Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD
Nombre : J U A N A N T O N I O L U G 0 R I O S .
Telefono : 5 5 7 - 1 7 9 5 .
Horas/semana : 2 O horas.
DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD, U A M - Izt. Fecha/inicio : 2 8 D E F E B R E R O 1 9 9 0 .
Fecha/termino : 1 O D E S E P T I E M B R E 1 9 9 O.
Tutor : M.ENC. R A U L A L V A G A R C I A. Puesto/adscrip. : PROFESOR ASOCIADO ttDtt, DEPTO. CIENCIAS
DE LA SALUD, DCBS. U.A.M.-Izt.
DE COMPLEJOS
Firma/alumno
Firma/tutor
IONICOS DE
INTRODUCCION
El transporte de cationes metdlicos mediado por
acarreadores modelo se ha estudiado desde hace casi 50 años.
En 1944, Hochtkins descubrió alteraciones en la permeabilidad
membranal de células por el efecto de antibióticos. Sin
embargo, estas hallazgos permanecieron sin mayor investigación
durante mucho tiempo.
En 1968 Pressman y Estrada-O. y colaboradores,
encuentran, de forma simultánea, que la actividad biológica de
los antibióticos tipo Valinomicina y Nigericina se debe al
transporte de especies iónicas a través de las membranas
celulares. Estrada-O. y colaboradores (1968), proponen que
dicho efecto es causado por la interacción directa de los
antibióticos con cationes de metales alcalinos.
Actualmente se conoce una gran variedad de acarreadores
modelo, todos ellos con la capacidad de unir cationes
metálicos alcalinos y transportarlos a través de membranas
lipídicas. Estas moléculas, por lo general, se aislan de
actinomicetos (Pressman, 1968; Cronquist, 1984), y se les ha
dado el nombre genérico de translocadores (Eisemann, 1968).
Además, se han usado ampliamente en la investigación del
transporte de iones a través de membranas biológicas, así como
en el estudio de los gradientes iónicos existentes entre el
interior y el exterior de la células y sus organelos (Latorre
y col., 1984; Pressman, 1976).
Los translocadores se han clasificado en dos grupos
generales: los canales y los ionóforos o acarreadores móviles.
1
Los canales
Los canales son moléculas con la capacidad de formar
poros en las membranas, con lo que se incrementa la
permeabilidad de las mismas, ya sea por aglomeración de varias
subunidades o al combinarse con algunos lípidos estructurales
(Gómez-P. , 1976).
Los ionóforos
Los ionofóros se dividen a su vez en dos clases: neutros
y carboxíl icos . Los neutros tienen una estructura covalente cíclica y
grupos polares hacia el interior de la molécula (Figura 1) que
interactúan con el catión a transportar; el exterior de la
molécula muestra a los grupos no polares, altamente
hidrófobos, que permiten solvatar al complejo ionóforo-catión
en la matriz lípidica de la membrana (Pressman, 1968).
M+ . cation.
-: Enlace de union.
Estructura.
O : Oxigeno.
Figura 1. Modelo esquembtico de interacci6n ion6foro neutro
cation metblico. Tomada de A r t 2 ( 1 9 8 4 ) .
2
-: Enlace de union.
Estructura.
o : oxigeno.
! T:'. Figura 3. Modelos de transporte mediado por ion6foros carboxllicos
A)Modelo Uniport para ion6foros neutros . B) Modelo Antiport para
iondforos carboxllicos, propuesto por Pressman.
3
Arzt (1984) describe que las caracteristicas de los
ionóforos son: la formación de complejos estables en solventes
orgánicos; la incapacidad para transportarse en membranas
congeladas; la inalterabilidad a los cambios de pH, asi como
una estequimetria 1:l. Además, el complejo resultante de la
unión ionóforo-catión con dicha estequiometria posee una carga
neta positiva (Pressman, 1968).
