7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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CONCEPTOS B SICOS DE
QUIMIOMETRI Y
CONTROL DE C LID D EN
QUI MIC N LITIC
vLcell vte rerre ret <;oll vzaLez
Departamento de Quimica nalitica
Universidad de Zaragoza
f---.
studio interferencias adirivas
f---.
studio recuperacion
> o l
Estudio interferencias
c._____-- - - - 1 propcrcionales ,
efectos de matriz
y
otros)
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CONCEPTOS B SICOS
DE
QUIMIOMETRI
Y
CONTROL DE
C LID D
EN
QUIMIC N LITIC
Vicente
erreira
onzalez
Departamento de Quimica nalitica
Facultad de Ciencias
Universidad de Zaragoza
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Conceptos basicos de Quimiometrfa Control de Calidad en
Qufmica Analftica
©
2006
Vicente Ferreira Gonzalez
a
edici n
2006
Imprime: Servicio de Publicaciones de Ia Universidad de
Zaragoza
ISBN: 84 96214 70 2
Deposito legal: Z 727 2006
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' - ' - '1•
L- 1• . . . . _ , ' - 1 '
Tema 1. Introducci6n
a Ia
quimiometria
1 Papel de Ia Qufmica Analftica 1
2 Conceptos fundamentales de Qufmica Analftica 4
3 Conceptos fundamentales de Ia teorfa de Ia
informacion: errores precision y exacti tud 15
4 Tests de significacion 37
Tema
2. Descomposici6n
de varianzas
aplicaciones analiticas 53
1 Concepto y util idad 53
2 Fuentes de variacion 53
3 Descomposicion de varianzas 55
4 ANOVA de un factor de efecto fijo o controlado 58
5 La tabla de analisis de Ia varianza 62
6 l modelo subyacente al ANOVA 6
7 Factor de efecto aleatorio/teorfa del muestreo 67
Problemas 70
Tema 3. Calibraci6n de metodos analiticos 73
1 Funciones de calibracion 73
2 Linealidad de
Ia
funcion de calibracion
7
3 La recta de regresion de y sobre x 75
4 l modelo subyacente a Ia regresion 78
5 Rectas de regresion ponderadas 81
6 Calibracion
por
adicion estandar 8
7 Rectas de calibrado como parametres de calidad
y diagnostico de metodos de analisis 86
Problemas
87
Tema 4. Validaci6n
Control
de
Calidad en
Quimica
Analitica
91
1 Introduccion 91
2 Validacion de metodos de analisis. Concepto 92
3
Validacion de
Ia
exactitud y trazabilidad de un
metoda 93
4 Vision general de Ia validacion de metodos de
analisis 102
5 Ensayos de control y puesta en marcha 105
Referencias recomendadas de quimiometria 109
Apendice :
Transparencias
control
de
calidad
Apendice
2: Tablas
estadisticas
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lCUH:l
1
UlUUUUt...t ...lUU
4 1 4
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QUIMICA
ANALITICA
A
VANZADA
TEMA
1 lntroducci n a Ia Quimiometria
Contenido
Papel
de
la
Quimica Analitica. Conceptos fundamentales: Metodo, proceso, instrumento, tecnica
..
; Conceptos
fundamentales
de
la teoria
de la
informacion: errores, precision y exactitud. Control
de la
exactitud. Fuentes
de
incertidumbre
en
Quimica Analitica.
Distribucion
de
errores aleatorios: distribucion normal y distribucion
t.
Teorema
del
limite central. Intervalos
de
confianza. Presentacion de resultados. Propagacion de
errores.
Tests de significacion: Test
t
test t por parejas, test
F
test
Q.
Verificacion de la normalidad
de
una poblacion.
1. PAPEL
DE LA
QUIMICA ANALITICA.
1.1. Obtencion de informacion
La funcion de la Quimica Analitica actual es proporcionar de manera optima la informacion de
caracter quimico de un sistema material que es necesaria para resolver un problema o cuestion que se
ha
generado sabre dicho sistema.
La
vision clasica y coloquial de la Quimica Analitica es la de la ciencia que "analiza" sin mas.
Esta vision presenta al profesional de la quimica analitica como una especie de mago al que se le Bevan
muestras para que, tras una serie de ensayos de naturaleza quimica y fisico-quimica, adivine que es lo que
contienen. Aun reconociendole valor romantico a esta vision es preciso reconocer que esta totalmente
pasada de moda. Como siempre, la realidad es alga mas prosaica y menos romantica pero no por ella
menos interesante.
Hoy se reconoce la importancia que
la
informacion tiene para abordar o resolver cualquier
proceso de produccion, de control, investigacion o desarrollo.
De
hecho, puede decirse que hemos vivido
y estamos viviendo una revolucion en el mundo del analisis y el control. £,Quien podia haberse imaginado
hace tan solo 20 aiios que iba a ser necesario analizar tantas cos as y tantos parametros de cada co sa?
j
Si
hasta la orina de los atletas puede sufrir mas de 20 analisis diferentes antes de una competicion Y lo
cierto es que vamos a mas: los alimentos, el agua, el aire, los juguetes, los materiales de construccion, los
embalajes, los plasticos y un largo etcetera de productos han de ser sometidos al analisis de numerosos
parametros acerca de su composicion quimica. Por no hablar del numero de parametros, cada
vez
mas
complejos, que han de ser controlados en un hospital.
Este cambia responde a toda una serie de causas y problemas relacionados con o generados por el
desarrollo y que,
en
parte, comentaremos posteriormente. Los analisis se realizan para resolver dichos
problemas, y la informacion que han de generar estos analisis no es cualquiera y a cualquier coste, sino
solo aquella que es precisa, justificada y suficiente para resolver el problema planteado acerca dicho
sistema material. Hay dos razones de peso para que esto sea asi: a) extraer informacion de un sistema
quimico puede costar mucho dinero, y tanto mas cuanto mas informacion y de mayor calidad sea; b) la
informacion ha de ser procesada, registrada y almacenada, y esto tambien cuesta dinero y ocupa mucho
tiempo. En ambos casas
un
exceso de informacion implica un coste y una perdida de eficiencia.
La
Quimica Analitica es la Ciencia cuya mision es generar esta informacion, tal y como puede verse en el
siguiente esquema:
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QUIMICA
__,. - A ~ N : : = - c A ' = L ' = I T = I = - = C ~ A , - - - - - - ~ ~
•
INFORMACION
UTIL
RESULT
ADO)
Esta vision de Ia Quimica Analitica supera a Ia tradicional
en
Ia que habia simplemente
una
muestra
noun
sistema material) que era analizada no de Ia que se extraia informacion)
para
nose sabia
que fm en Iugar de en respuesta a un problema). Por tanto los principales protagonistas de nuestra
historia son los sistemas materiales, los interrogantes que sobre ellos se formulan, y
Ia
informacion que
ha
de generarse
para
resolverlos. Esta informacion habra de responder a ciertos requisitos de calidad y
cantidad que iremos viendo posteriormente, y ademas habra de haberse obtenido a
un
coste razonable.
Por tanto,
un
requisito adicional de Ia tarea de Ia Quimica Analitica es el proporcionar Ia informacion
requerida al menor coste posible.
Otra cuestion subyacente a Ia anterior es Ia diferencia entre lo que es un simple analisis,
entendido como una operacion eventual realizada
en
un laboratorio, de lo que es
un
sistema de analisis y
medida que funciona de manera continua o semicontinua.
En
dicho sistema Ia informacion tiene que fluir
en un continuo ya que dicha informacion puede ser parte de una cadena de operaciones exterior al
laboratorio) a un ritmo determinado, y siempre manteniendo bajo control su coste
y
su calidad. Esto
afiade una novedad mas. La tarea de un quimico analitico ya no es solo saber analizar o generar
informacion), sino saber gestionar un sistema de analisis y medida.
Un
ejemplo:
Los ayuntamientos de las ciudades estan obligados a velar por la seguridad e higiene de sus ciudadanos, lo que
incluye el asegurarse de que en el casco urbano no hay acumulacion importante de algunos productos que se sabe
contaminantes, particulannente los oxidos de Nitrogeno y
el
Ozono.
Sistema: Atmosfera urbana; Problema planteado: Vigilancia de niveles de oxidos de nitrogeno y de ozono;
Informacion requerida:
a
Concentracion promedio de oxidos de Nitrogeno en la ciudad contaminacion a largo
plazo); b) Determinacion del riesgo de que en alguna zona se supere el nivel de exposicion maximo permitido.
Observa que para resolver esta cuestion es preciso el concurso de numerosos profesionales quimicos, politicos,
estadisticos, medicos, especialistas medioambientales ..)
Observa tambien que la informacion requerida es cuantitativa pero no se limita solo a un dato de concentracion.
Observa, ademas, que no se trata
de
realizar un analisis eventual, sino de montar un sistema
de
medicion y control
que habra de funcionar de forma continua y en un plazo determinado no tiene sentido que la respuesta se produzca
despues
de
haber pasado la alerta.
Observa, finalmente, que los contribuyentes quieren estar protegidos del peligro de la contaminacion, pero no
quieren que su dinero se gaste en experimentos.
Ejercicio.- Busca unos cuantos ejemplos mas identificando en todos los casas el problema el sistema a
estudio Ia informacion requerida y su posible inserci6n n una cadena exterior allaborator io la
periodicidad de los ana/isis y las dificultades de gesti6n de dicho sistema. Resalta las diferencias
entre el sistema material
a
muestra entre
a
informacion requerida el dato
de
concentracion entre el amilisis
y l
sistema
de
medida.
En RESUMEN: La
Quimica Analitica es Ia ciencia que se ocupa de Ia generacwn de
informacion de sistemas materiales sobre los que se
ha
planteado
una
cuestion o problema.
La
informacion generada debe ser la necesaria y suficiente para resolver el problema, y debe ajustarse en
tiempo, calidad y coste a los requerimientos. Dicha informacion se producira en
un
sistema que
funcionara de manera continua o semicontinua y que debe
ser
gestionado de forma adecuada.
La
informacion que Ia Quimica Analitica suministra puede
ser
de caracter quimico basico, o elaborada.
La
informacion quimica basica puede ser de naturaleza cualitativa, cuantitativa o estructural. AI atomo,
molecula o especie objeto de Ia investigacion analitica se le conoce como analito. Pero tambien Ia
informacion generada puede ser mas elaborada, como ocurre
por
ejemplo, en el control antifraude. En
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ema n roauccwn a
a
. . m mema
estos casos la informacion quimica no es relevante, se emplea la informacion quimica para obtener una
identidad de origen, marca o tipo, por ejemplo.
Tabla sinopsis de las diferencias entre la vision clasica y la actual de la Quimica Analitica y
de
su tarea
Vision clasica
Analizar
Conocimiento
Muestra
lndiferente
Metoda de analisis
Presencia o concentracion
Veracidad
Eventual
Calibracion
arametro
Funci6n
Raz6n
Objeto
Sujeto
Herramienta
Resu tado
Criteria de evaluaci6n
Frecuencia
Forma de control
1.2.- Grandes areas de trabajo de Ia
Quimica
Analitica
Vision actual
Proporcionar informacion optima
Resolver un problema
Sistema material
Cliente
Sistema de medida
Informacion
Utilidad/Coste
Continua o semicontinua
Continua sistematizada
retroalimentada
Como se deduce de lo expuesto en el epigrafe anterior, la Quimica Analitica no es solo una
Ciencia, rama de la Quimica, sino que es una profesion singular y en expansion. La Quimica Analitica
esta presente en muchas areas de actividad economica, cientifica o social, por
lo
que es muy dificil
describir de forma exhaustiva todas sus posibles aplicaciones. Sin embargo, si que conviene sefialar
algunas grandes areas y grandes retos.
Quimica Clinica: La medicina hospitalaria requiere informacion fidedigna y muy rapida de
muchos parametros quimicos y bioquimicos indicadores del estado de un paciente. Ademas del requisito
de rapidez y de gran nfunero de muestras, los ensayos quimicos se han de realizar con volumenes muy
pequefios de muestra. Casi todos los ensayos se realizan con sangre entera, plasma, suero u orina. Hay
mas de 50 parametros de naturaleza quimica que se analizan de forma rutinaria
en
el hospital, y el
numero de parametros que deben ser analizados se incrementa de forma continua conforme progresa la
ciencia medica. De esta forma, a\ln cuando los metodos de analisis tienden a ser mas sencillos y
automaticos, el flujo de informacion generado por ellaboratorio de un hospital es cada
vez
mas complejo
y dificil de gestionar. Para poder trabajar en el laboratorio de un hospital es preciso tener el Titulo de
Especialista correspondiente, regulado seg\ln el
Real
ecreto 1163 2002 de 8 de noviembre, B.O.E.
de 15 de noviembre.
En
mi conocimiento existe un curso magister de la Universidad Complutense de
Madrid. Se puede obtener mas informacion en la pagina Web de la sociedad Espafiola de Quimica Clinica
http://www.seqc.es/).
Quimica
Industrial:
En
casi todas las industrias de transformacion es preciso realizar de forma
rutinaria analisis
de
los productos de partida y del producto acabado. Estos analisis pueden tener la
funcion de aceptar/rechazar un lote determinado, lo que lleva asociada una decision de alta
responsabilidad. Otro area cada
vez ma:s
irnportante es el Control de Procesos, que si bien basta ahora se
realizaba con parametros exclusivamente fisicos densidad, temperatura, presion), cada vez se emplean
mas parametros quimicos medidas de infrarrojo, sondas de gases, sistemas sensores ..). Muchos de estos
sistemas de medida compleja un sistema de Infrarrojo Medio, o un conjunto de sensores de gases
denominados nariz electronica) se emplean no solo en las cadenas de produccion sino en la
caracterizacion del producto de partida o final. Ademas, el quimico analitico en una empresa se suele
hacer cargo de las reclamaciones de productos defectuosos o de procesos que no consiguen la calidad
deseada.
La
industria tambien analiza los productos propios y de la competencia, y emplea el analisis
como parte de la investigacion y desarrollo.
Medio ambiente: Cada vez hay mas parametros que es obligatorio controlar para proteger el
medio natural y la salud publica.
En el
agua y en algunos alimentos: pesticidas, compuestos
organoclorados, organofosforados, dioxinas, metales pesados;
en
el aire ,oxidos
de
nitrogeno, ozono,
oxidos de azufre, monoxido de carbono, etc. Este control suele realizarse en laboratorios publicos,
aunque existen cada
vez
mas laboratorios privados que emiten un certificado que solo sera valido si el
laboratorio esta acreditado) que puede ser irnprescindible para vender una mercancia, para conseguir
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V.Ferreira
pasar un control aduanero o conseguir un certificado sanitario. La mayor parte de estos analisis se
ha
de
realizar siguiendo unas normas muy estrictas sometidas a control legal. Trabajar en estas areas es lo que
denominamos trabajo en entomos regulados, lo que exige una forma muy rigurosa de planificar, ejecutar,
controlar, evaluar y registrar todos los pasos y datos de un analisis.
Protecci6n al consumidor: Los alimentos pueden contener sustancias no autorizadas que pueden
dafiar al consumidor, que no estan permitidas, o que son simplemente distintas de o especificado
fraude). Tambien es cada vez mayor
el
mimero de parametros a determinar: drogas veterinarias
anabolizantes no autorizados), conservantes ilegales en alimentos, niveles maximos de conservantes y de
ciertas sustancias toxicas, contaminacion bacteriana, presencia de transgenicos, etc. Esta area de trabajo,
es tambien un area sensible sometida a control legal y el trabajo se ha de desempefiar en un entomo
regulado.
Certificaci6n y peritaje: En muchas transacciones comerciales, el precio de
un
producto es
funcion de su contenido en cierto metal, o en cierto compuesto. Su determinacion con exactitud es una
cuestion clave que se realiza en laboratories oficiales o acreditados.
Otras muchas areas en donde el analisis es fundamental son la quimica forense y de aduanas, el
control antifraude, el control antidoping, la quimica agricola, etc.
2.- CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE QUIMICA ANALITICA
2.1. Metrologia fisica
y metrologia
quimica
La metrologia es la ciencia, o el conjunto de ciencias, que se encargan de medir. En tanto y en
cuanto para obtener informacion de un sistema material es precise realizar alguna medicion sabre el,
puede decirse que la Quimica Analitica es una metrologia de sistemas quimicos. Medir es comparar un
objeto con otro de referenda.
La
metrologia fisica clasica desarrolla sistemas de medida de longitudes y
pesos, y posteriormente otros de unidades de iluminacion, electricidad, etcetera. A partir de ese sistema
metrologico, se pueden hacer numerosos ensayos sabre los sistemas materiales para obtener informacion
de los mismos. Por ejemplo, podemos determinar su densidad, su dureza, su resistencia a las fuerzas de
cizalla, la viscosidad, etcetera. Son ensayos de tipo fisico.
