Universidad de Talca
Facultad de Cs. de la salud
Dpto. Bioqumica Clnica e Inmunohematologa
Espectrofotometra y Control Instrumental
Prof. TM. Mg Cs. Roxana Orrego C.
Marzo- 2014
Espectrofotometra
Trmino que se refiere al uso de la radiacin
electromagntica (REM) para
medir las concentraciones una sustancia.
Historia
Antes de 1940 la mayora de las determinaciones en qumica
clnica era de tipo volumtricas, gravimtricas y por comparacin
de colores. resultados semicuantitativos.
En la dcada del 50 se comienza a utilizar el espectrofotmetro en
USA,
Resultados: cuantitativos, confiables, reproducibles.
Mejora la precisin y la exactitud.
El espectrofotmetro es un instrumento muy til, por su
sencillez, rapidez, especificidad * y sensibilidad*.
* Dado en su mayor parte por la metodologa
estandarizada
1940
ANTECEDENTES
Todo tomo y molcula es capaz de absorber energa (bajo
ciertas limitaciones).
La energa puede proporcionarse en forma de REM luz
El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molcula esta
relacionada con su estructura.
As mismo la cantidad de REM absorbida est relacionada con el
nmero de molculas que interaccionan con ella.
Antecedentes tericos La REM se desplaza describiendo una onda, mientras ms pequea es
la longitud de onda () mayor energa que posee y viceversa.
La longitud de onda ( ) es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y
se mide comnmente en nm.(nanmetros)
La frecuencia ( ) es el nmero de ondas que pasan por un punto en una unidad de tiempo s-1= Hertz (Hz).
Antecedentes tericos
La espectrofotometra en qumica clnica slo trabaja con la REM
ultravioleta cercana y la visible.
Long de onda (nm) Color de la luz
absorbida
Color
complementario
trasmitido
380-420 Violeta Amarillo verdoso
420-440 Azul-violeta Amarillo
440-470 Azul Anaranjado
470-500 Verde azulado Rojo
500-520 Verde Prpura
520-550 Amarillo verdoso Violeta
550-580 Amarillo Azul-violeta
580-620 Anaranjado Azul
680-780 Prpura Verde
1. Fuente estable de E radiante (Lmpara)
2. Hendidura de entrada para enfoque de la luz
3. Selector de longitud de onda (sistema monocromador o filtros )
4. Hendidura de salida para enfoque de la luz
5. Dispositivo para mantener el recipiente que contendr la solucin
(porta cubeta)
6. Detector de energa radiante (fototubos)
7. Dispositivo para leer seal elctrica
0.05
Instrumentacin Espectrofotmetro de haz simple
1 +2
1
Lmparas:
Tungsteno fuente de radiacin de los 380 - 780 nm. Las ms empleadas en qumica clnica son las de yoduro de
tungsteno que tiene una vida til aprox. 3000 h.
Deuterio e hidrgeno en el intervalo de 220 - 360 nm. (UV)
Mercurio proporcionan slo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 y 546 nm (slo tiles para calibracin)
Distribucin espectral de lmparas
Selector
de
longitud
de onda
Filtro
Monocromador
Absorcin
Interferencia
De corte
De banda
Prismas
Redes De transmisin
De reflexin
Selectores de longitud de onda
Filtros : Dispositivos sencillos, formados por un solo material y
trasmite energa en la deseada , absorbiendo el resto de
las .
Filtros con absorcin-transmisin selectiva (filtros de vidrio y Wratten)
Filtros de interferencia
Monocromadores: producen un haz de radiacin de gran
pureza espectral y permiten variar de forma continua y en un
gran intervalo la . La E radiante es dispersada por un prisma
o una red de difraccin, estos
dan rangos ms estrechos de .
Filtro de interferencia
Prismas: generan dispersin de la REM
basado en el fenmeno de refraccin de la
luz. El grado de desviacin depende de la . Para la regin visible se usa prisma de vidrio
Para la regin UV se usa prisma de cuarzo
Rejillas o redes de difraccin o reflexin:
Superficie lisa, en la cual se graban gran n de
surcos.
Regiones UV-visible poseen
(300-2000 surcos x mm).
