Vías de senalización intracelular en el carcinomaescamoso infiltrante de cérvix uterino. Identificaciónde nuevos marcadores pronósticos
Francesc Alamedaa,b,c,∗, Gemma Mancebob,d, Belen Lloverasa,e, Josep Maria Soled,Laia Garrigos f, Ramon Carrerasb,d, Montserrat Arumi-Uriaa,c,e, Joan Albanell c,f,Sergi Serranoa,b,c y Federico Rojog
a Servicio de Patología, Hospital del Mar, Barcelona, Espanab Universidad Autónoma de Barcelona, Barcelona, Espanac Instituto Municipal de Investigación Médica, Barcelona, Espanad Servicio de Ginecología y Obstetricia, Hospital del Mar, Barcelona, Espanae Universidad Pompeu Fabra, Barcelona, Espanaf Servicio de Oncología, Hospital del Mar, Barcelona, Espanag Servicio de Patología, Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Espana
Recibido el 7 de octubre de 2013; aceptado el 8 de diciembre de 2013Disponible en Internet el 13 de marzo de 2014
ResumenAntecedentes y objetivos: Los receptores de tirosincinasa están frecuentemente activados enlos tumores humanos malignos. Esta activación lleva a las células a altos niveles de proliferación,migración, desdiferenciación, diseminación y resistencia a la apoptosis. Las vías de senalizacióndependientes de la activación de los receptores de la familia ErbB/HER en las que se han descritoalteraciones son las vías RAS-RAF-ERK, PIK3-AKT, MAPK y NFKB. El estudio de la actividad deestas vías puede ayudar a identificar aquellos tumores con alta agresividad y puede informaracerca de puntos de interés con potencial terapéutico.Material y métodos: Realizamos estudio inmunohistoquímica de EGFR, p-EGFR, p38, p-ERK ½,JNK, p-AKT, p65, p50, p52, relB, c-Rel y MAPK-1 en 32 carcinomas escamosos infiltrantes decérvix uterino en una matriz de tejidos.Resultados: Solamente la inmunoexpresión de p-ERK mostró correlación con el estadio dela enfermedad (p < 0,001) y la recidiva (p < 0,001). Además, la inmunoexpresión de MKP1 se
correlacionaba inversamente con los niveles de inmunoexpresión de p-JNK (p = 0,036) y p-p38(p = 0,011), indicando que MKP1 podría tener actividad anti-apoptótica. Esta hipótesis es refor-zada por la demostración de la correlación entre la detección de MKP y la mala respuesta altratamiento (quimioterapia y radioterapia).
∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [email protected] (F. Alameda).
n los últimos anos la frecuencia de carcinoma escamosonfiltrante de cérvix uterino ha disminuido en Espana debido
la introducción y a la práctica periódica de la citologíaervicovaginal.
Por otro lado, la mayor parte de los estudios se han diri-ido a las lesiones preneoplásicas, la acción de los VPH,n especial los de alto riesgo (VPH-AR), sobre el epite-io cervical normal y su proceso de carcinogénesis, pero lanformación acerca de los acontecimientos bioquímicos enl desarrollo y progresión tumoral, así como la respuestaerapéutica en el carcinoma escamoso invasivo de cérvixterino, es escasa. Los acontecimientos bioquímicos rela-ionados con los mecanismos de senalización intracelularesponsables del traslado de senales hacia el núcleo han sidooco estudiados en estos tumores, al contrario de otros car-inomas como el de mama, en los cuales algunas de estaslteraciones se han relacionado con respuesta terapéutica yronóstico1,2.
Los receptores de tirosincinasa están frecuentementectivados en los tumores humanos malignos3. Esta activa-ión lleva a cambios celulares mediados por distintas vías
e senalización, situando a las células en altos niveles deroliferación, migración, desdiferenciación, diseminación yesistencia a la apoptosis. Los cambios que ocurren en la
ecd
embrana citoplasmática modifican los mecanismos regula-ores de las células y favorecen el fenotipo maligno. Algunase las vías de senalización que dependen de la familiae receptores ErbB/HER están alteradas en las neoplasiasumanas. Distintas alteraciones se han observado en lasías RAS-RAF-ERK, PIK3-AKT, MAPK y NFKB. Estas vías deenalización están relacionadas con el estrés celular, la pro-iferación, la resistencia a la apoptosis y la resistencia agentes quimioterápicos.
