 94,47±1,20 1
Clostridia XVa 3∙104 93,50±1,13 0,999
Clostridia IV 1∙104 95,15±2,68 0,999
Enterobacteriaceae 8∙104 96,93±3,15 0,994
Enterococcaceae 1∙105 95,50±1,64 0,999
Lactobacillus spp. 1∙104 94,12±1,48 0,998
Bifidobacterium spp. 1,5∙104 93,05±2,63 1
Bacterias Totales 2∙104 94,45±1,93 0,998
2.2.1. Evolución de la microbiota fecal expuesta a los ingredientes funcionales
digeridos y sin digerir.
Las bacterias en el lumen intestinal pueden clasificarse en tres grupos según
su grado de patogenicidad: bacterias beneficiosas (bifidobacterias y lactobacilos,
potencialmente patógenas (enterobacterias, enterococos, Escherichia coli,
Bacteroides spp y estreptococcos) y bacterias patógenas (Estafilococos,
Clostridios, Proteus spp y Klebsiella spp) que pueden ser peligrosas a bajas
concentraciones. Por otro lado las bacterias potencialmente patógenas son
bacterias que pertenecen a la microbiota intestinal habitual, pero que
comenzarán a producir efectos patógenos si se encuentran en altas
concentraciones Los efectos beneficiosos que pueden producir son inhibición del
crecimiento de patógenos, producción de vitaminas estimulación del sistema
inmune etc. Los efectos patógenos de las bacterias incluyen intolerancia a la
alimentación, inflamación e infección entre otros (Waaij, 1999). Si en la
composición de la microbiota intestinal predominan especies como
bifidobacterias y lactobacilos, favorecerán la protección, ya que evitan el
crecimiento de bacterias patógenas (Wold y Adlerberth, 2000).
V. Resultados y Discusión
173
En la Figura 45 se pueden observar los resultados obtenidos para cada unode
los grupos microbianos estudiados en este ensayo. Las concentraciones de los
grupos microbianos Bacteroides, Clostridia XVa y Clostridia IV no cambiaron
durante el ensayo, por lo que es probable que se partiera de concentraciones
bajas en las heces de los lactantes sanos. Por otro lado, se debe destacar el
elevado límite de detección obtenido para el grupo Atopobium, lo que nos
dificultó su cuantificación ya que varias muestras obtuvieron valores cercanos a
este valor (8∙104 cels/g).
Desde un punto de vista general, el grupo Lactobacillus solamente aumentó
una unidad logarítmica desde el primer muestreo (0 h) al último (48 h). Todos
los grupos estudiados aumentaron la concentración de Lactobacillus durante las
primeras 6 horas, sin embargo, a partir de ese momento cada grupo evolucionó
de una manera diferente aunque sin grandes diferencias. De este modo, el
grupo control mantuvo los valores alcanzados a las 6 h hasta el último muestreo
(5,55 Log cels/g y 5,67 Log cels/g) siendo las concentraciones más bajas
comparándolas con los otros grupos de estudio. Aún así, no se observaron
diferencias significativas en ningún punto de muestreo, hecho probablemente
debido a la alta variabilidad encontrada entre los tres inóculos fecales. Aunque
parten de concentraciones similares, a medida que estudiamos la evolución de
este grupo microbiano las desviaciones aumentan, lo que podría explicarse
porque probablemente las especies predominantes de lactobacilos en cada uno
de los tres donantes sean diferentes y por lo tanto respondan de manera
diferentes ante los ingredientes funcionales.
En el ensayo anterior de la presente tesis doctoral obtuvimos resultados
positivos en el crecimiento de L. gasseri cuando suplementámos el medio de
cultivo con los sueros lácteos sometidos o no a digestiónpero esto no significa
que el crecimiento de todas las especies de latobacilos se estimule con estos
ingredientes. Una hipótesis podría ser por tanto, que en alguno de los inóculos
fecales predominara esta especie y en los otros predominara otra diferente,
que no se viera afectada por los ingredientes estudiados.
V. Resultados y Discusión
174
Aun así se debe destacar que todos los ingredientes testados dieron lugar a
concentraciones más altas que el grupo control, especialmente los nucleótidos,
aunque a las 48 horas el grupo SLβ alcanzó valores similares que Nuc dig. En este
sentido, Mateo, Dave y Stein (2004) en un estudio in vivo, sobre la microbiota
intestinal de lechones a los que se les suplementó la dieta con nucleótidos,
encontraron un aumento significativo de Lactobacilos respecto al grupo
alimentado con la misma dieta sin suplementar.
Aunque el aumento de grupo Lactobacillus (por parte del preparado de
nucleótidos) sea pequeño, debemos tomarlo en cuenta, ya que otros estudios in
vitro en los que se adicionan prebióticos con efectos beneficiosos probados no
observan cambios en este grupo (Saulnier, Gibson y Kolida, 2008).
El grupo Bifidobacterium, como se puede observar en la figura 45 presentó
un crecimiento que comenzó con una fase exponencial hasta las 12 horas
aproximadamente y posteriormente una fase estacionaria. En dichas curvas se
observa una pendiente de la fase exponencial diferente dependiendo del
ingrediente añadido, siendo las más suaves para el grupo control y los
suplementados con nucleótidos y las más marcadas para aquellos grupos a los
que se les añadió sueros lácteos sometidos o no a digestión. En el segundo
punto de muestreo (6 horas), y los grupos suplementados con sueros lácteos
presentaron las concentraciones más altas (p=0,06). En este sentido se
obtuvieron diferencias significativas a las 12 h de crecimiento, siendo los valores
de las concentraciones más altos para los grupos suplementados con los sueros
sin digerir cuyas medianas oscilaron entre 8,40‐8,42 Log cels /ml, seguidos de los
sueros digeridos (8,05‐8,32 Log cels /ml) respecto de los demás (7,72‐7,87 Log
cels /ml).
El incremento significativo que se produjo en la concentración de
bifidobacterias por parte de los concentrados proteicos sin digerir, a las 12 h fue
similar al encontrado por Saulnier, Gibson y Kolida (2008) suplementando el
medio de cultivo base con fructooligosacaridos (FOS), fructooligosacaridos de
V. Resultados y Discusión
175
cadena corta (scFOS) y simbióticos. Por lo que nuestros sueros lácteos sin digerir
mostraron un efecto similar en este grupo microbiano al de prebióticos y
simbióticos con beneficios ya confirmados.
Estos resultados se corresponden con los obtenidos en el ensayo anterior en
el que observamos una estimulación del crecimiento de B. longum por parte de
los concentrados proteicos y los nucleótidos, aunque esta vez estos últimos no
ejercieron efecto alguno sobre el grupo Bifidobacterium. Este hecho, puede ser
debido a que la concentración de nucleótidos a la que fue expuesto el inóculo
fecal (32 mg/L) fue menor que con la que obtuvimos los resultados positivos en
el ensayo citado (72 mg/L).
Se puede afirmar que los concentrados proteicos en las dosis utilizadas en
este estudio incrementaron el crecimiento de bifidobacterias. Sin embargo
estudios similares, aunque con concentraciones diferentes no pudieron ver
efecto alguno sobre este grupo microbiano (Bruck et al., 2002; Brück, Graverholt
y Gibson 2003b). Por otro lado, debido a la existencia de estudios
contradictorios relacionados con el crecimiento de bifidobacterias ante la
presencia de nucleótidos (Gil et al., 1986; Uauy, 1989; Balmer, Hanvey y
Wharton, 1994) y a que nuestros resultados indican que depende de la
concentración de los mismos, son necesarios más estudios para obtener
conclusiones claras a este respecto.
El grupo microbiano Atopobium‐Collinsella presentó un incremento de hasta
una unidad logarítmica durante las 6 primeras horas de su crecimiento, después
mantuvo su concentración en todos los grupos de estudio hasta el muestreo de
las 36 horas en el que comenzó a descender según el ingrediente añadido. De
esta forma se observaron diferencias significativas a las 48 horas, mostrando el
grupo control (5,50 Log cels /ml) los valores más bajos respecto al medio
suplementado con suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (5,88 Log cels/g.). La
concentración de este grupo bacteriano, depende del tipo de alimentación,
siendo mayores los recuentos en heces de niños alimentados artificialmente y
V. Resultados y Discusión
176
también depende de la edad, aumentando conforme el niño va creciendo
(Harmsen et al., 2000). En este estudio se observó que la suplementación con los
ingredientes, nucleótidos o sueros lácteos, mantuvo unas concentraciones
similares al grupo control excepto en el último muestreo en el que el grupo SLβ
obtuvo valores mayores.
El grupo microbiano Enterobacteriaceae presentó un rápido crecimiento en
todos los grupos de estudio entre el primer y segundo muestreo. Sin embargo, a
partir de este último el medio de cultivo sin suplementar y el suplementado con
nucleótidos sin digerir comenzaron un descenso lento. Por otro lado, el grupo al
que se le añadió suero lácteo rico en β‐lactoglobulina mantuvo sus valores
siendo estos los más altos en el último muestreo. Este resultado contrasta con el
obtenido en el ensayo anterior cuando se evaluó el crecimiento de E. coli,
expuesta a estos mismos concentrados digeridos y sin digerir, ya que inhibió su
crecimiento. Este hecho puede deberse a que el grupo analizado comprende
gran variabilidad de especies bacterianas y no sólo a E. coli, por lo que es
probable que algunas se vean afectadas por el ingrediente y otras manifiesten el
efecto contrario. Son diversos los estudios que observan un descenso en la
concentración de esa especie bacteriana y lo atribuyen a las proteínas del
lactosuero (α‐lactoalbúmina) (Brück et al., 2003a; Brück et al., 2006a)
Por otro lado se debe señalar que los grupos suplementados con nucleótidos
tanto digeridos como sin digerir no mostraron cambios respecto al grupo
control, como ocurrió en el ensayo con cultivos puros al estudiar el crecimiento
de E. coli. Sin embargo en un estudio llevado a cabo por Balmer, Hanvey y
Wharton (1994) observaron el efecto contrario en las heces de lactantes a los
que se les suplementó la fórmula infantil con nucleótidos, incrementando los
recuentos de E. coli.
En relación al grupo microbiano Enterococccaceae se debe destacar la alta
variabilidad encontrada entre los diferentes donantes, como ocurría con el
grupo Lactobacillus por lo que planteamos la misma hipótesis de que la especie
V. Resultados y Discusión
177
predominante dentro del mismo grupo sería diferente para cada lactante y
además, respondería de distinta manera ante los ingredientes objeto de estudio.
El grupo Enterococcaceae aumentó su concentración durante las primeras 6
horas de crecimiento de la misma forma para todos medios suplementados o no
con los ingredientes funcionales. A partir de las 12 horas la evolución es
diferente para cada muestra, siendo aquellos a los que se les añadió los
concentrados proteicos sometidos o no a digestión los que presentaron los
valores más altos. Los otros tres grupos (Control, Nuc y Nuc dig) evolucionaron
de una manera similar, excepto en el muestreo de las 48 h en el que el medio de
cultivo suplementado con los nucleótidos digeridos mostró concentraciones
mayores. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas debido a la
alta variabilidad citada anteriormente.
La concentración de bacterias totales llegó a 1010 cels/ml y siguió la misma
tendencia que los dos grupos anteriormente descritos (Enterobacteriaceae y
Enterococcaceae) que fueron los que presentaron mayores concentraciones
seguidos del grupo Bifidobacterium. En la Figura 45 se puede observar como las
bacterias totales tienen un crecimiento exponencial hasta las 6 h y
posteriormente entran en fase estacionaria, incluso en alguno de los grupos
acaba descendiendo su concentración. En este grupo no encontramos gran
variabilidad entre la microbiota de los donantes. Así se pudo observar
diferencias estadísticamente significativas en el último muestreo (48 h), siendo
los grupos a los que se añadió sueros lácteos con o si digestión los que
mostraron mayores valores (Control: 9,14 Nuc: 8,84, Nuc dig: 9,18, SLα: 9,49,
SLα dig: 9,45, SLβ: 9,61, SLβ dig: 9,40 Log cels/g).
Como se ha dicho al principio de este apartado, las concentraciones de los
grupos microbianos Bacteroides, Clostridia XVa y Clostridia IV se mantuvieron
prácticamente constantes a lo largo del estudio. El grupo Clostridia XVa fue el
único que pareció crecer en algún momento, pero no ocurrió en los tres
donantes por lo que se observaron altas desviaciones.
V. Resultados y Discusión
178
Tras la obtención de los resultados de la evolución de la microbiota fecal, se
puede afirmar que existió un efecto beneficioso por parte los concentrados
proteicos sobre el crecimiento de bifidobacterias y por parte del preparado de
nucleótidos sobre los lactobacilos. Además, una conclusión importante es que
ninguno de nuestros ingredientes dió lugar a un incremento en los grupos
microbianos Bacteroides y Clostridium leptum respecto al grupo control,
pertenecientes a la microbiota patógena (Waaij., 1999). Sin embargo como
hemos descrito anteriormente C. coccocoides y Atopobium mostraron mayor
crecimiento en el grupo suplementado con suero rico en β‐lactoglobulina. Estos
resultados también fueron encontraron por Langlands et al., (2004) y Saulnier,
Gibson y Kolida (2008) respectivamente al suplementar el medio con FOS, e
incluso en un estudio in vivo en humanos se observó un aumento de Collinsella
aerofaciens al consumir 2,5g FOS/día (Tannock et al., 2004)
Figura 45. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes sometidos o no a digestión in vitro. * Indica
diferencias estadísticas entre los grupos de estudio
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Bacteroides
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Clostridia IV
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Bifidobacterium
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48Log cels/m
lTiempo (horas)
Enterococcaceae
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Lactobacillus
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Enterobacteriaceae
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Bacterias totales
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Clostridia XVa
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Atopobium
Control Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
*
*
V. Resultados y Discusión
179
V. Resultados y Discusión
180
En la Figura 46 se presentan los resultados obtenidos al calcular la relación entre
los dos grupos microbianos Bacteroides y Bifidobacterium. En ella se puede observar
como esta relación disminuye entre las 0 y 12 horas, debido al crecimiento exponencial
de bifidobacterias, ya que la concentración de Bacteroides permanece constante
durante el ensayo.
Figura 46: Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.
Se observaron diferencias estadísticas (p<0,05) en la relación Bacteroides
/Bifidobacterium a las 12 horas entre los grupos de estudio, siendo los valores más altos
para el grupo control (0,45) y los suplementados con nucleótidos (0,46‐0,47) respecto
de los sueros lácteos sin digerir (0,41‐0,42) y digeridos (0,41‐0,43). No ocurrió lo mismo
en un estudio in vivo en el que los lactantes alimentados on una formula suplementada
con nucleótidos mostraron un descenso en esta relació (Signal et al., 2008)
Al realizar el análisis estadístico de la evolución de pH (resultados mostrados en
la Figura 47) se observarons diferencias estadísticas (p<0,05) a las 6, 12, 24 y 72 horas
de muestreo, pero como partimos de pH ligeramente diferentes en las tres
experiencias, decidimos trabajar con la variación de este parámetro que se presenta en
la Figura 45.
0,38
0,43
0,48
0,53
0,58
0,63
0,68
0,73
0,78
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Bacteroides/Bifid
obacterium
Tiempo (horas)
Control Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
V. Resultados y Discusión
181
Una mayor variación en el pH significa un aumento de la acidez, debido a una
mayor producción de ácidos grasos de cadena corta por parte de la microbiota fecal,
hecho que se refleja al realizar el test de correlación de Spearman en el que se
obtuvieron relaciones significativas negativas entre el pH y el ácido acético o el total de
ácidos grasos de cadena corta en todos los puntos de muestreo, además debemos
destacar la significación obtenida en el muestreo de las 12 h (r=‐0,927 , p<0,01) que
además coincide el aument de Bifidobacterias.
En los primeros puntos de muestreo, 6 y 12 horas, los mayores valores de
variación los obtienen los dos concentrados proteicos sin digerir, especialmente el
suero rico en β‐lactoglobulina que presenta diferencias significativas a las 12 horas.
Estas variaciones de pH se corresponden con las diferencias encontradas en el grupo
Bifidobacterium en los mismos puntos de muestreo (6 y 12 h), por lo que, podríamos
atribuir ese descenso de pH a la acidificación del medio a metabolismo de este grupo
microbiano
Figura 47. Variación de pH en cada punto de muestreo para los diferentes grupos de estudio.*Indica diferencias estadísticas entre los grupos de estudio para cada punto de muestreo.
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6h 12h 24h 36h 48h 72h
Variación de
PH
Control Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
*
V. Resultados y Discusión
182
Los resultados obtenidos en el análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) se
pueden observar en la Tabla 26 para los mayoritarios (acético, propiónico y butírico) y
en la Figura 46 para los minoritarios (isobutírico, isovalérico, valérico, isocaproico,
caproico y heptanoico). En lass muestras analizadas en este estudio, los ácidos valérico
y heptanoico no fueron detectados.
Los AGCC poseen un papel importante en la estimulación de la absorción de agua
y sodio, previenen la diarrea disminuyendo el pH luminal que evita el crecimiento y
proliferación de bacterias potencialmente patógenas, y protege contra la
carcinogénesis disminuyendo la biodisponibilidad de aminas tóxicas (Puccio et al.,
2007).
El ácido acético aumentó su concentración rápidamente hasta las 24 h en todos
los grupos de estudio, posteriormente las concentraciones se mantuvieron en los
grupos a los que se les suplementó con nucleótidos digeridos o no, y siguió
aumentando en los demás grupos. Como se puede observar en la Tabla 27 se
obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en los muestreos
realizados a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas, siendo en todos los casos los sueros lácteos sin
digerir los que produjeron mayor concentración de ácido acético, seguidos de los
mismos sueros digeridos siendo los nucleótidos, digeridos o no, los que mostraron
menores concentraciones. Las diferencias más marcadas ocurrieron a las 12 y 72 horas
y de nuevo podemos decir que este hecho se corresponde con el aumento significativo
de Bifidobacterium y el mayor descenso de pH. Son diversos los estudios que añaden
compuestos funcionales (prebióticos) a fórmulas infantiles ya que está demostrado el
aumento que provocan en los recuentos de bifidobacterias, lactobacilos y como
consecuencia una mayor producción de ácido acético y AGCC totales (Ben et al., 2004,
Knol et al., 2005; Cai, Luo y Ben, 2008).
Además el ácido acético producido por bifidobacterias mejora la defensa
intestinal mediada por las células epiteliales y por lo tanto protege al hospedador
contra infecciones (Fukuda, 2011).
V. Resultados y Discusión
183
Respecto al ácido propiónico, su concentración aumentó hasta las 12‐24 horas
de forma general, aunque en algunos grupos se produce un aumento en muestreos
posteriores (control a las 48 h y en los grupos suplementados con nucleótidos a las 72
h). Este compuesto presentó diferencias significativas en todas las etapas desde las 12
horas. Se debe destacar que los grupos suplementados con el preparado de nucleótidos
digeridos y sin digerir mostraron las concentraciones más altas de ácido propiónico a las
24 y 72 horas respecto a los demás grupos, y a las 36 y 48 h junto con el grupo control.
Por lo tanto, a partir de las 12 h los grupos a los que se les adicionó concentrados
proteicos obtuvieron los valores más bajos, en especial si las proteínas no estaban
digeridas.
En el caso del ácido butírico se debe señalar la gran variabilidad encontrada en
los tres donantes, hecho que era de esperar ya que los ácidos grasos son producto del
metabolismo bacteriano y ya mencionamos alta variabilidad que presentaron algunos
de los grupos como Clostridia XVa ( productor de ácido butírico). Aun así se observaron
diferencias significativas a las 6 y 36 horas de incubación del inóculo fecal entre los
grupos de estudio. Aunque todos los grupos a los que se les añadió los concentrados
proteicos sometidos o no a digestión mostraron los valores de ácido butírico más altos,
los grupos SLα dig SLβ presentaron los máximos valores en la concentración de este
ácido orgánico respecto a los demás grupos.
En resumen los grupos a los que se es adicionaron nucleótidos mostraron
valores de acético y butírico similares al control y superiores de propiónico. Los dos
concentrados proteicos sin digerir mostraron un comportamiento similar en cuanto a la
producción de ácido acético, aunque con valores mayores respecto al control. Este
hecho también ocurrió con los concentrados proteicos digeridos pero en menor
medida. Sin embargo, desde un punto de vista general se observaron unas
concentraciones menores de propiónico en los grupos a los que se le adicionaron los
sueros lácteos (digeridos o no). El ácido butírico presentó mayores valores para los
concentrados proteicos pero en especial en el enriquecido con α‐lactoalbúmina
digerido o con β‐lactoglobulina sin digerir.