En
todos los ensayos el sistema es estimulado
y su respuesta se compara con la del sistema de referenda.
Por
ejemplo, en la medicion de la masa la
fuerza de gravedad acrua sabre el cuerpo, y su respuesta el peso), se compara con la de una masa
escogida como referenda el kilo). Algo parecido ocurre en los ensayos de dureza de materiales, etc.
La metrologia quimica cuantitativa) busca medir lo que denominamos analitos: atomos, iones,
moleculas, radicales, macromoleculas, grupos funcionales, impurezas, etcetera. Como
toda
metrologia ha
de estimular el sistema material y estudiar la respuesta, pero el proceso de medicion en general resulta
mucho mas complicado que en el caso de los ensayos fisicos, como se resume en la tabla siguiente.
Tabla. Algunas diferencias entre la metrologia quimica y la metrologia fisica
Sistemas
fisi os
Propiedades flsicas
Con sistemas
de
referencia
arbitrarios
Directos
Mecanicos
Estimulando TODO el sistema
Propiedad del sistema
Serial
lnstrumentos dedicados
Parametro
~ Q u e mide?
Comparaci6n
Caracteri sticas
~ C o m o
~ D n d e ?
Sistemas guimi os
Analitos
Gran numero operaciones
previas
Alta intervenci6n humana
Estimulando ANALITOS
Propiedad analitica
Serial Analftica
lnstrumentos versatiles
Una dificultad de la metrologia quimica es que la comparacion ha de hacerse con un sistema de
composici6n conocida, y no con un sistema de unidades arbitrarias, como ocurre
en
la metrologia fisica.
La
segunda dificultad esta asociada
ala
complejidad de algunas tecnicas de medida quimicas y a los altos
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ema
:
n ro uccu:m a a . , mmwme na
requisitos de mantenimiento y preparacion de la muestra que llevan asociadas. Esto implica, por lo
general, que en la medicion quimica seni preciso incluir etapas de reduccion y pretratamiento de la
muestra. Otra caracteristica diferencial importante es que en la medicion quimica se precisa de la
participacion humana en un grado mayor, y ademas el tipo de profesional requerido es de una alta
cualificacion.
2.2.- Tecnicas de amilisis
Para obtener informacion quimica, ha de emplearse una propiedad del sistema material que este
relacionada de alguna manera con el analito.
Par
ejemplo, si la densidad de una disolucion esta
relacionada con la cantidad de analito que esta contiene, podemos emplear la determinacion
de
la
densidad para nuestros fmes. A esta propiedad la denominamos propiedad analitica y constituye el
principia de medida del analisis. Par ejemplo, muchos elementos de la tabla periodica tienen propiedades
de absorcion de luz muy atractivas para medirlos. Hay moleculas que tienen propiedades redox muy
defmidas que pueden ser explotadas en su medicion, otras tienen propiedades fluorescentes de interes, ...
instrumento
analftico
INFORMACION
UTIL
(RESULT
ADO
QUIMICA ANALITICA IDEAL
Como quiera que sea, la Quimica Analitica hace usa de una forma de materia o energia que es la
que emplea para estimular el sistema aprovechando una propiedad de este o de los analitos. La naturaleza
de esta forma de materia o energia y de la propiedad analitica empleadas en el proceso de medicion dan
origen a las Tecnicas de Analisis, que son todo un conjunto de estrategias de obtencion de sefiales
analiticas que emplean un principia de medicion similar.Por ejemplo, el usa de la capacidad de absorcion
de luz de longitud de onda defmida par los metales y otros elementos) da Iugar a las Tecnicas de
Analisis englobadas bajo el nombre Espectrofotometria de Absorcion Atomica. La respuesta generada
par el sistema es la que denominamos seiial analitica, que en el caso ideal anteriormente planteado
podria asimilarse al resultado buscado. Solo
en
casas muy particulares se pueden emplear tecnicas de
analisis basadas en una propiedad de la muestra y
no
del analito. Par ejemplo, la densidad o
el
indice de
refraccion se pueden emplear para conocer el contenido en azucar de un mosto o zumo de frutas, pero
solo porque en estos los azucares son un componente mayoritario el segundo en proporcion tras el agua).
Este ensayo
ya
no sirve si el contenido en azucares
es
inferior a 20 giL.
El tipo de sefial elegido para realizar la medicion es fundamental en quimica analitica, y de hecho
da Iugar a la clasificacion de las tecnicas y metodos de analisis.
En
primer Iugar puede hacerse la
siguiente division de tecnicas de analisis:
1.- Tecnicas clasicas de analisis, basadas en la medicion directa de alg\ln componente de una
reaccion de estequiometria conocida.
La
magnitud medida masa, volumen o cantidad de electricidad) es
una expresion directa caso de la masa), o relacionable a traves del conocimiento
de
la normalidad del
agente valorante volumetrias) de la concentracion de los analitos. Son las tecnicas que se estudiaron
fundamentalmente en el segundo curso del primer ciclo de la licenciatura.
2.- Tecnicas instrumentales de analisis, basadas en la interaccion de alguna forma de energia con
los analitos, y en la evaluacion de la forma e intensidad de la respuesta de los analitos a dicha forma de
energia. La magnitud medida guarda una relacion con la concentracion del analito y f c), que
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6
V.Ferreira
habitualmente es determinada mediante un proceso de calibracion. Parte de estas tecnicas fueron
estudiadas en el tercer curso de Ia Licenciatura. Algunas otras senin ampliadas
en
este curso.
En el cuadro presentado en a pagina siguiente se muestra una clasificacion elemental de las
tecnicas de analisis. Es recomendable memorizar su contenido, pues constituye un esquema util sobre el
que construir de forma ordenada los conocimientos de Quimica Analitica que se han de adquirir durante
la asignatura y a lo largo de la licenciatura.
Los procesos de medicion se realizan por medio de
instrumentos analiticos
especialmente
disefiados para cada tecnica analitica en particular. Los instrurnentos mas sencillos son la
balanza
y
la
bureta.
Los instrurnentos mas comunes en los laboratorios actuates son:
•
cromatografos de
liquidos o de gases, para el analisis de moleculas organicas o de iones. Se
comercializan basicamente cuatro tipos de sistemas bien diferenciados:
o sistemas HPLC,
o sistemas GC,
o analizadores de iones, y
o sistemas GC-MS y HPLC-MS.
• espectrofotometros
de absorcion molecular uv-vis, para muchos tipos de analisis de rutina.
Muchos de los metodos enzimaticos de analisis emplean deteccion espectrofotometrica.
• electrodos
selectivos de iones, particularmente el pHmetro.
• espectrofotometros
de absorcion/emision atomica, para el analisis de rutina de la mayor parte de
elementos metalicos. El sistema mas frecuente en las empresas es el espectrofotometro de
absorcion atomica a
la
llama, en algunos casos tambien equipado con camara de grafito.
• sistemas de valoracion automatica
tituladores automaticos) que para la determinacion del
punto de equivalencia pueden emplear electrodos selectivos, o espectrofotometros uv-vis.
•
sistemas autoanalizadores
que generalmente hacen uso de una reaccion y de una determinacion
espectrofotometrica uv-vis, pero lo hacen de forma automatica.
•
analizadores multicomponente.
Cada vez mas frecuentes en las empresas. Se trata de sistemas
basados en la medicion de parametros cromaticos uv-vis, IR, NIR.
MIR
), en la presencia de
una serie de sensores de distinta selectividad oxidos metalicos, oxidos polimericos), o incluso en
la deteccion rapida del espectro de masas, que captan gran cantidad de informacion en poco
tiempo y que es procesada por sistemas inteligentes para dar una informacion elaborada o
cuantitativa.
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tema
:
ntro ucc n a a mmwmetr a
Tabla de clasificaci6n de las tecnicas analiticas
Tecnicas Chisicas
Gravimetrias Miden una masa. Son De precipitacion Se emplean como metodos de referencia en
metodos absolutos
De volatilizacion
el analisis inorgamco. Analisis de Gases.
Determinacion formula empirica orgamcos.
Electrodeposicion
Volumetricas Miden
un
volumen de
Acido Base Se emplean como metodos de rutina en
reactivo que reacciona
Complexometrias
todas las ramas del analisis clasico
estequiometricamente con el inorgamco y orgamco)
analito
Redox
Precipitacion
Tecnicas Instrumentales
Cromatograticas
Separan todos los HPLC Cromatografia Analisis de rutina de todo tipo de especies
componentes en una
Liquida de Alta
orgamcas poco volatiles, analisis de
columna y
un
detector Resolucion) biomoleculas.
colocado a la salida los
detecta de forma continua
Analizadores de iones
Especificos para
Ia
determinacion
cuantitativa de aniones y cationes
CG
Cromatografia de
Analisis de todas las especies volatiles
Gases) basta puntos de ebullicion 400°).
Opticas Miden Ia Absorcion,
Espectrofotometria de Analisis no muy dificiles de especies
Emision, Fluorescencia,
Absorcion Molecular orgamcas e inorganicas uv-vis)
Dispersion de luz
Analisis de control y estructural IR).
Detector HPLC mas usado.
Fluorescencia
Detector HPLC de gran selectividad y
molecular sensibilidad. Analisis de biomoleculas.
Absorcion
y Emision Analisis de rutina de cationes y metales.
Atomica Tambien ultratrazas. Detector especifico
elementos
Electricas
Miden Potencial o Corriente Tecnicas
Medida de rutina de
pH
e iones mas
electrica
potenciometricas
comunes electrodos selectivos de iones .
Sensores de gases. Metodos de deteccion
punto final automatico. Detector HPLC.
Tecnicas Determinacion directa y selectiva de
voltamperometricas
especies con propiedades redox. Detector
HPLC altamente selectivo.
de Particulas
Emplean haces de particulas, Espectrometria de
Determinacion de estructuras orgamcas
iones, electrones y otras
Masas
Analisis de ultratrazas orgarucas e
especies
inorgamcas
Es
el detector mas potente de las tecnicas
cromatograficas
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8
V.Ferreira
Otras tecnicas
Emplean una miscellinea de
Medici6n de densidad, Determinacion
de
la composici6n
de
basadas en
principios cientificos para
de indice de mezclas muy sencillas y bien conocidas
propiedades
de
medir.
refracci6n, de arucar, alcohol, mezclas de disolventes).
una disoluci6n
no
conductividad Algunos
se
pueden emplear
como
de un analito) electrica, de rotaci6n detectores cromatognificos caso
del
indice
©V.Ferreira
de luz polarizada,
de
refracci6n o
del
de conductividad
electrica)
Puesto que un analito puede poseer distintas propiedades analiticas, puede ser analizado mediante
diferentes tecnicas. Por ejemplo, el hierro presente en una aleacion o en un mineral puede ser
determinado a traves de sus propiedades redox tras ser disuelto) con una dicromatometria, o mediante
una polarografia voltamperometria). Podriamos tambien hacer uso de sus propiedades opticas y
determinarlo a traves de
la
absorcion molecular uv-vis de alguno de sus complejos ferrocianuro, o
tiocianato, ...
), o bien a traves de sus propiedades opticas atomicas y determinarlo por absorcion atomica
a la llama, o por emision atomica. Como puede verse, surgen muchas posibilidades de analisis y eso que
no las hemos agotado todas. Para poder elegir es preciso establecer terminos de comparacion entre las
tecnicas, lo
que
da
origen a los
parametros de calidad
analiticos de los que hablaremos posteriormente.
2.3. Proceso analitico
n realidad, en muy pocos casos es posible extraer la informacion adecuada del sistema material
sin nada mas que la tecnica, el instrumento y las condiciones operativas del mismo. A diferencia de lo
que ocurre en el caso de la metrologia fisica). Esto es por las siguientes razones:
1.- Cualquier instrumento analitico emplea cantidades de muestra muy pequefias en la medicion,
debido a la cantidad de energia necesaria para obtener la sefial analitica. Por ejemplo, un
espectrofotometro de Absorcion Atomica aspira caudales de 0,5-2 mL/min. Mayores caudales requeririan
una llama mucho mas energetica y grande. Una columna de cromatografia gas capilar se satura con masas
superiores al microgramo de analito y no tolera mas de 0,1-1 mg de muestra. Cuanto mas eficaz sea la
columna, menor cantidad de muestra y analito puede procesar. Esto es, los instrumentos analiticos
procesan masas de muestra raramente superiores al miligramo, cuando los objetivos del analisis se
refieren a un sistema material que puede tener una gran dimension y heterogeneidad. Necesariamente
ha
de haber etapas de muestreo a fm de obtener una muestra representativa y de reduccion de la muestra, a
fm de llevarla al nivel analitico.
2.- Por otra parte, los instrumentos analiticos requieren que la muestra que se les PRESENT
refula una serie de requisitos, como por ejemplo, que sea liquida, o que no tenga particulas solidas, o que
su pH este comprendido en cierto rango, ademas por supuesto de que los analitos esten en una
concentracion adecuada, que no haya interferencias, etc ...
3.- Los instrumentos de medida en todos los casos suministran sefiales que podemos Hamar
primarias, y que aunque estan relacionadas directamente con el dato de concentracion o masa, es preciso
el conocimiento de la ley que permita relacionar la sefial generalmente una corriente electrica o una
magnitud fisica) con el dato de concentracion. La tendencia general es a utilizar zonas de trabajo en las
que la relacion sefial/concentracion sea lineal, y a determinar la concentracion mediante interpolacion en
una recta de calibrado.
4.- Ademas, en muchas ocasiones el dato analitico no constituye la informacion buscada, sino que
ha
de ser procesado o comparado para generarla, o simplemente no existe tal dato analitico porque lo que
se busca es una informacion mas elaborada. Ejemplos: en un laboratorio industrial con la responsabilidad
de realizar el control de materias primas, el dato de composicion no es la informacion buscada, sino el
hecho de si
ellote
debe ser aceptado o rechazado; otro caso, es el de un analizador de Infrarrojo Cercano
programado para detectar la calidad de un producto fmal. n este caso, ni siquiera se genera un dato de
composici6n, los espectros de infrarrojo son directamente procesados para determinar dicha calidad.
5.- Una ultima pero no menos importante raz6n, es que los analisis no son hechos aislados, sino
que tienden a ser sistemas de medici6n continuos o semicontinuos que se repiten en el tiempo. Esto
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ema n rooucc m a
a
., u m me na
implica que como todo sistema, debe ser continuamente controlado para asegurar que se mantiene bajo
control, y que el control debe estar disefiado de forma que pueda ser facilmente revisado y mejorado.
Por todas estas razones, el proceso de medicion analitica suele ser mas complejo queel expuesto
anteriormente, tal y como refleja la figura siguiente. En general habran de incluirse las siguientes etapas:
1.
Muestreo. Etapa cuya mision es proporcionar una fraccion del sistema representativa de
la propiedad a estudio.
2.
Reduccion de la muestra. Etapa importante solo en sistemas materiales grandes tipico de
solidos), en los que se
hade
triturar y mezclar los elementos que componen la muestra a
fm
de irla reduciendo en tamafio.
3. Acondicionamiento y preparacion
de
la muestra. Una etapa o con unto de etapas que en
muchos metodos pueden ser la parte mas complicada. Pueden incluir desde eliminacion
de humedad, hasta procesos de digestion, de puesta en disolucion, extraccion,
concentracion, transformacion quimica, etc
4. Medida. El proceso de medicion en el instrumento analitico en si. Esta etapa suele incluir
procesos de pretratamiento de la sefial.
5.
Calculo de la concentracion. En el caso mas com m, es la interpolacion en una recta de
calibrado.
6.
Procesado de la informacion. El conjunto de operaciones necesarias para transformar el
dato de concentracion o directamente la sefial)en la informacion requerida.
7. Evaluacion del sistema. El con unto de actividades que se realizan de forma continua y
que permiten determinar que la medicion se realiza en condiciones satisfactorias,
establecer su calidad y programar mejoras en el sistema.
A este proceso en etapas seguido por la Quimica Analitica para medir lo denominamosproceso
analitico y al conjunto de instrucciones concretas para la realizacion de un analisis particular,metodo de
analisis.
bruta
?
•
t
INFORMACION
UTIL
RESULTADO)
~
INFORMACION
r : : : : : : : = = ~ ~ S r A
DATO)
Muestra
preparada
PROCESO ANALITICO
INFORMACION
BRUTA SENAL)
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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10
V.Ferreira
2.4.- Definiciones
PRO ESO ANALITICO: Es el conjunto de etapas secuenciales que la Quimica Analitica sigue
para cumplir su mision, esto es, la de proporcionar la informacion requerida de un sistema material al
minima coste.
TECNICA ANALITICA: Es el principia de medida elegido para la realizacion de un analisis.
Par ejemplo, tecnica cromatogratica, o tecnica potenciometrica.
