2010/2011
17 de Maio de 2011
1.º Ano - 2.º Semestre
Alunas:
Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267
Bioquímica I
Estudo cinético da invertase da levedura
2 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Resumo
Este trabalho laboratorial teve como objectivos estudar a cinética do
enzima invertase (beta-fructofuranosidase) na reacção de hidrólise da sacarose
e a determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx. Pretendeu-se também
comparar a velocidade da reacção de hidrólise da sacarose num ensaio com
actividade enzimática e outro sem actividade enzimática.
No estudo cinético do invertase utilizou-se uma solução de enzima de
concentração 1,0 U/mL, a qual foi preparada por diluição de uma solução stock
1mg/mL, usando tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M. Após a sua preparação, a
solução de enzima foi mantida a uma temperatura próxima de 0ºC.
No ensaio com actividade enzimática, o reagente de Nelson foi
adicionado 10 minutos após a adição do invertase; como desactivador da
acção enzimática; aos tubos do segundo ensaio, o reagente de Nelson foi
adicionado antes da adição do enzima.
Os parâmetros cinéticos, Vmáx e Km, foram obtidos a partir da
construção de um gráfico das velocidades iniciais em função da concentração
de sacarose. Para a obtenção dos valores das velocidades iniciais
determinaram-se as diferentes concentrações de oses redutores produzidas
durante um intervalo de 10 minutos. Estes parâmetros foram calculados por 4
métodos diferentes e no final foi eleito o mais eficiente. Para a obtenção dos
valores e dos gráficos destes parâmetros cinéticos, foi utilizado um programa
de computador, Hyper.
Os valores obtidos de Km e Vmáx não correspondem ao esperado, sendo
que o valor de Km desta enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve
um valor de Km = – 9,482 ± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da
constante de Michaelis obtida, é maior do que o esperado, Vmáx = 3,93 ±
9,722. Este facto é devido às altas absorvâncias medidas para a hidrólise total
e a sua diferença para as absorvâncias medidas para a hidrólise não
3 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
enzimática, uma vez que a diferença é grande, altas absorvâncias
correspondem a velocidades inicias altas pela equação deduzida
anteriormente:
Segundo a apresentação destes gráficos e valores de Km e Vmáx, o
método mais rigoroso foi o método directo, uma vez que por todos
apresentarem um valor negativo, o mais próximo do valor da literatura foi o
calculado por este método. O menos rigoroso será sempre o método de
Lineweaver-Burk, uma vez que os parâmetros utilizados na construção do
gráfico são o inverso dos valores obtidos, assim, os valores de erro reduzido
são apresentados com erro grande e os valores de erro maior são
apresentados com erro diminuído.
Aferiu-se que estes resultados obtidos resultaram de erros experimentais
que podiam estar relacionados com a preparação da solução de enzima, com a
preparação do reagente de Nelson, com o período de incubação, com os
valores de absorvância e com as condições do meio – pH e temperatura,
principalmente.
4 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Registo e discussão dos resultados
Cálculo da concentração exacta das várias soluções de
invertase preparadas
Preparação das soluções
Solução de invertase 1,0 U/mL
Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):
E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01M,
obtendo então a concentração de:
Solução de invertase 2,5 U/mL
Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):
E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH7,5) 0,01M,
obtendo então a concentração de:
5 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Medições
Cada grupo ficou com uma dada concentração de invertase para
preparar (1,0 ou 2,5 U/mL). O nosso grupo preparou a solução de 1,0U/mL.
Concentração teórica da solução de invertase 1,0 U/mL
Concentração exacta da solução de invertase preparada
Para determinar a concentração exacta da solução de enzima preparada
utilizou-se a fórmula correspondente à lei de Beer-Lambert ( ). Sendo a
absorvância, o coeficiente de absorção molar ao comprimento de onda
utilizado e o percurso óptico, ou seja, a largura da cuvette.
Para esta medição da absorvência da solução preparada utilizou-se a
cuvette de quartzo devido ao comprimento de onda utilizado, uma vez que a
280 nm é a cuvette que menos absorve, como é visível no quadro abaixo
(Quadro 1).
Quadro 1. Gama de aplicação das cuvettes de acordo com o seu tipo de material.
Gama Espectral Material Gama de Aplicação
Visível Plástico 340-800 nm
Vidro 334-2500 nm
UV Quartzo 170-2600 nm
6 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Concentração exacta:
Concentração esperada:
A concentração exacta foi bastante mais elevada do que a concentração
esperada. Isto vai resultar em absorvâncias altas, como se verá mais à frente no
relatório.