Tabla 26. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana). Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC
0h
Control 4,69±0,24 (4,695) 0,26±0,02 (0,26) 0,16±0,00 (0,16) 17,86±0,42 (17,86) 5,52±0,30 (5,52) Nuc 4,22±0,15 (4,26) 0,25±0,01 (025) 0,17±0,02 (0,17) 17,15±0,66 (17,47) 5,02±0,17 (5,08)
Nuc dig 4,17±0,15 (4,23) 0,23±0,02 (0,22) 0,17±0,01 (0,17) 17,94±1,71 (18,55) 5,64±0,45 (5,05) SLα 4,79±0,91 (4,65) 0,23±0,01 (0,24) 0,16±0,00 (0,16) 20,93±5,15 (19,47) 5,59±0,87 (5,456)
SLα dig 4,81±0,45 (4,65) 0,24±0,02 (0,23) 0,19±0,00 (0,19) 20,34±1,75 (19,68) 5,64±045 (5,466) SLβ 4,84±1,04 (4,73) 0,23±0,03 (0,22) 0,17±0,00 (0,17) 21,20±4,85 (19,23) 5,60±1,07 (5,51)
SLβ dig 4,49±0,99 (4,39) 0,24±0,03 (0,23) 0,32±0,19 (0,32) 18,68±2,32 (18,26) 5,47±1,31 (5,37)
6h
Control 14,94±0,67 (14,787)* 0,77±0,30 (0,78) 0,36±0,18 (0,33)* 21,89±8,43 (20,10)* 16,68±0,39 (16,52)* Nuc 13,23±2,78 (13,13)* 0,76±0,20 (0,76) 0,19±0,02 (0,19)* 17,50±1,31 (17,17)* 14,49±2,78 (14,37)*
Nuc dig 12,80±2,33 (12,94)* 0,73±0,19 (0,72) 0,19±0,04 (0,18)* 17,72±2,05 (17,03)* 14,02±2,32 (14,17)* SLα 18,65±3,59 (18,50)* 1,01±0,16 (1,01) 0,80±0,06 (0,79)* 18,44±0,75 (18,22)* 21,08±3,28 (20,93)*
SLα dig 16,49±2,43 (16,21)* 1,05±0,11 (1,05) 0,55±0,16 (0,56)* 15,66±0,74 (15,63)* 18,54±2,09 (18,25)* SLβ 20,00±2,94 (19,79)* 0,93±0,14 (0,91) 1,35±0,13 (1,31)* 21,54±0,83 (21,57)* 22,93±2,62 (22,69)*
SLβ dig 17,08±3,08 (16,99)* 0,95±0,16 (0,94) 0,78±0,07 (0,80)* 18,01±0,28 (17,98)* 18,14±3,81 (17,10)*
12h
Control 22,95±1,41 (22,90)* 1,58±0,30 (1,52)* 0,81±0,72 (0,77) 15,02±3,56 (15,38)* 25,95±2,37 (25,90)* Nuc 16,80±4,26 (17,48)* 1,44±0,30 (1,49)* 0,45±0,50 (0,24) 11,59±0,78 (11,49)* 18,97±4,18 (19,97)*
Nuc dig 16,38±4,22 (16,06)* 1,43±0,29 (1,49)* 0,43±0,49 (0,24) 11,39±1,05 (11,00)* 18,53±4,17 (18,49)* SLα 32,24±1,09 (31,85)* 1,32±0,13 (1,29)* 1,01±0,42 (0,91) 24,52±1,83 (24,37)* 35,15±1,91(34,55)*
SLα dig 25,50±4,08 (24,05)* 1,70±027 (1,71)* 0,94±0,73 (0,88) 15,55±4,92 (14,23)* 28,47±3,30 (27,11)* SLβ 35,48±1,20 (35,34)* 1,10±0,03 (10,9)* 1,49±0,28 (1,43) 20,26±3,56 (19,84)* 38,68±1,73 (38,61)*
SLβ dig 28,91±2,67 (28,26)* 1,46±0,26 (1,45)* 1,27±0,78 (1,12) 20,26±3,56 (19,84)* 32,15±3,64 (31,14)*
24h
Control 29,50±6,77 (28,40)* 1,78±0,87 (1,42)* 0,57±0,57 (0,29) 18,15±5,28 (19,33)* 32,52±7,77 (31,31)* Nuc 28,05±3,84 (28,22)* 2,15±0,07 (2,13)* 0,84±0,94 (0,63) 13,09±2,03 (13,04)* 31,36±3,44 (31,80)*
Nuc dig 29,32±4,64 (30,10)* 2,18±0,12 (2,22)* 0,84±0,93 (0,65) 13,40±1,73 (14,01)* 32,65±3,91 (33,63)* SLα 44,55±3,29 (43,89)* 1,38±0,12 (1,43)* 0,75±0,67 (0,65) 32,38±1,96 (32,31)* 47,35±3,36 (47,12)*
SLα dig 37,46±1,44 (37,39)* 1,65±0,17 (1,65)* 0,96±0,83 (0,81) 22,83±2,44 (22,93)* 40,49±1,93 (40,58)* SLβ 43,75±4,83 (44,52)* 1,18±0,12 (1,13)* 1,20±0,49 (1,28) 36,97±3,00 (37,23)* 46,77±5,03 (48,36)*
SLβ dig 40,43±4,81 (38,65)* 1,53±0,30 (1,54)* 1,12±0,45 (1,21) 27,55±8,59 (25,62)* 43,56±4,40 (41,71)*
V. Resultados y Discusión
184
185
Tabla 26. (continuación) Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana). Acético Propiónico Butírico A/P Total AGCC
36h
Control 38,35±5,04 (38,76) 1,90±0,25 (1,98)* 0,69±0,54 (0,66)* 20,55±4,68 (19,69)* 41,61±5,95 (42,02)Nuc 33,85±6,37 (33,19) 1,94±0,55 (2,02)* 0,21±0,05 (0,21)* 18,00±2,91 (17,69)* 36,28±6,76 (35,71)
Nuc dig 36,08±9,47 (34,46) 1,66±0,44 (1,60)* 0,38±0,28 (0,27)* 22,32±6,21 (21,99)* 38,40±9,76 (36,86)SLα 43,80±3,88 (42,79) 1,62±0,38 (1,58)* 0,62±0,22 (0,68)* 28,44±8,23 (29,02)* 46,41±3,63 (45,81)
SLα dig 41,18±8,45 (40,40) 1,90±0,15 (1,88)* 1,18±0,99 (1,13)* 22,03±5,89 (21,67)* 44,59±7,54 (43,77)SLβ 43,45±3,41 (43,03) 1,20±0,23 (1,08)* 1,20±0,33 (1,15)* 36,80±4,00 (38,36)* 46,46±3,56 (45,72)
SLβ dig 39,70±0,77 (39,70) 1,41±0,29 (1,31)* 0,78±0,52 (0,54)* 28,83±4,83 (30,12)* 42,29±1,67 (41,56)
48h
Control 38,30±4,83 (38,87)* 2,40±0,46 (2,23)* 0,72±0,59 (0,73) 16,65±4,72 (17,63)* 41,97±5,37 (42,35)* Nuc 31,76±2,96 (31,84)* 1,98±0,40 (2,12)* 0,83±0,85 (0,59) 16,42±2,70 (15,76)* 34,87±3,84 (35,40)*
Nuc dig 31,79±3,09 (31,13)* 1,95±0,38 (2,05)* 0,84±0,90 (0,59) 16,68±2,63(15,66)* 34,86±4,08 (34,56)* SLα 42,94±3,09 (43,08)* 1,25±0,04 (1,26)* 0,92±0,34 (0,86) 34,33±3,19 (34,92)* 45,67±2,97 (46,02)*
SLα dig 40,93±5,22 (39,98)* 1,55±0,35 (1,58)* 1,07±0,99 (0,84) 27,32±5,45 (28,57)* 43,95±4,46 (43,33)* SLβ 42,93±3,37 (42,40)* 1,29±0,32 (1,18)* 1,50±0,50 (1,32) 34,96±8,79 (36,86)* 46,31±2,37 (45,76)*
SLβ dig 40,88±3,79 (40,92)* 1,63±0,29 (1,65)* 1,02±0,71 (1,00) 26,10±7,19 (24,90)* 44,16±2,43 (44,43)*
72h
Control 40,46±2,88 (41,31)* 1,34±0,59 (1,36)* 0,68±0,53 (0,68) 34,89±14,24 (32,45)* 43,11±4,32 (43,92)* Nuc 34,46±4,21 (33,41)* 2,34±0,31 (2,29)* 0,75±0,74 (0,64) 14,75±1,24 (14,40)* 37,86±3,92 (36,56)*
Nuc dig 34,36±2,94 (34,87)* 2,37±0,70 (2,41)* 0,71±0,74 (0,61) 14,55±1,53 (14,13)* 37,75±2,24 (38,10)* SLα 51,47±5,76 (51,57)* 1,60±0,19 (1,60)* 0,72±0,39 (0,53) 32,24±1,51 (32,18)* 54,26±5,73 (54,65)*
SLα dig 45,48±9,55 (46,35)* 1,91±0,08 (1,88)* 0,98±0,89 (0,86) 23,93±5,85 (24,11)* 48,75±8,36 (49,53)* SLβ 45,97±5,65 (46,15)* 1,16±0,08 (1,15)* 1,29±0,29 (1,15) 39,47±2,81 (39,43)* 49,01±4,94 (49,14)*
SLβ dig 44,61±8,06 (43,25)* 1,70±0,15 (1,68)* 1,04±0,69 (0,96) 26,64±6,80 (25,06)* 47,83±6,99 (46,47)* * Indica diferencias estadísticas (p<0,05), en el test de Kruskal‐Wallis, para cada ácido graso mayoritario entre los grupos de estudio en cada punto de muestreo.
V. Resultados y Discusión
186
Figura 48: Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios en cada punto de muestreo para los ingredientes estudiados
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 6 12 24 36 48 72
mM
IsobutíricoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 6 12 24 36 48 72
mM
IsovaléricoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 6 12 24 36 48 72
mM
CaproicoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 6 12 24 36 48 72
mM
IsocaproicoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig
V. Resultados y Discusión
186
V. Resultados y Discusión
187
En las heces de los lactantes que reciben alimentación natural el ácido graso
predominante es el ácido acético y en menor medida el propiónico y el butírico, sin
embargo, en las heces de aquellos alimentados de manera artificial aumenta la
proporción de estos dos últimos ácidos grasos. Este hecho se debe a la utilización de
los ácidos butírico y propionico en el colon por parte e los lactantes alimentados con
leche materna (Edwards y Parret, 2002; Vasallo, 2010).
Se debe destacar que los grupos suplementados con nucleótidos digeridos y
sin digerir, dieron lugar a las mayores concentraciones de ácido propiónico. Los
muestreos llevados a cabo desde las 12 horas, mostraron diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) entre los grupos de estudio. A las 12 horas el
grupo control y el suplementado con suero rico en α‐lactoalbúmina digerida
mostraron las concentraciones más altas respecto al grupo splementado con el otro
suero lácteo.
Respecto a los ácidos grasos minoritarios que se presentan en la Figura 46, se
debe destacar la alta variabilidad encontrada. Atribuimos este hecho al predominio
de especies bacterianas diferentes en los tres inóculos fecales, ya que a las 0 h la
variabilidad es menor y por lo tanto a una diferente respuesta ante los mismos
ingredientes. No observamos diferencias estadísticas entre los ingredientes
estudiados (sometidos o no a digestión) para cada muestreo. El ácido isobutírico
presentó las concentraciones más altas en el grupo control y en los que se
adicionaron los lactosueros sin digerir, hecho que ocurrió también con el ácido
isocaproico y el ácido isovalérico pero en este último además se observaron elevadas
concentraciones en los grupos con concentrados proteicos digeridos. El ácido
caproico obtuvo sus valores máximos en el grupo al que se le adicionó suero lácteo
rico en β‐lactoglobulina, hecho que no debemos tener en cuenta ya que este elevado
valor, también se obtuvo a las 0 h. Todos los demás grupos mostraron valores
similares entre ellos y también en el tiempo.
V. Resultados y Discusión
188
2.2.2. Evolución de la microbiota fecal expuesta a las fórmulas del estudio
comparándolas con la leche materna
El objetivo de este ensayo fue evaluar el efecto de la fórmula suplementada
sobre la evolución de diferentes grupos microbianos de un inóculo fecal, y
compararla con una fórmula control y con leche materna. Los resultados obtenidos a
este respecto se presentan en la Figura 47.
En primer lugar se debe destacar las diferencias obtenidas en el muestreo de
las 36 h en el grupo microbiano Lactobacillus que mostró mayores concentraciones
(p<0,05) para el grupo en el que el inóculo fecal fue expuesto a la leche materna
(LM: 6,91, LM dig: 6,50 Log nºcels/ml) respecto a los otros grupos de estudio (FC:
5,60, FC dig: 5,12, FS: 5,12, FS dig: 5,44 Log nºcels/ml). Además los grupos expuestos
a la leche materna fueron los únicos que incrementaron la concentración con el
tiempo de incubación, ya que los expuestos a las fórmulas infantiles mantuvieron las
concentraciones de Lactobacillus a lo largo del tiempo.
En el último muestreo se observaron unos valores mayores (sin diferencias
estadísticas) en la concentración de Lactobacillus para el grupo expuesto a la fórmula
suplementada respecto de la fórmula control (FC: 5,66, FS: 6,07 Log nºcels/ml). Era
de esperar una diferencia incluso mayor, ya que la fórmula suplementada tiene
adicionada el mismo preparado de nucleótidos que se ha evaluado en el ensayo
anterior, donde se pudieron observar unas concentraciones mayores de
Lactobacillus debidas a este ingrediente.
En relación al grupo microbiano Bifidobacterium, todos los grupos de estudio
(FC, FS y LM) digeridos y sin digerir evolucionaron en el tiempo con un crecimiento
típico. Se pudieron observar diferencias significativas a las 24, 36 y 48 horas, siendo
los valores más altos para los grupos expuestos a las fórmulas infantiles sin digerir y
los expuestos a la leche materna, por lo que en este caso los productos resultantes
de la digestión de las fórmulas infantiles no demostraron efecto bifidogénico. Por
otro lado se debe señalar que aunque sin diferencias significativas (p=0,07), a las 12
V. Resultados y Discusión
189
h de crecimiento la fórmula suplementada obtuvo unos valores superiores (8,70 Log
nºcels/ml) a los demás grupos incluidos los expuestos a leche materna (8,12 Log
nºcels/ml). Este efecto positivo de la fórmula suplementada puede ser atribuido al
enriquecimiento de la misma con α‐lactoalbúmina, ya que en el ensayo anterior fue
este ingrediente sin digerir el que mostró efecto bifidogénico, y no ocurrió lo mismo
con el preparado de nucleótidos. No obstante, podría ser debido a que la
concentración de este suero lácteo es menor en la fórmula suplementada que la
utilizada en el ensayo con ingredientes.
Los resultados obtenidos en este trabajo para el grupo microbiano
Bifidobacterium contrastan con otras investigaciones similares. En este sentido, un
estudio in vitro realizado con inóculos fecales, llevado a cabo por Brück, Graverholt y
Gibson, 2002 y en el que evaluaron una fórmula infantil suplementada con
lactoalbúmina y otra con glicomacropeptidos, no observaron modificaciones en la
concentración de bifidobacterias pero si observaron cambios en los recuentos de E.
coli, siendo menores para el grupo suplementado con α‐lactoalbúmina. Este hecho
puede ser debido a la baja cantidad de fórmula añadida al medio de cultivo, ya que
estos autores añaden 1 % peso/volumen y nosotros reconstituimos la fórmula, según
las instrucciones del fabricante, aproximadamente a 14,5% peso volumen pero en
agua milli‐Q.
El grupo microbiano Atopobium aumentó aproximadamente en una unidad
logarítmica a lo largo del tiempo e estudio (48 h). En los puntos de muestreo 0, 6 y
12 h las concentraciones de las fórmulas infantiles fueron similares entre sí y
también semejantes a las presentadas por los grupos expuestos a leche materna, sin
embrago cuando los grupos eran sometidos a digestión los resultados presentados
por la leche materna fueron ligeramente inferiores a los de las fórmulas infantiles. A
partir de este punto el grupo expuesto a la leche materna mantuvo los valores de
Atopobium más bajos que las fórmulas infantiles sin digerir, sin embargo para la
leche materna digerida ocurrió lo contrario. Este grupo microbiano se ha relacionado
con la atopia (Kirjavainen, Salminen y Isolauri, 2003) por lo que es deseable que se
mantenga en concentraciones bajas.
V. Resultados y Discusión
190
El crecimiento fue exponencial hasta las 6 horas para el grupo
Enterobacteriacea. A esta etapa le sucedió una fase estacionaria en la que no hubo
crecimiento. Este hecho fue similar para todos los grupos de estudio excepto para el
expuesto a leche materna sin digerir que apenas tuvo modificaciones en la
concentración enterobacterias desde el primer muestreo (0 h). Además debemos
destacar que algunos grupos de estudio presentaron un crecimiento mayor que se
reflejó en el último muestreo observándose diferencias significativas. A las 48 horas
los grupos expuesto a la leche materna presentaron direferencas siginificativas
Enterobacterias siendo sus valores de (LM: 8,61; LM dig: 9,12 Log nº cels/ml)
respecto de los demás grupos de estudio (FS: 7,90; FS dig: 8,08 Log nº cels/ml),
siendo la fórmula control sin digerir la que mostró los valores menores (FC: 7,61; FC
dig: 8,10 Log nº cels/ml). Según estos resultados podemos decir que la digestión a la
que fueron sometidas las fórmulas y la leche materna produce compuestos que
estimulan el crecimiento de Enterobacterias respecto de las leches sin digerir,
especialmente la leche materna.
Como se observa en la Figura 49 la variabilidad obtenida en el grupo
microbiano Enterococcaceae fue elevada, probablemente debido al predominio de
diferentes especies bacterianas pertenecientes a esta familia en los donantes de los
inóculos fecales. La alta variabilidad no permitió observar diferencias estadísticas
entre los grupos de estudió, sin embargo se debe señalar las altas concentraciones
alcanzadas por grupo expuesto a la fórmula suplementada a las 6 horas. Además
este grupo de estudio mostró una fase de crecimiento exponencial más marcada que
los demás. Este hecho se corresponde con el observado en el ensayo anterior, ya que
los concentrados proteicos estimularon el crecimiento de este grupo microbiano.
El crecimiento descrito por bacterias totales fue similar en todos los grupos
estudiados: primero aumentó una unidad logarítmica hasta las 6 h y después
disminuyó la concentración hasta las 12 h manteniéndose estos valores hasta las 48
h. Con excepción del grupo expuesto a la leche materna digerida, que no disminuyó
de las 6 a las 12 h y mantuvo sus valores más altos que los demás grupos de estudio.
Este hecho se refleja en el muestreo realizado a las 36 h de crecimiento, ya que se
V. Resultados y Discusión
191
obtuvieron diferencias estadísticas entre los grupos de estudio (FC: 9,23; FC dig:
9,07; FS: 9,19; FS dig: 9,04; LM: 8,89y LM dig: 9,67 Log nº cels/ml).
Los grupos microbianos Bacteroides y Clostridia XVa mantuvieron constantes
sus concentraciones a lo largo del estudio en 3,5 y 5 Log nº cels/ml respectivamente.
Por lo que es probable que, no hayan evolucionado por competición con los demás
grupos microbianos. Si los grupos microbianos Clostridia XVa y Bacteroides no han
aumentado, se podría afirmar que se ha obtenido un resultado positivo, ya que altas
concentraciones de las especies de estos dos grupos se han relacionado con niños
celiacos (Collado et al., 2007). Por otro lado el grupo microbiano Clostridia IV
presentó una variabilidad muy alta entre los diferentes donantes del inóculo fecal,
probablemente por la misma razón que en el grupo Enterococcaceae.
Figura 49. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a las fórmulas infantiles, control y suplementada, y a leche materna. * Indica diferencias estadísticas entre los grupos de estudio en el test de Kuskar‐Wallis.
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Lactobacillus
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Bifidobacterium
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48Log cels/m
lTiempo (horas)
Enterococcaceae
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cles/m
l
Tiempo (horas)
Clostridia IV
1,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/ml
Tiempo (horas)
Bacteroides
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/ml
Tiempo (horas)
Clostridia XVa
3,03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Atopobium
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/ml
Tiempo (horas)
Enterobacteriaceae
FC FC dig FS FS dig LM LM dig
* * * *
*
6,06,57,07,58,08,59,09,510,010,511,0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Log cels/m
l
Tiempo (horas)
Bacterias totales
*
V. Resultados y Discusión
192
V. Resultados y Discusión
193
Además, se calculó la relación entre los dos grupos microbianos Bacteoroides
y Bifidobacterium (Figura 50) que presentaron diferencias significativas (p<0,05) en
todos los puntos de muestreo, excepto a las 0 h. Las diferencias observadas a las 6 y
12 h mostraron los valores más altos en los grupos sometidos a digestión respecto a
los no digeridos, sin embargo en estos dos puntos de muestreo se pudo observar
cómo la fórmula suplementada digerida obtuvo valores ligeramente inferiores a los
de la fórmula control digerida y similares a los de la leche materna digerida. En Los
tres últimos muestreos se observó un incremento significativo de la relación de estos
microorganismos en los grupos expuestos a las fórmulas infantiles digeridas respecto
de los demás grupos. En un estudio in vivo llevado a cabo por Singhal et al., (2008)
también observaron un descenso de esta relación cuando los lactantes fueron
alimentados con una fórmula suplementada con nucleótidos.
Figura 50: Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.
Según los resultados obtenidos podemos afirmar que tanto las fórmulas
como la leche materna sin digerir obtienen mejores resultados en la composición de
la microbiota intestinal, ya que presentaron mayores concentraciones de
lactobacilos y bifidobacterias. Realmente no podemos extrapolar estos resultados a
lo que ocurre in vivo, debido a que tras la digestión in vitro hubo que someter a un
tratamiento térmico (100ºC 4 min) a las fórmulas infantiles y la leche materna para
0,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,80
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Bacteroides/Bifid
obacterium
Tiempo (horas)
FC FC dig FS FS dig LM LM dig
**
* * *
V. Resultados y Discusión
194
inactivar las enzimas utilizadas en dicha digestión, por lo que las proteínas enteras
fueron desnaturalizadas. De esta manera, podremos afirmar los efectos que
producen los péptidos resultantes de la digestión por un lado y las proteínas enteras
por otro. Sin embargo en el organismo de los lactantes tras la digestión
gastrointestinal llegarán al colon proteínas sin digerir y péptidos resultantes de la
digestión, de manera que la microbiota estará expuesta a estos dos productos.
En la Tabla 27 se pueden observar los resultados obtenidos para los ácidos
grasos mayoritarios y también la relación entre el ácido acético y propiónico y la
suma total todos los ácidos orgánicos. En primer lugar debemos señalar la alta
variabilidad encontrada a partir de las 24 horas para las fórmulas infantiles digeridas,
lo que nos indica que, como se ha dicho anteriormente, existen diferentes especies
bacterianas predominantes en cada uno de los tres inóculos fecales. Cada especie
bacteriana respondió de manera diferente ante los productos de digestión de dichas
fórmulas y por lo tanto el perfil de ácidos grasos fue diferente. Esta variabilidad ya ha
sido observada en diversos estudios similares al nuestro (Salazar et al., 2008,
Arboleya et al., 2012).