La expresión inmunohistoquímica de EGFR está aumen-ada en la displasia, el carcinoma in situ y el carci-oma infiltrante4. Se ha relacionado también con malronóstico5,6, probablemente por mala respuesta al trata-iento, especialmente en aquellos casos que se acompanane alteraciones de RAS4,7. Además, la expresión de los com-onentes de las vías dependientes de EGFR, como p-AKT
p-ERK, así como la expresión de la forma fosforilada deGFR (p-EGFR), no parecen tener impacto pronóstico enos carcinomas escamosos infiltrantes de cérvix uterino,n estadios tempranos, tratados con cirugía8. La inhibi-ión de algunas proteínas relacionadas con las vías de EGFRarece sensibilizar al carcinoma escamoso infiltrante, a laadioterapia y, por tanto, esperar una mejor respuesta a
ste tratamiento9. En las lesiones preneoplásicas, la inhibi-ión de EGFR por erlotinib previene de la inmortalizacióne las células escamosas infectadas por VPH, estimulando
M
CvHsiqdsum4W
lpyqctcpdcctmt
Marcadores pronósticos en cancer de cérvix
la apoptosis e induciendo senescencia. Dado que en célu-las infectadas por VPH la inmortalización por E6/E7 esun paso clave en la carcinogénesis cervical, EGFR es unadiana potencial para terapia quimiopreventiva en muje-res con alto riesgo de desarrollar carcinoma escamoso decérvix10.
También se ha observado una correlación entre la inmu-noexpresión de Pi3K y AKT con el estadio clínico, el gradopatológico y las metástasis ganglionares en estas neoplasias,si bien no se han correlacionado con la edad, el tamanotumoral o el tipo histológico11. Además, la expresión dep-AKT aumenta con el grado de las lesiones preneoplásicas12.Una disminución de los niveles de p-AKT se asocia con super-vivencia global13, y un incremento, con peor pronóstico14.p-AKT puede usarse como marcador de predicción de la res-puesta a radioterapia y quimioterapia15.
Se ha demostrado activación de la vía NFkB en la líneacelular de carcinoma escamoso de cérvix CD40+. La expre-sión de CD40, un miembro de la familia de receptores deTNF, es muy baja en epitelio normal y aumenta en las célulasinfectadas por VPH. Además, estas líneas celulares mues-tran un incremento de la actividad de la vía MAPK, así comoincremento de marcadores moleculares relacionados conlinfocitos T citotóxicos específicos16.
Diversos estudios han mostrado coactivación de las víasNOTCH (Notch1, Jagged1, Hes1 y CDK9) y NFkB (p50 y p65) yexpresión genérica de BCL2 y Ciclina D1. Estos datos sugie-ren que NOTCH1 es el regulador final17. La co-expresión delas vías de NOTCH1 y NFkB se asocia con progresión en el
carcinoma escamoso de cérvix. l
EGFR
p-ERK p-p38
p-EGFR
Figura 1 Expresión de EGFR, p-EGFR, p-ERK, p-P38, p-JNK y p-AKTp-EGFR se expresa débilmente. p-AKT y P-ERK se expresan en el núc
71
aterial y método
uarenta casos de carcinoma escamoso infiltrante de cér-ix uterino diagnosticados en el Servicio de Patología delospital del Mar durante los anos 1998 a 2004, ambos inclu-ive. Dos de ellos fallecieron en el periodo posquirúrgiconmediato y 6 no acudieron a controles después del alta pos-uirúrgica, de manera que solamente se dispone de datose seguimiento en 32 casos. Se escogieron 2 campos repre-entativos de cada caso para construir una matriz de tejidossando un Advanced Tissue Arrayer (Chemicon, Nippon Che-icon Corporation, Tokyo, Japón). Se obtuvieron secciones a
�m con un micrótomo Leica RM 2255 (Leica Microsystems,etzlar, Alemania).
