UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DECANATO
PROYECTO DE TESIS
TÍTULO: Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto
como promotoras del desarrollo vegetativo de arroz (Oryza
sativa).
AUTORES: MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel
PATROCINADOR: Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO SECRETARIO
MIEMBRO VOCAL JEFE CENTRO INVESTIGACION
JEFE DEPARTAMENTO DECANO
Lambayeque, Febrero del 2008
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DECANATO
PROYECTO DE TESIS
TÍTULO :
Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp
y su efecto como promotoras del desarrollo
vegetativo del arroz (Oryza sativa).
AUTORES :
GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio
MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel
ASESOR : Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
OFICINA DE GRADOS Y TITULOS
PROYECTO DE TESIS
I. GENERALIDADES
1. Título del Proyecto
Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp y su efecto como
promotoras del desarrollo vegetativo del arroz (Oryza sativa).
2. Personal investigador
2.1 Autores:
GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio
MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel
2.2 Asesor:
Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán
3. Carrera profesional / Especialidad
Biología/ Microbiología – Parasitología
4. Tipo de investigación
4.1. De acuerdo al fin que se persigue
Aplicada
4.2. De acuerdo a la técnica de contrastación
Experimental
5. Régimen de investigación
Libre
6. Localidad e Institución donde se desarrollará el Proyecto
Lambayeque, Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de
Ciencias Biológicas. Invernadero de la Facultad de Agronomía. Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.
7. Duración del Proyecto
9 meses
8. Fechas probables de inicio y terminación
8.1. Inicio: Noviembre 2008
8.2. Terminación: Julio 2009
9. Cronograma de actividades
ACTIVIDADES2008 - 2009
NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL
FASE DE PLANEAMIENTO
Revisión bibliográfica X X X
Elaboración del Proyecto
X X
Presentación del Proyecto
X X
Aprobación del Proyecto
Implementación del Proyecto
X
FASE DE INVESTIGACIÓN
Recolección de muestras
X X X
Procesamiento de muestras
X X X
Registro de datos X X X
Análisis estadístico de datos
X X
FASE DE COMUNICACIÓN
Análisis de Interpretación
X X
Elaboración del informe X X
Presentación y sustentación
X
10. Recursos disponibles
10.1 Personal
Se contará con el personal encargado del servicio técnico del Laboratorio de
Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas, “Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo”.
10.2. Equipos e Instrumentos
- Autoclave marca FANEN, autoclave vertical mod. 415.
- Biorreactores tipo tanque Batch en flujo de aire descendente.
- Estufa marca PRECISIÓN SCIENTIFICO P.S 30 -110ºC.
- Horno marca THELCO. Temp Range to 200ºC.
- Microscopio L200 eléctrico binocular marca ZEIS.
- Balanza analítica marca EXCELL BH – 150. Cap: 150g DIv: 0.005g.
- Cocina eléctrica marca CHARITO de una hornilla.
- Moledor manual marca CORONA. Acero inoxidable.
- pHmetro BIOCHEMICALS INSTRUMENTS S.R.L. Portátil con
compensación automática de Temperatura. Rango 0.0 a 14,0 pH,
margen de error +/- 0.1.
- Espectrofotómetro marca Génesis
- Cámara Digital Pentax 8.2 megapixeles
- Memoria USB KINGTONS, 4 Gb.
- Computadora Pentium IV.
10.3. Material y Reactivos
- Matraces de 250 mL
- Asas bacteriológicas
- Reactivos para la tinción de Gram
- Tubos de vidrio (13 x100 mm y 15x 150 mm)
- Placas de Petri
- Pipetas de 1 mL y 10 mL
- Láminas portaobjetos
- Láminas cubreobjetos
- Solución salina fisiológica estéril.
- Viales
- Jeringas de 1 mL y 5 mL
- Espátula
10.4. Local
Laboratorio de Microbiología – Parasitología de la Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