En el análisis de ácidos grasos solamente fueron detectados los ácidos grasos
de cadena corta mayoritarios (acético, propiónico y butírico) y ácido capróico como
ácido graso minoritario. La producción de ácido acético, propiónico y butírico es
característica de la fermentación de hidratos de carbono, sin embargo los ácidos
isobutírico e isovalérico provienen de la fermentación proteica (a partir de valina y
leucina respectivamente) (Midtvedt y Midtvedt, 1992). Según esta afirmación
nosotros deberíamos haber observado en el grupo expuesto a la fórmula infantil
suplementada mayores concentraciones o proporciones de los ácidos grasos
resultantes de la fermentación proteica.
A pesar de la alta variabilidad observada, se pudieron apreciar diferencias
significativas en todos los puntos de muestreo, para el ácido acético, propiónico, la
relación acético/propiónico y la suma total de ácidos grasos. Además el ácido
V. Resultados y Discusión
195
butírico también obtuvo diferencias significativas a las 12 horas de crecimiento
bacteriano.
En el punto de muestreo de las 6 h, las fórmulas infantiles y la leche materna
sin digerir presentaron valores significativamente más altos en las concentraciones
de ácido acético respecto a las mismas digeridas. Este hecho nos indica que la
actividad metabólica bacteriana fue mayor cuando el inóculo fecal fue expuesto a las
muestras sin digerir. Los grupos leche materna digerida y sin digerir, mostraron
valores más bajos que los de las fórmulas infantiles, comparando siembre las
digeridas por un lado y sin digerir por otro. En los siguientes muestreos la tendencia
es similar para este ácido graso, las fórmulas infantiles siguen obteniendo valores
similares entre ellas pero superiores a los de la leche materna, cuyos valores son
semejante digerida o no. Por lo tanto las diferencias estadísticas prestadas por el
ácido acético se deben por un lado a la digestión de las fórmulas y por otro a la
menor cantidad observada en los grupos expuestos a la leche materna sometida o
no a digestión.
En relación al ácido propiónico se obtuvieron diferencias significativas para
todos los puntos de muestreo incluido el comienzo del ensayo. Hasta las 24 h estas
diferencias se debieron la concentración tan alta en los grupos que fueron expuestos
a la leche materna sometida o no a digestión. Sin embargo, a partir de este muestreo
la fórmula suplementada digerida presentó una concentración similar a los grupos de
leche materna. Se ha descrito en varios estudios que el ácido propiónico afecta de
una manera positiva al metabolismo de los lípidos, aunque también se han
observado cantidades inferiores en las heces de lactantes alimentados de forma
natural respecto de los alimentados con fórmulas infantiles, debido a que estos
lactantes lo utilizan más eficentemente que los alimentados artificialmente e y por
esa razón la concentración de estos ácidos grasos es menor en sus heces (Edwards y
Parret, 2002). La relación acético/propiónico siguió una tendencia semejante, de
forma que a partir de las 12‐24 horas la fórmula suplementada digerida obtuvo
valores similares a los de la leche materna digerida e inferiores a los de la fórmula
control digerida.
V. Resultados y Discusión
196
El ácido butírico presentó concentraciones similares en los diferentes grupos
de estudio excepto en el muestreo de las 12 h, en el que la fórmula suplementada
(sometida o no a digestión) mostró un aumento significativo respecto a los otros
grupos de estudio. Aún así no debemos tener en cuenta esta diferencia ya que ese
aumento también se observó a las 0 h del estudio, por lo que este grupo partía de
concentraciones ya elevadas de ácido butírico. Se ha postulado, que el ácido butírico
es la principal fuente energética para los colonocitos (Edwards y Parret, 2002) pero
también hay autores que afirman que este ácido orgánico, producido por especies
bacterianas pertenecientes a los de clostridios o bacteroides, es perjudicial por
participar en la patogenia de la enterocolitis necrotizante (Waligora‐Dupriet, et al.,
2009)
Se ha descrito que individuos que padecen la enfermedad de Crohn, poseen
una reducción cuantitativa y cualitativa del grupo Firmicutes, especialmente en el
grupo de Clostridium leptum. Este grupo incluye diversas bacterias productoras de
butírico como puede ser Faecalibacterium prausnitzii (Sua et al., 1999)
De forma general la suma total de ácidos grasos de cadena corta fue superior
en el ensayo realizado con en las fórmulas infantiles sin digerir en relación a la leche
materna. Este hecho se ha descrito en numerosas ocasiones en heces de lactantes
alimentados con fórmulas respecto de los alimentados con leche materna (Vasallo,
2010).
Según los resultados obtenidos podemos afirmar que el perfil de ácidos
grasos de cadena corta evolucionó de forma similar en los inóculos fecales expuestos
a la fórmula suplementada y a la leche materna.
Tabla 27: Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana).
Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC
0h
FC 19,02±3,49 (18,78) 0,18±0,04 (0,17)* 0,21±0,01 (0,21)* 108,38±10,85 (107,06)* 19,78±3,53 (19,54)FC dig 19,02±1,88 (15,95) 0,12±0,00 (0,12)* 0,43±0,02 (0,43)* 127,85±8,52 (127,84)* 17,21±1,91 (17,20)FS 15,95±2,67 (18,78) 0,17±0,01 (0,17)* 0,22±0,04 (0,22)* 109,39±7,41 (109,15)* 19,71±2,75 (19,57)
Fs dig 18,91±4,26 (18,06) 0,14±0,02 (0,14)* 1,79±0,14 (1,78)* 126,43±11,46 (127,07)* 21,27±4,39 (20,94)LM 16,23±1,92 (16,22) 0,16±0,01 (0,16)* 0,32±0,01 (0,32)* 99,49±6,63 (99,49)* 17,21±1,95 (17,20)
LM dig 18,95±2,23 (18,95) 0,15±0,00 (0,15)* 0,48±0,02 (0,48)* 129,57±10,96 (129,57)* 20,10±2,28 (20,09)
6h
FC 34,57±1,80 (34,80)* 0,87±0,20 (0,84) 0,55±0,09 (0,54) 41,54±10,52 (42,28)* 36,16±1,77 (36,23)*FC dig 24,77±1,65 (25,53)* 0,73±0,04 (0,0,72) 0,33±0,12 (0,31) 33,83±1,87 (33,62)* 26,28±1,50 (26,91)*FS 36,62±0,16 (36,64)* 0,83±0,14 (0,13) 0,79±0,41 (0,81) 44,96±7,50 (43,98)* 38,50±0,25 (38,52)*
Fs dig 27,42±3,06 (26,51)* 0,60±0,22 (0,57) 1,1±0,89 (1,10) 48,87±12,59 (49,15)* 29,7±2,18 (28,74)*LM 31,24±5,35 (31,39) * 0,98±0,17 (0,95) 0,33±0,02 (0,33) 33,28±10,88 (33,79)* 32,90±5,25 ( 33,06)*
LM dig 22,86±1,23 (22,38)* 0,93±0,21 (0,87) 0,41±0,09 (0,42) 25,38±4,73 (27,16)* 24,59±1,13 (24,16)*
12h
FC 62,98±7,10 (62,80)* 1,01±0,08 (1,02)* 0,68±0,12 (0,69)* 63,03±10,79 (59,15)* 64,93±7,07 (64,84)*FC dig 27,00±0,86 (27,11)* 0,83±0,20 (0,81)* 0,39±0,16 (0,39)* 34,16±9,10 (34,67)* 28,64±1,04 (28,78)*FS 64,69±9,37 (63,05)* 1,13±0,22 (1,14)* 1,00±0,40 (0,98)* 58,05±4,74 (58,38)* 67,11±9,33 (65,44)*
Fs dig 31,55±4,83 (30,54)* 1,43±0,51 (1,42)* 1,14±0,89 (1,08)* 25,08±11,41 (25,09)* 34,65±5,63 (33,58)*LM 31,02±9,48 (29,58)* 1,34±0,07 (1,35)* 0,35±0,04 (0,36)* 23,51±8,40 (22,18)* 33,02±9,28 (31,60)*
LM dig 27,04±5,20 (24,66)* 1,97±0,43 (1,83)* 0,49±0,10 (0,52)* 13,80±1,19 (13,23)* 29,87±5,56 (27,18)*
24h
FC 92,22±13,36 (89,68)* 1,18±0,08 (1,19)* 0,65±0,17 (0,65) 78,44±11,30 (77,65)* 94,39±13,42 (91,78)*FC dig 45,46±9,74 (46,19)* 1,90±0,68 (1,93)* 0,45±0,08 (0,45) 28,00±15,41 (26,38)* 48,22±9,34 (49,06)*FS 88,82±11,31 (87,59)* 1,18±0,29 (1,15)* 0,83±0,57 (0,95) 77,24±9,80 (76,09)* 91,32±11,44 (90,19)*
Fs dig 53,30±17,72 (53,30)* 3,24±1,57 (3,18)* 1,08±0,70 (1,56)) 22,38±16,31 (22,41)* 57,90±16,95 (58,63)*LM 44,09±12,10 (42,36)* 3,53±1,45 (4,01)* 0,76±0,45 (0,77) 17,13±15,85 (9,61)* 48,78±10,71 (47,94)*
LM dig 56,78±2,45 (56,18)* 3,12±1,54 (3,18)* 0,38±0,04 (0,38) 22,63±12,00 (21,85)* 60,76±1,14 (60,42)*
V. Resultados y Discusión
197
198
Tabla 27. (continuación) Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana).
Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC
36h
FC 84,72±7,44 (85,55)* 0,89±0,30 (0,88)* 0,67±0,08 (0,68) 102,44±27,82 (101,77)* 86,55±7,82 (87,34)*
FC dig 44,56±16,69 (44,64)* 2,28±1,46 (2,15)* 0,35±0,15 (0,36) 33,21±28,47 (33,54)* 47,59±15,59 (47,64)*
FS 87,96±8,67 (86,74)* 1,08±0,29 (1,07)* 1,01±0,35 (1,03) 84,34±15,60 (82,66)* 90,33±8,75 (89,15)*
Fs dig 56,34±21,45 (57,64)* 4,79±2,79 (4,87)* 1,13±0,89 (1,12) 18,54±15,57 (17,08)* 62,81±20,01 (64,06)*
LM 61,34±10,27 (59,81)* 2,23±0,60 (2,30)* 0,75±0,55 (0,75) 30,26±13,44 (27,62)* 64,64±9,09 (63,15)*
LM dig 53,66±6,72 (53,90)* 4,66±0,56 (4,58)* 0,43±0,13 (0,43) 11,77±2,84 (11,86)* 59,16±6,47 (59,44)*
48h
FC 98,13±9,61 (96,68)* 1,20±0,32 (1,12)* 0,63±0,10 (0,67) 84,85±19,30 (82,01)* 100,26±9,94 (98,50)*
FC dig 48,37±17,28 (49,06)* 2,87±0,99 (2,60)* 0,35±0,13 (0,36) 19,72±12,05 (20,21)* 52,01±16,74 (52,97)*
FS 95,80±3,33 (96,13)* 1,25±0,14 (1,23)* 0,99±0,48 (1,00) 77,23±10,09 (79,51)* 98,30±3,46 (98,43)*
Fs dig 58,31±20,83 (60,40)* 6,69±4,37 (6,42)* 1,10±0,79 (1,13) 14,96±12,82 (15,06)* 66,58±17,73 (68,97)*
LM 68,31±17,04 (66,20)* 2,28±0,29 (2,34)* 0,91±0,62 (091) 30,95±11,16 (30,80)* 71,83±16,04 (69,66)*
LM dig 56,76±1,64 (56,26)* 5,27±0,15 (5,29)* 0,46±0,09 (0,47) 10,78±0,51 (10,55)* 63,15±1,10 (63,14)*
72h
FC 102,42±13,25 (101,58)* 1,07±0,14 (1,07)* 0,56±0,07 (0,55) 96,12±9,33 (95,45)* 104,29±13,36 (103,44)*
FC dig 50,28±15 (50,56)* 2,01±0,16 (2,08)* 0,35±0,12 (0,36) 24,84±6,28 (25,73)* 53,06±15,44 (53,25)*
FS 99,72±5,92 (99,57)* 1,14±0,09 (1,12)* 0,82±0,29 (0,80) 87,32±2,97 (88,51)* 101,95±6,18 (101,76)*
Fs dig 58,58±20,29 (59,48)* 5,66±3,16 (5,59)* 1,09±0,80 (1,10) 15,47±12,22 (15,54)* 65,82±18,24 (66,79)*
LM 73,85±23,10 (73,52)* 2,31±0,25 (2,30)* 0,91±0,61 (0,91) 33,15±13,70 (32,97)* 77,43±22,13 (77,11)*
LM dig 60,81±7,12 (58,79)* 5,48±0,22 (5,45)* 0,47±0,07 (0,47) 11,07±0,84 (10,77)* 67,40±6,89 (65,34)*
V. Resultados y Discusión
198
V. Resultados y Discusión
199
En la Figura 51 se muestran los resultados de la variación de pH. No
obtuvimos diferencias significativas en ningún punto de muestreo, y sin embargo,
podemos diferencias tres tendencias, una en la que la variación de pH se encuentra
entre 1,5 y 2,5 unidades y corresponde a las fórmulas infantiles sin digerir, otra en la
que dicha variación es menor, 1‐1,5 unidades y la presentan las fórmulas infantiles
digeridas y la Leche materna sin digerir y por último la que mostró la leche materna
digerida que varió su pH sólo en 0,5‐1 unidades.
Figura 51. Variación de pH en cada punto de muestreo durante la evolución del inoculo fecal expuesto a las fórmulas infantiles y a la leche materna.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6h 12h 24h 36h 48h 72h
Variación de
pH
FC FC dig FS FS dig LM LM dig
V. Resultados y Discusión
200
3. ESTUDIO III: Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados
con leche materna, procedentes de dos regiones españolas.
Los individuos de las dos regiones estudiadas, (Asturias y Murcia) cumplieron
los mismos criterios de inclusión no presentando diferencias iniciales en parámetros
como el peso al nacer o la edad gestacional. En la Figura 52, se muestra la evolución
de los grupos microbianos estudiados en los dos grupos de estudio, lactantes de
Asturias y lactantes de Murcia, alimentados con leche materna. Los resultados en
esta gráfica se expresan como media y desviación estándar, aunque el análisis
estadístico se realizó sobre la mediana de los datos aplicando test no paramétricos ya
que las variables no siguieron una distribución normal.
A pesar de la alta variabilidad interindividual encontrada, pudimos observar
algunas diferencias estadísticas (p<0,05) debidas a la región de nacimiento de los
lactantes. En este sentido, el grupo Bacteroides mostró concentraciones más altas
(p<0,05), en el primer punto de muestreo (8‐10 días) en los lactantes nácidos en
Murcia respecto a los nácidos en Asturias (8,30 ± 1,90 vs. 6,90 ± 1,86 Log nº cels/g). A
esta edad, los lactantes de Murcia también presentaron concentraciones
significativamente superiores a los de Asturias en el análisis de bacterias
pertenecientes al género Staphylococcus (6,64 ± 1,08 vs 5,62 ± 1,01 Log nº cels/g).
Del mismo modo, se observaron diferencias significativas en el último punto de
muestreo (90 días de edad) para la familia Enterobacteriaceae, apareciendo los
mayores recuentos, para este grupo microbiano, en los lactantes nácidos en Asturias
frente a los nácidos en Murcia (9,90 ± 0,65 vs 9,17 ± 0,84 Log nº cels/g).
La evolución de los grupos Enterococcaceae, Lactobacillus, Bifidobacterium,
Atopobium, Clostridia IV y Clostrida XVa fue similar en los dos grupos de estudio, no
presentando diferencias significativas entre ellos. Sin embargo, se pudo observar,
que en los últimos muestreos, algunos de estos grupos como Atopobium y C. leptum
se van diferenciando dependiendo de la región de nacimiento observándose mayores
concentraciones en los lactantes procedentes de Asturias para el primer grupo y en
los de Murcia para el segundo grupo. Estos resultados podrían indicar a que,
V. Resultados y Discusión
201
posiblemente, si se hubiera realizado un muestreo adicional hacia a los 4 meses de
vida, se podrían haber encontrado diferencias estadísticamente significativas en
estos grupos bacterianos.
Se realizó el test exacto de Fisher sobre los resultados obtenidos para
comparar los porcentajes de muestras positivas en los dos grupos de individuos. Tras
el análisis se observaron diferencias significativas (p<0,05) en el grupo C. leptum para
los tres puntos de muestreo (a los 8, 30 y 90 días de vida). Aunque las
concentraciones de este microorganismo fueron incrementándose con el tiempo en
los lactantes nácidos en Murcia, su frecuencia fue menor que en los lactantes nácidos
en Asturias (25 vs. 64% a los 8 días de edad, 55 vs 77% a los 30 días de edad y 65 vs
92% a los 90 días de edad). Para los demás grupos microbianos no se encontraron
diferencias estadísticas entre los porcentajes de muestras positivas.
Al analizar la correlación entre las poblaciones microbianas de los dos grupos
de estudio observamos correlaciones negativas significativas (p<0,05) entre la
concentración de Bacteroides y Enterococcaceae para los dos grupos de lactantes (R=
‐0,208 y ‐0,268 para lactantes de Asturias y Murcia, respectivamente). Sin embargo,
el grupo microbiano Bacteroides, se correlacionó positivamente y significativamente,
con las concentraciones de Bifidobacterias en los lactantes de Asturias y Murcia (R=
0,319 y 0,409, respectivamente). También encontramos correlaciones positivas
(p<0,05) en los dos grupos de estudio para los siguientes grupos microbianos:
Enteroccaceae y Enterobacteriaceae (Asturias; R= 0,473 y Murcia; R= 0,276), entre C.
leptum y C. coccoides (Asturias: 0,234 y Murcia: 0,360); Bifidobacterium y
Lactobacillus (Asturias; R= 0,368 y Murcia; R= 0,258); Bifidobacterium y Atopobium
(Asturias; R= 0,412 y Murcia R= 0,213). Por otro lado, se observó una correlación
positiva (p<0,05) dentro del grupo de lactantes de Murcia entre el grupo Atopobium y
C. coccoides (R= 0,467 y p<0,05) y en el grupo de Asturias entre Bacteroides y
Atopobium (R= 0,662 y p<0,05)
Figura 52: Evolución de las diferentes poblaciones bacterianas estudiadas en los dos grupos de lactantes procedentes de dos regiones geográficas diferentes ( Asturias, Murcia). *Indica diferencias estadísticas (U test, p<0,05)
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº cels/g
Días de vida
Enterococcaceae
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº cels/g
Días de vida
Bifidobacterium*
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nºcels/g
Días de vida
Enterobacteriaceae
*
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº
cels/g
Días de vida
Bacteroides
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº cels/g
Días de vida
Clostridium coccoides
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº
cels/g
Días de vida
Clostridium leptum
*
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº
cels/g
Días de vida
Staphylococcus
34567891011
0 20 40 60 80 100
Log nº
cels/g
Días de vida
Lactobacillus
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 20 40 60 80 100
Log nº
cels/g
Días de vida
Atopobium group
V. Resultados y Discusión
202
V. Resultados y Discusión
203
En la Figura 53 se presentan los resultados de las diferentes poblaciones
microbianas, observadossin tener en cuenta la edad de los lactantes. Tal y como se
aprecia, se detectaron concentraciones significativamente mayores en las heces de los
lactantes nácidos en Murcia respecto a las de los nácidos en Asturias para los grupos
microbianos Bacteroides (8,26 ± 2,17 vs 7,17 ± 1,94 Log nº cels/g) y Staphylococcus
(6,13 ± 1,21 vs 5,48 ± 1,41 Log nº cels/g).
Aunque sin diferencias estadísticas, debemos destacar que las concentraciones
de Clostridium leptum fueron ligeramente superiores en las heces de los lactantes de
Murcia respecto a las de los de Asturias (p=0,06) mientras que los niveles de
Lactobacillus fueron inferiores en los lactantes nácidos en Murcia (p=0,08). Este hecho
es interesante ya que todos los lactantes fueron alimentados con leche materna, de
este modo podemos considerar que existen otros factores, por determinar, que están
condicionando la composición de la microbiota intestinal. Estos factores deben estar
relacionados con el origen geográfico o con los hábitos alimentarios de la madre según
el del lugar de nacimiento.
Figura 53. Concentraciones de las diferentes poblaciones microbianas sin tener en cuenta la edad de los lactantes.
V. Resultados y Discusión
204
Diferencias en la microbiota intestinal por causas geográficas han sido
observadas en otros estudios, como en el llevado a cabo por Fallani et al., (2010), en el
que encontraron diferencias en la composición de la microbiota intestinal de lactantes,
alimentados exclusivamente con leche materna, de diferentes lugares europeos. Estos
autores, observaron altos niveles de Bacteroides en una de las localidades estudiadas
que se situaba en el sur de España, respecto de todas las demás que se encontraban
en el norte de Europa. Este hecho fue observado también en nuestro estudio en los
lactantes de nácidos en Murcia (sur de España) frentes a los nacidos en Asturias (norte
de España), por lo que podemos afirmar que altas concentraciones de Bacteroides en
las heces de lactantes alimentados con leche materna puede ser una característica
determinada por la zona geográfica de nacimiento.
En nuestro ensayo, las diferencias estadísticas observadas se limitan a unas
determinadas poblaciones bacterianas, de modo que la composición microbiana de las
heces fue similar en los dos grupos analizados. Este hecho, era previsible debido a la
homogeneidad de los grupos de estudio. Ésto también se confirma con el análisis de
correlaciones en el que se observó que prácticamente coinciden en los dos grupos de
lactantes. Los resultados nos indican entonces que, son pocas las diferencias
encontradas pero que éstas pueden ser debidas al origen geográfico. Los diferentes
hábitos dietéticos de las dos regiones estudiadas han sido mostrados en varios
estudios (Serra‐Majem et al., 2003; da Silva, 2010). Chocarro‐Egüaras (2003) según los
datos del Ministerio Español de Agricultura y Alimentación, relacionados con la comida
consumida en casa pueden ser la causa de las diferencias observadas en nuestro
estudio. En este sentido, Se han identificado, por dichos autores, tres regiones
diferentes, Islas Canarias, Sureste (en la que se encuentra Murcia) y Noroeste (en la
que se encuentra Asturias). La dieta murciana se caracteriza por el consumo de
vegetales frescos, olivas, ternera, arroz y cerveza mientras que la asturiana por
legumbres, ternera, cerdo, pescado, leche y vino.
