Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming
Dra. María Alejandra [email protected]
Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César MilsteinCONICET- Fundación Pablo Cassará
Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones
Buenos Aires 2 de noviembre 2009
Molecular Farming• Se define como una estrategia alternativa de producir
moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales)
• Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad.
• La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año.
• Mercado actual: 50 mil millones de U$.
• Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.
Ventajas• Bioseguridad• Maquinara de síntesis proteica eucarionte• Producción en condiciones controladas
(sistemas confinados)
Aspectos críticos• Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para
resolverlo (humanización de glicoproteínas).
• Tiempo: optimización del esquema de producción
• DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio).
• Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.
Sistemas de producción
• Planta a campo• Sistemas confinados (cultivos in vitro,
invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)
Cultivos in vitro• Callos• Cultivos de órganos (raíces, tallos)
– Frascos agitados– Bioreactores
• Suspensiones celulares – Frascos agitados– Bioreactores
Raíces transformadas
•Rápido crecimiento
•Estado de organización
•Estabilidad de producción
Bioreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)
Bioreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces
Biorreactores para el cultivo de raíces
Bomba de aire
Ro
tám
etro
Bo
mb
ap
eris
tált
ica
Generador de niebla
Cámarade cultivoControlador Controlador
On Off
Intensidad
Filtro de aire
Condensadorde niebla
Adición de nutrientes
Bomba
Salida de aire
AireAire
Inóculo
Reservorio
Malla de inmovilización
Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Suspensiones celulares
• Frascos agitados– Pequeños volúmenes– Conocimiento del
sistema– Estudios para escalado
Bioreactores
• Volumen 1 -3000 litros• Producción en gran escala• Modelo acorde al sistema y
escala de producción
Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales
Consideraciones para el diseño
• Crecimiento y demanda de oxígeno• Estado de agregación y propiedades
reológicas• Sensibilidad a las fuerzas de corte• Formación de espuma/ pared celular
Crecimiento y demanda de oxígeno• Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs)
– BY-2: 12 hs– NT-1, Xanthi: 18-24 hs
• Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: 0.02-0.1 x 10-9)
• A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno.
• Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación.• KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; células
animales: 0.25-10), rango restringido.• Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados),
altos niveles tóxicos.
Agregados-reología
• Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc.
• Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados
• Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).
Sensibilidad a las fuerzas de corte• Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a
bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5-10 µm), células animales ( diámetro: 10-100 µm)
• Alto volumen de vacuolas (90% volumen total)• Pared celular rígida, no- flexible.• Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y
estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar)
• Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación.
• Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados
Espuma/pared celular
• En la fase de crecimiento exponencial• Exacerbada durante la fase estacionaria• Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de
nutrientes y oxígeno: caída de la productividad• Crecimiento en pared, impeler, sensores.• Taponamiento de filtros de aire.• Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y
aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.
Estrategias para productos intracelulares
• Aumento de la tasa de crecimiento• Aumento de la concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch-/batch alimentado a alta densidad
celular• Cultivo semi-continuo o continuo para evitar
grandes agregados celulares y adhesión a superficies
Estrategias para productos extracelulares
• Mayor tasa de crecimiento• Mayor concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de
alta densidad celular• Recuperación de producto in situ• Mayor estabilidad de proteínas por agregado de
aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.
Tanques agitados
• Pros– Flexibilidad– Altos coeficientes de transferencia de masa– Homogéneos– Aplicable a cultivos de alta densidad– Permite trabajar en GMP
• Cons– Sistema de mezclado (shear stress)– Costos – Generación de calor– Riesgos de contaminación en válvulas
Agitador de paletas planas o Rushton
Agitador de paletas inclinadas
Neumáticos: burbujeo• Pros
– Fácil de escalar– Bajos costos– Bajos riesgos de contaminación– Sin generación decalor– Bajo shear stress
• Cons– Transferencia de oxígeno pobre– Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad– Formación de espuma a alta aireación
Neumáticos: airlift
• Pros– Direccionamiento del burbujeo– Buena transferencia de oxígeno– Menor shear stress, sin generación de
calor– Menores tiempos de mezclado– Menores costos, sencillez de escalado,
eficiente circulación de fluidos
• Cons– Mezclado ineficiente en cultivos de alta
viscosidad– Formación de espuma a alta aireación
Wave
• Pros– Shear stress– Transferencia de oxigeno– Costos operacionales
• Cons– Escalado– Transferencia de calor– Estrategias operacionales
avanzadas
De membrana
• Pros– Remoción de productos
extracelulares– Bajo shear stress– Bajos costos operacionales
• Cons– Escalado– Oxigenación– Baja transferencia de calor– Monitoreo on- line
Algunos ejemplos comerciales
Producto Sistema Compañía
Vacunas aviares Suspensiones celulares de tabaco (4-40 mg l-1)
Dow AgroSciences
glucocerebrosidasa Suspensiones celulares de zanahoria (Fase III)
Protalix Biotherapeutics
paclitaxel Suspensiones celulares de Taxus
Phyton Biotech
IPLEX (macasermin rinfabato )
Suspensiones celulares (2 g l-1)
Phyton Biotech+ Insmed
Eco-Pod
Reactor temporario para algas.Producción de biocombustibles.
Muchas gracias por su atenció[email protected]