11.0 Presupuesto
02.00 Bienes S/.
2050,00
02.06 Material de escritorio S/. 130,00
- 04 juegos de etiquetas
- 03 lápices marcador
- 04 millares de papel Bond A4 75 g
- 06 lapiceros
- 06 lápices
- 02 correctores de tinta
- 04 rollos de pabilo
- 03 cuadernos
- 03 cintas de embalaje
02.09 Material de Laboratorio S/. 570,00
- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb)
- Agar medio infusión de papa (BMS)
- Agar nutritivo
- Agar
- Solución salina fisiológica estéril
- Peróxido de hidrógeno
- Placas de Petri
- Frascos de boca ancha
- Tubos de dilución
- Tubos para pruebas bioquímicas
- Pipetas de 1 mL, 10 mL
- 04 asas bacteriológicas
- Agitadores de Vidrio
- Caja de Láminas portaobjetos
- Caja de Láminas cubreobjetos
- Algodón
- Jeringas de 5 mL, 1 mL
02.14 Material de impresión S/. 450,00
- 04 cartuchos de tinta para impresora en negro y a colores
- Memoria USB Kingston 4GB
02.16 Material fotográfico S/. 900,00
- Cámara digital
- Fotografías
03.00 Servicios S/. 2000,000
03.01 Pasajes y subvenciones S/. 800,00
- Movilidad a Lambayeque, 4 días por semana
- Movilidad a Chiclayo – Pomalca y viceversa
- Internet
- Impresiones: tipeos en computadora, copias fotostáticas
- Encuadernación
03.15 Publicaciones S/.300,00
- Publicación información total 6 ejemplares
03.24 Otros S/. 900,00
- Procesado revelado de películas: Fotografías y diapositivas
- Biorreactor tanque aireado con flujo descendente
- Análisis físico-químico del suelo
TOTAL S/. 4050,000
12. Financiación
El Presente proyecto de investigación será autofinanciado con el apoyo de la
Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento Académico de Microbiología y
Parasitología de la Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”.
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. REALIDAD PROBLEMÁTICA
El arroz (Oryza sativa L.) es el alimento básico para más de la mitad de la
población mundial, y representa el segundo cereal con más hectáreas sembradas a
nivel mundial después del trigo. El Perú ocupa la posición 14 en producción a nivel
mundial con 1 664 700 Tm de arroz al año, superado por Colombia (2 100 000 Tm) y
Brasil (10 940 500 Tm), siendo China el mayor productor del mundo con 592 873 253
Tm anuales (Infoagro, 2008).
La forma más conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrógeno
de los cultivos de arroz es la fertilización química, la cual representa una manera
rápida de reponer el nitrógeno perdido, sin embargo, bajo un manejo inadecuado
representa un riesgo ecológico por contaminación del suelo y del agua. Existe
discrepancia entre la cantidad de fertilizante nitrogenado aplicado y la que es
realmente utilizada por la planta (“bajo coeficiente de utilización”). Se ha determinado
que el nitrógeno aplicado a un cultivo está expuesto a pérdidas hasta del 67 %,
quedando un exceso de compuestos nitrogenados en el ecosistema lo que representa
la mayor fuente de contaminación por nitrógeno, tanto en la atmosfera (óxidos de N),
como en las aguas superficiales y profundas (nitratos).
La utilización de biofertilizantes constituidos por microorganismos que fijan el
nitrógeno, solubilizan nutrientes, producen hormonas y estimulan la protección frente
al ataque de plagas y patógenos, representa una alternativa para disminuir el uso de
fertilizantes químicos. Estos microorganismos denominados promotores del
crecimiento vegetal (PGPR) incluyen a bacterias del género Azospirillum spp. , de vida
libre, presentes en suelos a nivel mundial y capaz de fijar nitrógeno molecular del
medio ambiente, producir fitohormonas e incrementar la productividad agrícola.
A pesar de que existen productos comerciales de Azospirillum, su aplicación no
siempre es efectiva, por lo cual se prefiere el uso de microorganismos nativos,
adaptados a las condiciones climáticas y que puedan competir exitosamente con la
biota nativa.
1.1. Identificación del Problema
Uso irracional de fertilizantes químicos en gramíneas.
1.2. Delimitación del Problema
Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto en el
desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz”.
2. PROBLEMA CIENTÍFICO
¿Cuál son las características de las cepas nativas de Azospirillum spp. y cuál es
su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz” ?
3. HIPOTESIS
Cepas nativas de Azospirillum spp. fijan nitrógeno asimbióticamente, producen
ácido indolacético e incrementan el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L.
“arroz”.
4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA
Una de las principales actividades económicas en la región
Lambayeque es la agricultura, contando con 70,000 hectáreas de cultivo como el arroz
(MINAG, 2008). Para lograr rendimientos notables se requiere el uso de fertilizantes
químicos que suplementen su crecimiento pero a la vez su uso desmedido y
prolongado ocasiona graves consecuencias como infertilidad de suelos y por ende una
disminución en el potencial agrícola. Ante la problemática y buscando alternativas se
ha prestado especial atención al estudio de los microorganismos promotores del
crecimiento vegetal y a sus beneficios para la agricultura.