Se realizó estudio inmunohistoquímico de EGFR, p-EGFR,os miembros activados de la vía MAPK (p38, ERK ½, JNK),-AKT, las 5 subunidades de la vía NFkB (p65, p50, p52, relB
c-Rel) y la fosfatasa específica de MPK-1 Se consideróue la inmunorreactividad era positiva según los siguientesriterios: EGFR y p-EGFR cuando se observaba inmunorreac-ividad citoplasmática y de membrana10; p-ERK y p-AKTuando se observaba inmunorreactividad en núcleo y cito-lasma, p38, JNK, las subunidades de NFkB y MKP1 en casoe inmunorreactividad nuclear (figs. 1-3). Los datos paraada anticuerpo se muestran en la tabla 1. Los distintosasos se consideraron positivos o negativos para los distin-os anticuerpos, utilizando la mediana de expresión de losismos, según criterio establecido previamente18. Los resul-
ados se relacionaron con el estadio tumoral, la recidiva y
a respuesta al tratamiento.
p-JNK
p-AKT
. EGFR se expresa fuertemente con patrón de membrana, peroleo y en el citoplasma. p-p38 y p-JNK se expresan en el núcleo.
72 F. Alameda et al
p52 RelB
p65 p50 cRel
Figura 2 Expresión de las subunidades de NFKB P65, P50, P52, C-REL y REL-B. Expresión y nuclear.
p-ERK MKP-1
p-JNKp-p38
Figura 3 Regulación de MAPK (ERK, P38 y JNK) en el tumor: estos casos muestran altos niveles de expresión de p-ERK (núcleoy citoplasma) en las células neoplásicas que correlacionan con expresión fuerte y difusa de MKP1 (núcleo). Los niveles de p-P38 yp
-JNK eran indetectables en estos casos, sugiriendo inhibición de su expresión.
Marcadores pronósticos en cancer de cérvix 73
Tabla 1 Características de las proteínas estudiadas
Proteína Actividad Clona Dilución Resultado
EGFR SIG D-HER-1 PRE C-MEGFR-P SIG D-9H2 1:25 C-MVía MAPK
P38-P APO CS- THR180/182 1:100 NERK ½-P PROL CS-THR 202 1:50 N + CJNK-P APO CS-P 1:100 NAKT (A) CS-P 1:50 N + C
membrane; C-N: cytoplasm and nuclei; CS: cell signaling; D: dakosignalling.
Estudio estadístico
Se usó el test Chi-cuadrado o el test de Fisher para analizarla relación entre las variables categóricas. Se usó el paqueteSPSS 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, statistical package) parael análisis estadístico.
Resultados
Pacientes
La edad media de las pacientes fue de 55 anos (rango:38-83 anos). Dos de las pacientes eran HIV positivas peroninguna había desarrollado la enfermedad. La estadifica-ción se realizó mediante la clasificación de la FIGO. Un casocorresponde a estadio IA, 24 casos a estadio IB1, un caso aestadio IB2, un caso a estadio IIA y 5 casos a estadio IIB.
Veinticinco casos fueron sometidos a tratamiento quirúr-gico. En 21 de ellos se anadió además radioterapia; en 6,braquiterapia, y en 10, quimioterapia. Siete casos no fue-ron sometidos a cirugía. Dos de estos 7 casos fueron tratadossolamente con radioterapia, y en los 5 restantes se anadióquimioterapia y braquiterapia.