INSTRUMENTO ANALITICO: Es el sistema fisico empleado para realizar una medicion
analitica, es par tanto la materializacion de una tecnica analitica.
PRESENTACION de la muestra: Es la forma fisica en la que se debe encontrar la muestra que
va a medirse mediante una tecnica determinada, para que la medicion pueda realizarse con garantias de
exito y sin producir dafios al instrumento.
METODO ANALITICO: Es el conjunto de instrucciories necesarias para realizar un analisis
completo. Muy a menudo se equipara a PROTOCOLO, aunque este ultimo
es
mucho mas detallado.
PLAN
DE
MUESTREO: Es el conjunto
de
instrucciones y acciones necesarias para llevar a
cabo las operaciones asociadas a la toma de muestra.
ANALITO: Es la especie quimica atomo, molecula, ion, especie radical, agregado molecular,
macromolecula, etc ) que es objeto de un analisis.
2.5.- Metodos de amilisis
Aunque desde un punta de vista te6rico, el trabajo de la Quimica Analitica se realiza mediante la
cadena operacional conocida como Proceso Analitico, en la practica la cadena se separa en dos etapas
diferenciadas: Muestreo y Metoda de analisis. Esto es asi par razones estrictamente practicas y de
economia,
ya
que sabre una misma muestra se suelen realizar muchos analisis distintos, par lo que es mas
comodo archivar par un lado las instrucciones para realizar la toma de muestra, y
par
otro las de los
analisis correspondientes. Esto hace que en la practica, muchos metodos de analisis omitan la etapa de
obtencion de la muestra. Sin embargo, no debemos olvidar que los metodos estan disefiados para actuar
sabre un tipo de muestras particulares.
Un
ejemplo.
Un
metoda disenado para controlar
a
madurez de una fruta esta basado en
a
medida del
indice
de
refracci6n del zumo de dicha fruta. Sin embargo es de vital importancia especificar
a
forma en
a
que se debe obtener el zumo para que
a
medici6n sea correcta. Muchos metodos para
a
medici6n de ciertos parametros en sangre estan disenados para actuar sabre el suero sanguineo.
a forma en a que este se obtiene debe estar completamente especificada.
Los metodos de analisis contienen el conjunto de especificaciones necesarias para realizar la
determinacion de un analito en una muestra dada empleando una cierta tecnica de analisis, par
lo
que un
metoda viene defmido par un analito, un tipo de muestras y una tecnica de analisis.
Metoda espectrofotometrico para la determinacion de Calcio en agua.
Metoda colorimetrico para la determinacion de Calcio en cementos.
Muy probablemente existan muchos metodos distintos que permiten resolver un mismo problema
analitico. Los metodas pueden diferir en el tipo de tecnica analitica empleada en la medicion diferencia
sustancial), o en alguna otra etapa del proceso analitico diferencia secundaria). Los metodos de analisis
se clasifican seglin la calidad de los resultados que proporcionen, o mejor dicho, seglin el grado de
conocimiento que tengamos de ellos y el usa que pensemos darle. Pueden distinguirse las siguientes
categorias mas o menos bien definidas:
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, u m me r a
Metodos de referenda: Son metodos cuya exactitud se ha demostrado y es universalmente aceptada
basta el punta de haber adquirido un valor legal y haber sido propuestos par distintos
organismos nacionales o internacionales dedicados a la normalizacion y validacion
metrologica, o a la supervision de la tarea de los laboratories de alglin area de interes social.
Par ejemplo ISO (International Organization for Standardization), OCDE (Organization for
Economic Cooperation and Development), FDA (US Food and Drug Administration), Ia
EPA (Enviromental Protection Agency), el NIOSH (National Institute of Occupacional
Safety and Health), las distintas comisiones de la Union Europea, o a un nivel mas local los
ministerios de agricultura, sanidad o industria espaiioles,.... En estos ultirnos casas se
denominan metodos oficiales de analisis. No todos los metodos de referenda son oficiales,
pero de alguna manera todos los metodos oficiales son metodos de referenda.
Metodos estandares: Son metodos de precision demostrada y son recomendados par alguna asociacion
profesional para Ia realizacion de un tipo de analisis. Existen varias asociaciones de mucho
prestigio que proponen metodos de estas caracteristicas como la ASTM (American Society
for the Testing of Materials), que se dedica al analisis de productos manufacturados y
materias prirnas de interes industrial, la AOAC (Association of Official Analytical
Chemists), que se dedica al desarrollo de metodos para el analisis de alirnentos,
Ia
APHA
(American Public Health Association) que se dedica al control del agua potable, y muchas
otras asociaciones de caracter sectorial mas restringido como la OIV (Office International de
la Vigne et du vin), el IB (Institute ofBrewing, Analysis Comitee),.y un largo etcetera
Metodos recomendados par autores de prestigio: Hasta hace no muchos aiios, eran pocas las personas
que se encargaban de realizar las tareas de analisis en ciertos sectores sociales o industriales.
Algunos profesionales e investigadores eran los responsables de laboratories con
responsabilidades clave y alcanzaban una gran experiencia en el analisis de todo tipo de
muestras. En ocasiones, estos autores han escrito Iibras que se han convertido en la biblia
del analisis de ciertos productos o de algunas industrias. En muchas ocasiones estos Iibras
han acabado siendo adoptados como textos base por las asociaciones profesionales citadas
anteriormente. Historicamente los textos de Fresenius, Vogel, Feigl, Kalthoff merecen ser
mencionados. En Espaiia el del profesor Bermejo (dentro de Ia categoria generales ).
Metodos publicados en las distintas revistas analiticas: Son metodos de reciente desarrollo y aplicacion,
y par tanto no existe un grado de conocirniento similar al de los anteriores. Sin embargo
pueden representar mejoras muy considerables frente a los metodos estandares o de
referenda. Los publicados en las revistas de mas prestigio suelen incluir un estudio de
validacion completo realizado par los propios autores, aunque en Ia inmensa mayoria de los
casas Ia validacion se ha realizado tan solo en un laboratorio, par lo que antes de aplicarlo
deben volver a validarse. Par supuesto nadie, excepto el prestigio y etica profesional de los
autores, avala que los detalles publicados sean correctos. A pesar de estas lirnitaciones
aparentes, estos metodos constituyen la reserva cientifica y el nucleo de desarrollo de Ia
ciencia analitica, y muchos de elias estan llamados tras algunas modificaciones a convertirse
en los metodos estandares, de referenda o incluso oficiales del futuro. Ademas, resulta
obvio que no existen metodos de referenda, oficiales o estandares para todos los casas, par
lo que en muchas ocasiones los metodos publicados en las distintas revistas cientificas son el
Unico antecedente en el que podemos apoyamos.
En general, el nivel de conocimiento que se tiene sabre un metoda esta relacionado con su
irnportancia social o economica,
ya
que los metodos que mas se conocen son los que mas se practican.
Casi todos los problemas analiticos relacionados con transacciones comerciales (par ejemplo
determinacion de
Ia
ley del oro, de la plata, de un mineral irnportante, del grado de riqueza de un
reactivo ), con cuestiones de seguridad alimentaria o medioambiental (par ejemplo, determinacion de
restos de plomo en alirnentos, en fangos o en tierras) ode seguridad general (par ejemplo, determinacion
de AI en cementa) poseen metodas amparados par la ley y existen miles de laboratories de todo el mundo
que los practican, par lo
que el grado de conocimiento que se tiene de estos metodos es muy grande.
Otros problemas analiticos que son de irnportancia para un determinado sector industrial o economico
tienen metodos de referenda o metodos estandares (par ejemplo la determinacion del extracto seco de
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12 V.Ferreira
una cerveza) y tambien se practican en miles de laboratorios. Tambien nos encontramos con problemas
mucho mas especificos o mucho mas recientes que tan solo son resueltos analiticamente en uno o dos
laboratories, o que solo han sido abordados de forma experimental en laboratories universitarios o de
investigacion.
Ademas de Ia clasificacion anterior se pueden proponer muchas otras clasificaciones de tipos de
metodos analiticos. Por ejemplo podemos citar metodos de uso intemo, que son metodos disefiados para
el control de procesos o para el control intemo de una empresa y cuyo dato es simplemente orientativo,
podemos hablar de metodos de rutina, de metodos
de
screening rastreo, metodos modificados, metodos
automaticos, etc.
2.6.- Parametros de
calidad
de metodos, tecnicas y resultados
Como se afrrmo anteriormente, un mismo analito puede ser determinado empleando varias
tecnicas, o empleando una misma tecnica con distintas etapas de tratamiento de Ia muestra. Esto hace que
el nillnero
de
posibilidades para realizar un determinado analisis sea muy grande. Para poder establecer
comparaciones, necesitamos una serie de parametres o propiedades analiticas de los metodos que nos
permitan evaluar su calidad y compararlos entre
si En
este momento no vamos a dar defmiciones
estrictas de dichos parametres, sino que buscaremos comprender los parametres de forma intuitiva.
Defmiciones precisas se veran en secciones siguientes.
El
parametro de calidad analitico mas importante es Ia EXACTITUD. Puede aplicarse para
calificar tanto a un resultado como a un metodo e incluso a una tecnica. Puede comprenderse que es muy
dificil evaluar Ia exactitud de un resultado, puesto que esta se define como Ia similitud entre el valor
determinado y el valor real de Ia muestra. Pero claro, este valor real no se conoce nunca porque para algo
estamos analizando dicha muestra. Por ello suele aceptarse que un resultado es exacto si se ha realizado
siguiendo convenientemente
1
un
metodo de amilisis cuya exactitud
ha
sido
demostrada por
Ia
comunidad
analitica. La determinacion de Ia exactitud de un metodo es un tema complejo que conlleva
mucho trabajo y tiempo.
Otro parametro de calidad importante es la
PRE ISION
de un metodo
ode
un resultado, y mide
el grado de incertidumbre que tenemos sobre dicho resultado, o sobre los resultados generados por un
cierto metodo. Lo defmiremos con mas detalle posteriormente.
Los otros dos
parametros de interes son la SELECTIVIDAD y Ia SENSIBILIDAD de un
metodo. En este caso estos parametres se aplican a los metodos y tecnicas) y no a los resultados. La
Selectividad de un metodo mide su capacidad de que Ia sefial generada corresponda al analito y no a
posibles interferencias. Es por tanto un concepto relativo ya que dependera del caso concreto
en
que nos
encontremos. Ahora bien,
es
tambien correcto afirmar que hay tecnicas o metodos mas selectivos que
otros. Por ejemplo, puedo decir que los metodos de determinacion de Hierro basados en medidas de
Absorcion Atomica son mas selectivos que los basados
en
medidas de Absorcion Molecular, pero esto no
quiere estrictamente decir que todas las medidas de Absorcion Atomica del Hierro vayan a estar siempre
libres de interferencias. Esto dependera del caso concreto en que nos encontremos.
La SENSIBILIDAD de un metodo analitico se refiere a Ia cantidad de sefial producida por
unidad de masa de analito. Por tanto un metodo mas sensible que otro producira una sefial mucho mas
facil de medir. Aunque el concepto
es
facil de comprender, no es facil de medir por la sencilla razon de
que las sefiales pueden amplificarse tanto como queramos. Para medirlo
es
imprescindible especificar
perfectamente las condiciones de trabajo. Aun asi, en ciertos casos es mucho mas conveniente emplear el
parametro de limite de detecci6n o de
minima cantidad
detectable, que se defme como la masa minima
de analito que proporciona una sefial netamente diferenciable del ruido de fondo.
1convenientemente
hace
referencia a que
el
analisis
se
ha realizado en
un
laboratorio y
en
unas
condiciones en las que
se
pueda asumir que cumple los requisites de calidad
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. . mwmema
.
Las tecnicas de amilisis poseen una sensibilidad y selectividad intrinsecas, pero la sensibilidad y
selectividad del metoda puede mejorarse mediante el usa de etapas de tratamiento de la muestra o de
tratamiento de la informacion. Formas de mejorar la selectividad: incluir una etapa de separaci6n de
interferencias, derivatizar
al
analito transformandolo par reacci6n quimica) para poder emplear una
tecnica mas selectiva, enmascarar las interferencias, emplear estrategias matematicas para separar sefiales
superpuestas. Formas de mejorar la sensibilidad: lntroducir etapas de preconcentraci6n, derivatizar al
analito para poder emplear una tecnica o unas condiciones de trabajo) mas sensible, o emplear
algoritmos matematicos para reducir el ruido de fonda.
2.7. Cuestiones:
1.- Hemos dividido las tecnicas y metodos analiticos en clasicos e instrumentales, pero desde otro punta
de vista pueden dividirse en metodos absolutos miden directamente la masa de analito ), estequiometricos
miden la masa o volumen de un derivado de estequiometria conocida), o relativos miden un parametro
que esta relacionado con la concentraci6n de analito). Razona cual de ellos puede ser mas exacto.
2.- Trata de relacionar la clasificaci6n anterior de tecnicas absolutos, estequiometricos y relativos) con
Ia que hicimos anteriormente clasica e instrumental). Razona Ia respuesta.
3.- La selecci6n de un metoda de analisis es un asunto bastante delicado y cuyo comienzo siempre es Ia
elecci6n de la tecnica de medida. Lo que se hace
de acuerdo con criterios combinadas de caracteristicas
analiticas de cada tecnica y de asequibilidad y coste de las mismas. Una vez que se ha determinado Ia
tecnica de analisis que se ha de emplear, cual sera
Ia
cuesti6n clave siguiente en Ia selecci6n o disefio del
metoda.
4.- De los casas presentados a continuacion, nombra Ia tecnica de ami/isis, el anal to y el instrumento
con que se realiza
Ia
medicion:
Determinacion del contenido de azucar de un zumo de frutas
par
medicion de
Ia
densidad.
Determinacion de Hierro
par
medicion del color generado al formar un complejo con tiocianato.
Determinacion de Calcio par medicion del color generado al meter
Ia
disolucion en una llama.
Determinacion de Cloruro empleando un electrodo selectivo
Determinacion de pesticidas organoclorados
par
separacion en cromatografia gaseosa
empleando un detector selectivo de masas
Determinacion de cloruros del agua
par
pesada del precipitado de cloruro de plata obtenido
5.- Haz una visita a
Ia
pagina web de
Ia
asociaci6n ISO
b.ttp
: lwww.iso.ch/ ) y determina si hay a/gUn
metoda de ana/isis quimico para alimentos regulado par una norma ISO.
iQue
tipo de metodos?
6.- En
Ia
OCDE
b.ttp
:
www.oecd.org) hay un capitulo dedicado al tema de seguridad alimentaria. i Que
tipo de aspecto preocupa mas a Ia OCDE?
7
.-
iQue norma ASTM
b.ttp:
lwww.astm.org) tendrias que consultar para realizar un ana/isis de oxido
de cobre-I en tintas?
8.-
iEn
que esta basado el metoda propuesto
par Ia
EPA
b.ttp:
//www.epa.gov/) para determinar aniones
inorganicos en agua potable?
9.- iQue directiva de Ia
UE b.ttp:
europa.eu.int ) aborda el ana/isis de dioxinas y PCBs en piensos?
i Que recomienda esta directiva?
10.- i Como define Ia precision y Ia exactitud de un metoda bioanalitico Ia FDA b.ttp: lwww.(da.gov/)?
(una pista, busca validacion)
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:
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a
., momema
l
3.- CONCEPTOS FUNDAMENTALES
DE
LA
TEORiA
DE LA
INFORMACION: ERRORES, PRECISION Y EXACTITUD
Todas las decisiones que tomamos estan basadas en datos y el acierto de una decision depende de
Ia correcta interpretacion de estos datos. Un cientifico, al seguir el "metoda cientifico" busca disefiar un
experirnento que le proporcione los datos necesarios para aceptar o rechazar una hipotesis. El profesional
de una empresa recaba datos de composicion para aceptar o rechazar un lote de materia prima, o para
reformular un producto, o para cualquier otra cuestion, pero siempre se apoya en datos. El precio de
numerosos productos naturales e industriales se fija en funcion del contenido en ciertas sustancias, cuya
medicion puede resultar compleja, en fm, en un largo etcetera de actividades hay decisiones que deben
tomarse en funcion de datos obtenidos en un laboratorio o instrumento quimico de medida.
Silos
datos
fueran inequivocos tamar una decision seria facil, sin embargo, esto no
es
asi: los resultados
de
un
proceso analitico no son inequivocos, sino que existe una cierta probabilidad de que no coincidan
totalmente con los valores reales, por toda una seriede razones que vamos a estudiar. Las distintas causas
que pueden hacer que un resultado no concuerde exactamente con el valor cierto son analizadas,
clasificadas y tratadas por Ia teoria de los errores y
de las medidas repetidas.