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal como Azospirillum spp tienen
la capacidad de fijar elementos nutritivos para la planta como nitrógeno y producir
metabolitos fitohormonales de interés agrícola, entre los que destaca el ácido indol
acético (AIA), que desempeña un papel fundamental en el crecimiento de los cultivos,
manteniendo la calidad de los suelos agrícolas por más tiempo, promoviendo de esta
manera el crecimiento de las plantas, y evitando la infección del tejido vegetal por
patógenos.
Una vez que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal han sido
aisladas, deben ser caracterizadas en laboratorio e investigadas en su efectividad
sobre el desarrollo vegetativo en invernadero como requisito indispensable para su
inoculación y comercialización principal en campos, como biofertilizantes.
5. OBJETIVOS
5.1. Aislar cepas nativas de Azospirillum spp. de la rizósfera de Oryza sativa L.
“arroz” en campos agrícolas comerciales de Lambayeque.
5.2. Identificar fenotípica y bioquímicamente cepas nativas de Azospirillum spp.
5.3. Cuantificar el nitrógeno fijado por cepas nativas de Azospirillum spp.
5.4. Cuantificar el acido Indolacético producido por cepas nativas de
Azospirillum spp.
5.5. Determinar en condiciones de invernadero el efecto de la inoculación de
cepas nativas seleccionadas de Azospirillum spp. fijadoras de nitrógeno y
productoras de ácido indol acético en el desarrollo vegetativo Oryza sativa L.
“arroz”.
6. ANTECEDENTES
6.1. El Nitrógeno como nutriente
Todos los seres vivos necesitan nitrógeno (N2) para formar aminoácidos,
proteínas y ácidos nucleicos, pero el nitrógeno en la atmósfera no está presente de
forma que se pueda utilizar (Gardnier, 2005). El crecimiento del cultivo de arroz
depende de factores como el clima, agua y nutrientes accesibles a la planta (Murillo y
González, 1982). El nitrógeno es el nutriente más importante, y casi todos los suelos
son deficientes en este elemento (Cordero, 1993). Este elemento es absorbido en
forma de amonio (NH4+) o nitratos (NO3-) por las raíces vegetales, y es utilizado en el
interior de los tejidos para la síntesis de aminoácidos, que son translocados a las hojas
en donde se sintetizan las proteínas (Murillo y González, 1982).
La forma más conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrógeno
de los cultivos de arroz es la fertilización química, la cual representa una manera
rápida de reponer el nitrógeno perdido. Sin embargo, bajo un manejo inadecuado
representa un riesgo ecológico por contaminación del suelo y del agua (Vergara y
Rangel, 1990). La dosis recomendada de nitrógeno varía según la variedad y el
sistema de cultivo empleado, pero en promedio es de 120 kg N/Ha. Se sugiere aplicar
el 40-50 % de la dosis en la fase de macollamiento, y el resto (50-60 %) en la época
de diferenciación del primordio floral. Para la fertilización del arroz de secano se puede
utilizar urea, sulfato de amonio o nitrato de amonio (Cordero, 1993).
Se conoce que el nitrógeno aplicado a un cultivo está expuesto a pérdidas
hasta del 67 %, por lo que para mejorar la eficiencia de la fertilización ésta se fracciona
entre dos y cuatro aplicaciones, durante el macollamiento, o sea cuando las plántulas
presentan cuatro hojas completamente desplegadas, y durante la formación de la
panícula, para favorecer la fase reproductiva (etapa de diferenciación del primordio
floral). No se recomienda fertilizar a la siembra, pues durante la fase de plántula la
absorción de nitrógeno es casi nula (Conitta, 1991).
Los síntomas de carencia de nitrógeno en los vegetales son: amarillamiento de
las hojas más viejas, empezando por el ápice y avanzando hasta la base , crecimiento
lento, tallos delgados, raíces con escaso desarrollo, floración restringida con notable
reflejo en la fructificación siendo los frutos pequeños y la maduración acelerada. Los
vegetales ahíjan poco y deficientemente así como son más susceptibles al ataque de
plagas, enfermedades y heladas (Horticasa, 2008).