La leche materna es considerada el alimento ideal para el lactante y como
consecuencia, la composición de la microbiota intestinal de estos individuos ha sido
considerada como microbiota saludable. Al encontrar diferencias entre dos cohortes
V. Resultados y Discusión
205
de individuos nácidos mediante parto vaginal, alimentados exclusivamente con leche
materna y que no han sido tratados con antibióticos nos debemos plantear ¿cuál es
entonces la composición saludable de la microbiota intestinal? No se puede afirmar
que uno de los dos grupos de estudio presentara una microbiota más saludable que el
otro. En este sentido, definimos microbiota saludable como la comunidad microbiana
intestinal que ayuda al hospedador a mantener un estado de salud bajo ciertas
condiciones ambientales. Así, la misma composición de microbiota intestinal puede
contribuir al estado de salud o a la enfermedad n función de las condiciones
ambientales (Ley, 2010).
V. Resultados y Discusión
206
4. Estudio IV: Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con
fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA.
En este estudio, se ha evaluado si los ingredientes añadidos a la fórmula infantil
(suero rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA), ejercen efecto alguno sobre la
microbiota intestinal ya que, son muchos los estudios que demuestran los beneficios
que aportan estos ingredientes sobre la salud del niño (sistema inmune, perfil
aminoacídico…) (Hawkes et al., 2006; Davis et al., 2008; Singhal et al., 2010; Trabulsi et
al., 2011). Sin embargo su influencia sobre la microbiota intestinal ha sido poco
investigada hasta el momento. Se realizó un análisis cuantitativo, mediante técnicas
moleculares, sobre la composición de la microbiota intestinal en las heces de los
lactantes. Las muestras fueron obtenidas en las 4 visitas realizadas a la consulta de
pediatría, previamente programadas en el estudio.
En la Tabla 28 se muestran los límites de detección, coeficientes de regresión
(R2) de las rectas de calibrado y las eficiencias de las PCR cuantitativas para cada grupo
microbiano analizado. Se observó una eficiencia mayor del 90% en todos los grupos
microbianos estudiados excepto para Clostridia XVa cuya eficiencia fue del 81,12 ±
1,13 %.
Tabla 28. Limites de detección, eficiencias y coeficientes de correlación de las PCR cuantitativas de cada grupo microbiano.
Limite detección
(cels /g) Eficiencia (%) R2
Atopobium 1∙103 96,67 ± 3,03 0,999
Bacteroides 1∙103 98,8 ± 2,95 0,999
Clostridia XVa 5∙103 81,12 ±1,13 0,990
Clostridia IV 6∙103 93,15±4,77 0,999
Enterobacteriaceae 1∙105 98,47±2,16 0,995
Enterococcaceae 2∙105 100,88 ± 2,23 0,993
Lactobacillus spp. 1∙104 92,65 ± 1,82 0,999
Bifidobacterium spp. 1∙103 99,48 ± 1,68 0,997
Staphylococcus spp. 1∙104 93,92 ± 4,26 0,990
V. Resultados y Discusión
207
A las muestras analizadas que obtuvieron valores por debajo del límite de
detección, se les asignó como valor el límite de detección para poder, de este modo,
realizar el análisis estadístico. Los resultados cuantitativos obtenidos en el estudio de
la microbiota intestinal, para los cuatro muestreos realizados (2, 4, 7‐8 y 12 semanas
de vida) se presentan en las Figuras 51, 52, 53 y 54. Dichos resultados se expresan
como log cels/g de heces y se representan mediante diagramas de cajas.
Son varios los estudios que han investigado, in vitro, la acción antimicrobiana
de los péptidos obtenidos de la digestión de la proteína α‐lactoalbúmina (Brück,
Graverholt y Gibson 2002 y 2003b), mientras que, otros autores han observado un
efecto bifidogénico (Kee et al., 1998). Por esta razón, en nuestro estudio se hace
previsible encontrar una reducción en aquellas poblaciones microbianas
potencialmente patógenas y un aumento en las poblaciones beneficiosas por acción de
estos péptidos.
A las dos semanas de vida (Figura 54), las mayores concentraciones observadas
correspondieron a dos grupos microbianos anaerobios estrictos (Bacteroides y
Bifidobacterias) así como al grupo anaerobio facultativo Enterobacteriaceae. Este
hecho se corresponde con los datos descritos en la bibliografía ya que, en primer lugar,
el intestino del recién nácido es colonizado por los microorganismos anaerobios
facultativos que van consumiendo el oxígeno y que posteriormente son desplazados
por los anaerobios estrictos (Reinhardt et al., 2009).
En este primer punto de muestreo, se obtuvieron diferencias significativas
(p<0,05) en las concentraciones de Atopobium‐Colinsella y Clostridia IV entre los tres
grupos de estudio (LM, FC y FS). Dichas concentraciones en las heces de los lactantes
alimentados con leche materna: (4,39 (4,36‐4,41) y 4,63 (4,47‐5,09) log nº cels/g heces
respectivamente) en los alimentados con fórmula suplementada (4,43 (4.41‐4.51) y
4,43 (4,41‐4,51) log nº cels/g heces respectivamente), fueron similares. Mientras que
los lactantes alimentados con la fórmula control presentaron valores superiores. (6,13
(4.42‐7.97 7,49 (4,61‐8,43) log nº cels/g heces, respectivamente). Atopobium‐
Collinsella y Clostridia IV son dos grupos microbianos que comprenden especies
V. Resultados y Discusión
208
potencialmente patógenas (Waaij, 1999), y que por lo tanto, es deseable mantener en
concentraciones relativamente bajas. En este sentido, se ha comprobado que la
microbiota de los lactantes alimentados con leche materna, grupo que va a ser nuestra
referencia, mantiene un número más bajo de estos microorganismos (Bezirtzoglou,
Tsioysias y Welling, 2011). Una reducción en el grupo Clostridia no sólo confiere
beneficios para el hospedador por su potencial patógeno, sino que también,
concentraciones elevadas de estos microorganismos se asocian con la aparición de
enfermedad atópica (Kirjavainen, Salminen y Isolauri, 2003)
El grupo Bacteroides no presentó diferencias significativas (p<0,05) entre los
tres grupos de estudio, posiblemente por la alta variabilidad interindividual encontrada
en este grupo microbiano. Sin embargo, pudimos observar que las heces de los
lactantes alimentados con la fórmula objeto de estudio (FS), presentaron
concentraciones menores, de este grupo microbiano, que los de los otros dos grupos
(LM: 9,19 (7,06‐9,95), FC: 9,94 (9,16‐10,30) y FS: 6,30 (5,85‐10,04) log nº cels/g). En
base a estos resultados, la fórmula control se parece más a la leche materna, este
hecho podríamos considerarlo como un resultado positivo ya que el grupo del que
hablamos se clasifica como potencialmente patógeno (Waaij, 1999), y suele presentar
niveles más altos en lactantes alimentados con fórmula respecto de los alimentados
con leche materna. En el estudio comparativo de la microbiota fecal de lactantes
alimentados con leche materna de dos regiones diferentes de España observamos
como característica de los niños de Murcia que presentaban un elevado número de
Bacteroides siendo las concentraciones observadas parecidas a las presentadas por los
lactantes alimentados con una fórmula estándar (Peso‐Echarri et al., 2011).
Respecto al grupo microbiano Clostridia XVa, debemos destacar que los
lactantes pertenecientes al grupo LM y al grupo FS mostraron menor variabilidad que
los pertenecientes al grupo FC aunque las medianas obtenidas en los tres grupos
fueron similares.
En los niños alimentados con la fórmula suplementada, encontramos niveles
menores de los grupos Atopobium, Bacteroides y Clostridium. En este sentido, se hace
V. Resultados y Discusión
209
necesario destacar que en el caso de niños celíacos se han observado niveles altos de
Clostridium y Bacteroides, que se correspondieron con sobreproducción de citoquinas
inflamatorias que condujo a la alteración de la integridad de la barrera intestinal
(Collado et al., 2007). Por lo tanto, el bajo número encontrado de estos
microorganismos, podría sugerir que la fórmula suplementada puede inducir a una
menor incidencia en la aparición de procesos inflamatorios intestinales.
Los niveles de Enterobacterias y Enterococos fueron significativamente
superiores en las heces de los lactantes alimentados con fórmulas infantiles, respecto
de los de lactantes alimentados de forma natural. En este sentido, en base a la
composición de la fórmula suplementada, habrían sido previsibles unos niveles
inferiores de estos grupos en los lactantes alimentados con la misma ya que, son varios
los estudios que han observado cierta actividad antimicrobiana para la proteína
adicionada (Pihlanto‐Leppälä et al., 2000; van Hooijdonk, Kussendrager y Steijns, 2000;
Brück et al., 2003ab). Como se ha descrito, anteriormente, estos lactantes poseen
microbiota más diversa que los alimentados con leche materna. Por ejemplo, se han
observado concentraciones mayores de los grupos Bacteroides, Clostridium y
Enterobacterias en lactantes alimentados con fórmulas estándar respecto de los
alimentados con leche materna (Adlerberrth y Wold, 2009). Bezirtzoglou, Tsiotsias y
Wellin (2011) describen, en otro estudio más reciente, en el que compararon la
microbiota intestinal de lactantes alimentados con leche materna y fórmula infantil,
que, las concentraciones de los grupos Atopobium y Bacteroides se vieron
incrementadas en las heces de los niños alimentados artificialmente
Por otro lado los grupos Bifidobacterium spp y Lactobacillus spp mostraron
concentraciones similares para los tres grupos de estudio. Es ampliamente reconocido
que la principal diferencia entre la microbiota intestinal de lactantes alimentados con
fórmulas infantiles y leche materna son los recuentos superiores de bifidobacterias y
bactobacilos, observados en los niños alimentados de forma natural. Sin embargo, el
avance en el desarrollo de las fórmulas infantiles aproximándose, cada vez más a la
leche materna, ha hecho que el perfil de estas bacterias en los dos grupos de lactantes
difiera cada vez menos (Alderberth y Wold, 2009).
V. Resultados y Discusión
210
En la Tabla 29, se puede observar el porcentaje de muestras positivas en cada
grupo de estudio (LM, FC y FS) para los distintos grupos microbianos analizados. Para
los tres tratamientos, encontramos un 100% de muestras positivas en los grupos,
Bacteroides, Enterobacterias, Lactobacilos y Bifidobacterias.
Los valores de frecuencia de muestras positivas, no reflejaron los resultados
obtenidos en la cuantificación de los grupos microbianos. El grupo de lactantes
alimentados con fórmula suplementada, presentó un porcentaje de muestras positivas
para el grupo microbiano Atopobium similar al de los lactantes alimentados con leche
materna y, significativamente inferior a los alimentados con la fórmula control; lo
mismo ocurrió con el grupo Clostridia IV, aunque sin diferencias significativas
(p=0,099). Por otro lado, también obtuvimos diferencias significativas en los
porcentajes de muestras positivas para el género Staphylococcus spp y el grupo
Enterococcaceae. En este caso, las heces de los lactantes alimentados con fórmulas
obtuvieron valores similares entre sí, y diferentes a los alimentados con leche materna.
Los niños alimentados de forma natural obtuvieron menores porcentajes de muestras
positivas para el grupo Enterococcaceae.
Tabla 29. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el primer muestreo que corresponde con la edad de dos semanas.
Leche
materna Fórmula control
Fórmula suplementada
p
ATOPOBIUM (6/33) 18,20% (8/13) 61,50% (3/15) 20% 0,016
BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
CLOSTRIDIA XIVa (13/33) 39,40% (6/13) 46,20% (8/15) 53,30% 0,697
CLOSTRIDIA IV (20/33) 60,60% (12/13) 92,30% (9/15) 60% 0,099
ENTEROBACTERIACEAE (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
ENTEROCOCCACEAE (26/33) 78,80% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,045
LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
BIFIDOBACTERIUM (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
STAPHYLOCOCCUS (32/33) 97% (10/13) 76,90% (9/15) 60% 0,002
p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas)
En este primer muestreo encontramos mayor porcentaje de muestras positivas
para el género Staphylococcus en los lactantes alimentados con leche materna. En este
sentido, se ha descrito en la bibliografía que las heces de los lactantes alimentados con
V. Resultados y Discusión
211
leche materna presentan mayor número de bacterias pertenecientes al género
Staphylococcus que los alimentados con fórmulas infantiles (Jiménez et al., 2008).
Dentro de este genero, sin embargo, la especie predominante es Staphylococcus
epidermidis (coagulasa negativa) y posiblemente su aparición en la leche y en las heces
de los lactantes sea debido al contacto con la piel de madre (Martín et al., 2012).
Los resultados del segundo muestreo, en el cual los niños contaban
aproximadamente con 4 semanas de vida, se pueden observar en la Figura 55. En este
muestreo, los grupos microbianos dominantes en los tres grupos de estudio fueron
Bacteroides, Bifidobacterium y Enterobacteriaceae, aunque debemos tener en cuenta
que, en general, las concentraciones de las otras poblaciones microbianas analizadas
fueron mayores en las heces de los lactantes alimentados con fórmulas infantiles
frentes a los alimentados con lehe materna.
Del mismo modo, como sucedió en el primer muestreo, se encontraron
concentraciones significativamente mayores (p<0,05) para Enterobacteriaceae y
Enterococcaceae en los grupos de lactantes alimentados con fórmulas infantiles (FC:
9,35 (9,05‐10,00) y 7,87 (7,31‐8,31), FS: 981 (9,29‐10,47) y 8,02 (7,64‐8,25) log nº
cels/g, respectivamente) respecto de los alimentados con leche materna (9,02 (8,64‐
9,75) y 6,66 (6,24‐7,60) log nº cels/g, respectivamente). Aunque, se debe destacar que
los niños alimentados con la fórmula suplementada mostró en los dos casos valores
ligeramente inferiores a los presentados por el grupo alimentado con la formula
control.
Es probable que el hecho de no encontrar diferencias significativas en los
grupos Atopobium y Clostridia XIVa haya sido debido a la alta variabilidad obtenida. Sin
embargo, se repite el patrón anterior, de modo que los valores de estos
microorganismos en el grupo de leche materna fueron similares a los presentados por
el grupo de fórmula suplementada, aunque difiriendo de los obtenidos en el grupo de
niños alimentado con la fórmula control.
V. Resultados y Discusión
212
En la Tabla 30 se presentan los resultados de los porcentajes de muestras
positivas en el segundo muestreo. Estos resultados no se correspondieron con los
cuantitativos ya que, para las frecuencias de dichas muestras, no se encontró ninguna
diferencia estadística. El género Staphylococcus spp mostró una significación de 0,06
con un porcentaje de muestras mayor en el grupo alimentado con leche materna que
en los otros dos grupos de estudio.
Tabla 30. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el segundo muestreo que corresponde con la edad de cuatro semanas.
Leche
materna Fórmula control
Fórmula suplementada
p
ATOPOBIUM (15/33) 45,5% (9/13) 69,2% (10/15) 66,7% 0,243
BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
CLOSTRIDIA XIVa (19/33) 57,6% (9/13) 69,2% (10/15) 66,7% 0,777
CLOSTRIDIA IV (22/33) 66,3% (10/13) 76,9% (10/15) 66,7% 0,869
ENTEROBACTERIACEAE (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
ENTEROCOCCACEAE (28/33) 84,8% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,150
LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
BIFIDOBACTERIUM (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
STAPHYLOCOCCUS (25/33) 75,8% (8/13) 61,5% (4/15) 26,7% 0,06
p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas).
Entre las 7 y 8 semanas de edad de los lactantes, se realizó el tercer muestreo
de sus heces y se analizó la composición de la microbiota intestinal, cuyos resultados
se presentan en la Figura 56. De nuevo encontramos diferencias estadísticamente
significativas en el grupo Atopobium, sin embargo, las concentraciones de este
microorganismo en las heces de los lactantes alimentados con las dos fórmulas
infantiles fueron similares (FC: 6,94 (6,38‐8,10), FS: 6,74 (6,29‐7,16) log nº cels/g) y
superiores a los observados en las heces de los lactantes alimentados con leche
materna (LM: 4,40 (4,38‐6,70) log nº cels/g).
El efecto positivo de la fórmula suplementada sobre el grupo microbiano
Clostridia IV se mantuvo en valores semejantes que en los anteriores muestreos,
observándose concentraciones similares a las obtenidas por los lactantes
alimentados de forma natural. Las diferencias estadísticas (p<0,05) encontradas
para este grupo microbiano mostraron que, las heces de los lactantes alimentados
V. Resultados y Discusión
213
con la fórmula control presentaron valores superiores respecto de los otros dos
grupos (LM: 4,47 (4,46‐7,13), FC: 7,67 (4,60‐8,92), FS: 4,81 (4,51‐8,20) Log nº
cels/g). Según estos resultados se puede afirmar que el perfil de Clostridia IV en
heces de lactantes alimentados con fórmula suplementada es similar al de
aquellos alimentados con leche materna.
Debemos destacar las diferencias estadísticas encontradas en los grupos
microbianos Enterobacteriaceae y Enterococcaceae. En éstos, ya que los niveles
observados fueron superiores en las heces de neonatos pertenecientes a los grupos
alimentados con fórmulas infantiles respecto a los alimentados con leche materna.
Estos resultados se corresponden con los obtenidos al analizar la microbiota mediante
técnicas dependientes de cultivo. No observándose, en este caso, que la fórmula
suplementada ejerciera el efecto deseado ya que estos dos grupos se consideran
potencialmente patógenos (Waaij, 1999). En este sentido, en un estudio similar
realizado por Rochat et al., (2007) observaron que la fórmula infantil enriquecida con
suero lácteo (70% de la fuente de proteínas) mostró resultados superiores de estos dos
grupos microbianos en relación a la leche materna, aunque sin diferencias
significativas. Por otro lado un estudio in vitro llevado a cabo por Sauer et al., (2010)
observó un incremento en el crecimiento de ciertas cepas de E. coli al añadir
determinadas concentraciones de nucleótidos. Sin embargo, el crecimiento de
Enterococcus faecalis y Enterococus faecium no se vió estimulado tras la adición de
estos ingredientes. Mateo, Dave y Stein (2004) también obtuvieron una estimulación
del crecimiento de coliformes asociado con un descenso en los niveles de clostridios, al
suplementar con nucleótidos en un estudio in vivo realizado con lechones.
La presencia de diferencias tan marcadas en los niveles de enterococos entre
los grupos alimentados con leche materna y fórmulas infantiles, también fueron
descritas por otros autores como Euler et al., (2005) en fórmulas infantiles adicionadas
con prebióticos.
Los niveles de Lactobacilos, Estafilococos y Bifidobacterias en las heces de los
lactantes de 7‐8 semanas de edad, fueron similares en los tres grupos de estudio.
V. Resultados y Discusión
214
Respecto a las frecuencias de muestras positivas correspondiente a la edad de
7‐8 semanas sólo se observaron diferencias significativas en dos grupos microbianos
(Tabla 31): Atopobium y Staphylococcus spp que marcaron la diferencia entre la leche
materna y las fórmulas infantiles.
Tabla 31. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el tercer muestreo que corresponde con la edad de 7‐8 semanas.
Leche
materna Fórmula control
Fórmula suplementada
p
ATOPOBIUM (15/33) 45,5% (12/13) 92,3% (12/15) 80,0% 0,005
BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
CLOSTRIDIA XIVa (23/33) 69,7% (11/13) 84,6% (14/15) 93,3% 0,175
CLOSTRIDIA IV (15/33) 45,5% (10/13) 76,9% (8/15) 53,3% 0,173
ENTEROBACTERIACEAE (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
ENTEROCOCCACEAE (26/33) 81,3% (13/13) 100% (14/15) 93,3% 0,204
LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
BIFIDOBACTERIUM (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
STAPHYLOCOCCUS (22/33) 66,7% (5/13) 38,5% (4/15) 26,7% 0,027
p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas).
Los resultados cuantitativos del cuarto muestreo (12 semanas de vida para
los neonatos) se representan en la Figura 57. En ella se pueden observar diferencias
estadísticas en los grupos Atopobium, Clostridia XVa, Enteboacteriaceae y
Enterococcceae pero todas ellas debidas a la leche materna, ya que los niveles
bacterianos de las heces de los niños alimentados con ambas fórmulas infantiles
fueron similares entre sí. No obstante, debemos destacar que los lactantes
alimentados artificialmente presentaron mayores concentraciones de los siguientes
grupos microbianos: Atopobium, Clostridium y Enterococcus, siendo menores para el
género Staphylococcus.
V. Resultados y Discusión
215
Tabla 32. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el cuarto muestreo que corresponde con la edad de 12 semanas.
Leche
materna Fórmula control
Fórmula suplementada
p
ATOPOBIUM (17/33) 51,5% (12/13) 92,3% (14/15) 93,3% 0,000
BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
CLOSTRIDIA XIVa (25/33) 75,8% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,035
CLOSTRIDIA IV (22/33) 66,7% (12/13) 92,3% (13/15) 92,9% 0,080
ENTEROBACTERIACEAE (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
ENTEROCOCCACEAE (32/33) 97,0% (13/13) 100% (15/15) 100% 1
LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
BIFIDOBACTERIUM (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐
STAPHYLOCOCCUS (20/33) 60,6% (7/13) 53,8% (3/15) 21,4% 0,029
p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas).
Por lo tanto, según los resultados obtenidos en el estudio, podemos afirmar
que existe efecto protector por parte de la fórmula suplementada manteniendo las
concentraciones de Atopobium y Clostridium leptum, similares a las de la leche
materna a las 2, 4 y 7‐8 semanas de vida, y que desaparece en este último muestreo,
en el cual los resultados cuantitativos se vieron reproducidos en los cualitativos,
encontrando diferencias significativas en los mismos grupos microbianos. Este hecho
puede ser debido a que la cantidad adicionada tanto de lactoalbúmina como de
nucleótidos, a la fórmula objeto de estudio (α‐lactoalbúmina: 2 g/L y nucleótidos: 32
mg/L) fue menor que en otras investigaciones realizadas al respecto por otros autores.