Los surcos estn muy prximos entre s, cuando
la luz es reflejada por la rejilla, cada estra se
comporta como una fuente de radiacin.
*Dispersin de la luz en es lineal.
* Dispersin Luz es no lineal
Ancho de banda espectral (ABE) La luz que sale del sistema monocromador no es una sola , sino que comprende un intervalo de . Ancho de Banda: intervalo de que pasan a travs de hendidura de salida del sistema monocromador, medida en la del flujo saliente
detectado.
Celdas o porta muestras Existen de todos tamaos y formas.
Tienen un espesor (o trayectoria ptica) de 1,00 cm.
* Normalizacin de Abs= Abs leda x 1/camino ptico en cm.
Detectores : convierten energa radiante en seal
elctrica
(clulas fotovoltaicas, fototubos, fotodiodo, tubo
fotomultiplicadores, termopares y bolometros)
El detector ideal debe:
Poseer elevada sensibilidad en la regin espectral
de estudio
Dar respuesta lineal para la energa radiante
Tener un tiempo de respuesta pequeo
Ser utilizable en amplio intervalo de
Dar una mnima seal de salida ante ausencia de
radiacin.
Fotomultiplicador: seal ms intensa
Los electrones emitidos por una superficie fotosensible
inciden en una segunda superficie, llamada dnodo,
la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible
Fundamento de mediciones espectrofotomtricas.
Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (P P 0) donde P0 es la energa que sale del monocromador.
La ley que explica la relacin entre la absorcin y la concentracin de una sustancia es conocida comnmente como
ley de Beer o Lambert-Beer.
Si T es la transmitancia, es decir la radiacin que pasa al travs del cuerpo entonces T=P/P0 , por lo que T solo puede tener valores
que van desde 0 a 1.
T= P ; %T = P x 100
P0 P0
P0 P
C
b
Cuando no se absorbe luz P= P0 A = 0.
Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se transmite, es decir, P=1/P0 A = 1.
Al absorberse el 99% de la luz, se transite el 1% A = 2.
T
C
T
C
T= 10 k*C T= 10 k*b
A = b c Ley de Lambert-Beer
Reales = verdadero n (n2 +2)2
Instrumentales
Qumicas
Personales
Radiacin no monocromtica
Radiacin errtica o parsita
Errores de lectura
Influencia del equilibrio
Influencia del disolvente
Influencia de la temperatura
Impurezas de los reactivos
Interaccin entre especies absorbentes
(Interferencias espectrales)
Dimerizaciones
Rxs. AcidoBase Complejos
Clasificacin de las desviaciones de la ley de Lambert-Beer
Variabilidad Metrolgica La variabilidad metrolgica debida a variaciones sistemticas
del procedimiento de medida se cuantifica mediante el error sistemtico Error sistemtico: Se estima calculando la diferencia entre la
medida de un gran n de mediciones repetidas y el valor
verdadero. En todo sistema de medidas se producen
alteraciones que llevan a errores sistemticos que pueden ser de
tipo constante, proporcional o mixto.
1. Error constante: ser aquel valor que se mantiene en
la misma magnitud numrica en todas las mediciones.
2. Error proporcional: es aquel valor que har cambiar el
valor verdadero incrementando o disminuyendo la
magnitud de la medida.
3. Error mixto: afectan al valor verdadero tanto en forma
constante como proporcional simultneamente.
R = 1
R = 0,9996
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 100 200
absorbancia
ideal
absorbancia
medida
R = 1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 50 100 150 200
absorbancia
ideal
absorbancia
medida
R = 1
R = 1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 50 100 150 200
absorbancia
ideal
absorbancia
medida
La calibracin de los espectrofotmetros
comprende:
1. Calibracin de la escala fotomtrica
2. Calibracin de la escala de la longitud de onda
Calibracin de escala fotomtrica: se certifica la transmitancia y
absorbancia entregadas por el equipo
Se usan filtros con diferentes niveles de transmitancia
(alcance de : 340 -900 nm)
Calibracin de longitud de onda
Mtodos para la calibracin de la longitud de onda en el
visible y UV:
Mtodo n1 (ms adecuado) Uso de lmparas de con fuertes lneas
de emisin de bien definidas.
