Variabilidad en la determinación del estado de HER2por inmunohistoquímica en Chile
Luis Contreras-Melendeza,∗, Antonio Piottante-Beckera, María Contreras-Seitzb,María Garmendia-Floresa y Jorge Levican-Asenjoa
a Servicio de Anatomía Patológica, Clínica Las Condes, Santiago, Chileb Interno de Medicina, Universidad Andres Bello, Santiago, Chile
Recibido el 9 de julio de 2012; aceptado el 19 de septiembre de 2012Disponible en Internet el 13 de noviembre de 2012
PALABRAS CLAVENeoplasias de lamama;Genes;erbB-2, receptor;Inmunohistoquímica/normas/estándaresde laboratorios
ResumenIntroducción: La determinación del estado del gen HER2 en el cáncer de mama es un marcadorpronóstico, predictivo y de decisión terapéutica que requiere ser realizado con una técnicaexacta.Objetivo: Evaluar la variabilidad de la determinación del estado del HER2 por técnica inmuno-histoquímica (IHQ) en laboratorios chilenos.Pacientes y métodos: Se analizaron 221 biopsias con cáncer de mama invasivo provenientes de41 laboratorios nacionales para determinar el estado del HER2 por hibridación in situ fluores-cente (FISH). Un total de 201 biopsias permitieron análisis. El estado del HER2 se determinó porIHQ y FISH en forma estandarizada de acuerdo con las recomendaciones de la American Societyof Clinical Oncology y el College of American Pathologists. Estos resultados fueron comparadoscon los informes de IHQ provenientes de los diferentes laboratorios.Resultados: La variabilidad de la evaluación del estado de HER2 en laboratorios nacionales essimilar a lo descrito en la literatura internacional: llega al 19,7% cuando se compara con unatécnica IHQ estandarizada y alcanza el 26,9% cuando se compara con FISH. La tasa de falsospositivos en IHQ es del 15,7 y del 25,6% comparados con FISH.Conclusiones: Este estudio confirma la necesidad de que los laboratorios chilenos que realicen
l tratamiento oncológico basado en dianas moleculares sencuentra en plena investigación y desarrollo, esperándoseue en el futuro se convierta en el estándar de tratamiento.l receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2
HER2 es uno de los blancos terapéuticos más estudiado.Del 18 al 20% de los cánceres de mama presentan sobreex-
resión de la proteína HER21,2, lo que se debe al mecanismoe amplificación del gen en el 96,5% de los casos3, lo quee ha establecido como un marcador de mal pronóstico enacientes con cáncer de mama con o sin metástasis eninfonodos4,5.
El estado de HER-2 es predictivo de respuesta a terapiasistémicas. Las pacientes con sobreexpresión de HER2 eneneral no se benefician del tratamiento con tamoxifeno6,ero sí con el uso de quimioterapia basada en antraciclina,osiblemente debido a la amplificación simultánea de topoi-omerasa II7,8. Además muestran una buena respuesta con laerapia con trastuzumab9 (Herceptin®).
Existen varios métodos para determinar el estado deER2, y los más utilizados consisten en la demostración de laobreexpresión de la proteína por inmunohistoquímica (IHQ)
la demostración de la amplificación del gen HER2 por hibri-ación in situ fluorescente (FISH). De estos se encuentranprobados por la Food and Drug Administration (FDA) parandicar terapia con trastuzumab los métodos inmunohisto-uímicos de HercepTestTM (Dako®) y Pathway® HER-2/neuVentana®) y los métodos de FISH PathVysion® (Abbott®) yER2 FISH pharmDxTM (Dako®).
Para que el resultado del estado HER2 realizado porécnicas aprobadas por la FDA sea válido, requiere seguirstrictamente las instrucciones del fabricante, no solo conos reactivos proporcionados en los kits sino también en los
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iempos y el tipo de fijación, recuperación antigénica y equi-amiento con el que se realizó su aprobación. Cualquierambio que se realice en ellas obliga a que la técnica seaalidada por el laboratorio10.
La identificación de pacientes que requieren terapia conrastuzumab se basa en que la detección del estado delER2 se realice con una técnica exacta y reproducible11.sí, los pacientes correctamente seleccionados son benefi-iados con un aumento de la sobrevida, y los que no, evitanl perjuicio económico y la exposición a efectos adversos dea terapia utilizada12.