Base de actuação do reagente de Nelson
O cobre presente no reagente de Nelson é reduzido pelos glícidos
redutores (glicose e frutose) em meio alcalino e quente. A forma reduzida do
sal de cobre actua sobre o reactivo arsenomolibdato determinando o
aparecimento de cor azul, cuja intensidade é proporcional ao teor de glícidos
redutores da solução. Sob a acção do calor os glícidos redutores decompõem-
se parcialmente em fragmentos oxidáveis pelo hidróxido cuproso existente no
reagente de Nelson, resultando em ácido etanodióico, ácido propanodióico,
entre outros. Nesta reacção o hidróxido de cobre (azul) reduz-se a hidróxido
cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o hidróxido cuproso perde
uma molécula de água, transformando em óxido cuproso (vermelho). O óxido
cuproso assim formado, vai reduzir o reagente de arsenomolibdato dando o
óxido de molibdénio (MO3O8) de coloração azul, cuja intensidade é
proporcional a quantidade de glícidos redutores existentes na amostra, que
pode ser determinada espectrofotometricamente a 510 nm.
O invertase, como todos os enzimas, apresenta um pH óptimo de
actuação, onde apresenta uma actividade elevada, o seu intervalo de actuação
7 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
de pH é entre 3,5-5,5, sendo o pH óptimo 4,5, a 55ºC. Se o enzima não se
encontrar em solução, a hidrólise da sacarose ocorre facilmente se o meio for
ácido.
Tendo por base estes factores, podemos deduzir que o reagente de
Nelson altera o pH da solução, basificando-o, inibindo a actuação do enzima.
Este facto deve-se à alteração do estado de ionização de um grupo funcional
do enzima, independentemente da existência do tampão de acetato de sódio,
pois este não tem capacidades de neutralizar uma base tão forte. A alteração
dos estados iónicos dos grupos dos resíduos dos aminoácidos, principalmente
do centro activo, conduz a uma alteração da sua configuração pelo que a
ligação com o substrato é impossibilitada, levando a uma perda da sua
actividade catalítica e consequente paragem da reacção catalisada pela
enzima.
Este facto em conjunto com o posterior aumento de temperatura, leva à
desnaturação do enzima, impedindo-o de voltar a reagir, sendo a reacção de
hidrólise da sacarose dada por terminada.
Resultados obtidos nos controlos efectuados
Ao longo de toda a actividade laboratorial foram utilizados tubos de
controlo para cada quadro preparado.
No quadro 1, em que foi estudado a influência da concentração de
substrato na actividade enzimática do invertase da levedura, foi utilizado para o
zero do espectrofotómetro o tubo 1, pois não havendo sacarose no meio
reaccional não foi formado nenhum produto (glucose e frutose) e
consequentemente a concentração de glícidos redutores – o que é identificado
pelo método de Nelson – é nula.
O tubo 10 foi utilizado para controlar o efeito do reagente de Nelson na
actividade enzimática. Este reagente foi adicionado neste tubo antes do
enzima, ao contrário do sucedido nos outros tubos. Assim, visto que este inibe
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a actuação do enzima, obteve-se uma menor concentração de glícidos
redutores – glucose e frutose - pois a hidrólise do diósido não foi catalisada por
um enzima.
O tubo 11 permitiu seguir a dissociação da sacarose sem a acção do
enzima. Ao comparar este tubo com o tubo anterior (tubo 10) é possível
concluir que a dissociação ocorrida no tubo 10 se deve a uma dissociação
química “natural” da sacarose – sem enzima, pois uma vez que as
absorvâncias medidas foram idênticas, as concentrações de glícidos redutores
foram idênticas.
No quadro 2, em que foi controlada a hidrólise não enzimática da
sacarose, foi utilizado para o zero do espectrofotómetro o tubo 1, pelos
mesmos motivos que no quadro 1.
Quanto a este quadro todos os tubos de ensaio podem ser considerados
tubos de controlo, uma vez que é em relação a estes que se vai comparar a
reacção com enzima.
Dados obtidos no estudo da hidrólise total e não enzimática –
Gráfico Absorvância VS concentração de sacarose
Concentração teórica da sacarose em cada solução (VT=10 mL)
[ ]
Tubo 1
Tubo 2
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Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Tubo 8
Tubo 9
Registo dos resultados
Solução 1,0 U/mL de invertase
Quadro 2. . Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro, utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.