Se obtuvieron datos de seguimiento entre 2 y 12 anos pos-teriores al diagnóstico. Una paciente falleció a los 3 anos deldiagnóstico por un accidente vascular cerebral, sin eviden-cia de lesión de carácter neoplásico. Veintiséis casos estabanlibres de enfermedad entre los 2 y los 12 anos de segui-miento. Cinco casos recidivaron. La recidiva se objetivó porestudios de imagen y documentación morfológica (citología,biopsia o ambas). La localización de la recidiva fue en gan-glios linfáticos de diversas localizaciones (retroperitoneales,supraclaviculares, laterocervicales o una combinación deellos) en 4 de los 5 casos, y vaginal en 2 de los 5 casos. Dos
de los casos que recidivaron estaban en estadio IB1 y habíansido tratados con cirugía, radioterapia y quimioterapia. Losrestantes 3 casos que recidivaron estaban en estadio IIB yhabían sido tratados uno con radioterapia, otro con cirugía,
sdlt
AKT-P 54% MKP1 40%
adioterapia y quimioterapia, y el tercero con radioterapia quimioterapia.
studio inmunohistoquímico
l 50% de los casos expresaban EGFR, pero solamente el 10%xpresaban la forma fosforilada (p-EGFR) (tabla 2). p-ERKostraba inmunorreactividad en el 31% de los casos, por
o que consideramos activada la vía RAS-RAF-ERK en estosasos. Detectamos inmunorreactividad para p-p38 en el 38%e los casos e inmunorreactividad para p-JNK en el 30% deos casos. p-AKT se expresaba en el 54% de los casos. Losomponentes de la vía NFK mostraban diferentes grados denmunoexpresión como sigue: p65 en el 64% de casos, p50n el 24%, p52 en el 59%, REL-B en el 36% y c-REL en el 34%.
orrelación con variables clínicas
olamente la inmunoexpresión de p-ERK se correlacionabaon el estadio (p < 0,001) y la recidiva (p < 0,001). La expre-ión de MKP1 correlacionaba inversamente con la expresión
e p-JNK (p = 0,036) y p-p38 (p = 0,011) (tabla 3). Además,a presencia de MKP correlacionaba con mala respuesta aratamiento radioterápico y quimioterápico.
74
Tabla 3 Relación entre los datos clínicos y la expre-sión inmunohistoquímica (relaciones estadísticamentesignificativas)
P-ERK Estadio p < 0,001
P-ERK Recidiva p < 0,001P-ERK MKP-1 p < 0,001MKP-1 JNK-P (I) p = 0,036MKP-1 P38-P (I) p = 0,011
D
LeudEdLel1adpvasp
vamlsdepnp
nA2vdptplpmSgN2ieo
E(
n(cecr
aepipbEd
R
Pqt
Ce
Dap
C
L
B
factor receptor expression on disease-free survival and rate
(I): correlación inversa.
iscusión
a infección por VPH-AR es una condición sine qua non paral desarrollo del carcinoma escamoso infiltrante de cérvixterino. La infección por VPH-AR conduce a inmortalizacióne las células infectadas por acción de las oncoproteínas E6 y7. En estas circunstancias la expresión de los componentese las vías de senalización intracelular puede modificarse.a expresión de EGFR puede aumentar en la displasia yn el carcinoma escamoso infiltrante, y su forma fosfori-ada (p-EGFR) se ha hallado incrementada en alrededor del0% de los casos4, de acuerdo con nuestros datos. Algunosutores han mostrado que la expresión de los componentese las vías de senalización dependientes de EGFR (p-AKT y-ERK) no tienen significado pronóstico en carcinomas cer-icales en estadios iniciales tratados quirúrgicamente8, decuerdo también con nuestros datos. Sin embargo, la expre-ión de EGFR había sido relacionada previamente con malronóstico5.
La activación de EGFR lleva a la activación de laía PI3K-AKT-mTOR. Esta vía se asocia con mecanismosnti-apoptóticos. En nuestro estudio el 54% de los casosostraban inmunoexpresión de p-AKT. Una disminución de
a expresión de p-AKT se ha relacionado con aumento deupervivencia13. A la inversa, un aumento de la expresióne p-AKT se ha relacionado con mal pronóstico14, pudiendosta expresión usarse como marcador para predecir la res-uesta a quimioterapia y a radioterapia15. En nuestro estudioo detectamos asociación entra la inmunorreactividad de-AKT y el estadio, la recidiva o la respuesta al tratamiento.