6.2. Acido Indol acético como promotor del crecimiento vegetal.
El nombre de auxina es dado a un grupo de compuestos que estimulan la
elongación vegetal. El ácido indol acético (AIA) es la forma predominante, sin
embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indólicas naturales en
las plantas. Aunque las auxinas están en toda la planta, las mayores concentraciones
se localizan en las regiones meristemáticas en crecimiento activo. Se les encuentra
tanto como moléculas libres o en formas conjugadas inactivas. La concentración de
auxina libre en planta varía de 1 a 100 mg/Kg peso fresco. Las auxinas han sido
implicadas en la regulación de procesos fisiológicos como promoción del crecimiento y
diferenciación celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta,
estimulación del crecimiento y maduración de frutos, floración, senectud, geotropismo,
fototropismo, retardo de caída de hojas, flores y frutos jóvenes y la dominancia apical
(Gonzales et al., 1999).
La dominancia apical está relacionada con el transporte de auxina por medio
de un mecanismo dependiente de energía alejándose en forma basipétala desde el
punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de
brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia
apical (Arteca, 1996). Las auxinas son producidas en las pantas a partir del
catabolismo de triptófano lo cual se observó en ensayos en donde al colocar triptófano
éste era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentración en el mismo
(Salisbury et al., 1994; Taiz y Zeiger, 2006).
6.3. Azospirillum como promotor del crecimiento en gramíneas
El género Azospirillum fue descubierto por Beijerinck, quien lo nombró como
Spirillum lipoferum en 1925 (Döbereiner, 1980), y fue caracterizado por Döbereiner y
Day en la década de 1970 (Okon et al., 1976, citados por Vergara y Rangel, 1990). En
1978 fue reclasificado por Tarrand, Krieg y Döbereiner, quienes basados en estudios
de homología del ADN describieron el nuevo género Azospirillum, con dos especies:
A. lipoferum y A. brasilense.
El género Azospirillum, comprende bacterias del suelo de vida libre,
rizobacterias consideradas promotoras de crecimiento vegetal por su capacidad de
fijación de nitrógeno atmosférico y producción de fitohormonas, sideróforos y
mejoramiento del sistema de absorción radical y relación agua/planta (Tarrant, 1978;
Dobereiner, 1991; Okon y Labandera, 1994; Baldani, 1999; Cassán, et al., 2003)
Azospirillum es una α-proteobacteria, Gram negativa que utiliza como fuente
nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, nitrito, aminoácidos y nitrógeno
molecular. En condiciones desfavorables como desecación y carencia de nutrientes,
pueden enquistar, recubriéndose de una capa de polisacáridos, produciendo una
acumulación de gránulos de β-hidroxibutirato, que sirven a la bacteria de reserva de
fuente carbonada. Presenta quimiotaxis positiva hacia ácidos orgánicos, azucares,
aminoácidos, compuestos aromáticos y hacia exudados radicales. Esta capacidad de
migración es altamente dependiente de la actividad del suelo. Este género tiende a
dirigirse hacia lugares donde la concentración de oxigeno es la adecuada (aerotaxia).
Su comportamiento le permite a la bacteria dirigirse hacia un nicho ecológico
apropiado en la rizósfera donde realiza la fijación biológica de nitrógeno y sustancias
estimuladoras del crecimiento. (Collados, 2006).
Glick et al., (1999) sostienen que en la microbiota del suelo conviven distintos
géneros bacterianos. Estos se encuentran preferentemente interactuando con las
raíces de las plantas y su acción puede ser benéfica, perjudicial o neutral desde el
punto de vista del desarrollo y crecimiento vegetal. Aquellas bacterias rizosféricas
como Azospirillum spp. capaces de impactar positivamente sobre el crecimiento de
cualquier especie vegetal, son comúnmente conocidas como Bacterias Promotoras del
Crecimiento Vegetal PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria).
Las bacterias del género Azospirillum han sido, a la fecha, las más estudiadas
entre las PGPR. Según una revisión de Okon y Labandera González (1994) que reúne
información de 20 años de experimentación a campo, el porcentaje de éxito debido a
la inoculación con Azospirillum es de 60 a 70%. Estos ensayos fueron realizados en
diferentes suelos y regiones climáticas, y con distintos cultivos de importancia
agronómica, logrando incrementos en rendimiento del orden del 5 a 30%. Asimismo
Motsara et al. (1995) determinaron que en cultivos como arroz, maíz, trigo y caña de
azúcar, Azospirillum puede incrementar el rendimiento entre 15 y 30 %.
