Vigilancia Epidemiológica de
fiebre Zika basada en Laboratorio
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
Gestión Integrada para la prevención y control del Dengue
Componentes técnicos:
1.Epidemiología -> Vigilancia integrada y preparación a
brotes
2.Laboratorio (incluye la vigilancia para CHIKV y
ZIKAV)
3.Atención al paciente
4.Manejo Integrado de Vectores (MIV)
5.Gestión del ambiente
6.Vacuna (preparación ante la eventual introducción)
• El virus Zika (ZIKAV) es un arbovirus del género flavivirus; filogenética y antigénicamente
muy relacionado con DENV, virus de la Fiebre Amarilla, VON y de la Encefalitis de San Luis
• Pertenece a la Familia Flaviviridae
• Es transmitido por mosquitos del genero Aedes
• Esta filogenéticamente y antigénicamente relacionado con el virus Spondweni Presencia de
tropismo neurológico = Sindrome de Gullain Barré
• Tiene un genoma de RNA de cadena positiva, de cadena sencilla de aproximadamente 10.7
Kb
• Se han identificado tres linajes: Asiático, Oeste de África y Este de África
Generalidades del virus
Plourde AR, Bloch EM. Emerg Inf Dis 2016; 22 (7): 1185-1992
Generalidades del virus
• El ZIKAV fue aislado por primera vez en 1947, en un mono Rhesus centinela (No.
766), en la selva de Zika, cerca de la cuidad de Entebbe, Uganda, a un costado de
Lago Victoria
• En 1948 fue aislado por primera vez a partir de vector Aedes africanus, como
resultado de vigilancia entomovirológica
• La infección en seres humanos se demostró por estudios serológicos en 1952
(Uganda y Tanzania) y en 1968 se logró aislar el virus a partir de muestras de suero
humano en Nigeria
• Actualmente en el Continente Americano esta circulando el linaje Asiático.
Genoma de Flavivirus.“Primer reto”
WNVDENVESLZIKAYF
Reacción cruzada presente enreacciones serológicas pero
ausente en protocolos de Biología Molecular
Filogenia de Flavivirus
Cercanía filogenética con Spondweni: = Factor de asociación a casos con daño neurológico
Segundo reto: Clínica: ZIKA vs DEN-CHIK
Fuente: adaptado de Halstead SB et al. Et de la plaquette du Yap State. Department of Helath Services
Síntomas Dengue Chikungunya Zika
Fiebre ++++ +++ +++
Mialgias/artralgias +++ ++++ ++
Edema de extremidades 0 0 ++
Erupción maculopapular ++ ++ +++
Dolor retroocular ++ + ++
Conjuntivitis 0 + +++
Linfadenopatías ++ ++ +
Hepatomegalia 0 +++ 0
Leucopenia/trombocitopenia +++ +++ 0
Hemorragias + 0 0
Tercer reto: Innovación y desarrollo en la Vigilancia por Laboratorio de Arbovirus
• El Tiempo real es la metodología de elección y es la que se está usando en
México
• InDRE - CDC acordaron utilizar protocolo de trabajo unificado
• InDRE promoverá utilizar también RT-qPCR “DUPLEX” (CHIKV-DENV; ZIKAV-
DENV)
• Se desarrollan métodos para detección de hasta 10 marcadores diferentes en
reacciones de amplificación independientes
• Plataforma de ultima generación utilizando microfluidos y proceso único y
cerrado (extracción y amplificación)
• Las metodologías en desarrollo incluyen el utilizar plataformas en las cuales se
puedan extraer ARN y al mismo tiempo amplificar, metodologías que serán
utilizadas para analizar también bacterias (Rickettsias, Leptospira).