Por ejemplo, un estudio reciente sobre fórmulas infantiles enriquecidas con
lactoalbúmina adiciona 2,3 g /L (Trabulsi et al., 2011); y otro en el que enriquecen
fórmula infantil con nucleótidos, lo hacen con 72 mg/L (Yau et al., 2003).
En relación a las concentraciones de los dos grupos beneficiosos,
bifidobacterias y lacobacilos, (Waaij, 1999) presentadas por los lactantes alimentados
con ambas fórmulas infantiles (Fc y FS), se debe señalar que fueron superiores en el
primer muestreo y similares en el tercero, a las obtenidas por Salvini et al., (2011) en
las heces de lactantes alimentados con una formula suplementada con prebioticos
Figura 54. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 2 semanas de vida (primer muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).
ΨΨ Ψ
Ψ
V. Resultados y Discusión
216
Figura 55. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 4 semanas de vida (segundo muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).
ΨΨ Ψ
V. Resultados y Discusión
217
Figura 56. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 7‐8 semanas de vida (tercer muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).
ΨΨ Ψ
Ψ
V. Resultados y Discusión
218
Tabla 57. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 12 semanas de vida (cuarto muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).
Ψ
ΨΨ
ΨΨ
V. Resultados y Discusión
219
V. Resultados y Discusión
220
En un estudio llevado a cabo por Harmsen et al., (2000) en neonatos de 12
días de edad, no pudieron cuantificar debido a las concentraciones tan bajas para los
grupos microbianos Collinsella y Atopobium. No obstante, observaron un mayor
porcentaje de muestras positivas en los niños alimentados con fórmulas infantiles que
en los alimentados con leche materna. Además, analizaron muestras de individuos de
otras edades (niños, adultos y ancianos) que presentaron concentraciones de
aproximadamente 109 y 1010 cels/g de dichos grupos microbianos. Este hecho puede
hacernos afirmar que la abundancia de estos grupos microbianos se asocian con el tipo
de alimentación y la edad del niño.
En un ensayo in vitro llevado a cabo por Brück, Graverholt y Gibson (2002) se
observó que la proteína α‐lactoalbúmina produce un descenso en las concentraciones
de tres grupos microbianos clasificados como potencialmente patógenos (Bacteroides,
Clostridium y E. coli). Las técnicas utilizadas en dicho estudio fueron dependientes de
cultivo y aunque fueron diferentes a las nuestras, debemos tomar en consideración
que este trabajo mostró resultados similares en los grupos microbianos Bacteroides y
Clostridia ya que encontramos diferencias estadísticas en el grupo de Clostridia IV
durante los tres primeros muestreos con niveles inferiores en los grupos LM y FS
respecto de la FC. En relación al grupo Bacteroides, en el primer muestreo observamos
una concentración significativamente menor en los lactantes alimentados con fórmula
suplementada respecto a los otros dos grupos. Por otro lado, nosotros analizamos la
familia Enterobacteriaceae y las concentraciones fueron superiores, aunque no
siempre con diferencias significativas entre los grupos alimentados con fórmula infantil
y los alimentados con leche materna.
El grupo de investigación de Brück realizó dos ensayos in vivo con fórmulas
enriquecidas con α‐lactoalbúmina, en el primero (2003a), realizado en monos Rhesus,
observaron que la microbiota intestinal de los lactantes alimentados con la fórmula
suplementada era más parecida a la de los individuos alimentados con leche materna
que a la de los lactantes alimentados con fórmula estándar. En el segundo estudio
(2006a) realizado en niños, estos autores no obtuvieron conclusiones claras acerca del
papel de esta proteína sobre la población de Bifidobacterias, hecho que justifican por
V. Resultados y Discusión
221
partir de concentraciones muy altas de dichos microorganismos y por la alta
variabilidad individual encontrada. Aún así observaron también un descenso en las
poblaciones de Clostridios. Estos dos estudios utilizaron métodos moleculares
independientes de cultivo.
Son muy pocos los estudios que evalúan el efecto de los nucleótidos sobre la
microbiota intestinal, siendo además la mayoría de ellos in vitro. Es necesario señalar
también que algunos de estos estudios muestran resultados contradictorios (Gil et al.,
1986; Balmer, Hanvey y Wharton, 1994). Recientemente, se ha realizado un estudio in
vivo en el que se añadió a la fórmula infantil la misma cantidad de nucleótidos que la
empleada en este estudio (31 mg/L) y en el que se observó una menor proporción
Bacteroides/Bifidobacterium en las heces de los lactantes alimentados con la fórmula
suplementada respecto a los alimentados con la fórmula control (Singhal et al., 2008).
En el presente estudio, también se obtuvo en los lactantes alimentados con fórmula
suplementada, menor proporción de la relación Bacteroides/Bifidobacterium en el
primer muestreo, ya que los niveles de Bacteroides fueron menores en las heces de los
lactantes alimentados con la fórmula suplementada.
Con estos datos, podemos afirmar que el efecto protector encontrado durante
los tres primeros muestreos podría ser debido a la combinación de ambos ingredientes
empleados en la fórmula infantil suplementada aunque, cuando realizamos el estudio
in vitro, la proteína α‐lactoalbúmina fue la que proporcionó mejores resultados sobre
la microbiota fecal.
En la Tabla 33 se presentan los resultados obtenidos al realizar el análisis
estadístico sin tener en cuenta la edad de los lactantes. Todos los grupos microbianos
con excepción de Lactobacillus mostraron diferencias significativas (p<0,05) entre los
grupos de estudio. Sin embargo, una vez más, atribuimos éstas a la leche materna, ya
que las concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiadas eran
parecidas en las fórmulas infantiles ensayadasy diferentes, a su vez, a las obtenidas en
el grupo de lactantes alimentados con leche materna. Sólo debemos destacar que, en
el caso de los grupos microbianos Clostridia IV y Bacteroides, la fórmula suplementada
V. Resultados y Discusión
222
dio lugar a valores semejantes a los presentados por que recibieron leche materna y
diferentes a los que recibieron fórmula control.
Tabla 33. Resultados cuantitativos para cada grupo microbiano estudiado sin tener en cuenta la edad de los lactantes.
p: significación obtenida al realizar el test de Kruskal‐Wallisr (p<0,05 diferencias significativas).
Nuestro grupo de investigación llevó a cabo también el análisis de ácidos grasos
de cadena corta en las heces de los lactantes y aunque se encontró alta variabilidad
interindividual se pudo concluir que, en el último muestreo, la fórmula suplementada
produjo un perfil de ácidos grasos similar al obtenido en lactantes alimentados con
leche materna (Vasallo, 2011). Realizamos entonces un análisis de correlación de
Spearman entre los diferentes grupos microbianos y los ácidos grasos analizados y las
correlaciones significativas (p<0,005) más destacadas fueron las siguientes: una
relación positiva para el grupo Bacteroides y la producción de propiónico, e isovalérico
en las heces de los grupos alimentados con leche materna (r= 0,495 y r=0,507) y con
fórmula suplementada (r= 0,741 y r=0,578). Sin embargo, este mismo grupo
microbiano fue correlacionado negativamente con el ácido caproico en el grupo
alimentado de forma natural (r=‐0,075) y positivamente en el alimentado con la
fórmula suplementada (r=0,602). Hecho que era de esperar ya que el acido caproico es
resultado de la fermentación de proteica y esta fórmula contiene proteínas
adicionadas.
Leche
materna Fórmula control
Fórmula suplementada
mediana Q1‐Q3 mediana Q1‐Q3 mediana Q1‐Q3 p
ATOPOBIUM 4,40 4,38‐6,55 7,09 5,92‐7,92 6,63 4,43‐7,15 0,000
BACTEROIDES 9,78 6,66‐10,21 9,59 8,83‐10,10 9,14 6,01‐9,81 0,012
CLOSTRIDIA XVa 5,01 4,37‐7,03 6,84 4,45‐7,49 6,59 4,44‐7,55 0,004
CLOSTRIDIA IV 4,56 4,47‐7,14 8,10 4,87‐8,74 4,84 4,51‐8,15 0,000
ENTEROBACTERIACEAE 8,98 8,38‐9,43 9,54 8,93‐10,08 9,62 9,13‐10,19 0,000
ENTEROCOCCACEAE 6,75 6,28‐7,45 7,71 7,32‐8,20 8,02 7,45‐8,48 0,000
LACTOBACILLUS 7,18 5,80‐7,64 7,02 6,61‐7,21 6,81 6,54‐7,15 0,241
BIFIDOBACTERIUM 8,68 8,27‐9,00 8,50 7,94‐8,89 8,36 7,63‐8,69 0,003
STAPHYLOCOCCUS 5,80 4,71‐6,87 5,06 4,72‐6,43 4,73 4,71‐5,90 0,004
V. Resultados y Discusión
223
Para la fórmula suplementada sólo se encontró una correlación significativa,
entre el grupo Clostridia XVa y el ácido valérico.En general se debe destacar que las
correlaciones entre los grupos alimentados con leche materna y fórmula suplmentada
fueron similares y en parte diferentes a las obtenidas en el grupo alimentado con la
fórmula control.
VI. Conclusiones
225
VI. CONCLUSIONES
A partir de los resultados descritos en el presente trabajo se han obtenido las siguientes
conclusiones:
Estudio I
1.1. El preparado de nucleótidos, en la misma concentración que en la fórmula infantil,
mejoró el porcentaje de captación de calcio, aunque el efecto depende de la concentración
de mineral añadido. La adición de lactosuero rico en α‐lactoalbúmina, produjo un ligero
aumento en el porcentaje de captación de hierro independientemente de la dosis de mineral
añadida a la monocapa.
1.2. La disponibilidad del calcio y del cinc que contiene la leche materna es superior a la
de las fórmulas infantiles, aunque los ingredientes de la fórmula suplementada logran
mejorar el porcentaje y la eficiencia de captación de ambos minerales y el porcentaje de
transporte de calcio. Sin embargo, no producen modificaciones en la disponibilidad del
hierro.
Estudio II
2.1. La evaluación de cultivos puros de L. gasseri y B. longum expuestos a Los
concentrados proteicos (ricos en α‐lactoalbúmina y β‐lactoglobulina) muestra un estimulo
en el crecimiento del primer microorganismo, mientras que sólo el suero rico en α‐
lactoalbúmina incrementa los recuentos del segundo. Además, tras la digestión de ambos
sueros se produce un efecto inhibitorio sobre la cinética de E. coli. La adición del preparado
de nucleótidos a la concentración 72 mg/L presenta un ligero efecto bifidogenico.
2.2. Los ingredientes funcionales estudiados son capaces de modificar la microbiota
intestinal del inóculo fecal de manera beneficiosa. Los nucleótidos sometidos o no a
digestión dan lugar a las concentraciones más altas de Lactobacillus y a un aumento de la
producción de ácido propiónico a las 72h. Además, los dos sueros lácteos
VI. Conclusiones
226
independientemente de su tratamiento estimulan el crecimiento de Bifidobacterium y la
producción de ácido acético y butírico. Solamente el suero rico en β‐lactoglobulina produce
un aumento del grupo microbiano Atopobium al final del ensayo.
2.3. Tras la exposición de la leche materna al inóculo fecal se confirma un perfil
caracterizado por una mayor concentración de bacterias beneficiosas y un descenso en
grupos potencialmente patógenos (Clostridia IV) aunque tras su digestión se observan altos
recuentos de enterobacterias. Los recuentos de los grupos microbianos estudiados fueron
similares para las ambas fórmulas infantiles, aunque la fórmula suplementada da lugar a un
perfil de ácidos grasos semejante al obtenido en los grupos expuestos a la leche materna.
Estudio III
3.1. El estudio de la composición de la microbiota intestinal de dos poblaciones de
lactantes alimentados exclusivamente con leche materna y procedentes de dos regiones de
España diferentes (Asturias y Murcia) muestran diferencias en las concentraciones de
algunas poblaciones microbianas (Bacteroides, Staphylococcus, Clostridium leptum y
Enterobacteriaceae). Se puede afirmar que las poblaciones bacterianas intestinales se ven
influidas por el origen geográfico del hospedador, por lo que se define microbiota intestinal
saludable como aquella que ayuda a mantener un estado saludable bajo ciertas condiciones
medioambientales.
Estudio IV
4.1. Tras el ensayo clínico, se observa que La composición de la microbiota fecal de
lactantes alimentados con leche materna difiere de la de los lactantes alimentados con
fórmulas infantiles, obteniendo menores concentraciones de los grupos potencialmente
patógenos (Enterobacteriaceae, Enterococaceae, Clostridia IV, Clostridia XVa y Atopobium).
4.2. En contraste con los resultados obtenidos en los estudios in vitro, la adición de
ingredientes funcionales a la fórmula suplementada no produce un incremento en las
concentraciones de las bacterias beneficiosas durante los tres primeros meses de vida. Sin
VI. Conclusiones
227
embargo, produce una modificación en la composición de la microbiota intestinal de los
lactantes reduciendo algunos grupos microbianos con potencial patógeno (Clostria IV,
Atopobium y Bacteroides) respecto a los lactantes alimentados con la fórmula control.
Perspectivas futuras
Serían necesarios más ensayos para poder profundizar en los mecanismos a nivel celular por
los cuales se produce el efecto beneficioso de los ingredientes presentes en fórmula
suplementada, tanto en la disponibilidad mineral como en la microbiota intestinal así como
en las funciones fisiológicas en los lactantes.
VI. Conclusiones
228
VII. Resumen
229
VII. RESUMEN
La leche materna es el alimento ideal para el crecimiento y desarrollo de los
recién nácidos durante la primera etapa de su vida. Sin embargo, la alimentación con
leche materna no siempre es posible o deseable, por lo que se hace necesario
desarrollar fórmulas infantiles que sustituyan a la lactancia natural proporcionando un
crecimiento y desarrollo óptimos al lactante. α‐lactoalbúmina y nucleótidos son
compuestos presentes en la leche materna y que se encuentran en menor cantidad en
la leche vaca, por lo que actualmente son añadidos a las fórmulas infantiles
consiguiendo así un acercamiento a la composición de la leche materna. Se han
descrito números efectos beneficiosos relacionados con estos ingredientes, entre ellos
estimulación del sistema inmune, reparación y diferenciación del tracto
gastrointestinal. Sin embargo, todavía son escasos los estudios que evalúan su
influencia sobre la disponibilidad mineral o sobre la microbiota intestinal.
En la presente tesis doctoral se ha evaluado el efecto de estos dos ingredientes
funcionales (α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la disponibilidad mineral y sobre la
microbiota intestinal. Para ello, se ha modificado la composición de la fracción proteica
de una fórmula infantil aumentado su contenido en α‐lactoalbúmina, y añadiendo
nucleótidos y DHA.
El presente trabajo fue dividido en cuatro estudios, los dos primeros se
realizaron in vitro y los dos últimos in vivo. En el estudio I, se evaluó el efecto de los
ingredientes funcionales (α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la disponibilidad
mineral (calcio, hierro y cinc). Para ello, se llevaron a cabo dos ensayos, uno que se
realizó con los ingredientes puros y soluciones patrón de cada mineral y otro en el que
se evaluó una fórmula suplementada con los ingredientes funcionales comparándola
con una fórmula control y como referencia se utilizó la leche materna. Todos los
ensayos se realizaron con la línea celular Caco‐2 en un sistema bicameral que permite
medir el transporte mineral. La evaluación in vitro de la funcionalidad de los
ingredientes sobre la microbiota intestinal se determinó en el estudio II que también
VII. Resumen
230
se llevo a cabo en dos ensayos. El primero, se realizó sobre cultivos puros de tres
bacterias intestinales que fueron expuestas a dos concentrados proteicos, uno rico en
α‐lactoalbúmina y otro en β‐lactoglobulina y a dos concentraciones del preparado de
nucleótidos. Todos los ingredientes se evaluaron antes y después de una digestión in
vitro. En el segundo ensayo, se estudió la evolución de un inóculo fecal expuesto a los
mismos ingredientes que el ensayo anterior o a las fórmulas infantiles descritas para el
estudio de la disponibilidad mineral. Se analizaron diferentes grupos microbianos
mediante PCR a tiempo real y también los ácidos grasos de cadena corta. Por último,
en los estudios III y IV se investigó la influencia del lugar de nacimiento y la influencia
de los ingredientes añadidos a la fórmula suplementada sobre la composición de la
microbiota intestinal.
En los resultados obtenidos en el estudio I se observó un mayor porcentaje de
captación celular de una solución 10mM de calcio con la adición de nucleótidos. En
relación a los resultados de hierro, sólo se observaron diferencias estadísticamente
significativas en la retención celular con la adición de una concentración de 50 µM,
siendo los valores más altos para el grupo al que se le adicionó α‐lactoalbúmina. Se
pudo observar que aunque la disponibilidad de minerales de la leche humana es la más
alta, la adición de α‐lactoalbúmina y nucleótidos mejoró la disponibilidad de calcio y
cinc de las fórmulas infantiles evaluadas mediante la línea celular Caco‐2.
Respecto a los resultados del primer ensayo del estudio II, sobre la actividad
funcional de los ingredientes, los dos concentrados proteicos estimularon el
crecimiento de las bacterias bacterias lácticas (Lactobacillus gasseri y Bifidobacterium
longum) a si como sus digeridos ejercieron un efecto inhibitorio sobre la cinética de
Escherichia coli. Por otro lado, la adición del preparado de nucleótidos a la
concentración de 72 mg/L estimuló el crecimiento de B. longum.
En el ensayo 2 llevado a cabo con el inóculo fecal de lactantes expuesto a los
diferentes ingredientes (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina o β‐lactoglobulina y
nucleótidos), se observó que los concentrados proteicos en las dosis utilizadas en este
estudio incrementaron el crecimiento de bifidobacterias respecto del grupo control,
VII. Resumen
231
observandose también un aumento en la concentración de ácido acético. Aunque sin
diferencias estadísticas, el grupo microbiano Lactobacillus vio incrementada su
concentración con la adición de nucleótidos. Además, ninguno de nuestros
ingredientes dio lugar a un incremento en los grupos microbianos Bacteroides y
Clostridium leptum, a los que pertenecen especies patógenas. Estos resultados se
correspondieron con los obtenidos en el siguiente ensayo con las fórmulas infantiles y
la leche materna, ya que se encontró un aumento de los grupos beneficiosos en el
grupo expuesto a la fórmula suplementada, aunque sin diferencias significativas.
También se observó que las poblaciones microbianas de Bacteroides y Clostridia XVa
mantuvieron constantes sus concentraciones a lo largo del estudio. Por otro lado,
según los resultados obtenidos en relación a los ácidos grasos, podemos afirmar que
el perfil de ácidos grasos de cadena corta en la evolución de los inóculos fecales
expuestos a la fórmula suplementada fue similar al obtenido al trabajar con leche
materna.
En el estudio III en el que se comparó la composición de la microbiota intestinal
de dos poblaciones de lactantes, alimentados exclusivamente con leche materna, pero
procedentes de dos regiones diferentes de España (Murcia vs Asturias), se observaron
diferencias en algunas poblaciones microbianas.
Por otro lado, los resultados obtenidos en el estudio IV demostraron que la
fórmula infantil suplementada con α‐lactalbúmina y nucleótidos produce cambios
beneficiosos sobre la composición de la microbiota intestinal, reduciendo algunos de
los grupos microbianos potencialmente patógenos
VII. Resumen
232
VIII. Summary
233
VIII. SUMMARY
Breast milk is considered the best food for the newborn during the first months of
life; however, when breast‐feeding is not possible, infants depend either partially or totally
on infant formulas to satisfy their nutritional requirements during their first year of life.
Alpha‐lactalbumin and nucleotides are compounds naturally present in breast milk and
nowadays, are added to infant formulas as ingredients since have been reported to be
important for growth, repair and differentiation of gastrointestinal tract in infants. However,
there are little studies on its role on microbiota composition and mineral absorption.
The main objective of this doctoral thesis was to evaluate the effect of these two
functional ingredients (α‐lactalbumin and nucleotides) on both mineral availability and
intestinal microbiota. For this purpose, the composition of the protein fraction of infant
formula was modified by increasing its α‐lactalbumin content, and adding nucleotides and
DHA.
This work was divided in four studies. Studies I and II were performed in vitro and
studies III and IV in vivo. In study I, we evaluated the effect of functional ingredients (α‐
lactalbumin and nucleotides) on mineral availability (calcium, iron and zinc). Pure ingredients
and standard solutions of each mineral were assessed. Formula supplemented with
functional ingredients was compared with a control and human milk was used as reference
milk. All assays were performed with the Caco‐2 cell line seeded in a bicameral system. In
study II, the in vitro evaluation of the interaction of intestinal microbiota with ingredients
was determined. First, pure cultures of intestinal bacteria were exposed to two protein
concentrates, one rich in α‐lactalbumin and the other one rich in β‐lactoglobulin; moreover,
two concentrations of nucleotides were prepared. All ingredients were evaluated digested
and undigested. In the second experiment of this study, the evolution of a fecal inoculum
exposed to the same ingredients as the previous trial or infant formula, was studied.
Microbial groups were analyzed by RT‐ PCR and, short chain fatty acids were determined by
GC. Finally, in studies III and IV we assessed the influence of place of birth and the influence
of different ingredients on intestinal microbiota composition by p‐PCR.
VIII. Summary
234
Results on mineral availability showed that, the addition of nucleotides increased the
percentage of calcium cell uptake at 10 mM calcium. Regarding to iron, statistically
significant differences in cell retention were observed at 50 µM, the highest values were
observed for the group exposed to nucleotides. It was also observed that although the
availability of minerals was high in human milk, the addition of α‐lactalbumin and
nucleotides improved the availability of calcium and zinc from infant formulas by the Caco‐2
cell line.
Regarding the functional activity of ingredients, the two protein concentrates
stimulated the growth of lactic bacteria (Lactobacillus gasseri and Bifidobacterium longum);
meanwhile products from digestion exerted an inhibitory effect on the kinetics of
Escherichia coli. Furthermore, the addition of nucleotides at concentration 72 mg/L,
stimulated the growth of B. longum.