Las lmparas de mercurio producen fuertes lneas de emisin a 313, 365, 405, 436 y 546 nm.
Lmpara de hidrgeno (o deuterio) con lneas de emisin entre 486 y 656 nm.
Mtodo n 2 Uso de filtros de compuestos de tierras
raras (xido de holmio y didimio)
El espectro de absorcin del xido de holmio posee fuertes lneas de absorcin a 241, 279,
287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm. (rango 240-650)
El didimio tiene bandas de absorcin mucho ms anchas 573, 586, 685, 741 y 803. (rango 380-900nm)
Control de calidad de los espectrofotmetros
Es necesario realizar peridicamente pruebas
para verificar el instrumento.
Estas pruebas implicar evaluar :
1. Exactitud de longitud de onda
2. Linealidad de la respuesta del detector
3. Radiacin errtica(luz errtica o luz parsita)
4. Exactitud y precisin fotomtrica.
5. Estabilidad fotomtrica
Mtodo para evaluar y controlar la calibracin
Se debe evaluar la concordancia entre la longitud de
onda que indica el seleccionador y la longitud de
onda de referencia y sta se expresa en nm.
Mtodo del Punto Isosbstico.** Cuando una sustancia presenta diferentes espectros en forma
cida y bsica, stas pueden presentar un mismo punto donde
se cruzan, este punto grfico es conocido como PI. Estos son fijos
por lo que permiten verificar la exactitud de la longitud de onda.
**La limitacin de este procedimiento es que se debe hacer el
barrido espectrofotomtrico para cada una de las formas de
dicha sustancia.
Soluciones ms usadas Solucin cida-alcalina de cromato de potasio.(405-500 nm) Solucin cida- alcalina de rojo congo (520-570 nm)
Desventajas del uso de soluciones reactivas como estndar secundario:
picks de absorcin generalmente anchos cambios espectrales por contaminacin y/o envejecimiento errores en la preparacin del reactivos
Grfico punto isosbstico Rojo Congo
El mtodo consta de 3 pasos:
1. Preparacin de formas alcalinas y cidas del
colorante
2. Realizacin del barrido espectrofotomtrico
3. Interpretacin de resultados: grfico del espectro
para encontrar el PI.
Si el punto isosbstico experimental difiere del terico ,
estamos frente a un corrimiento de la longitud de onda.
Clculo de corrimiento(nm): PI experimental PI terico
Limites de aceptabilidad:
Intervalo ptimo : 2 nm
Intervalo aceptable: 3 nm
Linealidad fotomtrica Un espectrofotmetro que trabaje adecuadamente debe mostrar una
relacin lineal entre la cantidad de energa radiante absorbida y la
lectura del indicador.
Soluciones ms usadas:
La oxihemoglobina a 415 nm. p-nitrofenol a 405 nm. Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm. Sulfato de cobre 650 nm Colorante verde vegetal a 257, 410 y 630 nm
*Grficas no lineales
pueden indicar:
Error en diluciones
Error instrumental
Lmites de aceptabilidad:
r Ideal: 1
r ptimo: 0,9995-1
r Aceptable: 0,995-0,9994
Pendiente ideal: 1
Pendiente ptima: 0.98 - 1,02
Pendiente aceptable: 0.97 1.03
Evaluacin
Coeficiente de correlacin(r) y pendiente
Luz errtica:
Luz que llega al detector sin pasar por la muestra Se genera en los extremos de los intervalos espectrales. Produce
desviacin negativa de la ley de L-B.
Mtodos para evaluarla:
Uso de filtros o soluciones que posean alta transmisin sobre
una porcin del espectro, pero opacos por debajo de la lmite.
Soluciones ms usadas:
Li2CO3 < 250 nm
NaBr 0,1 M < 240 nm
Acetona < 320 nm
Limites de aceptabilidad
L.E ptima:
Exactitud fotomtrica Definicin: Grado de concordancia entre el valor de absorbancia
real y el obtenido.
As el error al leer una absorbancia respecto a una referencia se
denomina inexactitud fotomtrica.
Mtodo: medicin de absorbancia de soluciones, las que se
comparan con los valores de referencia.