3.1.- Errores exactitud
y
precision
resultado
i
i
incertidumbre
R
±
t
t
exactitud precision
t
t
Crasos Sistematicos Aleatorios
El grado de acuerdo entre el resultado de un
analisis y el valor cierto (el valor que es
aceptado como cierto) de composicion es lo que
denominamos exactitud. Dicha exactitud puede
verse alterada, de acuerdo con Ia teoria de
errores, por dos tipos de errores, los
denominados errores crasos y los denominados
errores sistematicos.
Un error craso es el resultado de un accidente o confusion fortuitos, por ejemplo el derrame de un
liquido,
Ia
confusion de un bote de reactivo, un error de transcripcion. Son errores que pueden ser
facilmente detectables por su magnitud (solo en un sistema bien organizado, clara) y se resuelven
repitiendo el analisis. Afectan a Ia exactitud. No son achacables al metoda de analisis, sino a un analisis o
tanda de analisis
en
concreto. Aparecen
de
forma fortuita y son, en principia, hechos muy poco
frecuentes. Su estudio e interpretacion puede realizarse a partir de
Ia
teoria de probabilidades y existen
una serie de tests especialmente diseiiados para detectar este tipo de errores.
La
probabilidad de
ocurrencia de estos errores es dificil de conocer durante Ia puesta en marcha de unmetoda de analisis, ya
que para medirla hacen falta tiempos muy largos de estudio y series muy grandes de datos. Sin embargo,
un laboratorio que realice con frecuencia un cierto tipo de analisis y lleve un sistema de control y archivo
adecuado, puede hacerse al cabo del tiempo una buena idea de su frecuencia
de
aparicion y
de
los
factores que en ello inciden.
La
frecuencia de aparicion de este tipo de errores esta ligada a Ia
complejidad y grado de manualidad del trabajo, y al nivel de organizacion dellaboratorio. Cuanto mas
largo y complicado sea un proceso de analisis,
y
cuanto mas desorganizado sea el trabajo de un
laboratorio tanto mas probable sera que se produzca un errorde este tipo.
Ejemplo. Un laboratorio que realiza un ana/isis de forma automatizada, ha llegado a
a
conclusion de que
I de cada 75 veces, hay un error en a introducci6n de muestra. Cuando ocurre esto, el sistema introduce entre un
2 un 90 menos de ana/ito en el sistema analitico, lo que produce un error
por
defecto de entre el 20 el 90
del resultado total. Puesto que los ana/isis se realizan por duplicado, t,cual es a probabilidad de que el
laboratorio de un resultado err6neo?
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16
V Ferreira ·
AI realizarse los ana/isis
por
duplicado, detectaremos Ia presencia de dicho tipo de error si observamos
una divergencia de mas del 10 entre los valores de las replicas. Tan solo podria pasarnos inadvertido un error
de este tipo, si el fallo del inyector ocurre de forma simultanea en las dos replicas Y ademas fuera de Ia misma
magnitud). Esto ocurrira 1/
75/
de las veces. Por tanto, Ia probabilidad de que
el
resultado vaya afectado de
dicho error craso sera inferior a/
0,
17por mil.
Un
error sistematico ( o determinado) es aquel que introduce una desviacion del resultado frente
al valor real como consecuencia de un paso del analisis defectuoso:
por
ejemplo una
mala
calibracion,
una interferencia, adsorcion y perdida de analitos por almacenar las muestras en recipientes inadecuados.
Como puede verse, no son errores fortuitos, sino que si no se corrigen afectaran aproximadamente por
igual a TODAS las muestras que se analicen siguiendo el mismo protocolo (por eso se Haman
sistematicos). Tienen un signo defmido (haran que los resultados se desvien del valor real por exceso o
por
defecto ). Se Haman sistematicos porque afectim a una parte del sistema de medida, o sea a un metodo
de analisis (p.e. un metodo de analisis que no tenga en cuenta
la
existencia de
una
interferencia) o a su
implantacion concreta en un laboratorio (p.e.
Un
laboratorio que tenga contaminado el patron de
referenda, o que tenga mal calibrada la balanza). Afectan a Ia exactitud. (afectan al resultado
directamente . Algunos errores sistematicos se corrigen mediante una calibracion, pero otros requeriran
distintas acciones correctivas que pueden implicar el cambio de m6todo o incluso de tecnica.
Por
ejemplo, los errores sistematicos consecuencia de contaminaciones en los materiales o
reactivos requieren el analisis de lo que se denomina blanco de analisis para poder detectarse y
corregirse. Finalmente, hay otros errores sistematicos cuyo descubrimiento y correccion son bastante mas
complicados. Se trata de errores asociados a Ia contaminacion del propio patron (que solo se corrige
conociendo su pureza), a Ia presencia de interferencias (cuya correccion muy probablemente requiera el
cambio de metodo , o a Ia presencia de lo que denominamos efectos de Ia matriz (
cuya
presencia se
detecta y corrige con mucho esfuerzo mediante una tecnica de calibracion denominada adicion estandar).
ncertid
ur
bre
La
incertidumbre se refiere al grado de claridad de nuestro conocimiento.
En
ausencia de
incertidumbre cualquier conocimiento no admite matices y tiene contomos perfectamente defmidos. En el
caso de
un
resultado analitico, sino hubiera incertidumbre un resultado de 26,0 mg/L seria estrictamente
26,0000000
mg/L
y lo podriamos considerar diferente de otro de 26,01 mg/L.
En
presencia de
incertidumbre, no es que dudemos de Ia veracidad, sino que admitimos que nuestro conocimiento no tiene
una claridad total, que existe un pequefio intervalo en tomo a nuestro resultado
en
el que es igualmente
probable que se encuentre
la
respuesta real. Por eso hablamos de precision de nuestro metodo de analisis
o de nuestro resultado.
25 26 27
I
) ~
I
I I I I
) . ~
Un mundo sin incertidumbre nuestro
conocimiento sabre cualquier resultado
o medida tiene claridad absoluta
2 5
\,
7
I
I.. ...
~
Un mundo con incertidumbre nuestro
conocimiento sabre cualquier resultado
admite que n sus cercanias es
probable que se encuentre el valor
cierto
La existencia de incertidumbre es una ley natural, y en el limite particular viene expresada por el
principio de Incertidumbre de Heissenberg, que establece que nuestro conocimiento sobre un sistema
particular nunca puede ser total, ya que al medir debemos interaccionar sobre nuestro sistema, lo que
provoca su cambio de estado. Este concepto puede chocar con algunas de nuestras experiencias con Ia
medicion, sobre todo si nos hemos desenvuelto desde el comienzo en
un
entomo digital. AI tomar el peso
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QUiMIC N LiTIC AV NZ D
tema 1: lntroducc i6n a Ia (..?mmwmetria
1
I
de un objeto de forma repetida, la balanza arroja el mismo resultado, lo que falsamente nos puede hacer
creer que no hay incertidumbre en esta medicion.
La
hay, lo que pasa
es
que en este caso es muy
pequefia, para detectarla solo tendremos que emplear una balanza mucho mas precisa.
En realidad, el proceso de medicion debe ser considerado como un proceso de reduccion de la
incertidumbre (mejora de nuestro conocimiento) del sistema objeto
de
la medicion. Antes
de
realizar la
medicion nuestra incertidumbre sobre la composicion de un sistema puede ser muy grande (aunque casi
nunca es infmita). Tras la medicion, nuestra incertidumbre acerca del conocimiento de ese sistema se
hace menor.
En
todos los casos incertidumbre hace referenda al intervalo de valores
en
el cual esperamos
que se encuentre el verdadero resultado de la medicion. Este intervalo de valores sera tanto mas estrecho
(y la incertidumbre sera menor) cuanto con mas cuidado realicemos la medicion, esto es, cuanto mas
control ejerzamos sobre el proceso de medicion. Este aumento del control requiere complicar y encarecer
de forma progresiva el proceso de medicion, lo que implica que debe alcanzarse siempre un punto de
equilibrio en el que el esfuerzo invertido proporcione la reduccion de incertidumbre imprescindible para
que el resultado de la medicion sea util. Una incertidumbre mas pequefia de la realmente necesaria
siempre supone un sobreprecio innecesario. Por el contrario, una incertidumbre mayor de la requerida
puede arruinar la fmalidad del analisis.
Un ejemp/o, en una determinacion volume/rica est(mdar (cuya incertidumbre o prec ision en terminos relativos se
situa en torno a 0.5-1 ), Ia pesada de muestra suele estar entre 0,1 y 1 g y
se
realiza en una balanza
analitica cuya precis ion es de ±0, 0001 g. La incertidumbre de Ia pesada en terminos re/ativos es
por
tanto
menor de un 1
por
mil, suficiente para considerarla despreciable frente a otras fuentes de incertidumbre
(por ejemplo Ia determinacion del
punto
final). No tendria sentido emplear
una
ba/anza de alta precision
(hay balanzas con precisiones ±0, 00001 g e inferiores), que es mucho mas cara y en Ia que Ia medicion es
mas lenta. Pero tampoco tendria sentido emplear un granatario (cuya precision se situa
en
torno a ±0,OJ g),
ya que esto aumentaria de forma indebida Ia incertidumbre del ana/isis.
La teoria cientifica asocia la incertidumbre a la existencia de unos errores denominados aleatorios
o indeterminados. El termino error no se maneja aqui como sinonimo de equivocacion, sino de
introduccion de error o incertidumbre. Un error aleatorio es aquel que introduce una desviacion del
resultado consecuencia de nuestra incapacidad para controlar todas las variables que afectan a nuestro
proceso de analisis. Los errores aleatorios se deben tanto a la variabilidad, temporal y/o espacial, del
sistema material que estamos estudiando ( errores
de
muestreo ), como a la imprecision del sistema de
medicion. Los errores aleatorios hacen que aumente la incertidumbre de un resultado, esto es, que se haga
mas amplio (difuso) el intervalo de valores en el cual sabemos que esta el valor real. Por esta razon no
tienen signo defmido y se denotan con un ±.
El control de estos errores es fundamental para
Ia
toma de decisiones y para el disefio de los
sistemas analiticos. Por ello los objetivos
de
este capitulo son comprender las razones de su existencia,
aprender la forma de medirlos, conocer en
que medida afectan al grado de conocimiento del sistema a
estudio y de que manera pueden mantenerse bajo control. Veamos un ejemplo que aclara a donde
queremos llegar y la importancia de su control.
El departamento de medio ambiente del ayuntamiento de una gran ciudad informa de que el contenido de oxidos de
Nitrogeno en la atmosfera es de 2,5 ppm. La medicion se realiza mediante unos sensores situados en media docena
de puntos de la ciudad y el promedio de los valores da la citada cifra de 2,5 ppm. l Cmiles son las posibles fuentes
de error de este resultado y como afectan a su credibilidad . ·
fuente de error
los sensores estan mal calibrados
los sensores no dan una respuesta constante
los sensores estan colocados en puntos de la ciudad que no son
representativos
tipo de error
Sistematico
( analitico)
Aleatorio
( analitico)
Sistematico (de
muestreo)
afecta a
exactitud
precision
exactitud
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18
los sensores
estin mal aislados termicamente y
su
respuesta depende
de la temperatura del dia
solo se recogen las mediciones a las 8 de la maiiana
en
una
zona de
la
ciudad hay
un
compuesto que produce
una
sefial
interferente
por muy representatives que sean los puntos de analisis en realidad
solo representan una fraccion infima de toda la atmosfera urbana
un sensor se estropea y arroja medidas erroneas
Aleatorio y
sistematico
analitico)
Sistematico de
muestreo)
Sistematico
analitico)
Aleatorio de
muestreo)
Craso
V Ferreira ·
precision y
exactitud
exactitud
exactitud
precision
exactitud
Tanto
los
errores
crasos
como
los sistematicos se
pueden
eliminar o al
menos reducir) siguiendo
un
trabajo riguroso y
empleando
metodos de analisis bien conocidos. Los errores
aleatorios
siempre
existiran y haran
que
el resultado tenga una cierta incertidumbre. Esta incertidumbre afecta a las
decisiones que
tomamos en base
a
los
resultados, como
lo
demuestran las siguientes
cuestiones:
Supongamos que
la
incertidumbre del resultado del ejemplo anterior fuera 1 ppm esto quiere decir que, evaluadas
las posibles fuentes de error aleatorio, el valor real de concentracion
se
encuentra con probabilidad en el intervalo
resultado obtenido±1 ppm). Si el nivel toxico de los oxidos deN es de 2,7±1 ppm, l,accionarias la alarma? l Y si
fuera la incertidumbre de ±0,001 ppm?
Reducir Ia
incertidumbre
cuesta
esfuerzo
y dinero. Una
forma obvia de reducir
Ia
incertidumbre
en
Ia
toma de muestra es
colocar
mas
sondas
en muchos puntos de
Ia
ciudad,
pero
esto
implica una
mayor
inversion
en
sondas
y un
mayor esfuerzo derivado de
Ia recolecci6n y manipulaci6n
de
un
conjunto
mayor
de
datos y del mantenimiento
de
un
sistema de medida mas complejo.
Si el nivel toxico fuera 100 ppm,
no
tendria mucho sentido invertir dinero para que la incertidumbre del resultado
fuera 0,001 ppm. l,Cual es la incertidumbre que mejor se adapta al coste y a las necesidades?
Todas estas cuestiones las iremos resolviendo en esta secci6n.
1°.- Clasifica los siguientes errores en las categorias craso, sistematico y aleatorio:
a) l matraz de aforo utilizado en un ana/isis contenia en realidad 250, mL (en Iugar de 250,
0
debido
a haber sido conge/ado.
b
En un ana/isis dado se estan utilizando disolventes organicos de tension superficial, viscosidad y
densidad muy distintas a las del agua. Se emplea material volumetrico normal (disenado y calibrado
para trabajar con disoluciones acuosas). Se observan los siguientes fen6menos:
1.- Quedan gotitas de disolvente agarradas a las paredes del material volumetrico.
2.- No ocurre lo anterior, pero el volumen remanente en la punta de la pipeta es casi nulo.
c) Tras realizar una medida en un instrumento cientifico, percibes que
Ia
celda (del detector) se
encuentra a una temperatura de trabajo incorrecta.
d AI concentrar una muestra por evaporaci6n del disolvente, se observa que e l ana/ito que se esta
analizando se co-evapora perdiendose parte. Haces cinco experiencias y encuentras que la cantidad
perdida es el 25, 26, 30, 24, y 22 .
e) Se desea determinar el contenido en Fe de un vag6n de piritas, y
Ia
sonda con que
Ia
que se extrae
Ia
muestra del vag6n es excesivamente estrecha, de forma que los trozos de mineral mas grandes no cab en
(el contenido en mena de un mineral no es el mismo
en
particulas grandes que en las pequenas) .
f En el caso anterior,
Ia
sonda es del tamano adecuado. l vag6n contiene 30
Tm
de mineral y se extrae
una muestra de 1
Kg
para su ana/isis.
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... ..
; .: ,; ,
:
1 bis.- Enumera y clasi.fica seg Un su importancia relativa todas las fuentes de incertidumbre que puede
haber
en l
determinacion de:
a tu
propio peso
b el contenido en Sn de una aleaci6n
c Ia temperatura de un habitaci6n
d las dioxinas presentes en el
gu
de un rio
e las dioxinas presentes en un tipo de productos alimenticios
3.2. Control de
a
exactitud
Para controlar la exactitud de un trabajo analitico son precisas tres cuestiones:
a) Que la muestra sea representativa del objeto y propiedad a estudio
b) Que el metodo de amilisis escogido tenga una exactitud adecuada y a ser posible, contrastada
c) Que la aplicacion del metodo a las muestras en nuestro laboratorio se realice de forma
adecuada y con garantia de calidad
La representatividad de la muestra se define como el grado de acuerdo entre la propiedad de la
muestra tomada y la del objeto o sistema material que representa. Esto es, la representatividad de la
muestra es la propiedad equivalente a la exactitud del resultado. Su medicion
es
dificil,
ya
que no
disponemos de sistemas materiales grandes de composicion controlada, lo que explica que se dedique un
gran esfuerzo al estudio de los sistemas de muestreo que proporcionan mejores resultados y que muchos
de los sistemas de muestreo esten regulados por ley como habras podido comprobar en los temas
legislados por la Comunidad Europea, ministerio de Sanidad y Consumo, ministerio de Industria .. ).