Experiments with the infant fecal inoculum exposed to the different ingredients
(whey‐lactalbumin‐rich α or β‐lactoglobulin and nucleotides), showed that protein
concentrates at the same concentration used in infant formula, increased the growth of
bifidobacteria respect to the control group; also an increase in acetic acid concentration was
observed. Despite no statistical differences were observed, Lactobacillus microbial
concentration increased with the addition of nucleotides. Furthermore, none of our
ingredients resulted in an increase in the potentially pathogenic microbial groups,
Bacteroides and Clostridium leptum. These results are consistent with those obtained
ininfant formula and breast milk, showing an increase of beneficial microbial populations in
the group exposed to supplemented formula; however, no significant differences were
observed. Microbial population concentrations of Bacteroides and Clostridia XVa remained
constant throughout the study. Furthermore, according the results obtained on fatty acids,
we can affirm that the profile of short chain fatty acids in the evolution of fecal inoculum
when exposed to the supplemented formula was similar to that reported in breast milk.
In study III, the intestinal microbiota composition of two breast‐fed infant’s
populations from two different locations of Spain, were compared. Some differences in
microbial populations were observed between the two different geographical location.
VIII. Summary
235
On the other hand, results obtained in the study IV showed that infant formula
supplemented with α‐lactalbumin and nucleotides showed beneficial changes on the
intestinal microbiota composition, reducing some of the potentially pathogenic microbial
groups.
VIII. Summary
236
IX. Bibliografía
237
VI. BIBLIOGRAFÍA Abrams SA. 2008. Assessing Mineral Metabolism in Children Using Stable Isotopes Pediatr Blood Cancer, 50:438‐441. Adlerberth I, Strachan DP. Matricardi PM, Ahrne´S, Orfei L, A°berg N, Perkin MR, Tripodi S, Hesselmar B, Saalman R, Coates AR. Bonanno CL, Panetta V, Wold AE. 2007. Gut microbiota and development of atopic eczema in 3 European birth cohorts. J ALLERGY CLIN IMMUNOL, 120 (2): 343‐350. Adlerberth I, Wold AE. 2009. Establishment of the gut microbiota in western infants. Acta Pædiatrica, 98: 229‐238. Alles MS, Scholtens PAMJ, Bindel JG. 2004. Current trends in the composition of infant milk formulas. Current Paediatrics, 14: 51‐63. Al‐Tamii MAHM, Palframan RJ, Cooper JM, Gibson GR, Rastall RA. 2006. In vitro fermentation of sugar beet arabinan and arabinooligosaccharides by the human gut microflora. J. Appl. Microbiol. 100: 407‐414. Álvarez‐Hernández X, Smith M, and Glass J. 1994. Regulation of iron uptake and transport by transferring in Caco‐2 cells, an intestinal cell line. Biochimica Biophysica Acta, 1192: 215‐222. Anderson PJ, Brooks CL, Berliner LJ. 1997. Functional identification of calcium binding residues in bovine α‐lactalbumin. Biochem. 36:11648‐54. Antila P, Paakkari I, Järvinen A, Mattila MJ, Laukkanen M, Pihlanto‐Leppälä A. 1991. Opioid peptides derived from in vitro proteolysis of whey proteins. Int Dairy J, 1:215–29. Arboleya S, Binetti A, Salazar N, Fernández N, Solís G, Hernández‐Barranco, A, Margolles A, De los Reyes‐Gavilán CG, Gueimonde M. 2012. Establishment and development of intestinal microbiota in preterm neonates. FEMS Microbiol Ecol , 79:763‐772. Artursson P, Karlsson J. Año. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco‐2) cell. Biochem biophys Res commun, 175 (3):880‐5.
Bäckhed F, Ley R.E, Sonnenburg JL. Peterson DA, Gordon JI. 2005. Host‐bacterial mutualism in the human intestine. Science, 307: 1915–1920 Balmer SE, Hanvey LS, Wharton BA. 1994. Diet and Faecal flora in the newborn: nucleotides. Arch. Dis. Childhood. 70: 137‐140
Barness LA. 1987. History of infant feeding practices. Am J Clin Nutr ;46:l68‐70.
Ben X, Zhou X, Zhao W, Yu W, Pan W, Zhang W, Wu S, Christian M, Schaafsma A. 2004. Supplementation of milk formula with galacto‐oligosaccharides improves intestinal micro‐flora and fermentation in term infants. Chinese Medical Journal, 117: 927‐931.
Berseth CL. 2006. Development and physiology of the gastrointestinal tract. In Neonatal nutrition and metabolism. Edited by Patti J Thureen and William W Hay. Published by Cambridge University Press, New York, 6: 67‐75.
Berzirtzoglou E, Tsiotsias A, Wellin GW. 2011. Microbiota profile in feces of breast‐ and formula‐fed newborns by using fluorescence in situ hybridation (FISH). Molecular Biology & Genetics. Anaerobe, 17:478‐482.
Bhattacharya A, Banu J, Rahman M, Causey J, Fernandes G. 2006. Biological effects of conjugated linoleic acids in health and disease. J Nutr Biochem, 17: 789‐810. Binaghi MJ, Greco CB, López LB, Ronayne de Ferrer PA, Valencia ME. 2008. Biodisponibilidad de hierro en la dieta infantil. Arch. Argent Pediatr, 106(5): 387‐389. Bjorksten B, Naaber P, Sepp E, Mikelsaar M. 1999 The intestinal microbiota in allergic Estonian and Swedish 2‐year‐old children. Clin Exp Allergy 29:342–346 Bjorksten B, Sepp E, Julge K, Voor T, Mikelsaar M. 2001. Allergy development and intestinal microflora during the first year of life. J. Allergy Clin. Immun, 108: 516‐20. Boehm G, Moro G. 2008. Structural and Functional Aspects of Prebiotics Used in Infant Nutrition. The Journal of Nutrition, 138: 1818S–1828S. Bouhallab S, Cinga V, Aı´t‐Oukhatar N, Bureau F, Neuville D, Arhan P, Maubois JL, Bougle´ D. 2002.
IX.Bibliografía
238
Influence of various phosphopeptides of caseins on iron absorption. J. Agric. Food Chem, 50, 7127‐7130. Bosscher D, Van Caillie‐Bertrand M, Robberecht H, Van Dyck K, Cauwenbergh RV, Deelstra H. 2001a. In vitro availability of calcium, iron and zinc from first‐age infant formulae and human milk. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 32, 54‐58. Bossche D, Lu Z, Cauwenbergh R V, Van Caillie‐Bertrand M, Robberecht H, Deelstra H. 2001b. A method for in vitro determination of calcium, iron and zinc availability from firstage infant formula and human milk. Int. J. Food Sci. Nutr., 52: 173‐182. Brew K, Castellino FJ, Vasaman T, Hill RL. 1970. The Complete Amino Acid Sequence of Bovine a‐Lactalbumin. The Journal of Biological Chemistry Vol. 245, (17); 4570‐4582. Brodbeck U, Denton W L, Tanahashi N, Ebner KE. 1967. The Isolation and Identification of the B Protein of Lactose Synthetase as α‐Lactalbumin. The Journal of Biological Chemistry Vol. 242, No. 7; 1391‐1397. Bronner F. 2008. Recent developments in intestinal calcium absorption. Nutrition Reviews Vol. 67, 2:109‐113. Bronner F, Pansu D. 1999. Nutritional aspects of calcium absorption. J Nutr., 129: 9‐12 Brück WM, Graverholt G, Gibson GR. 2002. Use of batch culture and a two‐stage continuous culture system to study the effect of supplemental α‐lactalbumin and glycomacropeptide on mixed populations of human gut bacteria. FEMS Microbiology Ecology, 41; 231‐237. Brück WM, Kelleher SL, Gibson GR, Nielsen KE, Chatterton DE, Lönnerdal B. 2003a. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α‐lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 37 (3); 273–28. Brück WM, Graverholt G, Gibson GR. 2003b. A two‐stage continuous culture system to study the effect of supplemental a‐lactalbumin and glycomacropeptide on mixed cultures of human gut bacteria challenged with enteropathogenic Escherichia coli and Salmonella serotype
Typhimurium. Journal of Applied Microbiology, 95: 44–53. Brück WM, Redgrave M, Tuohy KM, Lönnerdal B, Graverholt G, Hernell O, Gibson GR. 2006a. Effects of bovine α‐lactalbumin and casein glycomacropeptide‐enriched infant formulae on faecal microbiota in healthy term infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr , 43: 673–679. Brück WM, Kelleher SL, Gibson GR, Lönnerdal B. 2006b. The effects of a‐lactalbuminand glycomacropeptide on the association of CaCo‐2 cells by enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Shigella flexneri. FEMS Microbiol Lett, 259: 158–162. Brunser O, Espinoza J, Araya M, Cruchet S, Gil A. 1994. Effect of dietary nucleotide supplementation on diarrhoeal disease in infants. Acta Paediatr, 83: 188‐91. Buck RH, Thomas DL, Winship TR, Cordle CT, Kuchan MJ, Baggs GE, Schaller JP, Wheeler JG. 2004. Effect of dietary ribonucleotides on infant immune status. part 2: immune cell development. Pediatr Res, 56:891–900. Buddington RK, Williams CH, Chen S, Witherly SA. 1996. Dietary supplement of neosugar alters the faecal flora and decreases activities of some reductive enzymes in human subjets. American Journal of Clinical Nutrition, 63, 709‐716. Buddington RK, Sangild PT. 2011. Development of the mammalian gastrointestinal tract, the resident microbiota, and the role of diet in early life. Journal of Animal Science, 89: 1506‐1519. Cai JW, Luo YD, Ben XM. 2008. Effects of infant formula containing galacto‐oligosaccharides on the intestinal microflora in infants. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 10(5):629‐32. Campbell, P.N, Smith, A.D, Peters, T.J. Bioquímica ilustrada. 5 ª ed. © 2006.Última reimpresión: 2009 260 págs. ISBN13: 978844581604‐2 Editado por: ELSEVIER‐MASSON Cardelle‐Cobas A, Corzo N, Olano A, Peláez C, Requena T, Ávila M. 2011. Galactooligosaccharides derived from lactose and lactulose: Influence of structure on Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium growth. International journal of food Microbiology, 149:81‐87.
VIII. Summary
239
Carver JD. 1994. Dietary Nucleotides: Cellular Immune, Intestinal and Hepatic System Effects. American Institute of Nutrition, 144S‐148S. Carver JD, Walker WA. 1995. The role of nucleotides in human nutrition. J. Nutr. Biochem. 6: 58‐72
Carver JD, Barness LA. 1996. Trophic factors for the gastrointestinal tract. Clin. Perinatol , 23: 265‐285. Carver JD. 2003. Advances in nutritional modifications of infant formulas. Am J Clin Nutr, 77(suppl):1550S–4S Casado de Frías E., Maluenda, C, Casado, E. 1993. Alimentación del niño. En: Nutrición y dietética, aspectos sanitarios. Ed. Consejo General de Colegios Oficiales de Farmaceúticos. Madrid, España. Pp: 383‐403. Chatterton D, Smithers G, Roupas P, Brodkorb A. 2006. Bioactivity of β‐lactoglobulin and α‐lactalbumin—Technological implications for processing. Chen J, Cai W, Feng Y. 2007. Development of intestinal bifidobacteria and lactobacilli in breast‐fed neonates. Clinical Nutrition, 26: 559–566 Chevalier B. Nutrición infantil. Barcelona: Ed. Masson; 1997. Chocarro‐Egüaras R. 2003. Hábitos alimentarios y comparación con las diferentes zonas españolas. Universidad pública de Navarra. http://www.navarra.es/NR/rdonlyres/ADB42886‐C280‐4090‐A3DD 47383F7FFD3F/79829/17RAQUELCHOCARRO.pdf Chowanadisai W, Kelleher SL, Nemeth JF, Yachetti S, Kuhlman CF, Jackson JG, Davis AM, Lien EL, Lönnerdal B. 2005. Detection of a single nucleotide polymorphism in the human α‐lactalbumin gene: implications for human milk proteins. J. Nutr. Biochem, 16: 272–278. Collado MC, Calabuig M, Sanz, Y. 2007. Differences between the fecal microbiota of celiac infants and healthy controls. Curr. Issues Intestinal microbial, 8: 9‐14. Collard KJ. 2010. Iron Homeostasis in the neonate. Paediatrics, 123: 1208‐1216.
Commare CE , Tappenden KA. 2007. Development of the Infant Intestine: Implications for Nutrition Support. Nutrition in Clinical Practice, 22:159‐173 Cosgrove M, Davies DP, Jenkins HR. 1996. Nucleotide supplementation and the growth of term small for gestational age infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 1996. 74 (2): F122. Cosgrove M. 1998. Nucleotides. Nutrition, 14 (10): 748–751. Cordle CT, Winship TR, Schaller JP, Thomas DJ, Buck RH, Ostrom KM, Jacobs JR; Blatter, MM; Cho S; Gooch WM III;Pickering, LK. 2002. Immune status of infants fed soy‐based formulas with or without added nucleotides for 1 year: part 2: immune cell populations. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 34:145‐53 Corzo‐Martínez M, Ávila M, Moreno F, Requena T, Villamiel M. 2012. Effect of milk protein glycation and gastrointestinal digestion on the growth of bifidobacteria and lactic acid bacteria. International journal of food Microbiology, 153: 420‐427. da Silva R,, Bach‐Faig A, QuintanaRB, Buckland G, de Almeida MDV, Serra‐Majem Ll. 2010. Worldwide variation of adherence to the Mediterranean diet, in 1961–1965 and 2000–2003. Public Health Nutrition, 12(9A): 1676–1684 Davis AM, Harris BJ, Lien EL, Pramuk K, Trabulsi J. 2008. α‐Lactalbumin‐rich infant formula fed to healthy term infants in a multicenter study: plasma essential amino acids and gastrointestinal tolerance. European Journal of Clinical Nutrition, 62: 1294–1301. De Benoist B, McLean E, Egli I, Cogswell M. 2008. Worldwide prevalence of anaemia 1993‐2005. Global database on anemia. Ginebra: WHO. Dethlefsen L, Eckburg PB, Bik EM, Relman DA. 2006. Assembly of the human intestinal microbiota. Trends Ecol Evol, 21(9):517–523. Domellöf M, Lönnerdal B, Dewey KG, Cohen RJ, Hernell O. 2004. Iron, zinc, and copper concentrations in breast milk are independent of maternal mineral status. American Society for Clinical Nutrition, 79: 111–5. Domellöf M. 2007. Iron requirements, absorption and metabolism in infancy and childhood. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 10: 329–35.
IX.Bibliografía
240
Domellöf M, Hernell O, Abrams A, Chen Z, Lönnerdal B. 2009. Iron supplementation does not affect copper and zinc absorption in breastfed infants. American society for Nutrition, 89: 185‐90. Dorca J. 2008. Ingredientes funcionales en formulas infantiles. Boletín de Pediatría, 48: 347‐352. Doré J, Corthier G. 2010. The human intestinal microbiota. Gastroentérologie Clinique et Biologique, 34 (1): S7‐S15. Drago SR, y Valencia ME. 2004. Influence of Components of Infant Formulas on in Vitro Iron, Zinc, and Calcium Availability. Journal Agricultural and Food Chemistry, 52: 3202‐3207. Dube K, Schwartz J, Mueller MJ, Kalhoff H, Kersting M. 2010. Iron intake and iron status in breastfed infants during the first year of life. Clinical Nutrition, IN Press: 1‐6 Dupont C, Rivero M, Grillon C, Belaroussi N, Kalindjian A, Marin V. 2010. α‐Lactalbumin‐enriched and probiotic supplemented infant formula in infants with colic: growth and gastrointestinal tolerance. European Journal of Clinical Nutrition, 64, 765–767. Edwards CA, Parret AM. 2002. Intestinal flora during the first months of life: new perspectives. British Journal of Nutrition, 88, Suppl. 1, S11–S18. Ekmekcioglu C, Pomazal K, Steffan I, Schweiger B, Markti W. 1999. Calcium transport from mineral water across caco‐2 cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 2594‐2599. Espinosa RM, Tamez M, Prieto P. 2007. Efforts to emulate human milk oligosaccharides. British Journal of Nutrition, 98, Suppl. 1, S74–S79. Euler AR, Mitchell DK, Kline R, Pickering LK. 2005. Prebiotic effect of fructo‐oligosaccharide supplemented term infant formula a two concentrations compared with unsupplemented formula and human milk. J. Pediatr. Gastroentrol. Nutr, 40: 157‐164. Faelli A, Esposito G. 1970. Effect of inosine and its metabolites on intestinal iron absorption in the rat. Biochem Pharmacol, 19:2551. Fallani M, Young D, Scott J, Norin E, Amarri S, Adam R, Aguilera M, Khanna S, Gil A,. Edwards CA, Dore J. 2010. Intestinal microbiota of 6‐week‐old infants across Europe: geographic influence
beyond delivery mode, breast‐feeding and antibiotics. J Pediatr Gastroenterol Nutr,51:77‐84. Farré Rovira R. 2010. Biodisponibilidad mineral: evaluación. Alimentación, Nutrición y Salud, Vol 17 nº1: 1‐8. Fazzolari‐Nesci A, Domianello D, Sotera V, Räihä NC. 1992. Tryptophan fortification of adapted formula increases plasma tryptophan concentrations to levels not different from those found in breast‐fed infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr , 14: 456–9. Findlay, Brew K. 1972. The Complete Amino‐Acid Sequence of Human α‐Lactalbumin. Eur. J. Biochem, 27,65‐86. Forsythe P, Sudo N, Dinan T, Taylor VH, Bienenstock J. 2010. Mood and gut feelings. Brain, Behav, Immun, 24:9–16. Frazer, Anderson. Iron Imports I. 2005. Intestinal iron absorption and its regulation. Am J Physiol gastrointest Liver Physiol, 289:631‐635. Fredriksson A, Schroder N, Eriksson P, Izquierdo I, Archer T. 2000. Maze learning and motor activity deficits in adult mice induced by iron exposure during a critical postnatal period. Brain Res Dev Brain Res, 119(1):65–74. Friedman A, Galazka‐Friedman J, Bauminger ER, Koziorowski D. 2006. ron and ferritin in hippocampal cortex and substantia nigra in human brain. Implications for the possible role of iron in dementia. Journal of the Neurological Sciences, 248 (1‐2): 31‐34 Frontela C, Ros G, Martínez C. 2009b. Iron and calcium availability from digestion of infant cereals by Caco‐2 cells. Eur Food Res Technol, DOI 10.1007/s00217‐008‐0990‐z. Frontela C, Scarino ML, Ferruzza S, Ros G, Martínez C. 2009a. Effect of dephytinization on bioavailability of iron, calcium and zinc from infant cereals assessed in the Caco‐2 cell model. World J Gastroenterol, 15(16): 1977–1984. Frontela C, Peso‐Echarri P, González‐Bermúdez CA, López‐Nicolás R, Martínez‐Graciá C. y Ros‐Berruezo G. 2011. A critical perspective on cells lines studies in nutrition: the case of intestinal absorption. In: Caco‐2 and their uses. Edit. Megan A. Schulz. ISBN: 978‐61209‐917‐0. Nova Science Publishers, Inc.
VIII. Summary
241
Fukuda S, Toh H, Hase K, Oshima K, Nakanishi Y, Yoshimura K, Tobe T, Clarke JM, Topping DL, Suzuki t, Taylor TD, Itoh K, Kikuchi J, Morita H, Hattori M, Ohno H. 2011. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature, 469: 543‐7. Fuller Z, Louis P, Mihajlovski A, Rungapamestry V, Ratcliffe B, Duncan AJ. 2007. Influence of cabbage processing methods and prebiotic manipulation of colonic microflora on glucosinolate breakdown in man. Br J Nutr, 98, 364–372. Ganz T, Nemeth E. 2011. Hepcidin and disorders of iron metabolism. Annu. Rev. Med, 62: 347‐360. Gibson GR, Roberfroid MB. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 125, 1401–1412. Gil A, Corral E, Martinez A, Molina JA. 1986. Effects of dietary nucleotides on the microbial pattern of faeces of at term newborn infants. J Clin Nutr Gastroenterol; 1:34 Gil A, Rueda R. 2000. Modulation of intestinal microflora by specific dietary components. Microbial Ecol Health Dis, 2: 31‐9. Gil A, Rueda R. 2002. Interaction of early diet and the development of the immune system. Nutr Res Rev, 15:263‐92. Gil A. 2002. Modulation of the immune response mediated by dietary nucleotides. Eur J Clin Nutr, 56(suppl):S1– 4. Gill N, Finlay B. 2011. The gut microbiota: challenging immunology. Nature reviews. Immunoly, 11, 636‐637 Gomez HF, Ochoa TJ, Herrera‐Insua I, Carlin LG, Cleary TG. 2002. Lactoferrin protects rabbits from Shigella flexneri‐induced inflammatory enteritis. Infection and Immunity, 70: 7050–7053. Grasbeck R, Kouvonen I, Lundberg M, Tenhunen R. 1979. An intestinal receptor for heme. Scand J Haematol, 23: 5‐9. Greer, F.R. 2010. Vitamin K the basics: What’s new? Early Hum Dev, in press. doi:10.1016/j.earlhumdev..01.015. Greffeuille V, Kayodé APP, Icard‐Vernière C, Gnimadi M, Rochette I, Mouquet‐Rivier C. 2011. Changes in iron, zinc and chelating agents during
traditional African processing of maize: Effect of iron contamination on bioaccessibility. Food Chemistry, 126:1800‐1807. Guarner F. 2011. The intestinal microbiota and inflammatory bowel disease. Gastroenterol Hepatol. , 34: 147‐154. Gueimonde M, Tölkko S, Korpimäki T, Salminen S. 2004. New real‐time quantitative PCRprocedure for quantification of bifidobacteria in human fecal samples. Appl Environ Microbiol,70:4165–9. Gueimonde M. and de los Reyes‐Gavilán C.G. 2009. Detection and enumeration of gastrointestinal microorganisms EN: Handbook of probiotics and prebiotics, (2nd ed.) Eds. Lee, Y.L, and Salminen, S. John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, USA. Pp. 25‐43. (ISBN: 978‐0‐470‐13544‐0) Guéguen L, Pointillart A. 2000. The bioavailability of dietary calcium. J Am Coll Nutr 2000, 19(suppl):119S–136S. Gustafsson L, Hallgren O, Mossberg AK, Pettersson J, Fischer W, Aronsson A, Svanborg C. 2005. HAMLET Kills Tumor Cells by Apoptosis: Structure, Cellular Mechanisms, and Therapy. Journal of Nutrition. Gutiérrez P, Mora I, Díaz L, Jiménez C, Ramírez J, Solomon G. 2007 Immune response to nucleotide‐supplemented infant formulae: systematic review and meta‐analysis. British J. Nutr. 98, Suppl. 1: S64‐S67.