El modelo del mecanismo del transporte mediado por los
ionóforos neutros, con algunas excepciones, es de tipo
uniport; éste se caracteriza por ser electrogénico, es decir,
tranporta una carga eléctrica positiva que modifica los
gradientes eléctricos preexistentes (Figura 3 ) . Los ionóforos carboxílicos son ácidos orgánicos débiles,
monopróticos en su mayoria, y con peso molecular entre 500 y
1000 g mol''. Su estructura quimica básica consiste en una
cadena hidrocarbonada abierta, formada por anillos de
tetrahidropiranos y tetrahidrofuranos sustituidos. Poseen,
además, el grupo carboxilo en uno de sus extremos y uno o
varios hidroxilos en el otro.
Cuando se encuentran en medios poco polares, los
ionóforos carboxílicos adquieren un forma ciclica estabilizada
por puentes de hidrógeno, lo que origina una cavidad polar
ión-clatrante rodeada por grupos hidrófobos (Pressman, 1968).
De todos los ionóforos carboxilicos aislados hasta el
momento, los que se han estudiado exhaustivamente, tanto en
SUS efectos biológicos como en sus propiedades fisicoquimicas
son: la Nigericina (Estrada y col., 1967; Steinirauf y col.,
4
1968; Toro y col., 1976; Toro y col., 1987; Alva y col., en
prensa), la Monensina (Reed, 1979) y la Grixorixina (Allaume y
col., 1972) el Lasalocido (Degani y Friedman, 1974) y la
Calcimicina (Chaney y col., 1974) . El modelo propuesto por Pressman (1968) para el
transporte de cationes catalizado por los ionóforos
carboxflicos es de tipo antiport electroneutro; se caracteriza
por intercambiar especies iónicas sin alterar los gradientes
eléctricos a través de las membranas (Figura 2).
Los poliéteres carboxílicos han sido clasificados en
monovalentes -nigericina y monensina- y divalentes -1asalócido
y calcimicina- en función del número de oxidación del catión
metálico que transportan (Westley, 1982).
Sin embargo, existen evidencias de que el ionóforo
nigericina interactua, tanto con cationes monovalentes como
polivalentes, independientemente de su capacidad para
transportarlos a través de membranas lipidicas (Piedras y
col., 1986; Toro y col., 1987). En este sentido, afín queda por
aclarar cuáles son los parámetros fisicoquimicos del catión y
del poliéter, que regulan la interacción, ya sea para el
transporte o para formar clatratos fijos lipofilicos.
En este trabajo se demuestra, a partir de parámetros
fisicoquimicos de asociación, que los poliéteres carboxilicos
forman complejos con cationes metálicos alcalinos,
irrespectivo de su capacidad para transportarlos a través de
barreras hidrofóbicas.
5
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Contribuir a determinar las bases fisicoquimicas de la
formación de complejos iónicos de los poliéteres carboxilicos
Nigericina, Monensina e Isolasalócido, para correlacionarlas
con su actividad ionoforética.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
A ) Determinar los pKa de los poliéteres Nigericina, Monensina
e Isolasalócido en un medio de constante dielétrica ( )
de 38.48, para conocer la capacidad de disociación dcida
de estas moléculas.
B) Determinar la Ks de los complejos Nigericina, Monensina e
Isolasalócido con los metálicos alcalinos, para
determinar la estabilidad de unión de los complejos
formados.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Para lograr los objetivos arriba planteados se desarrolló
el siguiente diseño experimental:
1) Se formaron los ácidos libres de los poliéteres
isolasalócido y monensina por el método descrito por Yañez y
col. (1991) . E l ácido libre de nigericina fue una donación de
los laboratorios Hoffman-La Roche, New Jersey.
2) El pKa de los ácidos libres de monensina e isolasalócido se
obtuvo por el método descrito por Toro y col. (1987).
6
3) Las Ks de los complejos poliéter-catión se determinaron en
el mismo medio del inciso 2).
4) Se graficaron las isotermas de unión, relacionando el
catión total con el unido al poliéter.