Soluciones ms usadas:
340 nm: dicromato de potasio en cido perclrico 0,001 N H2SO4 0,01 N.
405 nm: p-nitrofenol en NaOH 0,1 N; soluciones de sales de nquel Ni(H2O) 6
+2 con Abs certificada
505 nm: soluciones de sales de cobalto Co(H2O)6+2 en H2SO4 0,47 N.
con Abs certificada.
540 nm: solucin de cianmetahemoglobina con Abs certificada
Evaluacin de la exactitud fotomtrica
Se debe calcular la inexactitud fotomtrica del instrumento
como la diferencia entre la absorbancia promedio
encontrada y el valor de referencia.
% Inexactitud fotomtrica: (Abs encontrada-Abs referencia)
Abs referencia
Limites de aceptabilidad:
Exactitud fotomtrica ptima : Inexactitud 2%
Exactitud fotomtrica aceptable: Inexactitud 3%
Ejemplo:
505 nm
Temperatura: 30oC
Medida 1= 0.315 Abs Medida 2= 0,313 Abs
Abs referencia 505 nm, 30oC = 0,323
Precisin fotomtrica
Def: grado de repetibilidad de medidas, siendo una medida de
dispersin de una serie de mediciones de %T o A alrededor del
valor medio y se expresa como coeficiente de variacin
porcentual.
Se puede usar cualquier solucin, lo importante es que esta
permanezca estable el tiempo que duren las mediciones.
Mnimo 10 mediciones
Impresin fotomtrica=CV % = DE x 100
X
Lmites de aceptabilidad
Precisin ptima: CV%< 0,5%
Precisin aceptable: CV% 0,5-1%
Estabilidad
fotomtrica
Capacidad del instrumento
de mantener constante la
Abs en funcin del tiempo.
Si observamos variaciones
constantes y continuas a
valores altos o bajos de Abs
tendremos deriva fotomtrica.
Si observamos variaciones
al azar de la Abs,
tendremos ruido fotomtrico
Calculo de la deriva: este parmetro es la pendiente de la curva de Abs v/s tiempo y se expresa como porcentaje.
Deriva: (Abs final- Abs inicial) x 100
Abs inicial
Calculo de Ruido: refleja la dispersin de los valores de los valores alrededor del valor medio de Abs multiplicado por 100 para expresarlo
en %.
Ruido: DE x 100
Abs promedio
Lmites de aceptabilidad:
Estabilidad ptima: Ruido + deriva < 0,5 %
Estabilidad aceptable: Ruido + deriva 0,5-1 %
Cuadro resumen de control fotomtrico
Tipo de control Espectrofotmetros
.
Fotmetros autoanalizadores
Control de
exactitud si si si
Control de
precisin si si si
Control de
linealidad si si si
Control de
estabilidad si si si
Control de
exactitud de
longitud de
onda
si no no
Control de luz
errtica o
parsita
si si si
Parmetro/ Frecuencia mensual trimestral semestral
Exactitud de X
Precisin X
Exactitud X
Luz parsita X
Estabilidad fotomtrica X
Cronograma recomendado para control fotomtrico
Referencias
1. Frings CS. & Broussard LA. (1979). Calibration and Monitoring of
Spectrometers and Spectrophotometers. Clin Chem 25/6, 1013-1017
2. Korzun WJ. & Miller G. (1986). Monitoring the Stability of Wavelength
Calibration of Spectrophotometers. Clin Chem. 32/1, 162-165.
3. Kaplan LA and Pesce AJ. (1996). Clinical Chemistry: theory, analyses and correlation. 3rd Edition
4. Duymovich C. Acheme R, Sesini S & Maziotta D. (2005)
Espectrofotmetros y fotocolormetros. Gua prctica de
actualizacin. Acta Bioquim Clin Latinoam; 39(4):529-39.
ANEXO
Controles de equipos de un laboratorio clnico
Instrumental
Espectrofotmetros
Fotocolormetros Balanzas
Centrfugas
Lectores de placas
Volumtrico Material de vidrio
Pipetas y
micropipetas
Dispensadores
Termomtrico
Termmetros
Baos termorregulados
Cubetas termostatizadas
Estufas
Refrigeradores
Congeladores