Guyton, A.C. Hall, J.E. Tratado de fisiología médica. 11ª ed. Madrid: Elsevier; 2006. Ha, EM. 2011. The Impact of Gut Microbiota in Human Health and Diseases: Implication for Therapeutic Potential. Biomolecules & Therapeutics, 19 (2):155‐173 Hadders, M.A. 2005. The role of long‐chain polyunsaturated Fatty acids (LCPUFA) in Growth and development. Early nutrition and its later consequences: new opportunities ISBN‐10 1‐4020‐3535‐7earnest‐danone Hakansson A, Zhivotovsky B, Orrenius S, Sabharwal H, Svanborg C. 1995. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8064–8068. Hakansson A, Svensson M, Mossberg A‐K, Sabharwal H, Linse S , Lazou I, Lönnerdal B, Svanborg C. 2000. A folding variant of a‐
IX.Bibliografía
242
lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology, 35 (3), 589‐600. Hamosh M. 1996Digestion in the newborn. Clin Perinatol; 23:191–209. Hanning RM, Paes B, Atkinson SA. Protein metabolism and growth of term infants in response to a reduced‐protein, 40: 60 whey: casein formula with added tryptophan. Am J Clin Nutr , 1992; 56:1004–11. Haro JF, Martínez‐Graciá C, Periago Mª J, Ros G. 2005. Prevención de la deficiencia en hierro mediante el enriquecimiento de los alimentos. An. Vet. 21: 7‐21. Harmsen HJM, Wideboer‐Veloo AC, Grijpstra J, Knoll, J, Degener, JE, Welling, GW. 2000. Development of 16S rRNA‐based probes for the Coriobacterium group and the Atopobium cluster and their application for enumeration of Coriobacteriaceae in human feces from volunteers of different age groups. Appl. Environ. Microbiol, 66, 4523‐4527. Haug A, Høstmark AT, Harstad OM. 2007. Bovine milk in human nutrition – a review. Lipids in Health and Disease, 6, 25:1‐16. Hawkes JS, Gibson RA, Roberton D, Makrides M. 2006. Effect of dietary nucleotide supplementation on growth and immune function in term infants: a randomized controlled trial. European Journal of Clinical Nutrition, 60: 254‐264. Hay G, Johnston C, Whitelaw A, Trygg K, Refsum H. 2008. Folate and cobalamin status in relation to breastfeeding and weaning in healthy infants. Am J Clin Nutr, 88:105‐114. Heikkilä MP, Saris PEJ. 2003. Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal bacteria of human milk. J Appl Microbiol, 95: 471‐478. Heine WE, Klein PD, Reeds PJ. 1991. The importance of α‐ lactalbumin in infant nutrition. J. Nutr, 121: 277‐283. Heine W, Radke M, Wutzke KD, Peters E, Kundt G. 1996. Alpha‐lactalbumin‐ enriched low‐protein infant formulas: a comparison to breast milk feeding. Acta Paediatr, 85:1024–8. Heird WC. 2007. Progress in Promoting Breast‐Feeding, Combating Malnutrition, and Composition
and Use of Infant Formula, 1981–2006. J. Nutr. 137: 499S–502S. Hernández Rodriguez M. 1999. Alimentación en la primera infancia. En: Tratado de Nutrición. Madrid: Ediciones Díaz de Santos, S.A. pp. 809‐29. Hernell O, Lönnerdal B. 2002. Iron status of infants fed low‐iron formula: no effect of added bovine lactoferrin or nucleotides. Am J Clin Nutr, 76:858‐64. Hernell O, Lönnerdal B. 2003. Nutritional evaluation of protein hydrolysate formulas in healthy term infants: plasma amino acids, hematology, and trace elements. Am J Clin Nutr, 78:296–301. Hess SY, Lönnerdal B, Hotz C, Rivera JA, Kenneth HB. 2009. Recent advances in knowledge of zinc nutrition and human health. Food and Nutrition, Bulletin. 30, nº1: S5‐S11. Hernández‐Ledesma B, Quirós A, Amigo L, Recio I. 2007. Identification of bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin. International Dairy Journal, 17: 42–49. Hill RL, Brew K. 1975. Adv. Enzymol., 43: 411‐490. Hoenderop JGJ, Nilius B, Bindels RJM. 2005. Calcium absorption across epithelia. Physiology review, 85: 373 – 422. Hooper LV, Macpherson AJ. 2010. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol;10:159–69. Hornstra G. 2000. Essential fatty acids in mothers and their neonates, Am. J. Clin. Nutr., 71 (suppl 5), 1252S‐1259S. Hsu SC, Levine MA. 2004. Perinatal calcium metabolism: physiology and pathophysiology. Seminars in Neonatology, 9: 23‐36. Hurrell RF, Juillerat MA, Reddy MB, Lynch SR, Dassenko SA, Cook JD. 1992. Soy protein, phytate, and iron absorption in humans. Am. J. Clin. Nutr., 56:573‐578. Huurre A, Kalliomäki M, Rautava S, Rinne M, Salminen S, Isolauri E. 2008. Mode of delivery. Effects on gut microbiota and humoral immunity. Neonatology , 93:236‐240.
VIII. Summary
243
Hyman PE, Clarke DD, Everett SL, Sonne B, Stewart D, Harada T, Walsh MDJH, Taylor IL. 1985. Gastric acid secretory function in preterm infants. J Pediatr, 106: 467–71. International Zinc Nutrition Consultative Group (IZiNCG), Brown KH, Rivera JA, Bhutta Z, Gibson RS, King JC, Lönnerdal B, Ruel MT, Sandtrom B, Wasantwisut E, Hotz C. Assessment of the risk of zinc deficiency in populations and options for its control. Food Nutr Bull 2004;25(1 suppl 2):S99–203. Janas LM, Picciano MF, Hatch TF 1987. Indices of protein metabolism in term infants fed either human milk or formulas with reduced protein concentration and various whey/casein ratios. J Pediatr 110, 838–848. Jackson J, Kuhlman C, Lönnerdal B, et al. 2002. Variations in concentrations of alpha lactalbumin (A Lac) in human milk: a nine‐country survey. FASEB J, 16: A663. Jackson JG, Janszen DB, Lönnerdal B, Lien EL, Pramuck KP, Kuhlman CF. 2004. A multinational study of α‐lactalbumin concentrations in human milk. J Nutr. Biochem, 15: 517–521. Jacquot A, Gauthier Rejean FS, Drouin R, Boutin Y. 2010. Proliferative effects of synthetic peptides from β‐lactoglobulin and α‐lactalbumin on murine splenocytes. International Dairy Journal, Vol. 20, 8: 514‐521. Jain A, Agarwal R, Sankar MJ, Deorari A, Paul VK. 2010. Hypocalcemia in the Newborn. Indian Journal Pediatrics, 77: 1123–1128. Jiménez E, Delgado S, Maldonado A, Arroyo R, Albújar M, García N, Jariod M, Fernández L, Gómez A, Rodríguez JM. 2008a. Staphylococcus epidermidir: A diferencial trait of the fecal microbiota of breast‐fed infants. BioMed Central Microbiology, 8: 143. Jiménez E, Marín ML, Martín R, Odriozola JM, Olivares M, Xaus J, Fernández L, Rodríguez JM. 2008b. Is meconium from healthy newborns actually sterile? Res Microbiol, 159: 187‐193. Jou MY, Philipps AF, Kelleher SL, Lönnerdal B. 2010. Effects of Zinc Exposure on Zinc Transporter Expression in Human Intestinal Cells of Varying Maturity. JPGN, 50 (6):587‐595. Jovaní M, Barberá R, Farré R, Martín de Aguilera E. 2001. Calcium, iron and zinc uptake from digest
of infant formulas by Caco‐2 cells. J. Agric. Food Chem. 49, 3480‐3485. Jyonouchi H. 1994. Nucleotide actions on humoral immune responses. J Nutr, 124 (1 Suppl):138S–43S. Kalliomäki M, Collado MC, Salminen S, Isolauri E. 2008. Early differences in fecal microbiota composition in children may predict overweight. Am J. Clin Nutr., 87: 534‐8. Kamau SM, Cheison SC, Chen W, Liu XM, Lu RR. 2010. Alpha‐lactalbumin: Its production technologies and bioactive peptides. Comprehensive reviews in food science and food safety, 9: 197‐212. Kee HJ, Kim ER, Jung HK, Yun SS, Juhn SL, Hong YH. 1998. Effect of enzymatically hydrolyzed a‐LA fractions with pepsin on growth‐promoting of Bifidobacterium longum ATCC 15707. Korean Journal of Dairy Science, 20(1), 61–68. Kelleher SL, Chatterton D, Nielsen K, Lönnerdal B. 2003. Glycomacropeptide and alpha‐lactalbumin supplementation of infant formula affects growth and nutritional status in infant rhesus monkeys. Am. J. Clin. Nutr., 77: 1261‐1268. Kirjavainen PV, Salminen SJ, Isolauri E. 2003. Probiotic bacteria in the management of atopic disease: underscoring the importance of viability. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 36:223–7. Knol J, Sholten P, Kafka C, Stemmbakkers J, Grob S, Helm K, Klarczyk M, Schöpfer H, Böckler HM, Wells J. 2005. Colon microflora in infants fed formula wiyh galacto‐oligosaccharides: More like breast‐fed infants. J. Ped. Gastroenterol. Nutr. , 40: 36‐42. Knyazeva EL, Grishchenko VM, Fadeev RS, Akatov VS, Permyakov SE , Permyakov EA. 2008. Who is Mr. HAMLET? Interaction of human α‐Lactalbumin with Monomeric Oleic Acid. Biochemistry, 47: 13127‐13137. Klein CJ. 2002. Nutrient requirements for preterm infant formulas. J Nutr, 132 (6 Suppl 1): 1395S–577S. Komatsuzaki N, Nakamura T, Kimura T, Shima J. 2008. Characterization of glutamate decarboxylase from a high gamma‐aminobutyric acid (GABA)‐producer, Lactobacillus paracasei. Biosci, Biotechnol, Biochem, 72: 278‐285.
IX.Bibliografía
244
Koletzko B, Baker S, Cleghorn G, Neto UF, Gopalan S, Hernell O, Hock QS, Jirapinyo P, Lönnerdal B, Pencharz P, Pzyrembel H, Ramírez‐Mayans J, Shamir R, Turck D, Yamashiro Y, Zong‐Yi D. 2005. Global standard for the composition of infant formula. Recommendations of an ESPGHAN coordinated International Expert Group. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 41:584–99. Krebs NF, Hambidge KM, Westcott JE, Miller LV, Sian l, Bell l, Grunwald G. 2003. Exchangeable zinc pool size in infants is related to key variables of zinc homeostasis. J Nutr, 133 (5 Suppl 1): 1498S–501S. Krebs NF, Westcott JE, Rodden DJ, Ferguson KW, Miller LV, Hambidge KM. 2006. Exchangeable zinc pool size at birth is smaller in small‐forgestational‐age than in appropriate‐for‐gestational‐age preterm infants. Am J Clin Nutr, 84: 1340‐1343. Lamberti LA, Walker CLF, Noiman A, Victora C, Black RE. 2011. Breastfeeding and the risk for diarrhea morbidity and mortality. BMC Public Health, 11(Suppl 3):S15 Langlands SJ, Hopkins MJ, Coleman N & Cummings JH. 2004. Prebiotic carbohydrates modify the mucosa associated microflora of the human large bowel. Gut, 53: 1610‐1616. Laparra M, Glahn LP, Miller DD. 2009. Different responses of Fe transporters in Caco‐2/HT29‐MTX cocultures than in independent Caco‐2 cell cultures. Journal of Food Science, 74 (2): 40‐46. Lauritzen L, Hansen HS, Jørgensen MH, Michaelsen KF. 2001. The essentiality of long chain n‐3 fatty acids in relation to development and function of the brain and retina. Progr. Lipid Res. 40: 1‐94. Lawrence RM, Pane CA. 2007. Human breast milk: current concepts of immunology and infectious diseases. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care, 37:7–36. Layton A, McKay L, Williams D, Garrett V, Gentry R, Sayler G. 2006. Development of Bacteroides 16S rRNA gene TaqMan‐based real‐time PCR assays for estimation of total, human, and bovine fecal pollution inwater. Appl EnvironMicrobiol; 72:4214–24. Leach JL, Baxter JH, Molitor BE, Ramstack MB, Masor ML. 1995. Total potentially available nucleosides of human milk by stage of lactation. Am J Clin Nutr, 61: 1224–30.
LeLeiko NS, Walsh MJ, Abraham S. 1995. Gene expression in the intestine: the effect of dietary nucleotides. In: Barness L, DeVivo D, Kaback M, Morrow G, Oski F, Rudolph A, eds. Advances in pediatrics. St Louis: Mosby‐Year Book, Inc,:145–69. Lerner A, Shamir R. 2001. Nucleotides in Infant Nutrition: A Must or an Option. IMAJ, 2: 772‐774. Levitt MD, Gibson GR, Christl SU. 1995. Gas metabolism in the large intestine. In: Human colonic bacteria: role in Nutrition, Physiology and Pathology. G. R. Gibson and G.T. Macfarlane (Eds).CRC Press, Boca Raton, FL, pp 131‐153. Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI. 2006. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature, 444(7122): 1022‐1023. Ley RE. 2010. Obesity and the human microbiome. Curr Opin Gastroenterol, 26: 5–11. Lien EL. 2003. Infant formulas with increased concentrations of α‐lactalbumin. Am J Clin Nutr, 77(suppl): 1555S–8S. Lien EL, Davis AM, Euler AR. 2004. Growth and Safety in Term Infants Fed Reduced‐Protein Formula with Added Bovine Alpha‐Lactalbumin. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 38: 170‐176. Lievin V, Peiffer I, Hudault S, Rochat F, Brassart D, Neeser JR, Servin AL. 2000. Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity. Gut 47:646‐652 Lind T, Lönnerdal B, Stenlund H, Ismail D, Seswandhana R, Ekström EC, Persson L. 2003. A community‐based randomized controlled trial of iron and zinc supplementation in Indonesian infants: interactions between iron and zinc. Am. J. Clin. Nutr., 77:883‐90. Lo CW. 1996. Human milk: nutritional properties. In:Walker WA,Watkins JB, eds. Nutrition in pediatrics. Hamilton, Canada. Decker: 436–48. Lönnerdal B., Cederblad Å, Davidsson L, Sandström B. 1984 The effect of individual components of soy formula and cow’s milk formula on zinc bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 40: 1064–1070. Lönnerdal B. 2000. Dietary Factors Influencing Zinc Absorption. Supplement: Zinc and Health: Current Status and Future Directions The Journal of Nutrition, :1378S‐1383S
VIII. Summary
245
Lönnerdal B. 2003. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. Am J Clin Nutr., 77 (suppl):1537S–43S. López‐Navarro AT, Ortega MA, Peragón J, Bueno JD, Gil A, Sánchez‐Pozo A. 1996. Deprivation of dietary nucleotides decreases protein synthesis in the liver and small intestine in rats. Gastroenterology, 110:1760‐1769. Macfarlane GT, Gibson GR, Cummings JH. 1992. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. Journal of Applied Bacterology, 72: 57‐64. Macfarlane GT, McBain AJ. 1999. The human colonic microbiota. In: Colonic Microbiota, Nutrition and Health. G. R. Gibson and M Roberfroid (Eds). Kluwer Academic Publishers, London, pp. 1‐26 Macfarlane GT, Macfarlane S. 1995. Proteolysis and amino acid fermentation. In: Human colonic bacteria: role in Nutrition, Physiology and Pathology. G. R. Gibson and G.T. Macfarlane (Eds). CRC Press, Boca Raton, FL, pp 75‐100 Macfarlane GT, Macfarlane S. 1997. Human colonic microbiota: ecology, physiology and metabolic potential of intestinal bacteria. Scandinowian Journal of Gastroenterology, 32 (Suppl. 222), 3‐9. Madureira AR, Pereira CI, Gomes AMP, Pintado ME, Malcata FX. 2007. Bovine whey proteins‐Overview on their main biological properties. Food research International, 40: 1197‐1211. Mahler GJ, Shuler ML, Glahn RP. 2009. Characterization of Caco‐2 and HT29‐MTX cocultures in an in vitro digestion/cell culture model used to predict iron bioavailability. J Nutr Biochem, 20(7): 494‐502. Marques TM, Wall R, Ross RP, Fitzgerald GF, Ryan CA, Stanton C. 2010. Programming infant gut microbiota: influence of dietary and environmental factors. Current Opinion in Biotechnology, 21: 149‐156. Markus CR, Olivier B, Panhuysen GEM, Gugten JV, Alles MS, Tuiten A, Westenberg HGM, Fekkes D, Koppeschaar HF, Haan EEHF . 2000. The bovine protein α‐lactalbumin increases the plasma ratio of tryptophan to the other large neutral amino acids, and in vulnerable subjects raises brain serotonin activity, reduces cortisol concentration, and
improves mood under stress. Am J Clin Nutr. 71: 1536–44. Markus CR, Olivier B, De Haan EH. 2002. Whey protein rich in a‐lactalbumin increases the ratio of plasma tryptophan to the sum of the other large neutral amino acids and improves cognitive performance in stress‐vulnerable subjects. American Journal of Clinical Nutrition, 75(6), 1051–1056. Martín R, Langa S, Reviriego C, Jiménez E, Marín ML, Xaus J. 2003. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. J Pediatr. 143: 754‐758. Martín V, Maldonado‐Barragán A, Moles l, Rodríguez‐Baños M, Del campo R, Fernández l, Rodríguez JM, Jiménez E. 2012. Sharing of Bacterial strains between breast milk and infant feces. Journal of human Lactation, 28(I):36‐44. Martínez C, Ros G, Periago MJ, López G. 1999. Biodisponibilidad de hierro en los alimentos. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 49 (2): 106‐113. Martínez Gómez M.J. 2001 Capitulo 4 “Maduración de las funciones metabólicas y digestivas para el lactante”. Alimentación infantil. Manuel Hernández Rodrígez. Editorial Diaz de Santos. ISBN:978‐84‐7978‐509‐3. Maslowski KM, Vieira AT, Ng, A, Kranich J, Sierro F, Yu D, Schilter HC, Rolph MS, Mackay F, Artis D, Xavier RJ, Texeira MM, Mackay CR. 2009. Regulation of inflammatory responses by gut microbiota and chemoattractant receptor GPR43. Nature, 461: 1282‐1286 Mateo CD, Dave RI, Stein HH. 2004. Effect of supplemental nucleosides for newly weaned pigs. J Anim. Sci. 82 (Suppl. 2), 71. Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. 2007. Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA‐targeted reverse transcription‐PCR. Appl Environ Microbiol, 73:32‐39. Appl Environ Microbiol 2007;73: 6695 Erratum in: Appl Environ Microbiol 2007;73:6695. Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Takada T, Tanaka R. 2004. Use of 16S rRNA genetargeted group‐specific primers for real‐time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol;70:7220–8
IX.Bibliografía
246
McKay C.P. Disorders in calcium metabolism. 2010. In: Fluids and electrolytes in pediatrics.Edit. Feld, L.G. and Kaskel F.J. ISBN: 978‐1‐60327‐225‐4. Mckie AT, Barrow D, Latunde‐Dada GO, Rolfs A, Sager G, Mudaly E, Mudaly M, Richardson CD, Bomford A, Peters TJ, Raja KB, Shirali S, Hediger MA, Farzaneh F, Simpson RJ. 2001. An iron‐regulated ferricreductase associated with the absorption of dietary iron. Science, 291:1755‐59. Merolla R. 2000. Evaluation of the effects of a nucleotide enriched formula on the incidence of diarrhea. Italian multicenter national study. Minerva Pediatr, 52: 699‐711. Midvetdt A, Midvetdt T. 1992. Production of short chain fatty acids by the intestinal microflora during the first 2 years of human life. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 15, 4: 395‐403. Millan Jimenez A. 2005. Papel de los nucleótidos en la alimentación del lactante. An Pediatr, Monogr. 3 (1): 34‐42. Mihatsch WA, Franz AR, Hogel J, Pohlandt F. 2002. Hydrolyzed protein accelerates feeding advancement in very low birth weight infants. Pediatrics, 110: 1199–203. Molina JA, Maldonado J. Características de la digestión y metabolismo en el lactante. En: Cruz Hernández M, editor. Tratado de pediatría. Barcelona: Ed. Espaxs. 1993. p. 655‐ 63. Monteagudo E, Ferrer B. 2010. Deficiencia de hierro en la infancia (I). Concepto prevalencia y fisiología del metabolismo férrico. Acta Pediatr Esp, 68 (5)8: 245‐251. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and citotoxicity assays. J. Inmunol. Methods 65:55‐63. Musci G, Berliner LJ. 1985. Physiological Roles of Zinc and Calcium Binding to α‐Lactalbumin in Lactose Biosynthesis. Biochemistry, 24: 6945‐6948. Murakami M, Hirano T. 2008. Intracelular zinc homeostasis and zinc signaling. Japanese cancer association, vol. 99, nº8: 1515‐1522. Neri‐Almeida D, de Mattos A, Medrano T, de Almeida P, Santos S, da Costa H. 2009. Lack of effect of nucleotide‐supplemented infant formula on the management of acute diarrea in infants. Nutr. Res. 29: 244‐247.