Existe una variabilidad publicada en la determinación delstado del HER2 de alrededor del 20% cuando se compa-an técnicas hechas con similares metodologías (IHQ o FISH)ntre laboratorios de referencia y/o centralizados con res-ecto a laboratorios locales13,14. Esta variabilidad tambiéne muestra en los resultados de pruebas de intercomparaciónon tinciones deficientes de IHQ para HER215.
Varios países han desarrollado guías de recomendacio-es para la determinación del estado del HER2 con el fine mejorar su exactitud. A pesar de no haber consensontre estas guías, en ellas se senala que, independiente-ente de la técnica que se emplee, esta debe ser primero
alidada, y además debe contarse con procedimientos deseguramiento de la calidad que incluyan tanto controlesnternos como externos16.
La guía de recomendaciones de la American Society oflinical Oncology y el College of American PathologistsASCO/CAP) publicada el ano 2007 identifica las posiblesuentes de variación en las fase preanalítica, analítica y
ostanalítica de la IHQ, que podrían explicar la importanteariabilidad observada en los estudios clínicos, e incluyeambién cambios en los criterios de interpretación con losue fueron aprobados las técnicas de IHQ y FISH por la FDA
Variabilidad en la determinación del estado de HER2 por inmunohistoquímica en Chile 35
Tabla 1 Comparación de parámetros para asignar puntaje a la expresión del gen HER2 en la tinción IHQ
Resultado Puntaje IHQ Herceptest® FDA ASCO/CAP
Negativo 0+ Ausencia de tinción o tinciónde membrana en < 10% de lascélulas tumorales
Ausencia de tinción o tinciónde membrana en < 10% de lascélulas tumorales
1+ Tinción de membrana débil,levemente perceptible en> 10% de las células tumorales,las células exhiben tinción demembrana incompleta
Tinción incompleta o débil enmembranas de célulastumorales (cualquierporcentaje)
No concluyente«Equívoco»
2+ Tinción de membrana completadébil a moderada en > 10% delas células tumorales
Tinción de membrana intensaen < 30% del tumor o tinción demembrana completa, débil oheterogénea en > 10% de lascélulas tumorales
Positivo 3+ Tinción de membrana intensa,completa en > 10% de lascélulas tumorales
Tinción de membrana intensa,completa, uniforme en > 30%de las células tumorales
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para la terapia con trastuzumab (tabla 1). Recomienda ade-más que el laboratorio que realice estas técnicas sea unlaboratorio acreditado por el CAP y que la técnica IHQ hayasido validada con un 95% de concordancia respecto del FISHu otra técnica validada, entre otros aspectos17.
En Chile no existen estudios respecto a la variabilidadde los resultados de las técnicas de IHQ empleadas parala detección del estado del HER2 en el cáncer de mama, yel presente trabajo pretende determinar la variabilidad delestado del HER2 por IHQ en laboratorios chilenos. Para ellose compararán los resultados del estado HER2 entregadospor diferentes laboratorios nacionales con los resultados deun laboratorio que cuenta con técnicas de IHQ y FISH estan-darizadas, aprobadas por la FDA y que tiene implementadoun método de aseguramiento de la calidad de acuerdo conlas recomendaciones ASCO/CAP18.
Pacientes y métodos
Durante los anos 2008 y 2009, provenientes de 41 laborato-rios públicos y privados chilenos, ingresaron al Laboratoriode Anatomía Patológica de Clínica Las Condes (APCLC)221 biopsias de 221 mujeres con cáncer de mama inva-sivo para determinar el estado de HER2 por FISH comométodo de estudio confirmatorio de resultados de laborato-rios locales en técnica inmunohistoquímica y como condiciónpara iniciar tratamiento con trastuzumab. Un total de 201(90,1%) casos permitieron análisis y 20 (9,9%) resultaroninadecuados. Se recibieron el consentimiento informado, lasinclusiones de parafina, el informe anatomopatológico deltumor y el informe del estado de HER2 determinado por IHQen cada laboratorio. El promedio de edad de las pacientesfue de 52 anos (rango 26-90), y el promedio de tamano tumo-ral fue de 26 mm (rango 5-75). El 85,3% de los tumores fue de
tipo ductal, el 4,3% de tipo lobulillar y el 10,4% correspondióa otros tipos histológicos.