METODOLOGIA
a ) Deterrninacion de los pKa
El pKa es un parámetro que indica la capacidad de una
molécula para disociarse. Este parámetro se relaciona con el
tamaño de la molécula y los grupos substituyentes que ésta
posea. Esto es de particular importancia pues lo que indica es
el punto en la escala del pH donde la mitad de la
concentración de la molécula está en forma ionizada (libre de
su proton en este caso) y la otra mitad conjugada
El pKa de los ácidos libres de monensina e isolasalócido,
en un medio de dioxano/H20 45 % ( = 38.48), se obtuvo por
titulación potenciométrica con hidróxido de tetrametil amonio
(TMAOH). El pH se registró con un electrodo combinado (A.H.
Thomas 4094-510) y un potenciómetro (ORION 701A). La solución
se mantuvo con agitación continua y temperatura constante.
b) Determinacih de l a K,
Las constantes de estabilidad (Ks) de la reacción de
formación de los complejos poliéter-catión, en solución, se
determinaron a temperatura ambiente Por técnicas
7
potenciométricas. Las mediciones se hicieron, al equilibrio,
teniendo el poliéter a 100 pM y concentraciones equivalentes
de cloruro del catión alcalino. Los experimentos se hicieron
en una solución homogénea de 1,4-dioxano/H20 45 % (vol/vol) a
pH = pKa, como fue previamente publicado para el complejo de
nigericina-potasio (Toro y col., 1987). Los electrodos ion
selectivos (Orion 8411 para sodio y Beckman 39047 para litio,
cesio) se equilibraron con soluciones de cloruro del metal
alcalino durante una semana; su respuesta Nernstiana se
verificó antes de usarse en un potenciómetro Beckman 4500
junto con un electrodo de referencia Beckman 41230. Todos los
reactivos utilizados fueron grado RA (Merck).
c ) Isotermas de unión
Las razones de unión se obtuvieron por titulación
potenciométrica en el mismo medio utilizado para la
determinación de las Ks. Los esperimentos se hicieron a
concentración constante de los 6cidos libres de los
poliéteres, añadiendo el catión metálico y graficando su razán
de unión como una función de [METAL UNIDO]/[METAL TOTAL],
según la técnica descrita por Smith (1981) . Durante la
titulación se midió el pH con un electrodo de vidrio (A.H.
Thomas 4094-510).
8
RESULTADOS
Estabilidad en la formación de los complejos poliéter-catión.
Las Tablas I , 11, I11 muestran las diferencias entre los
valores de Ks para los complejos de los poliéteres Nigericina,
Monensina e Isolasalócido con los cationes litio, sodio y
cesio en solución homogénea. La estimación de los valores
de G o , a partir de los datos de Ks, muestran que la
nigericina interactúa de manera equivalente con los tres\. ' -..,
cationes alcalinos probados (Tabla I).
Tabla I. Valores de Log Ks y G o para los complejos
nigericina-catión metalico alcalinoa.
Complejo de Nigericina log K, G o (Kcal/mol)
Litio
Sodio
Cesio
~~ ~ ~~
4.16 f 0.34
3.91 f 0.22
3.82 f 0.34
~ ~~~
-5,681
-5,339
-5,271
aEl &ido libre se disolvió en una solución de 1,4-
dioxano/H20 45 % (vol/vol) ( 38.48). ajustado a pH ( 7 . 7 6 ) con
Trietanolamina y HC1.
9
El isolasalócido,presenta un comportamiento similar al de
nigericina con los cationes probados.sin embargo, los valores
de Ks y de G o estimados, son entre una cuarta y quinta parte
de los obtenidos para nigericina (Tabla 11).
Tabla 11. Valores de Log Ks y G o para los complejos
isolasalócido-catión metálico alcalinoa.
Complejo de Isolasalócido log K, G o (Kcal/mol)
Litio
Sodio
Cesio
0.806 k 0.38 -1, o99
0.787 f 0.36 -1,072
0.709 k 0.25 - 966
aEl ácido libre se disolvió en una solución de 1,4-
dioxano/H20 45 % (vol/vol) (38.48). ajustado a pH = pKa con
Trietanolamina y HC1.
Por su parte, la monensina (Tabla 111) muestra un
comportamiento diferente a los dos poliéteres anteriores,
partir de sus valores de Ks y de las estimaciones de . G O ,
para los tres cationes, formando con el Na' los complejos m6s
estables, seguidos por los de Li', habiendo una mayor
diferencia con respecto a los de Cs'.