Neu, J. 2007. Gastrointestinal maturation and implications for infant feeding. Early Human Development, 83, 767–775 Otte J, Shalaby SM, Zakora M, Pripp AH, El‐Shabrawy S.A. 2007. Angiotensin‐converting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates: Effect of substrate, enzyme and time of hydrolysis. Int Dairy J, 17: 488–503. Ostrom KM, Cordle CT, Schaller JP, Winship TR, Thomas DJ, Jacobs JR,Blatter MM, Cho S, Gooch WM, Granoff DM, Faden H, Pickering LK. 2002. Immune status of infants fed soy‐based formulas with or without added nucleotides for 1 year: part 1: vaccine responses, and morbidity. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 34: 137‐44. Oakley AE, Collingwood JF, Dobson J, Love, G, Perrott HR, Edwardson JA, Elstner M, Morris CM. 2007. Individual dopaminergic neurons show raised iron levels in Parkinson disease. Neurology, 68:1820‐1825 Palmer C, Bik EM, DiGiulio DB, Relman DA, Brown PO. 2007. Development of the Human Infant Intestinal Microbiota. PLOS Biology, 5(7):1556‐1573 Paricio‐Talayero, JM, Hernández‐Aguilar MªT. 2009. En: Historia de la lactancia: Aspectos históricos de la lactancia al pecho. Lactancia materna. De la teoría a la práctica. Editorial panameriacana. Park KB, Oh SH. 2007. Production of yogurt with enhanced levels of gamma‐aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract. Bioresour Technol, 98: 1675‐1679. Pathirage SN, Pathigoda S, Peiris R, Ranganathan SS. 2009. Influence of exclusive breast feeding on occurrence, severity and recurrence of acute lower respiratory infections in preschool children. Sri Lanka Journal of Child Health, 38: 21‐24 Patterson J, Lei X, Miller D. 2008. The pig as an experimental model for elucidating the mechanisms governing dietary influence on mineral absorption. Experimental Biology and Medicine, 233:651‐664. Pereira GAPP, Genaro PS, Pinheiro MM, Szejnfeld VL, Martini LA. 2009. Dietary calcium‐ strategies to optimize intake. Rev Bras Reumatol, 49 (2):164‐80. Penders J, Thijs C, Vink C, Stelma FF, Snijders B, Ischa. 2006. Factors Influencing the Composition of
VIII. Summary
247
the Intestinal Microbiota in Early Infancy. Pediatrics, 118: 511‐521. Pellegrini A, Thomas U, Bramaz N, Hunziker P, Fellenberg R. 1999. Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine α‐lactalbumin molecule. Biochimica et Biophysica Acta, 1426: 439‐448. Perales S, Barbera R, Lagarda MJ, Farre R. 2005. Bioavailability of calcium from milk‐based formulas and fruit juices containing milk and cereals estimated by in vitro methods (solubility, dialyzability, and uptake and transport by caco‐2 cells). J Agric Food Chem, 53: 3721‐3726. Perales S, Barberá R, Lagarda MJ, Farré R. 2006. Fortification of milk with calcium bioavailability and interactions with iron and zinc. J. Agric. Food Chem., 54, 4901‐4906. Perales S, Barberá R, Lagarda MJ, Farré R. 2007. Availability of iron from milk‐based formulas and fruit juices containing milk and cereals estimated by in vitro methods (solubility, dialysability) and uptake and transport by Caco‐2 cells. Food Chemistry, 102 (4): 1296‐1303 Pérez AV, Picotto G, Carpentieri AR, Rivoira MA, Peralta‐López ME, Tolosa de Talamoni NG. 2008. Minireview on regulation of intestinal calcium absorption. Digestion, 77: 22‐34. Pérez‐Llamas F, Larqué E, Marín JF, Zamora S. 2001. Disponibilidad in vitro de minerales en fórmulas infantiles con distinta fuente proteica. Nutrición Hospitalaria XVI (5) 157‐161. Pérez‐Llamas, F., Gil, A., y Zamora, S. 2010. Capítulo 28: Calcio, fósforo, magnesio y fluor. Metabolismo óseo y su regulación. En tratado de Nutrición. Tomo i: Bases fisiológicas y bioquímicas de la nutrición. Peso‐Echarri P, Martínez‐Graciá C, Ros Berruezo GF, Vives I, Ballesta M, Solís G, Vasallo‐Morillas I, De los Reyes‐Gavilán CG, Margolles A, Gueimonde M. 2011. Assessment of intestinal microbiota of full‐term breast‐fed infants from two different geographical locations. Early Human Development, 87: 511–513. Permyakov EA, Shnyrov VL, Kalinichenko LP, Kuchar A, Reyzer IL , Berliner, LJ. 1991. J. Protein Chem. 10: 577‐584. Permyakov EA, Berliner LJ. 2000. Lactalbumin: structure and function. FEBS Letters, 473: 269‐274.
Pettker CM, Buhimschi IA, Magloire LK, Sfakianaki AK, Hamar BD, Buhimschi CS. 2007. Value of placental microbial evaluation in diagnosing intra‐amniotic infection. Obstet Gynecol. 109(3): 739–49. Picciano MF. 2001. Nutrient composition of human milk. Pediatr Clin North Am, 48: 53‐67. Pickering LK, Granoff DM, Erickson JR, Masor ML, Cordle CT, Schaller JP, Winship TR, Paule CL, Hylty MD. 1998. Modulation of the immune system by human milk and infant formula containing nucleotides. Pediatric, 101, 242‐249
Pihlanto‐ Leppälä A, Marnila P, Hubert L, Rokka T, Korhonen HJ, Karp M. 1999. The effect of a‐lactalbumin and b‐lactoglobulin hydrolysates on the metabolic activity of Escherichia coli JM103. Journal of Applied Microbiology, 87(4): 540–545. Pihlanto‐Leppälä A, Koskinen P, Piilola K, Tupasela T, Korhonen H. 2000. Angiotensin I‐converting Enzyme Inhibitory Properties of Whey Protein Digest: Concentration and Characterization of Active Peptides. Journal of Dairy Research, 67: 53–64. Pihlanto‐ Leppälä A. 2001. Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and ACE‐inhibitory peptide. Trends Food Sci Technol , 11: 347–56. Pinto M, Rabine‐Leon, S, Appay MD, Kedinger M, Triadou N, Dussaulx E, Louroix B, Simon‐Assmann P & Haffeb K. 1983. Enterocyte‐like differentiation and polarisation of the human colon carcinoma cell line Caco‐2 in culture. Biology of the Cell, 47: 323‐330. Puccio G, Cajozzo C, Meli F, Rochat F, Grathwohl D, Steenhout P. 2007. Clinical evaluation of a new starter formula for infants containing live Bifidobacterium longum BL999 and prebiotics. Nutrition, 23: 1‐8.
Ramírez‐Farias C, Slezak K, Fuller Z, Duncan A, Holtrop G, Louis P. 2009. Effect of inulin on the human gut microbiota: stimulation of Bifidobacterium adolescentis and Faecalibacterium prausnitzii. Br J Nutr; 101:541–50. REAL DECRETO 867/2008, de 23 de mayo, por el que se aprueba la reglamentación técnicosanitaria específica de los preparados para lactantes y de los preparados de continuación.
IX.Bibliografía
248
Rees L. 2005. Healthy digestión in infants. SA Farm Pract. 47(7); 31‐31. Reeves PG, Briske‐Anderson M, Newman SM. 1996. High zinc concentrations in culture media affect copper uptake and transport in differenciated human colon adenocarcinoma cells. Journal of Nutrition, 126: 1701‐1712. Reddy MB, Cook JD. 1994. Absorption of nonheme iron in ascorbic acid deficient rats. J. Nutr. 124(6): 882‐887. Reinhardt C, Reigstad CS, Bäckhed F. 2009 Intestinal microbiota during infancy and its implications for obesity. J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 48:249‐256
Rinttila T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A. 2004. Development of an extensive set of 16S rDNA‐targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real‐time PCR. J Appl Microbiol,97:1166–77. Rivera JA, CastilloLV, Sánchez JA. 2011. Detección de micoplasmas en cultivos celulares. ENF INF MICROBIOL, 31 (2): 60‐62 Rochat F, Cherbut C, Barclay D, Puccio G, Fazzolari‐Nescic A, Grathwohla D, Haschke F. 2007. A whey‐predominant formula induces fecal microbiota similar to that found in breast‐fed infants. Nutrition Research, 27: 735–740. Rodríguez‐Rodríguez EM, Sanz‐Alaejos M. y Díaz‐Romero C. 1999. Chemometric studies of several minerals in milks. <j. Agric. Food Chem, 47:1520‐1524. Rodríguez JM, Jiménez E, Merino V, Maldonado A, Marín ML, Fernández L, Martín R. 2008. Microbiota de la leche humana en condiciones fisiológicas. Acta Pediatr Esp. 66(2): 77‐82. Roig MJ, Alegría A, Barberá R, Farré R, Lagarda MJ. 1999. Calcium dialysability as an estimation of bioavailability in human milk, cow milk and infant formulas. Food Chem, 64: 403‐ 409. Ros, G. 2009. Alimentos infantiles para el periodo lácteo (parte I). Alimentacion, Nutricion y Salud, 16 (1): 1‐15. Rösner HI, Reinfield C. 2009. The Human α‐Lactalbumin Molten Globule: Comparison of Structural Preferences at pH 2 and pH 7. J. Mol. Biol. 394: 351–362
Rossi M, Amaretti A, Raimondi S. 2011. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients, 3: 118‐134. Round JL, Mazmanian SK. 2009. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nature Reviews, 9: 313‐323. Ruas‐Madiedo P, Gueimonde M, Margolles A, De los Reyes‐ Gavilan CG, Salminen S. 2006. Exopolysaccharides produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus. J. Food Prot. 69: 2011–2015 Rudloff S, Kunz C. 1997. Protein and nonprotein nitrogen components in human milk, bovine milk, and infant formula: quantitative and qualitative aspects in infant nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 24: 328–44. Sabater‐Molina, Larque E , Torrella F, Plaza J, Lozano MT, Muñoz A, Zamora S. 2009. Effects of dietary polyamines at physiologic doses in early‐weaned piglets. Nutrition, 25: 940–946. Saint‐Sauveur D, Gauthier SF, Boutin Y, Montoni A. 2008. Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and peptide fractions. International Dairy Journal 18, pp. 260–270. Saint‐Sauveur D, Gauthier SF, Boutin Y, Montoni A, Fliss I. 2009. Effect of feeding whey peptide fractions on the immune response in healthy and Escherichia coli infected mice. International Dairy Journal 19, pp. 537–544. Salami M, Yousefi R, Ehsani MR, Razavi H, Chobert JM, Haertl T, Saboury AA, Atri MS, Niasari‐Naslaji A, Moosavi‐Movahedi AA. 2009. Enzymatic digestion and antioxidant activity of the native and molten globule states of camel α‐lactalbumin: Possible significance for use in infant formula Int. Dairy J. 19: 518‐523. Salazar N, Gueimonde M, Hernández‐Barranco AM, Ruas‐Madiedo P, De los Reyes‐Gavilán CG. 2008. Exopolysaccharides Produced by Intestinal Bifidobacterium Strains act as Fermentable Substrates for Human Intestinal Bacteria. Appl. Environ. Microbiol, 74: 4737–4745. Salminen S, Bouley C, Boutron‐Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, Isolauri E, Moreau MC, Roberfroid MB, Rowland IR. 1998. Functional food science and gastrointestinal
VIII. Summary
249
physiology and function. British Journal of Nutrition, 80: S147‐S171. Salvini F, Riva E, Salvatici E, Boehm G, Jelinek J, Banderali G, Giovannini M. 2011. A specific prebiotic mixture Added to Starting Infant Formula Has Long‐Lasting Bifidogenic Effects. J. Nutr, 141: 1335‐1339 Sanderson IR, He Y. 1994. Nucleotide uptake and metabolism by intestinal epithelial cells. J Nutr, 124 (1 Suppl): 131S–7S. Sandström B, Cederblad A. 1980. Zinc absorption from composite meals. II. Influence of the main protein source. American Journal of Clinical Nutrition, 33: 1778–1783. Sandström B. 1992. Dose dependence of zinc and manganese absorption in man. Proc. Nutr. Soc. 51: 211‐218. Sandström O, Lönnerdal B, Graverholt G, Hernell O. 2008. Effects of α‐lactalbumin–enriched formula containing different concentrations of glycomacropeptide on infant nutrition. American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 87, No. 4, 921‐928. Savino F, Roana J, Mandras N, Tarasco V, Locatelli E, Tullio V. 2010. Faecal microbiota in breast fed infants after antibiotic therapy. Acta Pediatrica, 100: 75‐78. Sauer N, Bauer E, Vahjen W, Zentek J, Mosenthin R. 2010. Nucleotides modify growth of select intestinal bacteria in vitro. Livestock science, 133: 161‐163.
Saulnier DMA, Gibson GR, Kolida S. 2008. In vitro effects of selected synbiotics on the human faecal microbiota composition. FEMS Microbiol Ecol, 66: 516‐527 Schaller JP, Kuchan MJ, Thomas DL, Chordle CT, Winship TR, Buck RH, Baggs GE, Wheeler JG, Wheeler JG. 2004. Effects of dietary ribonucleotides on infant immune status. Part 1: Humoral responses. Paediatric Research 56, 883‐890
Schaller JP, Buck RH, Rueda R. 2007. Ribonucleotides: conditionally essential nutrients shown to enhance immune function and reduce diarrheal disease in infants. Semin Fetal Neonatal Med, 12: 35– 44.
Schanler RJ. 2001. The use of human milk for premature infants. Pediatr Clin North Am, 48: 207–19. Serra‐Majem Ll, Ribas L, García A, Pérez‐Rodrigo C, Aranceta J.2003. Nutrient adequacy and Mediterranean Diet in Spanish school children and adolescents. European Journal of Clinical Nutrition, 57 (1): S35–S39 Sghir A, Chow JM, Mackie RI. 1998. Continuous culture selection of bifidobacteria and lactobacilli from human faecal samples using fructooligosaccharide as selective substrate. J Appl Microbiol, 85: 769–777. Singhal A, Macfarlane G, Macfarlane S, Lanigan J, Kennedy K, Elias‐Jones A, Stephenson T, Dudek P, Lucas A. 2008. Dietary nucleotides and fecal microbiota in formula fed infants: a randomized controlled trial. J. Clin. Nutr. 87: 1785‐92. Singhal A, Kennedy K, Lanigan J, Clough H, Jenkins W, Elias‐Jones A, Stephenson T, Dudeck P, Lucas A. 2010. Dietary Nucleotides and Early Growth in Formula‐Fed Infants: A Randomized Controlled Trial. Pediatrics, 126 (4): 946‐953. Sua A, Bonnet R, Godon JJ, Gibson GR, Collins MD, Dore J. 1999. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals manynovel molecular species within the human gut. Appl Environ Microbiol, 65: 4799‐897 Suárez H, Cimino F, Bonilla E. 1985. Hierro en el sistema nervioso central: metabolismo y consideraciones fisiopatológicas. Invest Clín, 26: 247‐322. Swaisgood HE. 1995. Nitrogenous components of milk. F. Protein and amino acid composition of bovine milk. In R. G. Jensen (Ed.), Handbook of milk composition (pp. 464–468). New York, USA: Academic Press. Szymlek‐Gay EA, Hernell O, Abrams SA, Lönnerdal B, Graverholt G, Domellöf M. 2010. α‐Lactalbumin and Casein‐Glycomacropeptide Have No Effect on Iron Absorption From Low‐Iron Formula in Healthy Term Infants. Pediatric Research, 1: 12‐13.
Tannock GW, Munro K, Bibiloni R, Simon MA, Hargreaves P, Gopal P, Harsem H & Welling G. 2004. Impact of consumption of oligosaccharide‐ containing biscuits on the fecal microbiota of humans. Appl Environ Microbiol, 70: 2129‐2136.
IX.Bibliografía
250
Tiihonen K, Ouwehand AC, Rautonen. 2010. Human intestinal microbiota and healthy ageing. Ageing researches Rewviews, 9: 107‐116. Tolosa de Talamoni N, Perez A, Alisio A. 1998. Effect of cholecalciferol on intestinal epitelial cells. Trends Comp Biochem Physiol, 5: 179.185. Trabazo RL. 2005. Tendencias actuales en la formulación de alimentos para niños. An Pediatr, Monogr. 3(1):3‐15. Trabulsi J, Capeding R, Lebumfacil J, Ramanujam K, Feng P, McSweeney S, Harris B, DeRusso P. 2011. Effect of an a‐lactalbumin‐enriched infant formula with lower protein on growth. European Journal of Clinical Nutrition, 65: 167–174. Uauy R. 1989. Dietary nucleotides and requirements in early life. In: Lebenthal, editor. Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. 2nd ed. New York: Raven Press, p. 265–80. Uauy R, Stringel G, Thomas R, Quan R. 1990. Effect of dietary nucleosides on growth and maturation of the developing gut in the rat. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 10: 497‐503. Van Campen DR, Glahn RP. 1999. Micronutrient bioavailability techniques: accuracy, problems and limitations. Field Crops Research, 60: 93‐113. Van Hooijdonk AC, Kussendrager KD, Steijns JM. 2000. In vivo antimicrobial and antiviral activity of components in bovine milk and colostrum involved in non‐specific defence. Br J Nutr, 84 (Suppl 1): S127‐34. Vasallo, I. 2010. Estudio del efecto nutricional y bifidogénico de una formula infantil suplementada con nucleótidos, alfa‐lactoalbúmina y ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en niños recién nacidos sanos. Universidad de Murcia. Vasquez‐Garibay E, Mendez‐Estrada C, Romero‐Velarde E, Garcia‐Iglesias MT, Campollo‐Rivas O. 2004. Nutritional support with nucleotide addition favors immune response in severely malnourished infants. Arch Med Res, 35: 284‐8. Vásquez‐Garibay EM, Romero‐Velard E. 2008. Esquemas de alimentación saludable en niños durante sus diferentes etapas de la vida. Parte I. Primeros dos años de vida. Bol Med Hosp Infant Mex. Vol 65, Noviembre‐Diciembre. Venyaminov SY, Klimtchuk ES, Bajzer Z, Craig TA. 2004. Changes in structure and stability of
calbindin‐D28k upon calcium binding. Anal Biochem, 334: 97‐105. Viguria F, Miján de la Torre A. 2006. La pica: retrato de una entidad clínica poco conocida. Nutr. Hosp. 21 (5): 557‐66.
Waaij van der D. Microbial ecology of the intestinal microfl ora: infl uence of interactions with the host organism. In: Hanson LA, Yolken RH, editors. Probiotics, other nutritional factors and intestinal microflora. 1999; vol. 42. Nestle Nutrition Workshop Series. p. 1–15.
Waligora‐Dupriet AJ, Dugay A, Auzeil N, Nicolis I, Rabot S, Huerre MR, Bute MJ. 2009. Short‐chain fatty acids and polyamines in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Kinetics aspects in gnotobiotic quails. Anaerobe, 15: 138‐44. Wall R, Ross RP, Ryan CA, Hussey S, Murphy B, Fitzgerald GF, Stanton C. 2009. Role of gut microbiota in early infant development. Clin Med: Pediatr, 3:45‐54. Wang X, Gibson GR. 1993. Effects of the in vitro fermentation of oligofructose and inulin by bacteria growing in the human large intestine. J Appl Bacteriol, 75:373‐80. Wang X, Zhou B. 2010. Dietary zinc absorption: a play of Zips and ZnTs in the gut. IUBMB life, 62 (3): 176‐182. Watzke HJ. 1998. Impact of processing on bioavailability examples of mineral in foods. Trends in Food Science and Tecnology, 9: 320‐327. Weaver LT. 1992. Breast and gut: the relationship between lactating mammary function and neonatal gastrointestinal function. Proceedings of the nutrition society, 51: 155‐163. Weaver Berdine CM, Martin R., Nakatsu CH, Armstrong AP, Clavijo A, McCabe LD, McCabe GP, Duignan S,. Schoterman MHC, van den Heuvel EGHM. 2011. Galactooligosaccharides Improve Mineral Absorption and Bone Properties in Growing Rats through Gut Fermentation. J. Agric. Food Chem, 59: 6501‐6510. Wenzel U, Meissner B, Döering F, Daniel H. 2001. PEPT1‐Mediated Uptake of Dipeptides Enhances the Intestinal Absorption of Amino Acids Via Transport System. Journal of Cellular Physiology, 186: 251‐259. West AR, Oates PS. 2008. Mechanisms of heme iron absorption: current questions and
VIII. Summary
251
controversies. World J Gastroenterol , 14 (26): 4101‐4110. WHO 2002: http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_ guidelines.pdf.
Wold AE, Adlerberth I. 2000. Breast feeding and the intestinal microflora of the infant implications for protection against infectious diseases. Adv Exp Med Biol, 478: 77‐93. Yau KT, Huang CB, Chen W, Chen SJ, Chou YH, Huang FY, Kua KE, Chen N, McCue M, Alarcon PA, Tressler RL, Comer GM, Baggs G, Merritt RJ, Masor ML. 2003. Effect of nucleotides on diarrhea and inmune responses in healthy term infants in Taiwan. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 36: 37‐43. Yogman MW, Zeisel SH, Roberts C. 1982. Assessing effects of serotonin precursors on newborn behavior. J Psychiatr Res, 17: 123–33. Yoshida N, Yoshida T, Nakamura A, Monkawa T, Hayashi M, Saruta T. 1999. Calcitonin induces 25‐
hydroxyvitamin D 3 1alpha‐hydroxylase mRNA expression via protein kinase C pathway in LLC‐PK1 cells. J Am Soc Nephrol, 10: 2474–2479. Yu VY. 2002. Scientific rationale and benefits of nucleotide supplementation of infant formula. J Paediatr Child Health, 38: 543‐9. Yu VY. 1998. The role of dietary nucleotides in neonatal and infant nutrition. Singapore Med J, 39(4): 145–50. Zhang AS, Enns CA. 2009. Iron homeostasis: Recently indentified proteins provide insight into novel control mechanisms. Journal of biological chemistry. Vol. 284, nº 2 711‐715. Zimmermann MB, Hurrell RF. 2007. Nutritional iron deficiency. www. Thelancet.com vol 370. Zinn K, Chaudhuri T, Mountz M, Van der Berg G, Gordon D, Johannning G. 1999. 59Fe retained from an elemental 59Fe powder supplement without effects on 65zinc, 47calcium and 67copper in young pigs. Journal of Nutrition, 129(1): 181‐187.