Aplicación de la citometría de flujo al Aplicación de la citometría de flujo al estudio de la enfermedad mínima estudio de la enfermedad mínima
residual en leucemias agudasresidual en leucemias agudas
Air-cooled Argon Ion Laser
Beam Shaping Lenses
High SensitivityQuartz Flow Cell
Forward ScatterDetector
Side ScatterDetector
525BP FL1 (FITC)
575BP FL2 (RD1)
620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)
488DL488BK
550DL600DL
645DL
Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos
Láser, cámara de flujo y sistema óptico
11 de octubre de 2007
Leucemias Agudas. Respuesta al Leucemias Agudas. Respuesta al Tratamiento Tratamiento
AMO: < 5% blastos
SP: plaquetas > 100x109/L
RAN > 1x109/L
Cariotipo normal
Remisión completa morfológica Remisión completa citogenética
5%
10-5
E.Indetectable
EMR
Recaída
Tiempo
MORFOLOGÍA
CITOGENÉTICA
PCR
CITOMETRÍA
% Blastos en M.O.
Tratamiento Inducción
Tratamiento Consolidación
TPH Tratamiento Mantenimiento
Enfermedad Residual MínimaEnfermedad Residual Mínima
1012
1010
100-2
Carga
Normal LMA M0 LMA M1
LMA M7 LLA
MorfologíaMorfología
Linfoblastos reactivos
Linfoblastos LLA pro B
Morfología (LLA post inducción)Morfología (LLA post inducción)
Linfoblastos reactivos
Linfoblastos LLA bcr-abl
Morfología (LLA post inducción)Morfología (LLA post inducción)
Características de la muestra
• Aspirado medular
• Debe ser representativo de médula ósea
aspirado enérgico
1,5 mL de muestra
evitar la dilución con sangre medular
• Procesar en < 24 horas
Evitar pérdidas selectivas de células
EMR. CFMEMR. CFM
• Diferenciar las LMA de las LLA (B y T).
• Subclasificación precisa de las LLA (B y T).
• Diagnóstico preciso de M0, M6 (maduras) y M7.
• Diagnóstico de L.A. bifenotípicas y L.A. con marcadores aberrantes.
• Orientar la búsqueda de alteraciones citogenéticas específicas:
My: t(8;21) (ETO-AML1); t(15;17) (PML-RARa); inv(16) (CBFb-MYH11X)
Ly: t(9;22) (BCR-ABL); t(v;11q23) (MLL); t(1;19) (E2A-PBX1); t(12;21) (TEL-AML1)
• Detección de IFL al diagnóstico para el seguimiento de EMR.
Estudio Inicial de la LeucemiaEstudio Inicial de la LeucemiaObjetivos de la CFMObjetivos de la CFM
EMR. Citometría de flujo EMR. Citometría de flujo multiparamétricamultiparamétrica
PASOS:
• En el momento del diagnóstico:
1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL)
2. Diseñar paneles de seguimiento específicos
• Durante el seguimiento:
3. Obtención de muestras adecuadas
4. Aplicación de los paneles de seguimiento
5. Adquisición: Live gate
Estrategia de live-gate o list-gate
Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-
1. 1. Se adquieren 20000 leucocitos y se establece el % de células B
2. 2. En una live-gate (azul) se adquieren sólo las células CD19+
3. 3. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD20-CD10-
4. 4. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD34+ CD10-
EMR. CFMEMR. CFM
10 10 10 10 100 1 2 3 4
ALBA BORRAS RECHE.008CD10 PE ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
JUAN M.LOZANO GONZALEZ.013CD10 PE ->CD10 CD10
CD20 CD20
Morfología vs InmunofenotipoMorfología vs Inmunofenotipo
IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B)
EMR: 1,43%
Normal
EMR. LLA-B MLL+EMR. LLA-B MLL+
CD20
CD10
CD10
CD20
CD19
Post-Inducción: 0,14% de células
CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2).
Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).