Tubos [Sacarose] (mM)
Abs510nm – Hidrólise total
(enzimática e não enzimática)
Abs510nm – Hidrólise não
enzimática
Abs510nm – Hidrólise
enzimática
1 0,0 0,000 0,000 0,000
2 0,5 1,984 0,287 1,697
3 1,0 1,544 0,397 1,147
10 Estudo cinético da invertase da levedura
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0,000
0,150
0,300
0,450
0,600
0,750
0,900
1,050
1,200
1,350
1,500
1,650
1,800
1,950
2,100
2,250
2,400
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Ab
so
rvân
cia
a 5
10 n
m
Concentração de Sacarose (mM)
Absorvância VS concentração de sacarose
Hidrólise total (enzimática enão enzimática)
Hidrólise não enzimática
Hidrólise enzimática(diferença entre a hidrólisetotal e a hidrólise nãoenzimática)
4 1,5 1,755 0,343 1,412
5 2,5 1,875 0,413 1,462
6 3,5 1,917 0,489 1,428
7 5,0 2,232 0,390 1,842
8 10,0 1,892 0,548 1,344
9 15,0 1,979 1,044 0,935
Solução 2,5 U/mL de invertase
Quadro 3. Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.
Tubos [Sacarose] (mM)
Abs510nm – Hidrólise total
(enzimática e não enzimática)
Abs510nm – Hidrólise não
enzimática
Abs510nm – Hidrólise
enzimática
1 0,0 0 0 0
2 0,5 1,560 1,333 0,000
3 1,0 1,670 1,349 0,227
4 1,5 2,120 1,421 0,321
Gráfico 1. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.
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5 2,5 2,540 1,492 0,699
6 3,5 2,757 1,503 1,048
7 5,0 2,777 1,539 1,254
8 10,0 2,777 1,589 1,238
9 15,0 2,777 1,603 1,188
Gráfico 2. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.
Discussão dos gráficos obtidos
A reacção de hidrólise da sacarose tanto pode ocorrer “naturalmente”
como pode ocorrer na presença de enzima.
0,0000,1500,3000,4500,6000,7500,9001,0501,2001,3501,5001,6501,8001,9502,1002,2502,4002,5502,7002,8503,000
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Ab
so
rvân
cia
a 5
10 n
m
Concentração de Sacarose (mM)
Absorvância VS concentração de sacarose
Hidrólise total (enzimática enão enzimática)
Hidrólise não enzimática
Hidrólise enzimática(diferença entre a hidrólisetotal e a hidrólise nãoenzimática)
Imagem 1. Reacção de hidrólise da sacarose.
12 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Os enzimas, sendo proteínas com funções catalíticas, aumentam a
velocidade com que se atinge o estado de equilíbrio da reacção. Assim, duas
soluções que contenham a mesma concentração de substrato (neste caso,
sacarose), se uma tiver na presença de enzima (neste caso, invertase da
levedura) e outra não, a solução que estiver na presença do enzima irá obter
uma maior concentração de produto (glícidos redutores – frutose e glucose) no
mesmo intervalo de tempo.
Tanto no Gráfico 1 como no Gráfico 2 as absorvâncias mais altas
correspondem à hidrólise total, como era esperado. Uma vez que na hidrólise
total tanto ocorre hidrólise enzimática como não enzimática, levando a uma
obtenção maior de glícidos redutores. Estes dados correspondem aos obtidos
através da aplicação do quadro 1 do procedimento.
O conjunto de pontos que se referem à absorvância medida para a
actividade não enzimática deveria corresponder aos menores valores de todos,
uma vez que não enzimaticamente a reacção de hidrólise da sacarose é mais
lenta (obtém-se uma menor quantidade de glícidos redutores). O facto descrito
anteriormente deveria ser independente da concentração do enzima no meio
reaccional. No entanto, isso só aconteceu quando a concentração da solução
de invertase era 1,0 U/mL. Estes dados correspondem aos obtidos através da
aplicação do quadro 2 do procedimento.
Quanto à hidrólise enzimática, as absorvâncias deviam estar
compreendidas entre as absorvâncias da hidrólise total e da hidrólise não
enzimática e deveriam aumentar até uma dada concentração de sacarose e
depois manter-se estável, uma vez que para concentrações de enzima muito
menores que concentrações de substrato chega a um ponto em que todos os
centros activos dos enzimas estão ocupados, não sendo possível aumentar
mais a velocidade de reacção. Como todos os enzimas estiveram nas soluções
o mesmo tempo e na mesma quantidade, a partir de uma dada concentração, a
absorvância medida deve ser igual para todos.