Los componentes de la vía NFkB muestran expresiónuclear, indicando la translocación nuclear de las proteínas.sí, p65 se expresaba en el 64% de nuestros casos, p50 en el4%, p52 en el 59% y Rel-B y C-Rel el 36 y el 34%, respecti-amente. La vía NFkB se halla activada en líneas celularese carcinoma escamoso cervical CD40+. CD40 es un com-onente de la familia de receptores de factor de necrosisumoral (TNF) y se expresa en células escamosas infectadasor VPH-AR. Estas líneas celulares muestran activación dea vía MAPK y tienen marcadores moleculares asociados aresentación y procesamiento de antígenos, así como incre-ento de la susceptibilidad a los linfocitos citotóxicos T16.
e ha reportado co-activación de la vía NOTCH (Notch1, Jag-ed1, Hes1 y CDK9) y de la vía NFkB (p50 y p65), indicandoOTCH1 como regulador final17. La co-activación de estas
vías se ha asociado a progresión en el carcinoma escamoso
nfiltrante17. En nuestra serie no hemos detectado relaciónntre la expresión incrementada de NFkB y estadio, recidiva
respuesta al tratamiento.
F. Alameda et al
En nuestros casos, solamente la inmunoexpresión de p-RK mostraba correlación con estadio (p < 0,001) y recidivap < 0,001).
Además se observó correlación inversa entre la inmu-oexpresión de MKP1 y la inmunoexpresión de p-JNKp = 0,036) y p-p38 y (p = 0,011), indicando que pueden ejer-er acción anti-apoptótica. Esta hipótesis está soportada porl hecho de que en la presente serie la detección de MKP seorrelaciona con mala respuesta al tratamiento (quimiote-apia y radioterapia).
En resumen, nuestros datos sugieren que cambios enlgunas vías de senalización intracelulares en el carcinomascamoso infiltrante de cérvix están relacionados con la res-uesta al tratamiento. Los tumores más agresivos mostraríannmunoexpresión alta de p-ERK y MKP1 y baja expresión de-JNK y p-p38 y serían resistentes a la quimioterapia. Enase a nuestros datos, proponemos que la expresión de p-RK y MKP1 puede ser útil como factor pronóstico y comoiana terapéutica en estos tumores.
esponsabilidades éticas
rotección de personas y animales. Los autores declaranue para esta investigación no se han realizado experimen-os en seres humanos ni en animales.
onfidencialidad de los datos. Los autores declaran que enste artículo no aparecen datos de pacientes.
erecho a la privacidad y consentimiento informado. Losutores declaran que en este artículo no aparecen datos deacientes.
onflicto de intereses
os autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
ibliografía
1. Martinez-Garcia M, Banerji U, Albanell J, Bahleda R, Dolly S,Kraeber-Bodéré F, et al. First-in-human, phase I dose-escalationstudy of the safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamicsof RO5126766, a first-in-class dual MEK/RAF inhibitor in patientswith solid tumors. Clin Cancer Res. 2012;18:4806---19.
2. Inglés-Esteve J, Morales M, Dalmases A, Garcia-Carbonell R,Jené-Sanz A, López-Bigas N, et al. Inhibition of specific NF-�Bactivity contributes to the tumor suppressor function of 14-3-3�
in breast cancer. PLoS One. 2012;7:e38347.3. Boutros T, Chevet E, Metrakos P. Mitogen activate pro-
tein (MAP) kinase/MAP kinase-phosphatase regulation. Rolesin cell growth: Cell death and cancer. Pharmacol Rev.2008;60:261---310.
4. Iida K, Nakayama K, Rahman MT, Rahman M, Ishikawa M, Kata-giri A, et al. EGFR gene amplification is related to adverseclinical outcomes in cervical squamous cell carcinoma, makingthe EGFR pathway a novel therapeutic target. Br J Cancer.2011;105:420---7.