En cada caso el patólogo realizó la confirmación histo-lógica del tumor y seleccionó una zona representativa de
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ste para FISH e IHQ. Se detectó la expresión de HER2 porHQ usando Herceptest TM (DAKO, Carpintería, CA) y para elstudio de amplificación se usó FISH pharmaDx TM Kit, DAKO.n ambos casos se siguieron estrictamente las instruccionesel fabricante.
La valoración del estado del HER-2 por IHQ fue reali-ada por el patólogo usando microscopia de luz según lasecomendaciones de ASCO/CAP17 (tabla 1 y fig. 1).
Para la determinación de la amplificación del gen HER2or FISH se contaron las senales para HER2 y las senalesentroméricas del cromosoma 17 (CEN17) en 20 núcleos delomponente tumoral invasivo, y los núcleos se tineron conAPI (fig. 1). Se calculó la razón de senales HER-2/CEN-17 ye categorizó a cada paciente en uno de los siguientes gru-os: amplificado (razón > 2,2), no amplificado (razón < 1,8)
no concluyente o «equívoco» (razón entre 1,8-2,2). En losasos en que la razón resultó no concluyente se contaronas senales en 20 núcleos adicionales según las recomenda-iones ASCO/CAP17.
Se registraron los resultados de las técnicas de IHQbtenidas en laboratorios externos y APCLC junto con losesultado de FISH, que fue considerado como gold standardara efectos de este estudio.
Para el cálculo de concordancia, falsos negativos, fal-os positivos, sensibilidad, especificidad, valor predictivoositivo y valor predictivo negativo se utilizaron tablas deontingencia, excluyendo los resultados 2+.
seguramiento de la calidad de lanmunohistoquímica e hibridación in situuorescente en el laboratorio de anatomíaatológica de Clínica Las Condes
ontrol de calidad interno. Tanto para HerceptestTM como
ara HER2 FISH pharmaDxTM este fue verificado con el usoe cortes de tejidos controles negativos y positivos pues-os en el mismo portaobjetos. En ambas técnicas, siempreue estuvo presente, se verificó el control interno negativo
36 L. Contreras-Melendez et al
Figura 1 Tinciones inmunohistoquímicas e hibridación in situ fluorescente (FISH) evaluados según criterios ASCO/CAP. A) Tin-ción inmunohistoquímica para HER2 negativa 0 (400×). B) Tinción inmunohistoquímica para HER2 negativa 1+ (400×). C) Tincióninmunohistoquímica para HER2 no concluyente 2+ (400×). D) Tinción inmunohistoquímica para HER2 positiva 3+ (400×). E) FISH noamplificado (1.000×). F) FISH amplificado (1.000×).
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n el tejido a estudiar. La corrida de IHQ se validó siempreon la tinción de las láminas de cultivo celular entregadasor el fabricante según sus instrucciones y la lámina conontrol negativo de reactivo de cada muestra.Control dealidad externo. Se realizó a través del Colegio Americanoe Patólogos (CAP).
alidación de técnicas
erceptest: 100% de concordancia con FISH (25 casos).FISH: 97,4% de concordancia en pruebas de intercompa-
ación (40 casos)
esultados
os resultados de la determinación de HER2 por IHQ enaboratorios locales se comparan con los resultados obte-
idos con la técnica IHQ en APCLC en la tabla 2. Estosesultados se comparan además con la técnica de FISH enPCLC en la tabla 3, y finalmente los resultados de lasécnicas IHQ y FISH, cuando ambas son efectuadas en APCLC
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obre los mismos tejidos enviados por laboratorios locales,e comparan en la tabla 4.
Los casos con resultados por IHQ de 2+ considerados comoquívocos o no concluyentes son excluidos para efectos deálculos de sensibilidad, especificidad, concordancia, valorredictivo positivo y valor predictivo negativo, ya que no esosible designarnos como verdaderos positivos o negativosi tampoco como falsos positivos o negativos
De las 201 muestras analizadas, 14 (7%) ingresaron cate-orizadas en los laboratorios externos como negativas 0 y+, 121 (60,2%) como positivas 3+ y 66 (32,8%) como nooncluyentes 2+ (tabla 2).
Los resultados de la IHQ de laboratorios externos y APCLCe muestran en la tabla 2.
De las 14 muestras que ingresaron como negativas, 4esultaron positivas (28,6%), 4 resultaron no concluyentes28,6%) y 6 fueron negativas (42,8%).