Uma vez que as concentrações de sacarose em cada um dos casos
anteriores foi a mesma para cada tubo de ensaio, concluiu-se que as
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concentrações de frutose e glucose obtidas não enzimaticamente seriam as
mesmas que na situação onde ocorreu a hidrólise total. Assim, para se obter as
absorvâncias e consequentemente as concentrações dos glícidos redutores
obtidos enzimaticamente procedeu-se ao seguinte cálculo:
No Gráfico 1 aconteceu o esperado quanto ao intervalo de valores em
que devia estar a absorvância (entre as absorvâncias da hidrólise total e a
hidrólise não enzimática) mas quanto aos valores de absorvância manterem-se
aproximadamente iguais após uma dada concentração, não aconteceu o
esperado pois obtiveram-se valores muito dispersos, não seguindo qualquer
tendência. No Gráfico 2 ocorreu exactamente o contrário do descrito para o
Gráfico 1.
Cinética de Michaelis-Menten
Cálculo da velocidade inicial da reacção de hidrólise da
sacarose na mistura reaccional (vT= 1mL) devido à acção
enzimática (µM/min) para cada concentração de substrato
utilizada
Sabendo que na hidrólise total existem dois tipos de reacção, a
enzimática e a não enzimática, pode considerar-se que a concentração da
solução não enzimática na hidrólise total é igual à concentração obtida nos
outros tubos de ensaio correspondentes à hidrólise não enzimática, sendo que
as soluções, teoricamente, continham a mesma concentração de sacarose.
Assim, subtraindo o valor da absorvância da hidrólise não enzimática à
hidrólise total da sacarose obtém-se apenas a concentração dos glícidos
redutores originados pela reacção enzimática, como explicado anteriormente. A
partir desta variação de absorvância e sabendo que o coeficiente de absorção
molar dos produtos da reacção da glucose no método de Nelson a 510 nm é
igual a Ɛ510nm = 7,1 mM-1cm-1, pode-se calcular a concentração de glícidos
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17 de Maio de 2011
catalisados enzimaticamente. No entanto, apesar do método de Nelson reagir
com os dois glícidos redutores obtidos (glucose e frutose), vai-se considerar
para o cálculo da velocidade que só identifica a glucose, pois só para este
glícido é que se sabe o valor do coeficiente de absorção molar. Assim, o valor
desta concentração por unidade de tempo corresponde à velocidade inicial que
se pode determinar através da seguinte fórmula:
[ ]
Quadro 4. Registo das variações das absorvâncias - hidrólise enzimática - para as várias concentrações de sacarose nos diferentes tubos
Tubo ∆ Abs510 – Hidrólise enzimática
1 0,000
2 1,697
3 1,147
4 1,412
5 1,462
6 1,428
7 1,842
8 1,344
9 0,935
Para determinar a velocidade inicial para cada tubo de ensaio deduziu-
se uma fórmula que permitiu calcular a velocidade inicial através da
absorvância registada e da fórmula da própria velocidade.
[ ]
[ ]
Velocidade inicial
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Concentração da sacarose na mistura reaccional
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
16 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Representação gráfica de vo em função da concentração de
sacarose na mistura reaccional (vT= 1 mL). Determinação dos
parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando um método gráfico
adequado. Justificação da escolha do método efectuado.
Comparação do valor obtido para Km com valores da literatura.
Quadro 5. Concentração de sacarose na mistura reaccional (1mL) e velocidade inicial correspondente.
Tubos [Sacarose] (mM)
Velocidade inicial ( ) (µM min-1)
1 0 0
2 5 23,9
3 10 16,2
4 15 19,9
5 25 20,6
6 35 20,1
7 50 25,9
8 100 18,9
9 150 13,2
Tubo 7
Tubo 8
Tubo 9
17 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Pela observação do gráfico obtido, podemos notar que deve ter ocorrido
algum tipo de erro experimental, pois era esperado que se observasse um
gráfico onde fosse possível identificar facilmente que a velocidade de reacção
aumenta com o aumento da concentração se substrato. Para além disso era
também esperado que fosse perceptível ver como a velocidade da reacção
tende para um valor limite onde todos os enzimas têm os seus centros activos
ocupados, encontram-se saturados - sendo esta a velocidade máxima.
Os parâmetros cinéticos que se podem retirar do gráfico obtido, Km e
Vmáx não correspondem, portanto, ao esperado, sendo que o valor de Km desta
enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve um valor de Km = – 9,482
± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da constante de Michaelis obtida, é
maior do que o esperado, Vmáx = 3,93 ± 9,722. Este facto é devido às altas
absorvâncias medidas para a hidrólise total e a sua diferença para as
absorvâncias medidas para a hidrólise não enzimática, uma vez que a
diferença é grande, altas absorvâncias correspondem a velocidades inicias
altas pela equação deduzida anteriormente:
Gráfico 3. Representação da velocidade inicial (M min-1) em função da concentração de substrato, neste
caso, sacarose (mM) na mistura reaccional.