10
Tabla 111. Valores de Log Ks y G o para los complejos
monensina-catión metalico alcalinoa.
Complejo de Monensina log K, G o (Kcal/mol)
Litio
Sodio
Cesio
1.55 2 0.40
1.94 2 0.52
0.48 f 0.32
-2 , 117 -2 , 646 - 658
aEl dcido libre se disolvió en una solución de 1,4-
dioxano/H20 45 % (vol/vol) ( 38.48). ajustado a pH = pKa con
Trietanolamina y HC1.
Razones de unión.
El comportamiento de la unión del poliéter con los
cationes alcalinos se siguió por titulación potenciométrica en
solución homogénea. La Figura 4 muestra las isotermas de unión
de poliéter-metal en función de la concentración de metal
total a concentración constante de poliéter. Con cada catión
alcalino ensayado se produce una reacción de primer orden
aparente. Sin embargo, existen diferencias en la rapidez de
unión de los poliéteres con los distintos metales.
11
I
t O
cu O
\
*\ii N Y
O
12
O
P 0 a W CD O
O
R
f
a W o
s
*\'\\
Iu
[METAL unido] (x 10-4M)
0.3 5
0.3
0.25
0.2
0.15
o. 1
0.0 5
O I 1 1 1 1 1 1
O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
[Metal total] (x 10-4M) Figura 5. lsotermas de nigericina.
13
se observa un claro perfil de selectividad iónica para la
nigericina (Na' > Cs' > Li') , en este trabajo se muestra que este ionóforo interactúa, en solución homogénea, con valores
de afinidad casi idénticos con los cationes alCalinOS
mencionados (Tabla I).
El hallazgo de que no existen diferencias significativas
entre los valores de Ks, claramente indica que la nigericina
puede formar complejos de demandas energéticas equivalentes
con los metales alcalinos, irrespectivo de su capacidad para
transportarlos. Asi, los requerimientos energéticos de la
reacción de complejación parecen no ser el paso limitante del
proceso de transporte y, por lo tanto, no son responsables de
la selectividad observada en sistemas multifdsicos, tales como
tubos en llU1v y membranas lipidicas (Taylor y col., 1982).
También parece ser, a partir de los resultado
presentados, que no existe relación entre la estabilidad del
complejo y el tamaño del catión (por ejemplo, los radios
iónico, atómico o hidratado) ni con la electronegatividad. Por
lo tanto, se plantea la hipótesis de que la nigericina es
capaz de formar complejos virtualmente con cualquier catión
metdlico, sin importar su volumen.
La intensidad de unión determina la rapidez del transporte
iónico.
Parece ser que la intensidad de unión entre el poliéter y
el catión determina la rapidez del transporte iónico. Esto se
desprende de las diferencias de rapidez obtenidas a partir de
14
la razón existente entre la concentración de metal unido -o
complejo formado- y la de metal total, que se muestran en la
Figura 4 , donde se observan dos patrones generales de
comportamiento. Primero, se muestra una mayor rapidez de unión
con litio y cesio, lo que sugiere mayores fuerzas de atracción
entre estos cationes y el poliéter (Figura 5). Segundo, la
menor rapidez de unión con los cationes que son transportados
sugiere una fácil disociación entre éstos y el acarreador. ,
La intensidad de interaccón sugiere que litio y cesio se
unen fuertemente a la nigericina, no se disocian fácilmente y,
por lo tanto, el ionóforo es incapaz de transportarlos a
través de las barreras lipídicas. A s í , la disociación puede C ) ;i c .d.!