De las 66 muestras ingresadas como no concluyentes,
3 (34,8%) mantuvieron este mismo resultado, 19 (28,8%)ueron positivas y 24 (36,4%) fueron negativas.
De las 121 muestras que ingresaron como positivas (3+),8 (72,7%) fueron confirmadas como positivas, 19 (15,7%)
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Tabla 2 Resultados de tinciones IHQ efectuadas en laboratorios externos vs tinciones IHQ para HER2 en APCLC
resultaron negativas y 14 (11,6%) resultaron no concluyen-tes.
Estos resultados muestran una sensibilidad del 95,7%, unaespecificidad del 24%, una concordancia del 80,3%, un valorpredictivo positivo del 82,2% y un valor predictivo negativodel 60% de la técnica IHQ efectuada en laboratorios externoscomparada con la técnica IHQ efectuada en APCLC.
Los resultados de las IHQ de laboratorios externos com-paradas con FISH en APCLC se muestran en la tabla 3
De los 121 casos informados como positivos por IHQ enlaboratorios externos, 90 (74,4%) demostraron amplificacióny 31 (25,6%) no mostraron amplificación. En los 14 casosinformados como negativos se demostró amplificación en 4de ellos (28,6%). De los 66 casos ingresados como 2+, mostra-ron amplificación 22 (33,3%) y no hubo amplificación en 43(65,2%); un caso (1,5%) resultó no concluyente en FISH. Estos
resultados demuestran una sensibilidad del 95,7%, una espe-cificidad del 24,4%, una concordancia del 74,1%, un valorpredictivo positivo del 74,4% y valor predictivo negativo del71,4%.
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Los resultados de la IHQ y FISH efectuadas en APCLC seuestran en la tabla 4. Los 49 casos diagnosticados como
egativos por IHQ de APCLC fueron confirmados por FISH, degual manera los 111 casos informados como positivos en IHQesultaron amplificados en FISH. Con estos datos se obtuvie-on una sensibilidad, una especificidad, una concordancia,n valor predictivo positivo y un valor predictivo negativoel 100%. De los 41 casos informados como no concluyentes,5 resultaron no amplificados (85,4%), 5 resultaron ampli-cados (12,2%) y un caso persistió como no concluyente2,4%).
iscusión
ste es el primer estudio nacional acerca de la variabilidad
n la determinación del estado del HER2 por IHQ en biopsiase pacientes con cáncer de mama invasivo.
Nuestros resultados muestran similar variabilidad queos descritos en la literatura13,14: llegan al 19,7% cuando
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e comparan con una técnica IHQ estandarizada y al 25,9%uando se comparan con FISH. La tasa de falsos positivoss del 15,7% al comparar resultados de IHQ y del 25,6% alomparar IHQ con FISH. La tasa de falsos negativos alcanzal 28,6% tanto para IHQ como para FISH. Estos resultadosolo representan una fracción de la variabilidad que puedexistir en los laboratorios nacionales; la muestra incluye enu mayoría casos 2+ y 3+ por IHQ (93,1%).
Cuando se evaluaron los 14 casos referidos como negati-os (0 o 1+), el 28,6% resultaron ser falsos negativos. El grupoe exámenes negativos por técnica de IHQ derivados a nues-ro laboratorio para estudio con técnica de FISH representaolo el 6,9%, mientras que en la población general repre-enta el 58-60% de todos los casos1,2, afectando de estaanera los cálculos de sensibilidad, especificidad y valorredictivo negativo para este grupo, por lo que deben seromados con precaución. Sin embargo, y a pesar de lo ante-ior, no habría razón para suponer que esta tasa en nuestroaís pudiera ser diferente en la población general, ya quel repetir la IHQ en nuestro laboratorio en las mismas mues-ras derivadas tuvimos una concordancia con FISH del 100%n casos positivos y negativos, datos similares a los reporta-os en otros trabajos19. Una de las causas más importantese falsos negativos según la literatura son los problemas dejación de las muestras20,21, y aunque esto pudiera ser unactor que explicara estos resultados, en nuestra opinión esoco probable ante los resultados al repetir IHQ en nuestroaboratorio.
Con la estandarización de la fijación se logra una dismi-ución de la categoría de exámenes inadecuados del 10,5 al,4%, mejorando además la concordancia entre IHQ y FISH22.n nuestros resultados el 9,9% de los exámenes no permitie-on análisis de FISH, lo que indica problemas preanalíticososiblemente por fijación inadecuada.