18 Estudo cinético da invertase da levedura
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Como as velocidades iniciais têm um valor elevado, a velocidade
máxima também o terá.
Para obter valores credíveis de Km e Vmáx o gráfico deveria apresentar
uma curva hiperbólica rectangular, isto é, uma curva onde à medida que a
concentração de substrato aumenta, a velocidade da reacção também
aumenta, sendo que inicialmente aumenta muito rapidamente, passando
progressivamente a tender para um determinado valor, correspondente à
velocidade máxima. Assim, seria de esperar que se observasse que o gráfico
obedecia a uma cinética de Michaelis-Menten. A constante de Michaelis, Km,
seria igual à concentração de substrato para a qual a velocidade inicial da
reacção é metade da sua velocidade máxima.
De seguida está apresentado o gráfico esperado para uma cinética de
Michaelis.
Apesar dos resultados obtidos, a equação de Michaelis-Menten
apresenta alguns problemas que dificultam os cálculos dos parâmetros
cinéticos, tais como:
Imagem 2. Equação de Michaelis-Menten e representação da curva de saturação para um enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato (eixo das abcissas) e a velocidade de reacção (eixo das ordenadas).
19 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
1. Vmáx é uma assímptota da hipérbole
2. Os dois parâmetros cinéticos estão extremamente correlacionados
3. Erros experimentais
Para uma melhor determinação dos parâmetros cinéticos, a equação de
Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que são
mais úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais. São conhecidos três
métodos (transformações lineares) distintos para a determinação dos
parâmetros cinéticos (Vmáx e Km):
Método de Lineweaver-Burk;
Método de Hanes;
Método de Eadie-Hofstee.
Método de Lineweaver-Burk
O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a
forma mais comum e simples de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser
a mais fiável.
Neste método, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da
equação de Michaelis-Menten:
20 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
Como se pode observar na figura, o resultado deste tipo de
representação é uma linha recta cuja equação é do tipo y = mx + b, sendo o
ponto de intersecção entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a
⁄ , e o ponto de intersecção entre a recta e o eixo de abcissas
equivalente a ⁄ .
Geralmente, os gráficos de Lineweaver-Burk distorcem as medidas
realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a
estimativas não muito exactas de Vmáx e de Km. A principal desvantagem deste
método é a de que, ao calcular-se os inversos, altera-se por completo a
distribuição dos erros experimentais – um pequeno erro experimental passa a
ser um grande erro após a inversão da equação de Michaelis-Menten. No
entanto também apresenta a sua vantagem – permite uma determinação de
Vmáx precisa.
O gráfico obtido neste trabalho experimental para o método de
Lineweaver-Burk é o que se ilustra a seguir.
Imagem 3. Representação do gráfico de Lineweaver-Burk.
21 Estudo cinético da invertase da levedura
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Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:
Vmáx = 17,93 M/ min
Km = -1,018 mM
Método de Hanes
Neste método multiplica-se por [S] na expressão do duplo recíproco,
vista anteriormente. Esta representação não causa alteração do desvio
experimental ao longo da escala de [S], daí ser o mais indicado para a
estimativa por transformação linear e/ou gráfica.
Imagem 5. Equação do método de Hanes e respectiva representação gráfica.
Neste método [ ]
⁄ varia linearmente com [S]. O declive da recta é igual
a ⁄ . A intersecção da recta com o eixo das ordenadas é numericamente
Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk.
22 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
igual a ⁄ e a intersecção da recta com o eixo das abcissas é
numericamente igual a –Km.
Imagem 6. Gráfico obtido no método Hanes.
Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:
Vmáx = 13,85 M/ min
Km = -8,714 mM
Método de Eadie-Hofstee
Este método consiste na multiplicação por V na expressão do duplo
recíproco e no seu rearranjo.
Imagem 7. Equação do método de Eadie-Hofstee e respectiva representação gráfica.
23 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
O declive desta recta é numericamente igual a - Km. A intersecção da
recta com o eixo das ordenadas é numericamente igual à Vmáx e com o eixo das
abcissas é numericamente igual a ⁄ .
Este é um bom método para testar desvios à equação de Michaelis-
Menten.
Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:
Vmáx = 18,56 M/ min
Km = -1,032 mM
Método de Eisenthal e Cornish-Bowden
Existe ainda um método (linear) directo. É um método não paramétrico
e é denominado método de Eisenthal e Cornish-Bowden. Neste método Km e
Vmáx podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equação de
velocidade:
Imagem 8. Gráfico obtido no método de Eadie-Hofstee.
24 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
[S]i, V0i
Após a sua determinação experimental, cada par de valores de [S] i e V0i
passa a ser constante;
V e Km
Para cada experiência, a incógnita é determinar qual o par de
parâmetros cinéticos que satisfaz simultaneamente todos os valores
experimentais de [S] e V0.
Para cada [S]i traça-se uma recta que une os pontos (- [S]i, 0) e (0, V0i);
Cada recta traçada inclui todos os pares de valores de Km e V que
satisfazem os valores experimentais de [S]i e V0i;
Ordenada na origem V = V0
Abcissa na origem Km = - [S]
Imagem 9. Equação usada no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.
Imagem 10. Representação gráfica pelo método de Eisenthal e Cornish-Bowden.
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O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao único par de
valores de Km e V que satisfaz simultaneamente os dois pares de
valores experimentais de [S] e V0 – Km* e V*.
A estimativa dos parâmetros cinéticos é feita através da mediana das n.(n-
1)/2 intersecções obtidas onde n é o número de pontos experimentais.
As vantagens deste método são as seguintes:
Não requer cálculos,
Com dois ou três [S] obtêm-se uma estimativa de Km e do
desenho experimental,
Insensível a outliers.
Imagem 11. Resultados ideias do cálculo dos parâmetros cinéticos pelo método de Eisenthal e Cornish-Bowden.
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Imagem 12 Gráfico obtido no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.
Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:
Vmáx = 18,84 M/ min
Km = -0,9963 mM
Como é visível em todos os métodos que resultam do rearranjo da
equação de Michaelis-Menten, os dados experimentais obtidos não
correspondem, nem aproximadamente, aos valores esperados, uma vez que
seria de esperar um Km entre 25 e 30 mM e se obteve valores negativos de Km.
Sendo Km o valor de uma concentração é impossível ter um valor negativo.
Quanto à Vmáx seria de esperar uma menor velocidade. Segundo a
apresentação destes gráficos e valores de Km e Vmáx, o método mais rigoroso
foi o método directo, uma vez que por todos apresentarem um valor negativo, o
mais próximo do valor da literatura foi o calculado por este método. O menos
rigoroso será sempre o método de Lineweaver-Burk, uma vez que os
parâmetros utilizados na construção do gráfico são o inverso dos valores
obtidos, assim, os valores de erro reduzido são apresentados com erro grande
e os valores de erro maior são apresentados com erro diminuído.
27 Estudo cinético da invertase da levedura
17 de Maio de 2011
O facto de se obter valores tão distantes dos esperados leva a
considerar que ocorreram uma série de erros na realização do procedimento
que afectaram os resultados. Esses erros podem começar, por exemplo, na
preparação da solução de invertase e continuar na preparação do reagente de
Nelson. Uma má preparação deste reagente pode ter como consequência a
não paragem da actividade enzimática, levando a uma maior produção de
glícidos redutores e consequentemente a uma absorvância maior. Uma adição
tardia deste reagente a cada tubo conduziria a um aumento do tempo de
incubação e como tal a uma maior concentração de produto formado.
Além da preparação de soluções podem também ter ocorrido erros na
medição das absorvâncias nos diferentes tubos, uma vez que a linearidade
entre a absorvância e concentração é limitada por diversos factores químicos e
instrumentais, tais como: dispersão da radiação devido à presença de
partículas na solução ou desvios nos coeficientes de absorção molar devido a
interacções intermoleculares entre moléculas “muito próximas”, a utilização
radiação não totalmente monocromática e possibilidade de fluorescência da
amostra, assim como alterações do índice de refracção das cuvvetes e
alterações no equilíbrio das soluções analisadas. Ao obter absorvâncias muito
altas, irá obter-se concentrações de produto formado muito altas, o que vai
influenciar a velocidade inicial obtida em cada tubo de ensaio e
consequentemente os parâmetros cinéticos.
A obtenção de valores de Km muito baixos pode dever-se à alta afinidade
entre enzima e substrato. Cada enzima apresenta um valor característico de Km
e de Vmáx. Para a maioria das enzimas, o valor de Km está entre 10-1 e 10-7 M.
Esse valor depende do substrato em particular e também das condições no
sistema de reacção, tais como pH, temperatura e força iónica. Km corresponde
à concentração de substrato em que metade dos centros activos da enzima
está preenchida e mostra a afinidade pela enzima ao substrato; um Km baixo
implica uma grande concentração do complexo enzima substrato em solução,
portanto, muito substrato em solução, isto é, pequeno Km implica velocidade
maior.
