Artrosis: Activación de Autofagia para
prevenir el daño articular
Beatriz Caramés
Grupo de Biología del Cartílago, Reumatología-INIBIC
Cátedra Bioibérica de Ingenieria Tisular y Terapia Celular, 18 de Noviembre 2015 1
Ideas para recordar…
La artrosis (OA) es una patología de la articulación, caracterizada
por la destrucción del cartílago articular, la inflamación de la
membrana sinovial y el daño en el hueso subcondral=
discapacidad.
El envejecimiento es uno de los factores de riesgo más
importantes en la OA, por lo que retrasar su aparición podría
reducir la aparición de esta patología.
Un fallo en los mecanismos de homeostasis celular (balance
síntesis/degradación) es el evento más temprano que precede a la
degeneración del cartílago articular en la OA.
No existen fármacos modificadores de la enfermedad.
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Defecto autofagia= Proteínas dañadas/
acumulación organelas
Estrés oxidativo (producción ROS)
Disfunción Mitocondrial
Senescencia celular y muerte
Autofagia
Degradación / Síntesis MEC
Degradación del Cartílago
Artrosis (OA) Husa et al., Nature 2010 (with modifications)
La autofagia es esencial para el mantenimiento
de la homeostasis del cartílago
Envejecimiento
Factores Mecánicos
Factores Metabólicos
Inflamación
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Autofagia: Mecanismo de reciclaje celular
Sistema de reciclaje para mantener la
función celular y la supervivencia.
Mecanismo de degradación celular
más importante a través de enzimas
lisosomales.
Se activa cuando hay estrés celular
(ayuno, organelas dañadas, proteínas
mutadas).
Las consecuencias de un defecto de
autofagia: Patologías relacionadas
con el envejecimiento.
Barranco, Nat Rev Rheumatol 2015
Mizushima and Komatsu, Cell 2011
Spilman et al, Plos One 2010
Inuzuka et al, Circulation 2009
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Autofagia: Señalización y Regulación
Lotz and Caramés, Nat Rev Rheumatol, 2011
Atg genes
LC3-II
Atg genes
LC3I
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Autofagia: Morfología
Autofagosomas
Autolisosomas
Mizushima at al., Cell 2010 Mouse embryonic fibroblasts (EM)
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Normal OA
Be
cli
n1
L
C3
Aging
UL
K1
Sa
fra
nin
O
Normal OA
LC3-II
Beclin1
GAPDH
LC3-I
ULK1
GAPDH
Aging
ULK1: Autophagy initiator
Beclin1: Autophagy regulator
LC3: Autophagy executer Human cartilage
Human chondrocytes
La autofagia disminuye en el cartílago OA y envejecido
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Disminución de autofagia en un modelo de OA B
ecli
n1
Sa
fra
nin
O
Sham 8 Weeks after surgery
UL
K1
Mouse knee joints (C57BL6/J)
2 months old (MMTL+MCL)
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La autofagia basal está disminuida con la edad
Ratones transgénicos GFP-LC3 (C57Bl6/J)-Análisis confocal
6 meses/edad 28 meses/edad
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9 mo-12 mo
La autofagia basal está disminuida con la edad
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El daño en la articulación es posterior al defecto de autofagia
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Disminución de autofagia: 9 mo-12 mo
La pérdida de función de autofagia regula dianas
relacionadas con el envejecimiento
Tabla 1. Proteínas moduladas (siAtg5 vs siCtrl)-iTRAQ-Condrocitos humanos
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El daño mecánico disminuye la autofagia
Control Injury Control Injury Control Injury
24 hours 48 hours 96 hours
LC3-I
LC3-II
β-actin
ULK1 LC3 Beclin1
Co
ntr
ol
Inju
ry 4
8 h
ou
rs
Mature Bovine Explants (14-30 months, 8 mm diameter)
Injury Conditions: 40% Strain; 2 min preload; 0.5 seconds load
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24 hours 48 hours 96 hours
Co
ntr
ol
Inju
ry
Rap
a 1
μM
Inju
ry+
Ra
pa
¿Tiene la activación farmacológica de autofagia un
efecto beneficioso sobre la OA?