Al analizar los casos enviados como 3+ por los labora-orios locales para confirmación por FISH la tasa de falsosositivos al comparar sus resultados con IHQ y FISH enPCLC fue del 15,7 y del 25,6%, respectivamente. Aproxi-adamente una de cada 4 pacientes referidas con informeositivo 3+ en IHQ no demostró amplificación del gen enISH, lo que implica someter a estas pacientes a los efec-os de toxicidad del trastuzumab sin beneficio terapéutico,ausando además un perjuicio económico tanto para lasacientes como para el sistema de salud, debido al altoosto de cada tratamiento. Las fuentes que contribuyen ena tasa de falsos positivos son el procesamiento del tejido,a variabilidad de reactivos, la recuperación de antígenos
la interpretación19,23-26.En nuestro trabajo, al comparar los 66 casos referidos
omo 2+ hubo un 34,8% de concordancia en IHQ. Son resul-ados similares a los publicados por Reddy27, quien obtuvon 26% de concordancia en este tipo de muestras. Cuarenta yres casos (65,2%) resultaron positivos o negativos en APCLC;sando las recomendaciones de la ASCO/CAP, estos no hubie-an requerido confirmación por FISH17, evitando así el costoconómico para las pacientes de esta técnica y una mejorelección del tratamiento.
En nuestro trabajo no dispusimos de información sobre elipo y el tiempo de fijación, las láminas de IHQ para revi-
ión, los anticuerpos utilizados, los protocolos de tinción nil criterio de interpretación empleados. Es por este motivoue no pudimos identificar en forma objetiva las fuentes de
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ariabilidad en la determinación del estado del HER2 porHQ.
La alta variabilidad demostrada en este estudio podríaxplicarse por diferencias en la sensibilidad y la especifi-idad de los diferentes anticuerpos usados en IHQ15,20,26,28,n la falta de estandarización de las técnicas15, en laalta de procedimientos de control de calidad externo enterno, entre otros17, o por diferencias en el criterio denterpretación28,29.
Inferimos que una de las fuentes más importantes deariabilidad en este estudio es el criterio de interpretación,ues hubo un 80,3% de concordancia para los resultados deHQ entre los laboratorios externos y el nuestro. Al respecto,a literatura reporta que al estandarizar estos criterios laoncordancia entre IHQ y FISH mejora del 69,4 al 94,7%28.
En nuestro estudio, al usar criterios de interpretaciónstandarizados sobre las muestras analizadas según las reco-endaciones de ASCO/CAP17, las que en la literatura hanemostrado tener un mayor valor predictivo de respuesta aa terapia29, obtuvimos una concordancia entre ambas técni-as del 100%, el número de casos con resultados equívocos seedujo de 66 a 41, y con el uso de técnica estandarizada noubo falsos negativos. Creemos que esta mejor concordanciae debe a la implementación de todas las recomendacio-es de esta guía, datos similares a los reportados en otrasxperiencias22.
Suponemos que las posibles fuentes de variabilidad de laécnica misma, como los anticuerpos y los reactivos usados,os procedimientos técnicos estandarizados con controles dealidad interno y externo, entre otros, no difieren a lo repor-ado en la literatura de otros países, y estarían influyendon los resultados de los laboratorios externos.
Este estudio muestra que la variabilidad encontrada ena determinación del estado HER2 por IHQ en nuestro país esreocupante. Confirma además que para obtener un resul-ado exacto es necesario contar con técnicas IHQ validadas,rocedimientos y criterios de interpretación estandariza-os, con estrictos controles de calidad tanto internos comoxternos, los que permite identificar de forma objetiva a lasacientes en las cuales la terapia específica o combinacionese ella serán efectivas.
esponsabilidades éticas
rotección de personas y animales. Los autores declaranue para esta investigación no se han realizado experimen-os en seres humanos ni en animales.
onfidencialidad de los datos. Los autores declaran que enste artículo no aparecen datos de pacientes.
erecho a la privacidad y consentimiento informado. Losutores declaran que en este artículo no aparecen datos deacientes.
onflicto de intereses
os autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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Agradecimientos
A las tecnólogos médicos Carmen Arriagada Vargas y AnaMaría Oyarzun Macías por su compromiso con el asegura-miento de la calidad de las técnicas inmunohistoquímicas.
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