Azospirillum produce sustancias promotoras del crecimiento, como ácido indol
acético, citocininas, giberelinas (Monzón de Asconegui, 2003; Cacciari et al, 1989),
sustancias que estimulan la densidad y largo de los pelos radicales, la aparición de
raíces laterales y el volumen radical; permitiendo que el potencial de absorción de
nutrientes y agua se eleve, beneficio que en el caso de los cultivos de zonas áridas y
semiáridas constituye una ventaja aún mayor (Di Barbaro et al. 2005).
Se ha demostrado que las plantas inoculadas con Azospirillum spp. absorben
más rápido minerales de la solución y, consecuentemente, acumulan más materia
seca, N, P y K en tallos y hojas (Puente y Peticari, 2006). Las fitohormonas podrían
ser las responsables del mejor crecimiento de la raíz y de la parte aérea de las plantas
debido a que los efectos de la inoculación son similares a los que se observan cuando
las plantas son tratadas con estas sustancias.( Tien et al., 1979)
7. MATERIAL Y MÉTODOS
7.1. Material
7.1.1 Material biológico
- Muestras de rizósfera de Oryza sativa L. “arroz” obtenidas de campos
agrícolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, región de
Lambayeque.
- Semillas de arroz Oryza sativa L. “arroz”
7.1.2 Material de laboratorio
- Placas de Petri
- Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos
- Tubos de vidrio (13 x 100 mm y 15 x 150 mm)
- Pipetas de 1 mL y 10 mL.
- Asas bacteriológicas
- Agitador de vidrio
- Bolsas de algodón de 500 g
7.1.2. Medios de Cultivo (Anexo 1)
- Agar Nutritivo
- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb) semisólido
- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb) sólido
- Medio Rojo de Congo Acido málico
-Caldo extracto de suelo 10%
-Caldo tripticasa de soya suplementada con triptofano
7.1.3. Reactivos y Colorantes
- Colorantes para tinción de Gram.
- Peróxido de hidrógeno.
- Tiras reactivas para oxidasa.
- Azul de bromotimol.
- Reactivo de Salkowski
- Solución Oxidante para determinación de Amonio
- Solución salina fisiológica estéril
- Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%
- Solución acuosa de Rojo de Congo (1:400)
7.1.4. Otros
- Semillas de Oryza sativa L. “arroz”
- Extracto de levadura.
- Fertilizante nitrogenado: Urea (46% N)
- Macetas.
- Biorreactor tanque tipo Batch con flujo de aire descendente.
- Tamizador.
- Espátulas.
- Bolsas plásticas.
7.2. Métodos
7.2.1 Población y muestra de estudio
La población estará constituida por bacterias del genero Azospirillum presentes
en la rizósfera de Oryza sativa L. “arroz”, de campos agrícolas del distrito de Pomalca,
provincia de Chiclayo en la región de Lambayeque y la muestra estará constituida por
96 cepas de Azospirillum spp.; número que fue calculado según la fórmula
mencionada por Alvitres (Alvitres, 2000)
Z2 (p.q) T2n =
3,84 (0,20 x 0,80)
0,0064
T2
n =
n = 96
Donde:
n = tamaño de muestra
Z = 1,96 (α = 0,05), valor estándar
p = 0,20, presencia de Azospirillum spp. en la rizósfera de arroz.
q = ausencia, 1 – p: 0,80
T = error permitido: 8%
7.2.2. Primera Fase: Aislamiento, identificación y selección de cepas nativas de
Azospirillum spp. fijadoras de nitrógeno.
a. Zona de muestreo
Para aislar cepas nativas de Azospirillum sp. fijadoras de nitrógeno se
tomarán muestras de raíces de cultivos de arroz, establecidos en campos
agrícolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, región de Lambayeque.
El distrito de Pomalca está comprendido entre los paralelos 6º 45’ y
6º 46’ de latitud sur y los meridianos 79º 46’ y 79º 48’ de longitud oeste. La zona
presenta un clima subtropical árido, con un rango de temperatura media de 35,7ºC
hasta máxima absoluta de 32,5 ºC.
b. Obtención de muestras de rizósfera
Cada muestra consistirá en extraer todas las raíces de plantas de arroz,
cultivadas en campos comerciales del distrito de Pomalca, región de Lambayeque
y que se encuentren al final del ciclo vegetativo poco antes de la cosecha. Cada
una de las muestras será depositada en bolsas plásticas debidamente etiquetadas
e inmediatamente serán transportadas para su procesamiento en el laboratorio de
Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque.
c. Aislamiento de cultivos puros de bacterias fijadoras de nitrógeno.