Existem outros factores que podem influenciar a actividade enzimática,
como o pH e a temperatura do meio:
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pH
As proteínas como já foi visto, são construídas a partir de
aminoácidos. Estas unidades bioquímicas possuem grupos básicos,
neutros e ácidos.
Consequentemente, a enzima intacta
pode conter ambos os grupos
carregados positiva ou
negativamente a um dado pH. Deste
modo, grupos ionizáveis são,
aparentemente, muitas vezes parte
do centro activo visto que a acção
catalítica de ácidos e bases está ligada a vários mecanismos
enzimáticos. Além disso, variações do pH podem alterar a estrutura
tridimensional das enzimas. Por essas razões, as enzimas são activas
somente dentro de uma certa faixa de pH. O pH do meio pode afectar a
velocidade máxima da reacção, Km, e a estabilidade da enzima. Em
alguns casos, o substrato pode conter grupos iónicos, e o pH do meio
influi na afinidade do substrato com a enzima.
Temperatura
A velocidade das reacções catalisadas por enzimas cresce até
um certo limite. Acima de uma determinada temperatura, a actividade da
enzima diminui devido à sua desnaturação.
A velocidade de uma reacção química é afectada pela
temperatura – isso pode ser explicado pela teoria de Arrhenius que se
baseia na hipótese de que duas partículas devem se colidir na
orientação correcta e com energia cinética suficiente para que os
reagentes sejam transformados em produtos. Pode-se dizer que o
mesmo acontece com as reacções catalisadas por enzimas, lembrando
que a variação de temperatura afecta as constantes cinéticas (Km e
Vmáx).
Imagem 13. Efeito do pH na actividade enzimática.
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Em baixas temperaturas, as reacções são mais lentas devido à
queda da energia cinética do sistema. Porém, como as enzimas são
proteínas, o aumento da temperatura não causa apenas o aumento da
velocidade de reação, mas, sim, dois efeitos opostos:
Até determinada temperatura, ocorre um aumento da
velocidade de reação;
A partir de determinada temperatura, há uma diminuição na
velocidade de reação.
A actividade enzimática da invertase atinge um máximo aos 55ºC,
a temperatura ambiente do
laboratório era 29ºC.
À medida que a temperatura
aumenta, a actividade catalítica
aumenta também, até atingir um
determinado valor - Temperatura
Óptima. A partir desta temperatura,
que corresponde ao valor máximo de
actividade enzimática, a actividade
catalítica começa a diminuir, pois, a temperaturas elevadas inicia-se a
desnaturação térmica das proteínas.
Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade enzimática.
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Bibliografia
Alexander, R.R., Griffiths, J.M., e Wilkinson, M.L. (1984) Basic
Biochemical Methods, John Wiley & Sons: New York, pp. 56-67.
Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley:
Reading, MA, pp.299-321.
Cornish-Bowden, A. (1995) Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland
Press: London.
Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison
Wesley Longman: New York.
Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for
Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp.
199-206.
Questionário
1. Porque é que a solução de invertase foi preparada em tampão
Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M e os ensaios foram realizados usando-se tampão
acetato de sódio (pH 4,5) 0,2 M?
O enzima invertase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica α(1→2) do
dióxido não redutor, sacarose, originando glucose e frutose na proporção de
1:2 - por cada molécula de sacarose hidrolisada, formam-se duas moléculas de
oses redutoras.
A invertase apresenta uma actividade elevada num intervalo alargado de
valores de pH (3,5 – 5,5), apresentando um valor de pH óptimo igual a 4,5.
O pH tem uma grande influência na actividade enzimática. Os enzimas
sofrem os mesmos efeitos estruturais observados nas proteínas globulares
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pela variação de pH - mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da
enzima devido a uma repulsão de cargas.
Assim, a solução de enzima foi preparada a valor de pH igual a 7,5 pois
para este valor de pH, o enzima é bastante estável. Nesta fase o importante foi
preparar uma solução diluída assegurando que o enzima estaria presente na
sua forma estável para que mais tarde fosse possível estudar a sua actividade.
Os ensaios foram realizados usando-se tampão acetato de sódio (pH
4,5) 0,2 M pois este é o valor de pH óptimo do enzima, ou seja, é o valor de pH
para o qual o enzima tem máxima potência e eficiência.