La exactitud de un metodo de analisis se determina en los estudios de validacion del metodo, que
veremos con algo mas de detalle en el Tema
4
Los estudios de validacion tienen como objeto verificar
que la sefial es proporcional a la cantidad de analito, determinar el rango de concentraciones en que se
verifica dicha proporcionalidad, verificar que la constante de proporcionalidad no cambia de muestra a
muestra efectos de la matriz), que no hay interferencias, y determinar
cual debe ser la funcion de
calibracion. En general, los metodos de analisis tienen una exactitud asociada, como
ya
discutimos en el
epfgrafe 2 de este capitulo. Esto quiere decir que hay metodos que son mas exactos que otros, bien
porque emplean una tecnica mas exacta de por si, o porque son menos sensibles a cierto tipo de
interferencias. Ahora bien, la exactitud de un metodo no
es
un absoluto, sino que es un atributo que
depende de la muestra y del problema analitico concreto. La aplicacion de un metodo conocido a un
nuevo tipo de muestras o de problemas analfticos requiere verificar que su exactitud sigue
manteniendose. ·
Otro parlimetro relacionado con la exactitud de los metodos de analisis es la robustez, que se
defme como la resistencia al cambio de la sefial al cambiar alguno de los parlimetros de analisis. Este
termino sera defmido con mayor precision posteriormente y aqui solo haremos un uso intuitivo del
mismo. Hay metodos analiticos que son muy robustos,
16
que significa que su aplicacion a un laboratorio
concreto no representa mayores problemas. Por el contrario, hay metodos analiticos muy poco robustos
que requieren un elevado control de las condiciones operacionales y ambientales, un elevado
adiestramiento de los operadores de laboratorio y un esfuerzo de calibracion muy riguroso. La
transferencia de un metodo poco robusto de un laboratorio a otro puede ser muy costosa.
La
exactitud del trabajo de un laboratorio concreto que emplea un metodo previamente validado)
se puede verificar mediante el uso de muestras certificadas, de estlindares quirnicos, por comparacion con
metodos contrastados oficiales o estlindares), o mediante ensayos
de
colaboracion. Se mide comparando
el
resultado medio
con el valor real. La forma mas directa es, desde luego, el uso de una muestra
certificada, aunque no existen muestras para todos los problemas posibles. Una muestra certificada es una
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20
V Ferreira ·
muestra tipo cuyas propiedades de composicion son perfectamente conocidas. Por ejemplo, una muestra
de polvo de granito con contenido certificado en Estafio. Las muestras certificadas son producidas
por
alguno de los organismos de acreditacion y normalizacion y se pueden adquirir solicitandolas a dichos
organismos, o bien a alguna empresa especificamente dedicada a ello (podnis encontrar un directorio
en
la pagina http://www.labcompliance.com/ref-compounds/suppliers.htm). Los dos organismos mas
importantes que producen muestras certificadas son el americana y el europeo, cuyos datos se facilitan a
continuacion.
''National Institute
of
Standards and Technology (NIST) , que produce mas de 1200
SRM
(Standard Reference Materials) URL: http://ts.nist.gov/srm
Bureau Commounaitaire de Reference (BCR) - Certified Reference Materials; Institute of
Reference Materials and Measurements (IRMM) http://www.irmm.jrc.be/
Otros, Laboratorio del Government Chemist , http://www.lgc.co.uk/; Laboratorio Nacional de
Ensayos (Francia), http://www.lne.fr/.
Para que el trabajo de un laboratorio sea satisfactorio, es preciso que la organizacion y forma de
trabajo del mismo se ajusten a una serie de normas de calidad. n particular, es preciso que ellaboratorio
garantice que la
sefi al
de analito obtenida en el analisis de
una
·muestra se pueda relacionar de forma
inequivoca con la sefial de estandares de concentracion perfectamente conocida. A este concepto se le
denomina TRAZABILIDAD del resultado. Para garantizar la trazabilidad del resultado es preciso
introducir todo el sistema analitico en un sistema de calidad (proceso de acreditacion de un laboratorio o
de un metodo particular). Este proceso puede ser largo pero supone determinar cuales son los puntos
criticos del sistema y establecer los controles de calidad y de verificacion que se consideren pertinentes,
ademas del establecimiento de una cadena jerarquica, de estructuras de responsabilidad, etc... Puede
considerarse necesario el establecimiento de auditorias extemas (una empresa experta en calibracion que
periodicamente revisa el material de vidrio, las balanzas, instrumentos, etc, ), ademas de establecer
controles propios (muestras de referenda intema, blancos, controles de pesada ...).
Hablaremos con mas extension en el capitulo 4.
3.3.-
edida dea precision
Una
de las consecuencias de la existencia de incertidumbre es que,
por
lo general, cuando
realizamos medidas repetidas de
una
muestra, no obtenemos una serie estrictamente identica de
resultados. El grado de dispersion obtenido
en una
serie de medidas repetidas es una estimacion de la
precision de nuestro metodo. Hay varios parametros que se pueden emplear para medir la dispersion. l
mas importante es la desviacion estandar, ya que esta relacionado con las propiedades matematicas
fundamentales de las distribuciones. La desviacion estandar se denota con S y se calcula con la conocida
formula:
S
n l
[1]
don de i es un dato de una serie de n datos con media
Un
metodo de medida preciso es aquel que va afectado de pocas variaciones aleatorias, por lo que
al repetir un proceso de medicion deberan obtenerse valores muy proximos entre si y consiguientemente,
una desviacion estandar pequefia. Por el contrario, en un metodo impreciso acruan muchas fuentes de
variacion aleatorias (fuera de nuestro control) que hacen que medidas repetidas de un mismo objeto
arrojen resultados dispares y muy disperses. Por consiguiente, la desviacion estandar sera muy grande.
Esta misma observacion es valida para un metodo de muestreo determinado: Un metodo de muestreo
preciso nos proporcionara resultados replicados con una S menor que uno imprecise.
La
desviacion
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t:: :
:
.; ;
i
u
lQ
estandar se expresa a menudo como tanto por ciento de
la
media, y entonces se le denomina Coeficiente
de Variaci6n o
RSD
Relative Standard Deviation).
En ocasiones puede ocurrir que la desviaci6n estandar de
una
serie replicada de medidas sea cero.
Esto no quiere decir que la precision analitica sea infmita y la incertidumbre sea cero, lo U nico que quiere
decir es que
la
incertidumbre de dicho proceso de medici6n es muy pequefia y nose ha podido medir.
Ejemplo. AI medir de forma replicada el peso de una moneda cuyo peso real es 0,4500
g
en
un
granatario, se obtiene Ia siguiente serie de medidas: 0,45; 0,45; 0,45; 0,45; 0,45; 0,45. La
media de esta serie es 0,45 y su desviacion estandar
0.
Esto no quiere decir que Ia medicion en
el
granatario
no
tenga imprecision, lo unico que quiere decir es que
su
imprecision es inferior
a 0 01 g y no Ia hemos
podido
medir.
Ejercicios:
2°.- Cinco laboratorios distintos estan realizando un ensayo de colaboracion
en el
que se analizan par
sextuplicado unas muestras certificadas
con un
contenido de 16.5 Jig L-1 de un pesticida organo
fosforado metilparation) . La tabla siguiente resume los resultados obtenidos par los distintos
laboratorios:
A 15,8 15,3 16,3 15,9 16,0
16,2
B 17,9 18,3 18,2 17,9 18,0 18,1
15,1 16,7 17,1
15,9 16,9 16,9
D 12,8 10,9 13,5 11,3 12,0 11,9
E 16 6
16,9
16,4
16 6 16,5 16,4
Empleando Ia media y Ia desviacion estandar de cada sexteto de resultados, califica el trabajo
de los laboratorios en cuanto a su precision y exactitud.
iA
que tipos de errores pueden ser debidas las
desviaciones observadas? Representa
en
un eje cada una de las series
de
medidas obtenidas par cada
laboratorio junto con el valor central y Ia desviacion estandar.
3°.-
Un
ingeniero quimico desea conocer Ia concentracion de un
producto
de reaccion
que
se genera en
tres reactores de 200.000L. Para ella toma seis muestras aleatorias de distintas
partes
de cada reactor y
las analiza
par
un metoda analitico
muy
preciso. Los resultados
que
obtiene en las seis muestras de cada
reactor son los siguientes:
A 15,8 15,3
16 3
15,9 16,0 16,2
B 17,9
18,3 18,2 17,9 18,0 18,1
c
15,1 16 7 17,1 15,9 16,9 16,9
iCual es el reactor que produce mayor rendimiento? iCual es el que genera un producto de
calidad
mas
uniforme?
iA que piensas
que
pueden
deberse las diferencias encontradas? iCual es Ia
diferencia entre Ia variabi lidad aleatoria) analitica y Ia muestral?
4°
La
siguiente tabla muestra los resultados obtenidos en Ia medicion repetida de Ia Absorbancia de una
muestra. Construye
el
histograma correspondiente a
Ia
distribucion de los resultados y calcula
su
valor
central promedio) y su dispersion desviacion estandar).
medida valor medida valor medida valor
1
0.341 7 0.347 13 0.363
2 0.335 8 0.346 14
0.353
3
0.347
9
0.343
15
0.
348
4 0.359 10 0.342
5
0.353 11 0.356
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22
V Ferreira ·
6 0 346 12
0 350
3.4. Distribuciones de resultados. Distribuci6n normal propiedades
En las series de medidas repetidas las distribuciones de resultados que se obtienen no siguen
distribuciones caprichosas, sino que se pueden observar distribuciones tipo en funcion de Ia naturaleza de
los factores causantes de Ia desviacion. De todas las distribuciones tipo Ia mas importante es Ia
distribucion normal o de Gauss. Otras distribuciones de resultados posibles son Ia log-normal, Ia
distribucion binomial y la de Poisson.
La distribucion normal o gaussiana es una distribucion simetrica en
Ia
que el suceso mas probable
es el central, y Ia probabilidad de ocurrencia de un hecho disminuye de forma exponencial conforme nos
alejamos del centro. Esta distribucion es Ia que mejor representa
Ia
distribucion posible de resultados
afectados por una serie de fuentes aleatorias de incertidumbre, tal y como ocurre con los resultados
proporcionados por un metodo analitico. Esta observacion puede considerarse una verdad empirica acerca
de la naturaleza general de la realidad. En la figura siguiente se muestran cuatro distribuciones gaussianas
tipicas.
N(30,1 2)
- - - - - - - - - - - - - - - ~
- - - - - - - A ~ - - - - ~
:E
0,6
-1-- ------ - -----------1
c
0
a
o 4 ---------'- \-'- 'rJ+-------
- -------,1---\------l
0 10 20
30
40
Figura 5: Ejemplos de distribuciones gaussianas
Cada una de las distribuciones viene defmida por tan solo dos parametros, que son los que
figuran entre parentesis. El primero es el que denominamos centroide y coincide con el centro de la
distribucion y valor maximo, y el segundo es el que denominamos
a
(sigma) o desviacion tipica de
Ia
distribucion. Este parametro es el que determina la anchura de Ia distribucion tal y como puede verse por
comparacion entre las cuatro distribuciones. El significado de estas distribuciones es el siguiente: Si
tuvieramos un metodo de analisis cuya precision fuera ±1,2 y analizaramos repetidamente (infinitas
veces) una muestra cuyo valor de composicion real fuera 30,0, obtendriamos una distribucion de
resultados como la indicada por la gaussiana N(30,1 '2). De acuerdo con esta distribucion, el valor que
obtendriamos un nfunero superior de veces es 30,0, y el 50% de los valores serian superiores a 30,0 y un
porcentaje similar serian inferiores a 30,0. Como puede verse de forma aproximada en Ia figura,
practicamente todos los valores estarian comprendidos entre 26 y 34. Por el contrario, si nuestro metodo
tuviera una precision de ±3,0, la distribucion de resultados esperada seria la marcada como N(30,3). En
esta distribucion el valor mas probable sigue siendo 30,0, y de nuevo el 50% de los valores son
superiores a este valor, y el otro 50% inferiores. Sin embargo, puede observarse que el intervalo en que se
encuentran la mayor parte de los valores es muy superior (aproximadamente entre
21
y 39), siendo
relativamente probable encontrar valores como 24 o 36
Estas distribuciones no solo pueden describir la distribucion de resultados potenciales de un
analisis de precision conocida, sino que tambien pueden describir
Ia
distribucion del valor de un cierto
atributo en una poblacion. Por ejemplo, si tenemos un lote
de
pastillas de un farmaco que deben contener
30,0 mg de principia activo por pastilla, es mas que probable que no todas las pastillas tengan
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,
f \ 1 ~ 1 \ L l l l \ f \
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\ {U1111lVUlto..U.
JU
exactamente 30,0 mg, sino que apareceni una distribuci6n parecida a alguna de las de la figura, mas o
menos ancha segful sea la homogeneidad dellote.
L,Siempre
aparece una distribuci6n gaussiana?
No. Hay ocasiones en las que no aparece una distribuci6n gaussiana, pero esto siempre es debido
ados
posibles razones. En primer Iugar, existe la posibilidad de que los datos no pertenezcan a una unica
misma serie (poblaci6n). Par ejemplo, si en el caso del metoda analitico en el que has analizado
repetidamente una muestra certificada, este analisis se realiza en dos dias distintos y el metodo se
descalibra, obtendrias una distribuci6n suma de dos distribuciones. Lo mismo ocurriria si el late de
pastillas incluyera pastillas producidas por dos fabricantes distintos. Este efecto se puede observar en la
figura siguiente. Observa que la distribuci6n de resultados suma de las dos distribuciones individuales es
marcadamente asimetrica. Decimos que los resultados no se distribuyen de forma normal.
1,2
g
0,8
g
:g 0,6
.c
[ 0,4
0,2
0
0 10
20
sum
\
I\
\ N(32'5,1
5
N 30,1 ,2)
h \
}
30 40
Figura
6:
Una funci6n suma de 2 gaussianas de distinto centro noes una gaussiana
Existe una segunda posibilidad. Hay ocasiones en las que son otras distribuciones de
probabilidad las que aparecen. Por ejemplo, en distribuciones de atributos que par naturaleza no pueden
ser simetricas aparece una distribuci6n muy importante denominada log-normal. Este es el caso de la
distribuci6n del atributo peso en la poblaci6n humana. Esta distribuci6n no puede ser simetrica ya que
sabemos que siendo el peso medio 70Kg, existen individuos cuyo peso es superior a 140Kg, pero no
pueden existir individuos con peso negativo (que tendrian que existir para que la distribuci6n fuera
simetrica). La distribuci6n del peso tiene que ser una distribuci6n asimetrica con una cola hacia la
derecha, tal y como muestra la figura
7.
Sin embargo, la distribuci6n dellogaritmo del peso si que es una
distribuci6n normal (par eso se llama log-normal).
0,4
0,35
0,3
0
0,
25
;g
0,2
:c
0,15
c
e
c
0,1
0,05
0
-0,05
10 20 30
Figura
7:
Otras distribuciones importantes
Otras distribuciones importantes son la de Poisson, que es la que
se
obtiene cuando un hecho es
poco frecuente. Por ejemplo, podriamos obtener una distribuci6n de ese tipo al muestrear particulas de
mineral con distinto contenido en mena y ganga. Habria una composici6n media, pero algunas particulas
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24 V Ferreira ·
que tuvieran mas mena que ganga darian contenidos muy superiores. Otra distribuci6n posible es Ia
binomial, que es Ia que aparece cuando hay dos sucesos posibles (por ejemplo, blanco o negro) cada uno
con una probabilidad asociada, y realizamos extracciones de N elementos.
Una
comparativa de estas
distribuciones se puede
ver
en Ia figura 7.
Aparte de porque se trata de una distribuci6n natural , Ia distribuci6n gaussiana es muy
importante porque Ia mayor parte de los tests estadisticos estan basados en esta distribuci6n o en otras de
ella derivada. Ademas, y como veremos posteriormente, bajo ciertas circunstancias , incluso
distribuciones marcadamente asimetricas pueden ser convertidas en distribuciones normales.
Por
todas
estas razones es vital para cualquier cientifico (mas para aquel cuyo trabajo este relacionado con datos y
mediciones) el comprender y saber manejar las propiedades de esta distribuci6n.
La formula de Ia distribuci6n gaussiana es Ia siguiente:
Las poblaciones distribuidas normalmente se caracterizan por el valor central de
Ia
distribuci6n,
f.l
y por su desviaci6n estandar poblacional,
cr
, que determina Ia amplitud de Ia distribuci6n.
En
dichas poblaciones se cumple que:
aproximadamente 2/3 (67%) de todos los individuos estan en el intervalo f.l±cr
aproximadamente el 95% de todos los individuos estan en el intervalo f.l±2cr
aproximadamente el99,7 de todos los individuos estan en el intervalo f.l±3cr
0,35
0,3
C 0,25
;g 0,2
:c
8
0,15
:
Q .
0,1
0,05
0
15,9%
___;
/
_ / f
0
/ \
\
\
15,9%
6
\
5 0
\
2 3
J.L 2a
Figura :
r
o
pied d
es de las distribuciones normales
Todas las distribuciones normales cumplen las propiedades anteriores, independientemente de
cuales sean su centroide y desviaci6n tipica.