(Dobereiner, 1980)
Se tomarán las raíces de las plantas de arroz y se lavarán
generosamente con agua potable hasta eliminar el suelo remanente. A
continuación se cortarán secciones de raíces de aproximadamente 5 cm de
longitud (desde el extremo final hacia arriba), se depositarán en un vaso de
precipitación y desinfectarán superficialmente con hipoclorito de sodio (NaClO) al
2 % durante 5 minutos y luego se enjuagarán dos veces consecutivas con agua
destilada estéril. Después se depositarán las raíces en una mayólica desinfestada
con alcohol, y se cortarán en fragmentos de un tamaño aproximado de 2 cm de
longitud y luego se enjuagarán con agua destilada estéril.
Se realizará el enriquecimiento de cada una de las muestras para favorecer el
crecimiento de microorganismos fijadores de nitrógeno para lo cual las raíces se
depositarán (con pinza o con asa bacteriológica en anillo) de 10 a 15 mm por
debajo de la superficie en tubos con 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de
bromotimol (NFb) semisólido, a razón de un fragmento por tubo. La incubación se
realizará en aerobiosis a 28º C por 1 semana y se seleccionaran los tubos donde
se observe el viraje del color del medio de verde a azul y la presencia de una
película gruesa blanquecina ubicada entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se tomará
una alícuota de la película y se preparará una suspensión en 1 mL de solución
salina fisiológica estéril, y luego se sembrará por agotamiento y estría en placas
con medio NFb sólido complementado con 20 mg/L de extracto de levadura y se
incubarán a 28º C durante 5 días, transcurrido los cuales en caso positivo se
observarán colonias blanquecinas y pequeñas con viraje del medio del verde al
color azul.
A continuación, se realizará tinción de Gram y en caso de que se
observen bacilos pequeños Gram negativos, se seleccionará la colonia y se
sembrará (puntura) en medio NFb semisólido en aerobiosis a 28º C por 1 semana
hasta que se observe el viraje del color del medio de verde al azul y la presencia
de una película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. En caso
positivo se tomará una alícuota y se sembrará por agotamiento y estría en placas
de Petri que contengan medio Rojo Congo ácido málico por 48 a 72 h a 28°C.
Luego se seleccionaran las colonias rojo escarlata, y se realizara tinción de Gram
para confirmar la morfología y reacción, y se sembrarán en placas de Petri con
agar nutritivo y posteriormente en viales con la finalidad de obtener cultivos puros
para su posterior caracterización.
d. Identificación a nivel de género de Azospirillum spp.
La identificación a nivel de género de las bacterias nativas fijadoras de
nitrógeno se realizará en función de las características morfológicas y fisiológicas
según el Manual de Bergey de Bacteriología Determinativa (Holt et al., 1994)
e. Detección y cuantificación de ácido Indolacético, AIA “in Vitro”
Se obtendrá una suspensión celular en solución salina fisiológica 0.85%
estéril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas
previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustará su concentración en
1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cámara de Neubauer. A continuación se
inoculará 1mL de cada suspensión bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de 15
x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptófano
(0,01 g L -1), a 30 °C durante 72 horas. Luego se centrifugará a 1000 rpm durante
15 minutos.
Se transferirán 0,4 mL del sobrenadante hacia tubos de 13 x 75 mm y se
agregarán 1,6 mL de reactivo Salkowski modificado (relación 4:1). Se mezclarán y
dejarán en reposo en oscuridad durante 30 minutos, posteriormente se observará
una coloración violácea y se medirá la absorvancia en el espectrofotómetro a 530
nm. Las concentraciones se calcularán ajustando la curva de calibración.
f. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno, FNB “in vitro.”
Se obtendrá una suspensión celular en solución salina fisiológica 0.85%
estéril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas
previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustará su concentración en
1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cámara de Neubauer. A continuación se
inoculará 1mL de cada suspensión bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de
15 x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo al 10% a 30ºC durante
72 horas en agitación constante (150 rpm). Luego se transferirán 5 mL del caldo
cultivado a frascos de penicilina de 50 mL y se agregarán 15 mL de KCl 2M, y se
dejarán en agitación constante (150 rpm) durante 1 hora y luego se dejarán en
reposo durante 1 hora adicional.