5. Pérez-Regadera J, Sánchez-Munoz A, de-la-Cruz J, Ballestín C,Lora D, García-Martín R, et al. Impact of epidermal growth
of pelvic relapse in patients with advanced cancer of thecervix treated with chemoradiotherapy. Am J Clin Oncol.2011;34:395---400.
6. Yamashita H, Murakami N, Asari T, Okuma K, Ohtomo K,Nakagawa K. Correlation among six biologic factors (p53,p21(WAF1), MIB-1, EGFR, HER2, and Bcl-2) and clinical out-comes after curative chemoradiation therapy in squamouscell cervical cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009;74:1165---72.
7. Toulany M, Dittmann K, Baumann M, Rodemann HP. Radiosen-sitization of Ras-mutated human tumor cells in vitro by thespecific EGF receptor antagonist BIBX1382BS. Radiother Oncol.2005;74:117---29.
8. Eijsink JJ, Noordhuis MG, ten Hoor KA, Kok M, Hollema H,de Bock GH, et al. The epidermal growth factor receptorpathway in relation to pelvic lymph node metastasis and sur-vival in early-stage cervical cancer. Hum Pathol. 2010;41:1735---41.
9. Lee CM, Fuhrman CB, Planelles V, Peltier MR, Gaffney DK,Soisson AP, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase inhibition byLY294002 radiosensitizes human cervical cancer cell lines. ClinCancer Res. 2006;12:250---6.
10. Woodworth CD, Diefendorf LP, Jette DF, Mohammed A, MosesMA, Searleman SA, et al. Inhibition of the epidermal growthfactor receptor by erlotinib prevents immortalization of humancervical cells by Human Papillomavirus type 16. Virology.2011;421:19---27.
11. Yao TT, Dai YZ, Li SZ. Expression and clinical significance of
PI3 K and protein kinase B in cervical carcinoma. Ai Zheng.2008;27:523---30 (abstract; article in Chinese).
12. Kohrenhagen N, Voelker HU, Schmidt M, Kapp M, KrockenbergerM, Frambach T, et al. Expression of transketolase-like 1 (TKTL1)
75
and p-AKT correlates with the progression of cervical neoplasia.J Obstet Gynaecol Res. 2008;34:293---300.
3. Lee CM, Shrieve DC, Zempolich KA, Lee RJ, Hammond E, Han-drahan DL, et al. Correlation between human epidermal growthfactor receptor family (EGFR, HER2, HER3, HER4), phosphory-lated Akt (P-Akt), and clinical outcomes after radiation therapyin carcinoma of the cervix. Gynecol Oncol. 2005;99:415---21.
4. Faried LS, Faried A, Kanuma T, Aoki H, Sano T, Nakazato T,et al. Expression of an activated mammalian target of rapamy-cin in adenocarcinoma of the cervix: A potential biomarker andmolecular target therapy. Mol Carcinog. 2008;47:446---57.
5. Feng W, Duan X, Liu J, Xiao J, Brown RE. Morphoproteo-mic evidence of constitutively activated and overexpressedmTOR pathway in cervical squamous carcinoma and highgrade squamous intraepithelial lesions. Int J Clin Exp Pathol.2009;2:249---60.
6. Hill SC, Youde SJ, Man S, Teale GR, Baxendale AJ, Hislop A,et al. Activation of CD40 in cervical carcinoma cells facilitatesCTL responses and augments chemotherapy-induced apoptosis.J Immunol. 2005;174:41---50.
7. Ramdass B, Maliekal TT, Lakshmi S, Rehman M, Rema P, NairP, et al. Coexpression of Notch1 and NF-kappaB signaling path-way components in human cervical cancer progression. GynecolOncol. 2007;104:352---61.
8. Rojo F, Gonzalez-Navarrete I, Bragado R, Dalmases A, Menendes
S, Cortes-Sampere M, et al. Mitogen-activated protein kinasephosphatase 1 in human breast cancer independently predictsprognosis and is repressed by doxorubicin. Clin Cancer Res.2009;15:3530---9.