ser un paso limitante mayor del transporte mediado por 3 9 I;,, ~
4-, E acarreadores móviles, como ha sido sugerido para potasio y P' !-
rubidio (Riddell y col., 1988). U) rj ' r r l rr: , n
La mayor afinidad e intensidad de interacción de litio y p ? , u Z'
cesio muestrada por la nigericina parece relacionarse con la 7: ,,-, "I ¿-)
z U) mayor afinidad electrónica (ea) y con los valores de potencial
-7 - g 5;
de reducción (EO) de ambos cationes, más que con su tamaño y
electronegatividad. Esto se desprende de que los valores de Eo
de Li' (-3.02 V) y Cs' (-3.02 V) son mayores que los de Na'
(-2.71 V) como indican Cotton y Wilkinson (1966). También a
partir de datos (Day y Selbin, 1969) que muestran que el ea de
litio (0 .58 eV) es menor que el de sodio (eaNa+ 0.78 eV) . En consecuencia, las propiedades energéticas intrinsecas de los
átomos metálicos pueden
selectividad de unión y
jugar un papel central en la
de transporte iónico. Estos datos
15
complementan evidencias previas que indican que las
variaciones en la estructura quimica de los poligteres
determinan las transiciones de selectividad iónica para el
transporte (Eisenman y col., 1968).
Los perfiles de interacción iónica de los poliéteres.
En conclusión, la correlación de los diversos resultados
entre si mostrada en este trabajo difiere respecto a las
selectividades de extracción y transporte previamente
publicados para estos poliéteres en sistemas experimentales
diversos (Tabla 111). Además, ello ilustra que los ionóforos
son capaces de interactuar con cationes metálicos que no son
translocados a través de fases lipldicas. En consecuencia, los
perfiles de interacción iónica mostrados en este trabajo
pueden apoyar nuevas lineas de interpretación para explicar la
actividad biológica de los ionóforos carboxilicos (Osborne y
col., 1977; Ben-Hayyim y Krause, 1980; Hatefi y col., 1982;
Osborne y col., 1982) a través de la unión de metales fijos
dentro de enzimas, dentro de complejos proteicos y en ligandos
de superficie membranal.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado parcialmente por CONACyT
P228CCOX891754, DGICSA C89-01-0216 y (290-01-0287.
16
ACTIVIDADES REALIZADAS
Lugo-R., J.A., Alva, R., Rivera, B.E., Toro, M., Estrada-O.,
S. Sobre el mecanismo de transporte de cationes mediado
por poliéteres carboxílicos. I SIMPOSIO DEL DEPARTAMENTO
DE CIENCIAS DE LA S A L U D . U.A.M. Iztapalapa, octubre, 1990
Alva, R., Lugo-R., J.A., Rivera, B.E., Toro, M. y Estrada-O.,
S. 1990. Comportamiento dual del poliéter carboxílico
nigericina: acarreador iónico vs ligando iónico fijo. En
Memorias d e l N Simposio d e E s t u d i a n t e s d e Posgrado en
Química "Fernando Romott, A. Domínguez O., M.E. Ortiz
Romero V., M.T. Ramírez S. y S. Tello S., ed. U.A.M.,
U.A.Z., México, D.F. pp. 69-73.
Alva, R., Lugo-R., J.A. , Arzt, E., Cerbón, J., Rivera, B.E.,
Toro, M. y Estrada-O. , S. Nigericin forms highly stable
complexes with lithium and caesium. J. Bioenerq.
B i o m e m b r . En prensa.
OBJETIVOS ALCANZADOS
Se determinaron los valores de pKa para la Niger ic ina ,
Monensina e Isolasalócido. Además, se obtuvieron las Ks de sus
complejos con los cationes metálicos probados. Todo esto
coadyuvó a la publicación de un artículo, que contribuirá al
entendimiento de las bases fisicoquímicas que regulan la
17
formación de los complejos iónicos de los poliéteres
carboxilicos mencionados, y su correlación con la actividad
ionoforética de estos.
RECOMENDACIONES
3 )
Se deberá continuar esta linea de trabajo con otros iones
met6licos diferentes, para dilucidar el mecanismo
fisicoquimico de acción de los poliéteres.
Se deben utilizar otras metodologias de cuantificación para
incrementar la información sobre los fenómenos que
ocurren durante la formación de complejos iónicos.
Es recomendable favorecer la integración de grupos de
investigación, con un enfoque multidisciplinario, para
complementar la información sobre estos fenómenos.
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Ramirez S. y S. Tello S., ed. U.A.M., México, D.F. PP.
124-128.
ANEXO
22