Posteriormente se tomarán 10 mL del sobrenadante y se centrifugarán
(2000 rpm) durante 20 minutos. Luego se verterá el sobrenadante hacia tubos de
dilución (la biomasa quedará en el fondo del tubo de centrífuga), se añadirán
0,4 mL de solución alcohólica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al
0,5 % y 1 mL de solución oxidante, y se agitarán para mezclar. Se dejarán en
reposo durante 1 hora. Finalmente se leerán las absorvancias en
espectrofotómeto a 632,9 nm y se calcularán las concentraciones en una recta
patrón construidas a partir de diluciones sucesivas de un patrón de 100 ppm de
cloruro de amonio.
7.2.3 Segunda Fase: Efecto de cepas nativas de Azospirillum spp. fijadoras de
nitrógeno y productoras de ácido indolacético en el desarrollo vegetativo de
Oryza sativa L. “arroz” en condiciones de invernadero.
Para determinar el efecto de la inoculación de Azospirillum spp. en el
desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz”, se obtendrá una suspensión
bacteriana en solución salina fisiológica de cada una de las cuatro cepas nativas
de Azospirillum spp. seleccionadas, y se hará dos inoculaciones una al momento
de la siembra y la segunda 35 días después de la siembra.
a. Siembra de semillas de Oryza sativa L. “arroz”
var. INIA 508-Tinajones.
Se utilizará un suelo de textura franco – arcillosa procedente de un
campo comercial de arroz, ubicado en el distrito de Pomalca, provincia de
Chiclayo, región Lambayeque.
Después de la caracterización físico – química, el suelo se
esterilizara en autoclave a 121°C, 15 libras de presión durante 3 horas y se
repartirá en macetas de 2,5 Kg de capacidad a razón de 2 Kg por maceta. A
continuación se realizará un riego hasta la saturación del suelo y se sembrarán
semillas de arroz var. INIA 508-Tinajones (diez por maceta), aproximadamente a
0.5 cm de profundidad. A los 35 días después de la siembra, las plántulas serán
raleadas eliminando las más pequeñas y dejando las cuatro más vigorosas por
maceta.
b. Fertilización nitrogenada
La dosis utilizada para la fertilización química será de 120 kg N/Ha
(100%), que en el experimento equivaldrá a 0,817 g de urea por maceta y se
aplicará en forma de disolución acuosa. La fertilización se fraccionará en dos
partes, la mitad a la siembra y la otra mitad 35 días después.
c. Inoculación de las cepas de Azospirillum spp.
Cada una de las cuatro cepas nativas de Azospirillum spp. que presenten
los valores mayores en la producción de ácido indol acético y en la fijación de
nitrógeno será cultivada en agar nutritivo (placas de Petri) a 30 °C por 48 horas.
La biomasa desarrollada se cosechará con solución salina fisiológica estéril y se
estandarizará su concentración entre 600 y 900 millones de células/mL.
Se realizaran dos inoculaciones, la primera a la siembra, añadiendo 20
mL de la suspensión de bacterias a cada una de las macetas y la segunda
inoculación se realizará 35 días después de la siembra, aplicando 10 mL de la
suspensión en la base de cada una de las plantas.
d. Determinación del peso de la biomasa seca aérea y radicular.
Transcurridos 70 días después de la siembra, las plantas serán extraídas
cuidadosamente y se separará el sistema aéreo del sistema radicular. Las raíces
se lavaran para eliminar el suelo adherido y para determinar el peso de la biomasa
seca, raíces y follaje serán introducidas en bolsas de papel y secadas a 80 °C por
48 horas en el caso del follaje, y a 100 °C por 24 horas en el caso de las raíces.
Transcurrido el tiempo de secado las muestras se pesaran en una balanza
analítica y se calculará el promedio g/planta en cada maceta.
7.2.4. Análisis estadístico de los datos
Los datos obtenidos se someterán a un Análisis de Varianza (ANAVA),
para determinar las diferencias estadísticas entre tratamientos y se empleará la
prueba discriminatoria de Tukey (α = 0.05) para determinar su nivel de significancia
entre ellos (Padrón, 1996).