Médula ósea en recuperación post QT (LMA-M2 en RC)
IFL: CD19+ CD45-
EMR: 0,024%
EMR. LLA-B común (TEL-AML1)EMR. LLA-B común (TEL-AML1)
Expresión normal
Expresión anómala
EMR. LLA-B (BCR-ABL)EMR. LLA-B (BCR-ABL)
Ddiagnóstico (sp)
LLA pro-B
Post-Inducción
EMR: 0,058%
4 meses después del diagnóstico
ER: 30,6%
LLA-B MLL+. Evolución EMRLLA-B MLL+. Evolución EMR
Inmunofenotipos Leucémicos (1)
NUMCross-LineageCD19+CD33+ 13CD19+CD13+ 7CD19+CD15+ 3
total 23AsincronismosCD19+CD22++CD34+ 5CD19+CD22++CD20- 5CD20+TdT+ 1IgMc+TdT+ 2
total 13HiperexpresiónCD34+++ 4CD10+++ 16
total 20Fenotipos infrecuentesCD19+CD45- 22CD19+CD34+CD10- 9CD19+CD34-CD10++ 6CD19+CD20-CD10- 5
Total 42
NUMFSC/ SSCHight FSC/ SSC 1
total 1AsincronismosTdT+CD5+ 1
total 1Fenotipos ectópicosCD1a+ 2CD3-CD4+CD8+ 2CD3dimCD7+ 1CD3dim/-CD4-CD8- 2
total 7Fenotipos infrecuentesCD34+CD7+ 1
Total 1Pérdidas antigénicasCD5- 1
Total 1
LLA-B (n=43)
Entre 1 y 5 IL/ paciente
LLA-T (n=4)
3 IL/ paciente
(1) No incluidos KOR-SA ni NG2
Estudio Inicial de la Leucemia. CFMEstudio Inicial de la Leucemia. CFM
• Infidelidad de línea (29%)– CD2 (21%)– CD7 (9%)– CD19 (2%)– CD20 (0,8%)– CD5 (0,8%)
• Sobrexpresión (21%)– CD33 (11%)– CD34 (9%)– CD13 (2%)– CD117 (0,8%)– CD15 (0,8%)
• Anormal FSC/SSC (17%)– Alto FSC/SSC (13%): CD2,
34, 7, 117, 19, 20– Bajo FSC/SSC (4%): CD13,
33,15
Fenotipos aberrantes en LMAFenotipos aberrantes en LMA126 pacientes (San Miguel- Blood 2001)126 pacientes (San Miguel- Blood 2001)
• Asincronía de antígenos (78%)– CD34+/ DR -/CD33+ (9%)– CD34+/CD56+ (8%)– CD34+/CD11b+ (5%)– CD34+/CD33++ (3%)– CD34+/CD14+ (3%)– CD34+/CD117+/DR - (2,3%)– CD34+/CD117-/CD15+ (2,3%)– CD34+/CD3-/CD13+/DR+ (1,5%)– CD34+/CD3-/CD13+/DR- (0,8%)– CD34+/CD3-/CD117+/DR+ (0,8%)– CD117+/CD33+/DR- (11%)– CD117+/CD34-/CD15- (6%)– CD117+/CD11b+ (5,5%)– CD117+/CD33+/CD34-/CD15+ (4%)– CD117+/DR-/CD15+ (2,3%)– CD117+/DR-/CD15- (2,3%)– CD117+/DR+/CD33+/CD34- (0,8%)– CD33++/DR-/CD34-/CD15-/CD14- (17%) – CD33-/CD13+ (14%)– CD33+/CD13- (7%) – CD33+/DR+/CD4+/CD45dim (0,8%)– CD33+/DR+/CD15-/CD14- (0,8%)– CD33+/CD45d/CD34-/CD15- (0,8%)– CD33+/DR+/CD56+/CD13+ (0,8%)
t(9;22) (BCR-ABL) KOR-SA+, CD66+, CD38 het / low, CD34 y CD10 hom, CD13+
11q23 (MLL) Pro-B, CD15+, NG2+, My+
t(1;19) (E2A-PBX1) Pre-B
t(12;21) (TEL-AML1) CD45-, CD20-, CD10+++, >DNA index
LLA-B. CorrelaciónLLA-B. Correlación citogenéticacitogenética
LMA. Correlación citogenéticaLMA. Correlación citogenética
CBF-MYH11X CD34+, CD13+, CD2+ (31%)
PML-RAR HLA-DR-, CD34-. CD15s- y CD13+ heterogéneo. Stop madurativo.