De hecho, todas las distribuciones normales son exactamente iguales si se normalizan de Ia
siguiente manera: Para cada punto de Ia poblaci6n normal se calcula el siguiente parametro que
denominamos z:
X -
f 1
Z
=
[3]
a
Este parametro no es mas que Ia distancia al centroide normalizada por Ia desviaci6n tipica de Ia
distribuci6n (distancia al centro normalizada por el error) y si ahora para cada z representamos su
probabilidad de ocurrencia, obtenemos Ia distribuci6n normal estandarizada o distribuci6n z.
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(. , U M CA
AN AL CA
A V
ANL. A J A
ema muoauccwn a
a
., m m :ana
Distribuci6n
nonnal
estandar
045
.z
.........
/ '
'
\
\
,
\
/
\.,
/
: .
.........
-5
-3 -2 -1 2 4 5
Figura
9:
Distribucion normal estandar
La ecuaci6n de la distribuci6n normal estandar es la siguiente:
1
(
z/{
p y) =
2
[4]
-
Lo que nos muestra, tal y como se ve tambien en la figura 9, que la distribuci6n z es una
distribuci6n normal de cr=l y centroide f-1.=0.
Cualquier hoja de calculo o paquete estadistico nos permite conocer cual es el porcentaje de
individuos de dicha distribuci6n que se encuentran a una cierta distancia z del centroide.
La tabla de z
adjunta a este material tambien permite conocer este valor. De manera similar, es posible conocer el
porcentaje de individuos que se encuentra en un cierto intervalo, simetrico o no, en tomo al centroide.
Ejemplo. En la distribucion N(30,1 '2) que manejamos anteriormente, el 67 de los elementos se
encuentran en torno a 30±1,2, y el 95 de los elementos en torno a 30±2,4. Si queremos saber
cuimtos elementos (que porcentaje) son mayores de
32,
es preciso hacer el siguiente calculo. La
distancia
a[
centroide es 2. Esta distancia expresada en unidades de sigma es la que denominamos
z yes z=211,2=1,67. Buscando en la tabla zen lafila de z 1,6, columna 0,0
7
se obtiene un valor
0,0475, lo que quiere decir que un 4, 75 de elementos son mayores de 32. Si desearamos conocer
la proporcion de elementos que estan en el entorno 30±2, solo hay que descontar los que estan a
la derecha de
J-L
+1,6a- (4 ,75 ) y los que estan
ala
izquierda de
J-L-1,6a-
(4
7
5 ),
por
lo que el
90,50 de elementos se encuentran en el intervalo pedido.
En
general, el intervalo simetrico que ·contiene a un cierto porcentaje de individuos en tomo al valor
central se calcula con la ayuda de la tabla y la formula,
x=p±za- [5]
Conocido este intervalo podemos inferir que si de la poblaci6n normal extraemos al azar un elemento, la
probabilidad de que se encuentre
en
el intervalo anterior es la asociada a z.
SO.- Si el nivel diario de impurezas de un deposito de agua se distribuye de forma normal con una media
4,
0 giL y con una desviacion estandar
0,
3 giL:
a)
;,Que porcentaje de dias encontraremos una concentracion comprendida entre 3,7y 4,3 giL?
b);, Y entre 3,4 y 4,6 giL?
c);, Y que porcentaje de dias encontraremos un nivel de impurezas superior a 4,9 giL?
6°.- Si un metodo para la determinacion de Cloruros en agua tiene una precision de
0,
02 giL y
analizamos un estandar certificado de 1,28 giL; ;,Cual es la probabilidad de que por causas puramente
aleatorias obtengamos un valor inferior a 1,24 giL?
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26
V Ferreira ·
r.-
La poblacion de marcianos tiene un tamano que se distribuye norma/mente con media 6 em y
desviacion estandar 1. 1 Cual es Ia probabilidad de que el primer marciano que encuentre Ia NASA tenga
un tamano comprendido entre 5 y
7
em?
3.5. Teorema del limite central
La
siguiente propiedad fundamental de las poblaciones normales es
la
conocida como
teorema
del limite central
Esta propiedad establece que si de una poblacion dada con valor central
J l
y
desviacion
cr
extraemos grupos de n elementos y determinamos
su
media la nueva poblacion formada
por las medias de dichos grupos se distribuye tambien de forma normal con
un
valor medio
J l
y con una
desviacion
cr/...Jn.
Esto es
la
distribucion de las medias tiene el mismo valor central y una dispersion que
se ha reducido en un factor
Jn
Por ello en la distribucion de las medias se cumple que:
- aproximadamente 2/3 de todas las medias de n individuos estan en el intervalo f.J±cr
J
n
- aproximadamente el 95 de todas las medias de n individuos estan en el intervalo f..l±2cr/...Jn
- aproximadamente el99,7 de todas las medias den ind ividuos estan en el intervalo
f.J±3cr/...Jn
- en general el x de todas las medias de n individuos estan en el intervalo
f.J±zcr/...Jn
donde z es
un valor que se encuentra tabulado en tablas estadisticas.
Lo que se expresa de manera analoga a como hicimos anteriormente mediante la formula:
8°.-
1
Cuales seran las nuevas
J1
y a de los niveles semanales (en Iugar de diarios) de impurezas del
deposito de agua del problema 4 JL 4,0 y a= 0,3 giL)?
9°.- 1 Cual es el intervala de concentraciones que se espera que se encuentren los niveles de impurezas
del deposito el 95% de las semanas?
10°.- Si los marcianos del ejercicio via} an siempre en grupos de cuatro, 1 cual sera Ia probabilidad de
que
Ia
media de tamano del primer cuarteto encontrado par Ia NASA sea inferior a 5 em?
El teorema del limite central tiene una consecuencia practica de gran importancia para la
medicion: Es posible regular
la
incertidumbre de un resultado controlando el nfunero de mediciones
replicadas realizadas sobre una misma muestra o en su caso controlando el nfunero de incrementos
muestrales extraidos de un sistema para estimar su composicion media.
Ejemplo. Si
Ia
imprecision de un metoda de ana/isis es de 10 ppm (a=10 ppm), un resultado de ana/isis
de una muestra dada en el 95% de los casas contendra al valor real de composicion de dicha
muestra en el intervalo x±2a.
sta
quiere decir, que si el resultado es, par ejemplo, 220 ppm,
tenemos el 95% de probabilidad de que el valor real de
Ia
muestra este en el intervalo 220±20. Si
par
el contrario, realizamos 4 ana/isis de dicha muestra (lo que denominamos replicas) , enemas
el 95% de probabilidad de que el valor real de
Ia
muestra este en el intervalo
220±(20/raiz(4))=220 ± 5. Hemos reducido Ia incertidumbre del resultado en unfactor 2.
10bis.- Si se desea conocer el contenido media en co/estero de un late de alimento producido en un
proceso continuo de variabilidad 10 , con una precision superior al 1 , 1 cuantas muestras de alimenta
tendre que tamar? Nota: Debe suponerse que Ia imprecision analitica es despreciable.
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tema ntro< ucc n a a
~ m m w m e m a
Observa que estamos diferenciando la precision del metoda de analisis de la incertidumbre del
resultado. Igualmente, estamos diferenciando entre la precision de un
metoda de muestreo y la
incertidumbre de la muestra fmal recogida.
Un segundo efecto de gran importancia que se observa en las distribuciones de las medias de
poblaciones que no se distribuyen de una forma normal es que la distribucion de las medias es siempre
mucho mas normal que la distribucion de partida y tanto mas cercana a la normal cuanto mayor es el
nllinero de elementos que componen la media.
Esta aflrmacion puede ser ilustrada con algunos ejemplos.
En
primer lugar consideremos la
distribucion derivada dellanzamiento de un dado. Se trata de una distribucion uniforme con 6 resultados
posibles y equiprobables. Bastante lejos de una distribucion normal. Si lanzamos el dado dos veces y
sacamos la media del resultado obtenido, la distribucion deja de ser uniforme, ya que algunos resultados
son mas probables que otros como consecuencia del juego de combinatoria.
Par
ejemplo, el resultado 1
solo se obtiene si tanto el primer dado como el segundo sacan
1.
Su probabilidad es 1/36 (ya que hay 36
resultados posibles).
Par
el contrario, el resultado 3,5 se obtiene con mas combinaciones de dados
(1
y 6,
2 y 5, 3 y 4, 4 y 3, 5 y 2, 6 y 1) . Su probabilidad es 1/6. Si lanzamos el dado 5 veces,
el
nllinero de
resultados posibles es 5
6
= 15625 par lo que la probabilidad de sacar un 1 ( o un 6) pasan a ser
practicamente nulas mientras que la probabilidad de ocurrencia de los hechos centrales es superior.
Tambien muchas distribuciones marcadamente asimetricas se convierten en distribuciones
simetricas muy similares
ala
normal. Considera el ejemplo de una distribucion tipo Poisson, como la que
se obtiene al muestrear particulas de un mineral que contiene particulas de mena y particulas de ganga,
siendo las prim eras 999 veces mas frecuentes que
las
segundas. Si extraemos al azar 1000 particulas (que
podrian ser las que caben en la punta de espatula que empleamos para pesar y comenzar el analisis) , el
nllinero de particulas de mena presentes en el analisis sigue una distribucion muy sesgada denominada
distribucion de Poisson que es la que se ve en la flgura
9-1
mostrada a continuaci6n. Como puede verse,
aunque la media de la distribucion
es
1, la probabilidad de extraer 0 particulas es exactamente igual a la
de extraer 1, que representaria el
1lnico
resultado correcto. Extraer dos particulas pasa aproximadamente 2
de cada 6 veces (dariamos un resultado doble del real), y extraer 3 ocurre todavia un 6,
1%
de las
ocasiones.
Extrocci6n de 1000
portlculos
2 replicas
0,4
0,3
0,35
0,25
-
0,3
0,25
r-
11
0,2
-
-
:
i 0 2
0 15
r- r
0,1
0,05
r-
r
l l
0 15
-=-
-
-
::
0,1
-
-
-n n
,05
r -
- -
0
0 1 2 3 4
5 6
7
8
g
10
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
•
4,5
5
5,5
n• partfculas men
n• med io de partfcula s de men
Figura
10-1
Figura 10-2
10 replicas
2
replicas
0 14
0,1
0,
12
0,09
0,08
11
0,1
0 08
:
0
1 5
itn- llnn
0
G.
0 )4
n i l ~
,02
0
11 0,07
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0,
06
i
0 05
g 0 04
a
ooJ
n1
0,02
n1 11
0,01
, nil IIII I
0
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~ < ? ~ 1 '
~ ' ?
'
' "'
'
'
• med io de partfcul sde men
n•
med
io
de
partfculas
de
m
n
Figura 10-3
Figura 10-4
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28
V Ferreira ·
Si este analisis lo replicarnos (esto es, para carla muestra de mineral realizarnos dos
determinaciones que comienzan cogiendo 1000 particulas carla una). La distribucion de resultados
posibles pasa a ser la mostrada en la figura 9-2, si realizarnos 10 replicas del analisis, la distribucion de
resultados (expresada como nfunero de particulas de mena carla 1000 particulas) seria la que
se
muestra
en la figura 9-3, y si lo replicararnos 20 veces, obtendriarnos la distribucion de resultados mostrados en 9-
4. Las dos ultimas distribuciones de resultados son muy parecidas a la normal, a pesar de que dado el
ejemplo escogido, se trata de distribuciones discontinuas. Como quiera que sea, su consecuencia es de
gran importancia practica,
ya que si realizarnos el nfunero suficiente de replicas, la distribucion de
resultados va a ser normal. Esto refuerza la importancia de esta distribucion y de su uso practico.
3.6.- Intervalos de confianza
La introduccion de la distribucion z nos esta permitiendo conocer de antemano en que intervalo
en tomo a un valor medido, o a una media de valores medidos, esperarnos con una cierta probabilidad
que este contenido el valor real. Esto es un gran avance,
ya
que desde que introdujimos el concepto de
imprecision e incertidumbre hablarnos de la existencia de un intervalo de valores en el cual acepto que
existe una probabilidad de que se encuentre nuestro valor real. Ahara podemos darle extension numerica,
y lo unico que hacemos es darle la vuelta a la formula
-
( j
- ( j
=
J 1
± z Fn ,para pasar a
J 1
= ± z Fn
[7]
Estos intervalos se denominan intervalos de confianza de una media o de un valor.
Esta idea puede ser explotada para saber si una media o un valor son normales , o si por el
contrario, son tan poco probables que lo
mas seguro es que procedan de una poblacion distinta. Esto se
utiliza directarnente en la toma de decisiones.
Par ejemplo, en el deposito de agua de los ejemplos anteriores, sabemos que de forma natural, el
99, 7
de las semanas el nivel de impurezas estara en el intervala 4, 0 ± 0, 34 giL que es el intervala de
confianza de la media semanal del
99, 7 ).
Si una semana en particular encontramos un nivel de
impurezas de 4, 5 giL sabemos que es tan poco probable que de forma natural se encuentre un
nivel tan alto
(Ia
sabemos despues de estudiar dicho sistema durante mucho tiempo, obviamente),
que es practicamente seguro que ha pasado alga en el sistema; como que se han obturado los
filtros,
a
que el metoda de ana/isis esta fallando;
par
lo que el data nos indicaria que debemos
iniciar alguna acci6n al respecto.
1JD Sabemos que un matraz aforado de 2 mL tipo B tiene una tolerancia que podemos asimilar
ala
desviaci6n de la poblaci6n) de 0, 03 mL. Deseamos saber si el matraz se ha descalibrado par su usa.
Para ella lo aforamos con agua densidad 1,0000 glmL) y determinamos supeso: 20,0610 g. ;,Cual es la
probabilidad de que el matraz se haya descalibrado?
3.7.- distribuci n t
La
cuestion siguiente es que en ocasiones no conocemos los parametros que defmen a la
poblacion.
n
realidad es justarnente al reves: si mido es para averiguarlos. Esto nos obliga a estimar la
desviacion estandar poblacional,
cr
a partir de la desviacion estandar de un numero limitado de
mediciones, s (desde el punto de vista practico, podemos considerar
a
como una s con mas de 50 grados
de libertad). Ahora bien, al realizar esta estimacion aumenta mi incertidumbre, por lo que cuando manejo
desviaciones estandar, s,
ya
no puedo emplear la distribucion normal, sino una muy parecida que se
denomina funcion de distribucion t. Para comprender su origen y uso es conveniente que resolvamos
primero el siguiente ejercicio:
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(.)U M CA
ANAL CA
A V
ANLAUA
ema
:
muoaucc n a a
. m omema
bis.- ;,Que tipo de distribuci6n se obtiene si de una poblaci6n que en cierto parametro se distribuye de
forma normal (con centro
J
y desviaci6n tipica
CY ,
extraemos n elementos, calculamos su media y
calculamos el cociente
para cada extracci6n aleatoria
den
elementos?
Resulta obvio que la distribuci6n que se obtiene es la distribuci6n z, o distribuci6n normal
estandar,
ya
que el panimetro anterior es justamente la distancia de cada media al centroide de la
distribuci6n normalizado por la desviaci6n (en este caso de las medias).
Pues bien, si en la formula anterior reemplazamos
cr
por s, se obtiene Ia distribuci6n t. Esto es, t
es l a distribuci6n estadistica derivada de Ia distribuci6n normal que aparece cuando de una poblaci6n que
se distribuye de forma normal, extraemos n elementos, calculamos su media y su desviaci6n estandar y
representamos
la
distribuci6n de probabilidades del panimetro t calculado segun
j l
X
t
[8]
f n
Como se puede apreciar en la ecuaci6n anterior, t es un parcimetro de distancia al centroide
normalizada
por
el error, de manera exactamente amiloga a z.
Lo
que ocurre es que en el caso de t el error
se estima por s/raiz(n), mientras que en el caso de z (para una media) el error es cr/raiz(n)
La
forma de la distribuci6n t es muy s imilar a la de la funci6n normal, si bien siempre es mas
ancha, y se obtiene una distribuci6n t para cada n. Esto es, si de la poblaci6n normal extraemos grupos de
2 elementos, calculamos su media y su desviaci6n estandar, obtenemos la distribuci6n t con un grado de
libertad (el nUII1ero de grados de libertad de s es n-1 .
En
esta distribuci6n el intervalo que contiene al
95 de los elementos de la poblaci6n es ±12,7 (frente a 1,96 de
la
distribuci6n z). Si se realizan
extracciones de 3 elementos, se obtiene
la
distribuci6n t con 2 grados de libertad, en la que el 95 de los
elementos estan en el intervalo ±4,3, si de 4 elementos la de 3 grados de libertad (±3,18), y asi
sucesivamente. Si se extrae un
nUII1ero
muy grande de elementos la distribuci6n t se superpone a la z
(ya
que s tiende a cr cuando n tiende a
oo
.
lPor que la distribuci6n t es siempre mas ancha que z? Porque el numerador del cociente que
defme a t es el mismo que el que defme a z, pero en el denominador t depende de s. S es un estimador de
cr, cr es fijo, pero s puede variar tanto mas cuanto menor sea el numero de grados de libertad de
su
estimaci6n. Esto implica que s puede ser mas pequefio (y mas grande) que sigma, lo que hara que valores
de t grandes sean probables. En la figura 11 se muestran distribuciones t de distintos tamafios que ilustran
este efecto.