7.2.5. Tipo de estudio y Diseño de contrastación de hipótesis
El trabajo de investigación será realizado en dos fases: en la primera fase
descriptiva se ejecutará el aislamiento, identificación a nivel de género, detección
y cuantificación de ácido indolacético y de la fijación biológica de nitrógeno “in
vitro”.
En la segunda fase correspondiente a una investigación experimental se
determinará el efecto de la inoculación de cepas nativas fijadoras de nitrógeno y
productoras de ácido indolacético en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L.
“arroz” en condiciones de invernadero. Se utilizará un diseño clásico experimental
completamente aleatorio (DCA), con 15 tratamientos y tres repeticiones,
totalizando 45 unidades experimentales.
Los tratamientos corresponderán a: 4 cepas de Azospirillum spp. nativas
fijadoras de nitrógeno (cepa 1, cepa 2, cepa 3, y cepa 4), dos testigos químicos
(fertilizante nitrogenado con 50% de urea y 100% urea ), 9 tratamientos que
combinan cada cepa con fertilizante nitrogenado al 50% y al 100% ( cepa 1 más
50% de urea , cepa 1 más 100% de urea, cepa 2 más 50% de urea, cepa 2 más
100% de urea, cepa 3 más 50% de urea, cepa 3 más 100% de urea, cepa 4 más
50% de urea y cepa 4 más 100% de urea) y un testigo absoluto (sin inóculo y sin
fertilizante).
8. Referencias bibliográficas
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ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO
Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, NFb (Motsara et al., 1995.)
COMPOSICIÓN g/L
Ácido málico 5
KOH 4
K2HPO4 0,5
FeSO4·7H2O trazas
MnSO4·7H2O 0,01
MgSO4·7H2O 0,01
NaCl 0,02
CaCl2 0,01
Na2MoO4 0,002
Azul de bromotimol (0,5 % m/v en etanol) 2 ml
Biotina 0,1 mg
Agua destilada 1000 ml
Ajustar el pH a 6,8 - 7,0 (color verde) con NaOH. Para medio semisólido añadir 2 g
de agar. Para medio sólido añadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.
Medio rojo de Congo ácido málico
COMPOSICIÓN g/L
Ácido málico 5,0
K2HPO4 0,5
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0,1
Extracto de levadura 0,5
FeCl3.6H2O 0,015
KOH 4,8
Solución acuosa de Rojo de Congo (1:400) 15 mL
Agua destilada 1 000 mL
Colocar la solución acuosa de Rojo de Congo al final, y ajustar el pH a 7,2. Para medio
solido añadir 20g de Agar.
Agar nutritivo (AN)
COMPOSICIÓN g/L
Peptona 5 Extracto de carne 3
Agar 15
Agua destilada 1000 ml
Ajustar el pH a 7,0
Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano
COMPOSICIÓN g/L
Peptona de caseína 17.0g
Peptona de harina de soya 3.0g
D(+)Glucosa (o dextrosa) 2.5g
Cloruro de sodio 5.0g
Fosfato dipotásico 2.5g
Triptófano 0.01g
Agua destilada 1000 ml
Disolver por calentamiento y agitación, ajustar a pH 7,3.
Caldo extracto de suelo
COMPOSICIÓN g/L
K2HPO4 0,4
MgCl2 0,1
MgSO4.7H2O 0,05
FeCl3 0,01
CaCl2 0,1
Triptona 1,0
Extracto de levadura 1,0
Extracto de suelo al 10% 250 mL
Agua destilada 750 mL
Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz
250 g de suelo agrícola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500
mL con agua destilada y filtrar. Tomar sobrenadante 25 mL del filtrado y completar a
250 mL con agua destilada
ANEXO 2
Reactivo de Salkowski
COMPOSICIÓN g/L
H2SO4 Concentrado 150 mL
Agua destilada 250 mL
FeCl3 0.5 M en H2O destilada 7.5 mL
4 mL de reactivo + 1 mL de muestra
Solución oxidante para determinación de Amonio
COMPOSICIÓN g/L
Citrato de sodio 20g
Hidróxido de sodio 1g
Hipoclorito de sodioal 5% 2mL (Lejía comercial)
Agua destilada 100mL
_____________________________Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán
Firma asesora
_____________________________Franklin Ignacio García Pastor
Firma autor (s)
_____________________________Harold Ángel Muñoz Cieza
Firma autor (s)
_____________________________Fecha de Presentación