Caso a preparação da solução fosse realizada para outros valores de
pH, o enzima poderia não ser estável e, mais tarde, ao realizar os ensaios,
poderia ocorrer o caso extremo de não se encontrar enzima em solução para
catalisar a reacção, sendo impossível de atingir o objectivo do trabalho.
2. Como comprovaria que a ocorrência de uma reacção num
homogenato ou extracto celular era devida à acção catalítica de um
enzima, presente nesse homogenato, sobre o substrato utilizado?
Para comprovar que a ocorrência de uma reacção num homogenato ou
extracto celular era devida à acção catalítica de um enzima realizar-se-ia um
estudo cinético, traçando-se o gráfico da velocidade inicial em função da
concentração de substrato. Se nesse gráfico se obtivesse uma hipérbole
rectangular, concluir-se-ia que a reacção era devida à acção catalítica de um
enzima que obedece a uma cinética de Michaelis-Menten.
No entanto, existem vários enzimas que não possuem um
comportamento Michaeliano e, por isso, seria necessário recorrer a outra forma
de confirmar a existência de actividade catalítica. Poder-se-ia, então, efectuar
um ensaio com um agente interferente, causando, por exemplo, uma variação
significativa de pH e/ou temperatura. Caso se obtivesse um gráfico de
velocidades iniciais em função da concentração de substrato em que a
velocidade inicial da reacção tivesse diminuído ou mesmo desaparecido em
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17 de Maio de 2011
relação ao ensaio cinético sem agentes interferentes, saber-se-ia que o enzima
era responsável pela actividade catalítica. Os agentes interferentes actuariam
como agentes desnaturantes dos enzimas catalíticos da reacção, de natureza
proteica, perdendo assim a sua actividade devido a alteração das condições
experimentais do meio.
3. Um enzima que apresenta um pH óptimo a 6,8, tem uma
actividade muito reduzida a pH 4,2. Como poderia determinar se esta
redução na actividade resulta de uma ionização reversível do substrato
e/ou enzima ou é causada por uma desnaturação irreversível do enzima?
O pH determina o estado de ionização dos diferentes grupos
constituintes dos diversos componentes do vaso reaccional, nomeadamente
dos enzimas e do substrato. Variações acentuadas deste, poderão levar à
impossibilidade de estabelecer ligações enzima-substrato, devido à
modificação do centro activo do enzima. Estas modificações poderão ser de tal
modo significativas que alteram a estrutura da proteína, pois as alterações das
forças electroestáticas de diferentes grupos ionizáveis levam a um aumento da
instabilidade do enzima, levando à sua desnaturação e consequente perda da
actividade catalítica.
Para verificar experimentalmente se ocorreu desnaturação irreversível
do enzima ou ionização reversível do substrato e/ou enzima, realizar-se-ia um
ensaio cinético para um pH óptimo de 6,8. De seguida realizar-se-ia um outro
ensaio adicionando um ácido, de modo a diminuir o pH até ao valor de 4,2.
Analisando a velocidade da reacção, verificar-se-ia que no último ensaio
ocorreria uma diminuição da mesma. Se, ao voltarmos ao pH 6,8, adicionando
base, se verificasse um aumento da velocidade da reacção, significaria que
tinha ocorrido uma ionização reversível do substrato e/ou enzima. Caso
contrário, se a velocidade se mantivesse inalterável, significaria que tinha
ocorrido uma desnaturação irreversível.
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4. Qual é a forma geral da curva que representa a dependência
da velocidade de uma reacção enzimática com a temperatura do meio?
Justifique sucintamente.
A temperatura apresenta uma grande influência na catálise enzimática.
Existe uma temperatura para a qual a actividade do enzima é máxima –
temperatura óptima – diferente de enzima para enzima (Imagem 14. Efeito da
temperatura na actividade enzimática.)
Esta influência sobre a cinética da reacção enzimática deve ser
entendida em duas fases distintas: no princípio, aumentos de temperatura
levam a aumentos da velocidade de reacção, por aumentar a energia cinética
das moléculas componentes do sistema – este efeito é observado num
intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial
do enzima.
No entanto, temperaturas muito mais elevadas levam à desnaturação do
enzima por alterarem as ligações químicas que mantêm a sua estrutura
tridimensional. A temperatura que provoca a desnaturação está, geralmente,
pouco acima da sua temperatura óptima. Deste modo, verifica-se uma
diminuição da actividade enzimática à medida que a temperatura aumenta a
partir da temperatura óptima.
Por outro lado, a temperaturas inferiores à temperatura óptima, a
velocidade da reacção é pequena devido à existência de menor energia
envolvida nas colisões entre o enzima e o substrato, originando uma menor
actividade enzimática.