..
..
g
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•
a
e
Q.
I
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t
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30
V Ferreira ·
Figura
11
Las dos expresiones que defmen los resultados mas probables de una determinacion para una
medida y para una media) se convierten en:
x = J1 ± ts [9] para un linico dato, y x = J1 ± t n [10] para una media
Y las correspondientes expresiones de los intervalos de confianza de
una
media o de
un
valor se
convierte en las expresiones:
J1 = x ± ts [11] y J1 = x± t n [12], respectivamente.
n estas formulas,
t
depende tanto del nivel de probabilidad empleado al igual que z) como del
nfunero de medidas que hay amos empleado en Ia estimacion de s: en realidad del nfunero de grados de
libertad empleado en el calculo de s
=no
de medidas empleadas
-1 .
12°.- En Ia determinacion de Sn en un vegetal, seis determinaciones han dado los siguientes resultados
(expresados en ppm): 24,4; 24,0; 24,1; 24,3; 24,2; 24,5 ;,Cwil es el intervalo de valores en el que existe
un 95 de probabilidades de que se encuentre
Ia
concentracion real de Sn en el vegetal?
La media es 24,25 ppm, y
Ia
desviacion estandar 0,187 ppm. El numero de grados
de
libertad es
el numero de datos empleados en
Ia
determinacion de s menos 1, esto
es,
5. Para un 95 de
probabilidades y 5 grados de libertad, el valor de t es 2,571 (el valor de z era aproximadamente 2 . El
intervalo de confianza de
Ia
media es par tanto ±ts/
J z
± 2,571 0,1871 J6 ± 0,196 ppm. Par tanto
en el intervalo comprendido entre 24,05 y 24,45 tenemos un 95 de probabilidad de que se encuentre el
valor real de Sn.
Como
ya
establecimos anteriormente, Ia amplitud del intervalo depende del nfunero de
mediciones, por lo que se puede regular el nivel de incertidumbre de nuestro resultado con el nfunero de
mediciones replicadas realizadas, o con el nfunero de muestras extraidas. En el caso de Ia distribucion t,
al aumentar el numero de mediciones tambien aumenta el nfunero de grados de libertad del calculo de s,
par lo que t para un mismo nivel de confianza es menor.
13°.-t,Cuimtas mediciones mas del vegetal anterior tendrias que r_ealizar para reducir
Ia
longitud de este
intervalo a
Ia
mitad?
14°.-t,Cual es
Ia
diferencia existente entre JlY
x 1
Y entre
CYy
s?
1
Tiene sentido dar signa a
CYo
s? ;,Par
que?
1
Yunidades?
15°.- Nos dice el analista que el contenido de un colorante en un alimento es de 5 ppm.
1
Que mas datos
necesitamos para conocer Ia precision del data?
1
Ypara Ia exactitud?
16°.- En un Espectrofotometro de Absorcion Atomica estamos midiendo el contenido en Cu de un
mineral. Obtenemos los siguientes valores de Absorbancia:
0,546; 0,560; 0,576; 0,551; 0,556; 0,549;
;,Cual es el valor media,
cualla
precision, y cuales los intervalos de confianza al 95 y al 99 . ;,Que
quieren decir estos parametros?
17°.- Un quimico necesita hacer unos ana/isis de un producta industrial que se encuentra en varias ppm.
El
error tolerado es de 1,0 ppm. En una muestra patron ensayada 10 veces se obtienen los siguientes
resultados:
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..
:: : :
U U U ~ \ ; 1 U H
i: a
.uuuu
u
t
25,8; 26,3; 25,0; 24,9; 25,6; 25,9; 26,2; 25,3; 25,5; 25,0
a) 1 Cucintos datos tendrci que tamar cada vez para tener Ia conjianza P=O ,05) de que el valor real
se
encuentra en el intervalo requerido?; b) 1 Y si el error tolerado fuera de 0,3 ppm?; c) 1 Y si siguiera
siendo de 1,0 ppm pero se requiriera el 99,9 de probabilidad?;
d)
t,Despues de esto que pensarias al
descubrir que
el
analista
para
ahorrar tiempo solo tomaba uno de los datos?
18°.- Se tomo Ia temperatura en puntas distintos de un bio-reactor, dando los siguientes resultados: 33,0;
33, ; 32,5; 33,9t,Cucil es
Ia
temperatura real del reactor con sus intervalos de confianza a/95 y a/99 ?
19°.- t,Bajo que circunstancias podemos conocer el intervalo de conjianza de un ana/isis del que solo se
ha realizado una replica?
La cuestion planteada en el ejercicio 19 es de gran importancia para la Quimica Analitica, ya que
a menudo los analisis son caros y dificiles de replicar. Suele ser comlin entre los quimicos no muy
familiarizados
con
la quimiometria pensar que si no se han hecho replicas de una medida, no es posible
obtener
una
estimacion de su incertidumbre. Seglin esta concepcion
no
tendria valor realizar analisis con
una linica replica. Esto es cierto, sin embargo,
tan
solo en el caso de que no se tenga realmente ninguna
estimacion de Ia incertidumbre, lo cual ocurre las primeras veces en que se emplea
un
metodo de analisis.
No hay que olvidar, sin embargo, que muy a menudo
si
que disponemos de
una
evaluacion de
la
incertidumbre
con
base
en
Ia experiencia previa y que como dijimos en la introduccion, los metodos
analiticos se hacen funcionar de forma semicontinua para formar autenticos sistemas analiticos de los que
estamos siempre aprendiendo.
Cuando empleamos una distribucion t es porque asumimos que no tenemos
un
conocimiento
preciso de
la
desviacion tipica de
la
poblacion y manejamos
una
s, desviacion estandar, que es una
estimacion de a con n-1 grados de libertad. Dicha estimacion puede servir para mediciones subsiguientes
siempre que
sea
razonable pensar que ambos sets de datos proceden de
una
poblacion con identica sigma.
Esto es, si al poner en marcha un metodo de analisis en ellaboratorio se realiza un estudio de su precision
analizando de forma replicada 6 muestras, las obtenida vamos a llamarla s
1
puede considerarse que es
una estimacion de la precision
del
metodo con 5 grados de libertad. Si se emplea ese metodo para analizar
una
segunda muestra con resultado x
2
,
y no se tienen razones para pensar que Ia precision del metodo
vaya a ser diferente en esa segunda muestra, se puede y debe) aprovechar la estimacion anterior de la
precision para establecer los intervalos de confianza de esta segunda medicion:
De
la misma manera, si a continuacion se analiza una muestra 3 y en esta ocasion se realizan dos
replicas de media x y desviacion s3), podria pensarse que la expresion del intervalo de confianza para
el resultado obtenido en
su
analisis viene defmida por:
Donde t
se mide con un grado de libertad, lo que haria que el intervalo de confianza fuera muy
ancho. Sin embargo esta aproximacion no es correcta, ya que obvia el conocimiento previo de sigma que
tenemos. Si s
3
y s
1
son ambas estimaciones de la misma a,
no
hay razon para emplear la que es
una
estimacion mas debil basada en menos grados de libertad). Seria mas correcto escribir entonces:
Observa que el nfunero de grados de libertad de t siempre se corresponde con el de s, y raiz de n se corresponde con el nfunero
de mediciones empleadas para obtener Ia media).
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32
V Ferreira ·
n realidad, y como veremos posteriormente, si tanto s
3
como s
1
son ambas estimadores de la
misma desviacion tipica (con 5 y 1 grados de libertad, respectivamente), lo mejor que podemos hacer es
combinarlas para obtener una s combinada con 6 grados de libertad, de forma que nuestro conocimiento
mejore.
Los intervalos de confianza nos pueden servir tambien para detectar la presencia de errores
sistematicos. Gracias a ellos podemos decidir con una probabilidad adecuada si una media de resultados
esta alejada de un valor real o no de forma significativa.
20°.-
El
analista del ejemplo 17, introduce algunas semanas despues una disoluci6n de concentraci6n
conocida C= 25,3 ± 0,1 ppm proveniente de una muestra certificada, y encuentra los siguientes datos:
26,2; 25,3; 26,8; 26,0; 26,1; 26,3; 25,8
t,Se puede afirmar la existencia de un error sistematico?, ;,Con que grado de confianza? ;,Que
decision debe tomarse?
3.8.-
Presentaci n de resultados
n
la practica real, tanto si se han obtenido en
un
sistema analitico de precision conocida como si
se han obtenido de un metodo poco conocido, los resultados no se suelen presentar empleando la
expresion del intervalo de confianza en funcion de t ni en funcion de z. En la practica se suele dar el
resultado medio como una estimacion del valor verdadero y una estimacion de la precision del metodo en
forma des ode
cr
segful el conocimiento que tengamos del metodo. Es preceptivo indicar el numero de
elementos que componen la media, y el
nl1mero de
grados de libertad con que se conoce s (como
indicamos con anterioridad, si el nl1mero de grados de libertad es superior a 50, entonces s y a son
practicamente coincidentes). Si el resultado es la media de varias replicas en ocasiones no se da la
desviacion estandar, sino el parametro s/raiz(n) o cr/raiz(n), que se conoce como error estandar de la
media. n estos casos se pueden presentar los resultados como
Resultado=media ± error estandar
de
la media
En cualquier caso, y al no existir un convenio universalmente aceptado, debe explicarse el que se
esta empleando.
El valor medio tiene que escribirse con un numero de cifras significativas que sea coherente con
la precision del experirnento. Si se incluyen cifras significativas de mas, no solo se dificultara la lectura y
la interpretacion, sino que inducira a pensar que los resultados tienen una precision mayor de la que en
realidad tienen. Si se incluyen cifras significativas de menos se perdera informacion de forma
injustificada.
l Que entendemos por cifras significativas? Las cifras de un resultado que conocemos con certeza
suficiente. Si obtenemos un resultado 16,5412 ppb y nuestra incertidumbre es ±1,3, debemos expresar el
resultado como 16,5
i. Por
que? Porque aceptamos que nuestro intervalo de confianza tiene una extension
de ±1,3 unidades y su centro
lo
situamos en 16,5. Si lo situamos en 16, nos distanciamos
innecesariamente media unidad del centro mas probable. Si
lo
situamos en 16,54 lo estamos situando con
una precision muy superior a la que en realidad somos capaces, lo cuallleva a engafio. Siguiendo con el
mismo razonamiento, si nuestra incertidumbre es ±0,13, el resultado debe expresarse como 16,54. Si
nuestra incertidumbre es ±0,013, lo escribiremos como 16,541.
Observa que el nl1mero de cifras significativas no coincide con el nl1mero de cifras decirnales.
Por ejemplo, el resultado anterior expresado en ppm es 0,0165, 0,01654 o 0,016542, segnn sea la
precision. Esta es Ia utilidad de Ia notacion denominada cientifica, en la que las cifras significativas se
incluyen como prefijo y se afiade un exponente para indicar Ia posicion de la coma. n los tres casos
anteriores, el resultado en notacion cientifica seria 1,6 10
2
; 1,65 10·
2
y 1,654 10·
2
ppm, respectivamente o
1,6 10
; 1,65 10
y 1,654 10
•
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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ema
:
m roauccwn
a
a
., mwmema
El mantener la coherencia de las cifras significativas nos obligani a prescindir de algunas cifras
obtenidas en nuestras mediciones y en ocasiones a redondear. Ambas cosas deben realizarse
exclusivamente al presentar los resultados. Nunca debe prescindirse durante los ca.lculos previos de cifras
cuya falta pudiera afectar al resultado. En la pnictica esto quiere decir que para los calculos debemos
preservar tantas cifras como las significativas mas dos.
21°.-1, Tiene sentido
sis
=
0,01 ppm, escribir
el
resultado como 2,0263 ppm?
1,
Y como 2 ppm?
En cuanto a las desviaciones estandar y las incertidumbres, no tiene sentido expresarlas con mas
de dos cifras significativas. La razon es clara: una desviacion estandar es una medida de la incertidumbre
de una medicion, es por naturaleza un ±algo. Por ejemplo 13,2±1,1 tiene sentido y nos indica que la cifra
3 oscila una unidad y algo mas, pero 13 ,2± 1,12 no tiene sentido, ya que no tenemos en realidad ninguna
posibilidad efectiva real de conocer la segunda cifra decimal ( cuarta significativa) del resultado.
AI
expresar la desviaci6n estandar o la incertidumbre en forma relativa, la cuestion se simplifica.
Si nuestra imprecision es superior al 10 , solo podremos dar dos cifras significativas. Si esta entre 1 y
10 , podremos dar 3, y si esta entre 0,1 y 1 , podremos dar 4.
3.9.- Propagacion combinacion de errores
Cualquier resultado analitico tiene una incertidumbre y error fmales que son consecuencia de las
incertidumbres y errores cometidos en cada uno de los pasos del analisis. Es necesario conocer como se
suman
o
propagan) los errores sistematicos o aleatorios de cada una de las etapas para determinar tanto
cual es la incertidumbre o error fmal esperados, como en cual de las etapas del analisis debe realizarse un
mayor esfuerzo para disminuir la incertidumbre o el error fmal.
Los errores se propagan de una forma muy diferente si son aleatorios o sistematicos, puesto que
los ultimos tienen signa defmido y los primeros
no.
Si al realizar una medida se realizan una serie de
operaciones aditivas (o consecutivas) que introducen cada una un cierto error aleatorio, el error aleatorio
fmal no es la suma de los errores aleatorios cometidos en las distintas operaciones, sino que son las
varianzas (
2
las que son la combinacion lineal de las varianzas.
220.-
Se tiene una bureta cuyo error de lectura que podemos asimilar a CY es
±0
02 mL,
1,
cual es el error
introducido
par
la bureta en una valoraci6n?
Hay que recordar que en la bureta se realiza la operaci6n de lectura dos veces: una cuando
enrasamos a cera y otra cuando tomamos el volumen consumido. l error total es debido a las dos
operaciones:
cr
2
=
cr
2
+
cr
2
= 0 02
2
+
0 02
2
= 0 0008=>
cr
= 0 028 mL
, , . , ,
Nos interesa particularmente conocer cual es la incertidumbre de un metoda de analisis en
funcion de la incertidumbre introducida en las distintas etapas del analisis. Veamos lo que ocurre en una
cierta determinacion volumetrica. Como ejemplo supongamos que pesamos
0,1 g de muestra, se afora a
100
mL,
se pipetean 10
mL
de muestra y se consumen alrededor de 20 mL de agente valorante.
Supongamos tambien que la Normalidad del agente valorante es conocida con una gran precision
(incertidumbre despreciable) y que el error de viraje es nulo. La incertidumbre del resultado de la
valoracion
es
funcion de las incertidumbres introducidas en la operacion de pesada, aforo, transferencia y
valoraci6n.
1.
Incertidumbre de la pesada: Podemos asimilarla a la incertidumbre de lectura, que para
una balanza analitica normal es de ±0,0001
g.
2. Incertidumbre del aforo: Podemos asimilarla a la tolerancia del matraz, que para un
matraz aforado de 100
mL
de clase B es de ±0,2 mL
3. Incertidumbre del pipeteo: Podemos asimilarla ala tolerancia de la pipeta, que para una
pipeta normal de 10
mL
de clase B es de ±0,04
mL.
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34
V Ferreira ·
4. Incertidumbre de Ia
valoraci6n: Con los condicionantes previamente descritos, podemos
asimilarla al error de lectura ya calculado en el ejercicio 22, ±0,028 mL.
Para combinar todas estas incertidumbres debemos pasarlas primero a desviaciones relativas, ya
que se encuentran en unidades
no
homogeneas y posteriormente sumamos sus cuadrados
ya
que se trata
de errores aleatorios
. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Inc.Global=± (
0
•
0001
]
2
0
•
2
]
2
0
•
04
]
2
0
•
028
]
2
= ± ~ 1
+0,002
2
+0,004
2
+0,0014
2
=±0,48
0,1
100 10 20
Este resultado nos indica que la incertidumbre de la operaci6n global (expresado como RSD( )) es el
0,48 y que pnicticamente toda la incertidumbre se
ha
introducido en la e tapa de pipeteo.
23°.- Calcula el efecto que sabre la precision global tendria en el caso anterior: a) sustituir
Ia
pipeta de
tipo B (tolerancia ±0,04)
por
una tipo A (tolerancia ±0,02),· b) sustituir el matraz aforado tipo B
(tolerancia ±0,2)por uno tipo A (tolerancia ±0,
1).