PLZF- RAR CD56+
AML1-ETO CD19+, CD56+, CD34+++
Paneles de anticuerpos monoclonales empleados para el estudio inicial de las LAs (FITC/ PE/ ECD/ PC5/ PC7)
cMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/ CD8/ CD3/ CD19CD10/ CD20/ CD45/ CD34/ CD19CD38/ CD22/ CD45/ HLADR/ CD19CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD19KOR-SA/ 7.1/ CD45/ CD24/ CD19IP (DNA)/ pan-B
cMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/CD8/ CD3/ CD19CD7/ CD34/ CD3/ HLADR/ CD5CD7/ CD1a/ CD45/ CD33/ CD56CD7/ CD13/ CD45/ CD10/ CD2CD38/ TCR/ CD45/ TCR/ CD3
LLA de fenotipo B LLA de fenotipo T
INMUNOFENOTIPOS LEUCÉMICOS
LMAcMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/ CD8/ CD3/ CD19CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD34CD7/ CD117/ CD45/ CD34/ CD56CD65/ CD135/ CD45/ CD2/ CD34CD64/ CD11b/ CD45/ CD14/ CD16HLADR/ CD235a/ CD45/ CD34/ CD41
Estudio Inicial de la Leucemia. CFMEstudio Inicial de la Leucemia. CFM
EMR en LLA infantil. EMR en LLA infantil. CheckpointCheckpointCoustan-Smith E et al. Blood 2000
EMR POST-TRATAMIENTO DE INDUCCIÓN
ESTUDIOS SECUENCIALES
Van Dongen JJM et al. Lancet 1998 (n=129)
Recaídas (3 a)
Bajo Riesgo (EMR- en semanas 5 y 12) 2%
Alto Riesgo (EMR 0,1% en semanas 5 y 12) 75%
Riesgo Intermedio (EMR 0,1% en semanas 5 o 12) 23%
Coustan-Smith E et al. Blood 2000 (n=195)
(EMR 0,01%) Recaídas (4 a)
Post-inducción EMR+ y Semana 14 EMR+ 68%
Semana14 EMR- 7%
EMR en LLA infantil. CheckpointEMR en LLA infantil. Checkpoint
EMR en LLA infantil. CheckpointEMR en LLA infantil. CheckpointDworzak MN et al. Blood 2002
Alto Riesgo: EMR 0,1% en d. 33 y 0,01% en s. 12
EMR 10/ L en d. 33 y 1/ L en s. 12
DETERMINACIÓN SECUENCIAL
Vidriales MB et al. Blood 2003
EMR en el día 14 del tratamiento de inducción
0,5% RFS 16 m
<0,5% RFS NR
<0,03% RFS “extrapolada” a los 5 años de 90%
Vidriales MB et al. Blood 2003
EMR en el día 35 del tratamiento de inducción
0,05% RFS 17 m
<0,05% RFS 42 m
EMR en LLA de adultos. CheckpointEMR en LLA de adultos. Checkpoint
0 10 20 30 40 50 600
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Time (months)
0 10 20 30 40 50 600
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Time (months)
mediana (IC 95%)
EMR < 0,02 na
EMR 0,02 9 5 m
mediana (IC 95%)
EMR < 0,02 na
EMR 0,02 6 5 m
EFS OS
EMR en LLA Infantil. ResultadosEMR en LLA Infantil. Resultados
San Miguel JF et al. Blood 2001
EMR después del tratamiento de Inducción
EMR en LMA. CheckpointEMR en LMA. Checkpoint
Venditti A et al. Blood 2000
EMR después del tratamiento de consolidación
OS 0,035% 10m
<0,035% nr
RFS 0,035% 77% (7m)
<0,035% 17% (nr)
Buccisano F et al. Leukemia 2006
EMR después del tratamiento de consolidación
(cutoff : 0,035%)
Post-IND (pos) / Post-CONS (neg) =
Post-IND (neg) / Post-CONS (neg)
Checkpoint EMR en LMA. Checkpoint EMR en LMA.
EMR en LLA. ConclusionesEMR en LLA. Conclusiones
• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables
• Cantidad de EMR significativa:
Post-tratamiento de Inducción: 0,1%
Durante el resto del tratamiento: 0,01%
• Muy mal pronóstico:
Pacientes con EMR 1% post-Inducción
EMR persistente
• Muy buen pronóstico:
EMR- post-Inducción y post-Consolidación
EMR- precozmente (d. 19)
• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables
• Muchas veces no es posible incluir a todas las células leucémicas en un solo IFL.
• Cantidad de EMR significativa: variable según estudios
Post-tratamiento de Inducción: 0,1%, 0,5%,
* Post-Consolidación: 0,2% , 0,035%
• Muy mal pronóstico:
Pacientes con EMR 1% post-Inducción (83% recaidas)
• Muy buen pronóstico:
EMR- post-Inducción < 0,01%
EMR en LMA. ConclusionesEMR en LMA. Conclusiones