DGE/InDRE
Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos
División Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
A
B
CD
E
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
DGE/InDRELaboratorio de Arbovirus y Virus HemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
Ante la ausencia de sondas especifica:Identificación de especificidad mediante analisis de “High Resolution Melting” (HRM)
Control Positivo
Curvas de Disociación(Control Negativo)
Curvas de Disociación(Control positivo)
Curvas de disociacióndel Control positivo)
Curvas de disociacióndel control
Negativo
Curvas del Control positivo) Curvas del
Control negativo)
Curvas del Control positivo
(Duplicado)
Curvas del Control positivo
(Duplicado)
Escala logarítmica
Escala lineal
Control Negativo
RT-PCR y RT-qPCRSYBR Green - ZIKA
Duplex DENV-ZIKAV
A
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Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1, B) DENV-2, C) DENV-3, D) DENV-4 Y E) ZIKAV. Escala lineal Arbovirus y virus hemorrágicos
División Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
• En una sola reacción detección
de cinco virus
• Ahorro de insumos
• Ahorro de tiempo
Duplex DENV-ZIKAV
Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1, B) DENV-2, C) DENV-3, D) DENV-4 Y E) ZIKAV. Escala logarítmica
A
B
C
D
E
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
DENV-1/ZIKA
A
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A
B
Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1 y B) ZIKAV
Escala lineal Escala logarítmica
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
DENV-2/ZIKA
A
B
A
B
Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-2 y B) ZIKAV
Escala lineal Escala logarítmica
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
DENV-3/ZIKA
A
B
A
B
Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-3 y B) ZIKAV
Escala lineal Escala logarítmica
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
DENV-4/ZIKA
A
B
A
B
Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-4 y B) ZIKAV
Escala lineal Escala logarítmica
Arbovirus y virus hemorrágicosDivisión Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
Vigilancia por Laboratorio
Linaje circulando en América.
CDC confirma a InDRE hace 15 días que se pueden utilizariniciadores promovidos por CDC de Fort Collins – R. Lanciotti
Sonda para “SINGLEPLEX” y para “DUPLEX”
Sonda marcada con Texas Red óanálogo y con Quasar 705
Solicitar de manera inmediata a su proveedor de Applied ajustar
Termocicladorpara utilizar el quinto canal
(Quasar 705)
ZIKA - Algoritmo en fase agudaPara búsqueda intencionada –Con circulación autóctona
RT-qPCR
Muestra de suero de 0-5 días de
iniciados los síntomas, según definición de caso
emitido por DGE
+-
DIFERENCIAL
ZIKAV
Se descarta caso
Se confirmacaso
Denv, ChikvLeptospira
Rick, Paludismo
-
VERSION 1.0
ZIKA - Algoritmo en fase aguda para búsqueda intencionada – Con circulación autóctona
• La muestra necesaria para la confirmación de
infección por virus Zika, debe tomarse por
venopunción (5 ml sin usar anticoagulante) entre los
días 0 y 5 de iniciados los síntomas,
• Enviar al LESP 2.5 ml de suero en red de frío (2-8°C),
acompañadas con el formato de estudio
epidemiológico correctamente llenado
• El llenado incorrecto del formato es motivo de
rechazo definitivo
Objetivos de la toma , manejo y envío de muestras al LNR o al LESP
• Realizar Vigilancia Epidemiológica basada en laboratorio de calidad para Entrega de
resultados confiables, en tiempo y forma
• Definir los lineamientos para la toma, manejo y envío de muestras para diagnóstico
de Zika
Toma, manejo y envío de Calidad
= Diagnóstico por laboratorio
de Calidad
Tipo de muestras
Suero, sangre
completa*, LCR
Moscos TejidosOtros (RNA, cDNA)
Tipo de muestras analizadas en laboratorio para Arbovirus (Zika)
* RT-qPCR
Proceso
Tipo de muestra
( Suero, sangre completa*, LCR,
moscos)
Red fría
Documentos completos
Formato de envío con datos clínicos epidemiológicos
completos
Casos especiales para envío a
CCOMS (CDC).
Triple embalaje
(CLASE A)
CALIDAD TOTAL…… DE INICIO A FIN
* RT-qPCR
Experiencias
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Rechazos y justificación del rechazo en la RNLSP de MéxicoTotal Lipémica Hemolizada insuficiente Días de tránsito Sin Registro
20112012 2013
20142015
Mejora continua en la RNLSP reflejo de la disminución de rechazos
Coordinación de Vigilancia Epidemiológica por Laboratorio/DDYR/InDRE/DGE
VEV vs ARBOVIRUS
Necesario intensificar la vigilancia entomo-
virológica
Aprovechar la ventaja de esta vigilancia.
Búsqueda anticipaday preventiva
ZIKA
ENTOMOLÓGICA
VIROLÓGICA
Perspectivas
DENV (CUATRO SEROTIPOS, GENOTIPOS)
CHIKV
ZIKA
WNV
MAYARO……….
Reto para laSalud Pública
y para el diagnóstico
por laboratorio
“Insumos”InDRE cuenta con insumos
para 1200 reacciones
Perspectivas a mediano plazo
RT-qPCR genérico Dengue
RT-qPCR Chikungunya
RT-qPCR Zika
RT-qPCR FNO
Cuatro canales en termociclador
Propuesta realizada a CDC y OPS en agosto del presente año
Documentos de referencia
Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos
CISCO: 59410, [email protected]
GRACIAS