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La indución de autofagia previene el daño articular
Surgically-induced OA (MMTL+MCL; Glasson et al., Osteoarthritis Cartilage 2007)
Vehicle (DMSO); Rapamycin (1 mg/kg weight/day); Daily, intraperitoneal (i.p)-10 weeks
Safranin O staining; Histological Scoring System (Glasson et al., Osteoarthritis Cartilage 2010)
OA-Vehicle Control-Vehicle (10x)
Control-Rapa OA-Rapa
OA-Vehicle (40x)
OA-Rapa
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Población heterogénea de ratones: diferentes cepas de ratones
BALB/CByJ x C57BL/6J F1 (CB6F1) females x CH3/HeJ x DBA/2J F1 (C3D2F1) males
Dosis de Rapamicina: 2.24 mg rapa/Kg peso/dia
Estudio Multicéntrico
Cohorte de estudio: 1960 ratones
Harrison et al. Nature, 2009
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Normal OA leve
OA moderada OA Severa
Población heterogénea de ratones: Patología articular
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La rapamicina reduce el daño articular
* p > 0.01
Control Rapamicina
15 ratones Control/ 15 ratones Rapamicina
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National Institute of Aging Intervention Testing Program (NIA-ITP)
Objetivos:
Encontrar agentes que puedan incrementar la supervivencia/retrasar el
envejecimiento en ratones:
1. Para entender los mecanismos que controlan el envejecimiento.
2. Para desarrollar farmacos que retrasen el envejecimiento y las enfermedades
relacionadas con el envejecimiento en humanos.
Compound Results
Aspirin Increased Lifespan
Nitroflurbiprofen Increased Lifespan
Nordihydroguaiaretic acid
Caffeic acid phenethyl ester
Enalapril
Rapamycin Increased Lifespan
Simvastatin No increased lifespan
Resveratrol No increased lifespan
Oxaloacetic acid
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La diabetes provoca daño articular que se previene
inhibiendo mTOR con Rapamicina
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Glucosamina activa autofagia en condrocitos
LC3-II
Control GlcN 0.1 GlcN 1 GlcN 2.5 GlcN 5 GlcN 10
24 hours
mM
LC3-I
GADPH
8 hours 24 hours
Control 9.82 ± 1.95 11.82 ± 2.32
GlcN 10 mM 40.91 ± 3.02* 46.87 ± 2.40*
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Glucosamine Hydrochloride
* p < 0.01
GlcN 250 mg/kg weight/day
(ip/gavage administration) - 7 days
GFP-LC3 mice (6 mo)
** p < 0.05
Glucosamina activa autofagia en cartílago
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Glucosamina induce autofagia a través de la
inhibición de Akt/FoxO y mTOR
p-FoxO3
p-rbS6
p-Akt
GAPDH
GAPDH
GAPDH
Control GlcN 10 mM
24 h
Condrocitos humanos
Protein of interest Control GlcN 10 mM
p-Akt 0.263 ± 0.046 0.098 ± 0.014*
pFoxO3 0.066 ± 0.019 0.010 ± 0.002*
prbS6 1.029 ± 0.180 0.277± 0.060*
GlcN Akt FoxO (active form)
p-mTOR
p-rbS6
p-FoxO (inactive form)
* p < 0.05
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Identificación de nuevas moléculas
mediante cribado de alto rendimiento (HTS)
Alteración de la homeostasis del cartílago articular:
- Incremento envejecimiento articular: moléculas anti-senescentes
- Disminución autofagia: moléculas pro-autofágicas
Colaboración Grupo BioFarma (USC)
HTS
Condrocitos
Humanos
Inducción
senescencia
Disminución
autofagia
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BioFarma Chemical Libraries
Caramés et al, Arthritis Rheum, 2010, 2012, 2013, 2015
Caramés et al, Annals Rheum Dis, 2012
López de Figueroa et al, Arthritis Rheum, 2015
Ribeiro et al, Osteoarthritis Cartilage, 2015
López de Figueroa et al (In preparation)
Ribeiro et al (In preparation)
OA
Terapéutica
La autofagia es esencial para el mantenimiento
de la homeostasis del cartílago
Defecto autofagia= Proteínas dañadas/
acumulación organelas
Estrés oxidativo (producción ROS)
Disfunción Mitocondrial
Senescencia celular y muerte
Autofagia
Síntesis / Degradación MEC
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Envejecimiento
Factores Mecánicos
Factores Metabólicos
Inflamación
Dra. Beatriz Caramés
Paloma López de Figueroa
Madalena Ribeiro Uxía Nogueira
División de Reumatología
INIBIC-Hospital Universitario de A Coruña
Colaboradores Grupo de Biología del Cartílago
Agradecimientos
Dr. Francisco J. Blanco
Dr. Martin Lotz Dra. María Isabel Loza
Dr. Mohit Kapoor Dr. Carlos López Otín
Dr. Ron Heeren
INIBIC:
Plataforma Histomorfología Plataforma Proteómica
Plataforma Cultivos
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Artrosis: Activación de Autofagia para
prevenir el daño articular
Beatriz Caramés
Grupo de Biología del Cartílago, Reumatología-INIBIC
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