Este mismo razonamiento puede aplicarse para el calculo de la incertidumbre de una operaci6n de
medida compuesta de una toma de muestra y de una determinacion analitica.
23bis
0
Si estamos determinando cual es el contenido media en Sn de un carnian cargado de casiterita y
para ella empleamos un metoda analitico cuya
cr
es 1 g/Kg y ademas sabemos que el metoda de muestreo
empleado tiene una
cr
de 3 g/Kg,
1
cual es el error aleatorio que se comete al extraer una muestra y
analizarla una vez?.
24°.- Expresa de forma precisa el significado de cada una de las crdel ejemplo anterior.
Cuando lo que queremos determinar son los errores sistematicos, el error de la medida fmal es la
suma de los errores sistematicos cometidos en las etapas individuales (recuerda que los errores
sistematicos tienen signo). El calculo hay que hacerlo con cuidado, ya que es facil confundir los signos.
Ejemplo. En una determinacion volumetrica la pesada de muestra se realiza con un error sistematico del
-1 (por una mala calibraci6n de la balanza) y el aforo a volumen con un error
del 1
(por
una mala calibraci6n del matraz aforado). Determina cual es el error del resultado si el resto
de la valoraci6n (pipeteo, titulaci6n y calculo de los equivalentes) ya no va afectada de mas
errores.
Un error sistematico del -1 en la pesada, quiere decir que la masa medida es un 1 inferior
a la real. Un error sistematico del +1 en el aforo a volumen, quiere decir que el volumen
contenido en
el
matraz de aforo es un
1
superior al nominal. Veamos como afectan estos
errores
al numero de equivalentes de ana/ito presentes en la alicuota de muestra analizada:
Si tomamos una mas a real de 100
mg, Ia
lectura de Ia balanza sera de 99 mg; Esta mas a se
disuelve ahara en un matraz de 100 mL nominales, que contiene en realidad 101
mL.
A
continuaci6n se taman por ejemplo 10 mL de este volumen y se valoran con agente valorante,
dandonos un resultado de
X mequivalentes. Nuestro resultado sera que Ia cantidad total de
equivalentes seran 1OXpresentes en 99 mg de muestra.
Sin embargo, el numero de equivalentes presentes rea/mente seran 10,
IX
en 100 mg de
muestra. El error final cometido es:
q
1
0 / J 1 l c
1
)
'
E=JOX/99-JO,JX/100= (10/99-10,1/JOO)X= (0,10101-0,JOJ)X= 1,01
J0-
5
X
E(O/o)=l,OJJ(J
/0,101
X
100 = 0,01
;::: 0
I
Esto es, el Error relativo final es aproximadamente Ia suma de los errores relativos.
Si el matraz de aforo tuviera un error del -1 , el resultado seria sin embargo un error por
exceso del
2,
03 . Calculalo como ejercicio.
E -
\0
1 \l y
) ,_
1
y
'
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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..
ema
: lnlTUUUl:l:IUH
a a
\,lUlliiiUIIlt;U
1<1 J J
25°.- Si en la determinacion del contenido de Pb de un maiz se introduce un sesgo (error sistematico) en
la etapa de muestreo del maiz de 2,2 ppm. Y que el metoda analitico empleado, esta mal calibrado,
introduciendo un error p r exceso
de 1,1
ppm.
1,Cual
es el error sistematico total del resultado?
Otra situacion de combinacion y propagacion de errores que debemos considerar es aquella en la
que el resultado analitico depende de uno o varios datos o parametres que son procesados con un
operador matematico. Por ejemplo, para calcular la densidad, nos apoyamos en dos datos la masa y el
volumen), y dividimos el dato del primero por el segundo. Un segundo ejemplo, la Absorbancia es en
realidad el logaritmo de la Transmitancia, que a su vez es el cociente de los dos parametres medidos I e
1
0
•
Existen muchos casos de este tipo y nos interesa conocer como un error aleatoric en uno de los
parametres se transmite al resultado
fmat
Para ello es preciso echar mano del calculo diferencial, y averiguar como una variacion en un
parametro x, afecta a mi resultado y, que es fun cion de x.
y=f x)
una variacion diferencial en x, introduce la siguiente variacion en y:
d y ~ d x l
Ahora bien, como las varianzas estan relacionadas con el cuadrado de las variaciones:
por lo que
a
=
(:)'a;
[ 4]
Esto es, como era de esperar, la imprecision en el parametro x se transmite al resultado fmal a
traves de
la
derivada de la funcion con respecto a x al cuadrado.
En el caso mas general, si un resultado analitico es dependiente de m factores xi de acuerdo con la
expresion:
y = f X1,
X2
XJ...Xm),
una variacion diferencial en cada uno de los factores, introduce una variacion en el resultado dada por:
dy =l
1
dx
dxm
bY
I, lo que conlleva que la varianza del resultado se relaciona con la
tlxl tlx2 &m
varianza de cada factor seglin:
siempre que los factores m sean independientes solo en este caso podemos despreciar los productos
cruzados que aparecerian al elevar al cuadrado la expresion diferencial.
La
aplicacion de la expresion anterior a distintas relaciones matematicas entre y
y
x nos lleva a
las expresiones que se muestran en la tabla mostrada en la pagina siguiente.
26°.- En los metodos opticas, lo que se mide rea/mente es el porcentaje de luz absorb ida
p r
Ia muestra
(I = Trcmsmitancia), pero el parametro que manejamos p r ser lineal con
Ia
concentracion es
Ia
Absorbancia, que se define como A =-logT. Calcula el interval
a
en el que
Ia
desviacion estandar relativa
es minima.
1
Que implicaciones tiene esto?
27°.- Se h de determinar una constante de reparto de un equilibria de extraccion de un ana/ito entre dos
fases. Para ella medimos las concentraciones en el equilibria
de
ana/ito en ambas fases. Para Ia
determinacion del ana/ito en fase organica se emplea un metoda
de
RSD conocida del
10 .
Para Ia
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6
V Ferreira ·
determinacion
enf se
acuosa se emplea un metoda
de
RSD del 5 . ;,Cual
es Ia
imprecision (en RSD) de
Ia
determinada?
27bis.- Aplica
Ia
expresion p r deducir que
Ia
varianza de una poblacion de medias de n elementos
(que se distribuyen norma/mente con sigma
Ci
es igual a
Ia
varianza de
Ia
poblacion original reducida
en n
TIPODE
RELACION
y
= X1 X2
y
= X
X2
y
X1 X2
y
= X1 X2
y=log x
I
FORMA
DE
LA
INCERTIDUMBRE
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tema
:
ntro ucc n a
a
, m metr a
j
4.- TESTS DE SIGNIFICACION
4.1.- Concepto
y estructura
general
Como hemos vista en las secciones anteriores, la existencia de lo que denominamos errores
aleatorios no nos permite conocer con absoluta certeza el valor real de un panimetro. Mas bien hemos de
conformarnos con delimitar un intervalo mas o menos estrecho en el que dicho valor real se halle con una
cierta probabilidad. Este hecho repercute fuertemente en todos los procesos de toma de decision y los
convierte en procesos relacionados con el calculo
de
probabilidades. Desde el punta de vista conceptual
esto supone un vuelco que es muy importante meditar y comprender: Las casas no van a ser ya blancas o
negras, sino que
diremos que algo es blanco si Ia probabil idad de
que nolo
sea a partir de los datos
observados, es despreciable. El investigador es quien delimita lo que considera despreciable o no.
Siempre habremos de admitir la probabilidad de que los datos observados sean fruto de la variabilidad
aleatoria.
En la actualidad, los procedimientos mas utilizados para realizar el contraste de hipotesis son los
denominados test o contrastes de hip6tesis , cuya caracteristica mas especifica es que parten de la teoria
de la probabilidad para formalizar una regia de decision entre dos hipotesis complementarias; su objetivo
va
a ser aceptar o rechazar hipotesis cientificas, mediante un razonamiento inductivo de tipo
probabilistico.
Todos los contrastes de hipotesis tienen una estructura similar, y constan de las siguientes etapas:
1) Conocer, en la medida de lo posible, la distribucion de la poblacion.
2) Determinar las hipotesis de la prueba, que seran complementarias:
La hipotesis nula H
0
es la que se establece como verdadera y es la que se aceptara o rechazara. La
hipotesis nula en general establece que las diferencias entre los valores de los datos
se
deben a
causas puramente aleatorias. La hipotesis alternativa H
1
es la complementaria a la nula y par
tanto, se aceptara como verdadera cuando rechacemos la hipotesis nula. La hipotesis alternativa
par tanto, establece que las diferencias entre los valores observados NO se deben a causas
puramente aleatorias, sino que se de ben a la existencia de un factor con efecto.
3) Eleccion del nivel de significacion y el estadistico de prueba. El nivel de significacion a. nos
marca el error maximo del denominado tipo I que estamos dispuestos a admitir. Defme el
porcentaje de la poblacion que elegimos considerar no normal. Si elegimos a.=0,05, estamos
diciendo que aceptamos que un 5 de la poblacion lo vamos a considerar extraiio.
Si
la prueba es
de dos colas, consideraremos normal el 95 central y despreciaremos los 2,5 de los elementos
mas extremos. Si la prueba
es
de una cola, despreciaremos
el
5 mas extrema, tal y como
se
ve
en la figura
11.
La eleccion ·del nivel
de
significacion tiene importantes consecuencias. Si
elegimos a.=0,05, y rechazamos la hipotesis nula, tenemos un 5 de probabilidad de
equivocarnos. Si elegimos a.=0,01 y rechazamos la hipotesis nula, solo tenemos un
1%
de
probabilidad de equivocarnos, pero esta aumentando el riesgo de cometer un error
complementario (error que denominamos tipo II). Luego lo vemos con mas detaile.
El estadistico de prueba ( el tipo de test) es
el
que nos permitira dividir la distribucion muestral en
dos regiones complementarias, la de aceptacion de H
0
y, la de rechazo de Ho y aceptacion de H
1
(denominada region critica).
4) Obtencion de las regiones de aceptacion y rechazo de la hipotesis nula H
0
cuyos valores limites
los determinaremos en las tablas correspondientes segtin el estadistico que hayamos elegido. La
region de rechazo
es
la zona de la distribucion de la muestra cuya probabilidad es menor o igual
al nivel de significacion a..
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38
V Ferreira ·
prueba bilateral prueba unilateral
Figura 11
Con esta regia de decision nos podemos encontrar con las siguientes situaciones:
Decidimos
H
verdadera
H
1
verdadera
AceptarHo
decision correcta
Error de tipo T
P error tipo
II =
Rechazar Hoy
Error de tipo I
decision correcta
aceptar H
1
P error tipo I) = a.
a.
:;=Riesgo,
1- = Potencia del test
5) Calculo del estadistico de contraste. Que es el que nos va a permitir aceptar la hipotesis nula, si el
estadistico de contraste se encuentra en la region de aceptacion, o rechazarla, si se encuentra en la
region de rechazo.
6 Conclusiones.
En esta seccion presentaremos los contrates mas usados, dando un enfasis especial a los controles de
exactitud y precision de los resultados y metodos analiticos. Analicemos con ayuda del ejemplo
presentado en el problema 11 la estructura basica de los tests, siguiendo los puntas presentados
anteriormente.
11°.- Sabemos que un matraz aforado de
2
mL tipo B tiene una tolerancia que podemos asimilar a
Ia
desviaci6n de
Ia
poblaci6n) de 0 03 mL. Deseamos saber si el matraz se ha descalibrado
por
su uso.
Para ello
lo
aforamos con agua densidad 1,0000 g/mL) y determinamos supeso: 20,0610
g. ;
Cucil
es
Ia
probabilidad de que el matraz se haya descalibrado?
La forma de trabajar es la siguiente:
En primer Iugar consideramos si la poblacion se distribuye de forma normal o no. No existe
ningUn motivo para que la poblacion no se distribuya de forma normal y asumimos que asi lo hace. en
otros casas mas complejos es preciso aplicar algtin test para verificar la suposicion de normalidad. AI
fmal del presente capitulo veremos algtin tipo de test para verificarlo)
En segundo Iugar, formulamos la hipotesis nula,
lfo.
Esta hipotesis establece que todas las
diferencias son atribuibles a errores de naturaleza aleatoria. En nuestro caso la hipotesis nula es que el
matraz no esta descalibrado, y por tanto la diferencia entre el valor medido 20,0610 g) y el esperado
20,0000) es aleatoria,
ya
que ambos puntas pertenecen ala misma distribucion. De forma simultanea se
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tema
:
ntroauccwn a
a
, utm mema
:J:
plantea la hipotesis altemativa, que es que esos dos valores pertenecen a distribuciones distintas, el
segundo a una distribucion de centro conocido e igual a 20,0000, y el primero a una distribucion con
centro diferente.
En tercer Iugar se debe elegir el test estadistico y el nivel de significacion. Puesto que conocemos
la distribucion de la poblacion
J..L=20,0000;
a=0 03
mL),
escogeremos un test z.
En cuanto al nivel de significacion, comunmente se toma el nivel del 95%. Esto quiere decir que
si la probabilidad de que el valor medido pertenezca a la distribucion de referenda es inferior al 5%
(a=0,05), rechazaremos la hipotesis nula. Dicho de otra forma, vamos a considerar tan solo el 95% de los
individuos centrales de la poblacion, y vamos a despreciar como poco normales o poco probables el 5%
de los individuos situados en los extremos, segun se mostro en esquema en la figura 11.
El cuarto paso es determinar las regiones de aceptacion y rechazo de la hipotesis nula. En nuestro
caso, y puesto que hemos decidido realizar un test
z,
lo
que tenemos que determinar es que valores de z
son los que delirnitan el 95% de elementos centrales de la poblacion de los dos sectores (colas) que
consideramos marginales. En nuestro caso z=1,96.
El quinto paso es el calculo del estadistico
de
contraste, esto es, el valor experimental de z. En el
caso que nos ocupa,
lo
que tenemos que calcular es cual es la distancia normalizada en terminos del error
mediante la formula [3].
=X
J
=
0,0610
=
2 03
J 0,03 '
Esto es, nuestro valor se encuentra separado 2,03
a
del valor central y queda por tanto fuera de la
zona de aceptacion, que quedaba confinada para valores de z inferiores a 1 96. En la tabla de la
distribucion z se aprecia que tan solo un 2x0,0212=4,24% de puntas de la poblacion estan separados
tanto (o mas) del valor central. Dicho de otra forma, la probabilidad de que de una poblacion con centro
20,0000 y
a
0,03 extraigamos un valor 20,0610 es inferior al 5%. Par tanto rechazamos la hipotesis nula
y concluirnos que el matraz esta descalibrado. La probabilidad de equivocamos al decir esto es inferior al
5% (lo que se denomina error a o error de tipo que es el error de rechazar una hipotesis nula cierta).
4.2. Errores tipo
I
y tipo II
Habitualmente nos limitamos a fijar el nivel de significacion
a
por lo que podemos no ser
demasiado conscientes de las irnplicacjones reales
que
tiene dicha eleccion, pero veamos que es lo que
ocurre cuando cambiamos deliberadamente el nivel de significacion a. Puesto que defmirnos a como el
error de tipo que estamos dispuestos a asumir, podriamos pensar que trabajaremos mas seguros si
hacemos que a sea mas pequefio. Hagainos a por ejemplo 0,01 en Iugar de 0,05. AI tamar dicha decision,
desde luego que sera mucho menos probable que rechacemos una hipotesis nula cierta, pero estamos
perdiendo precision. Esto se puede ver facilmente con ayuda del ejemplo mostrado en el epigrafe
anterior. Si en el caso anterior a=0,01, entonces el z que delimita las zonas de aceptacion y rechazo ya no
es 1,96, sino que es 2,575. El estadistico de contraste (el z experimental) sigue siendo el mismo, 2,03,
pero en esta ocasion cae dentro de la zona de aceptaci6n de la hipotesis nula. Por tanto, al cambiar el
valor de a estariamos aceptando que nuestro matraz no esta descalibrado.
Lo que ocurre es que en al hacer mas pequefio el riesgo alfa, hacemos mas alto su riesgo
complementario, que se denomina beta, y que es aceptar como cierta una hipotesis nula falsa,
lo
que se
denomina error de tipo II. Ambos riesgos estan ligados y su defmicion exacta escapa del alcance de estos
apuntes.
Tambien podemos especular con lo que ocurriria si decidimos hacer mas grande el error alfa, por
ejemplo 0,1. En ese caso rechazaremos la hipotesis nula mucho mas facilmente, par
lo
que sera muy poco
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40
V Ferreira ·
probable que aceptemos una hipotesis nula falsa (error tipo II o error
j3 ,
pero sera mucho mas facil que
rechacemos una hipotesis nula cierta (error tipo o error a .
4.3. Comparacion de una media con un valor conocido mediante el test t
Ademas del test z, que se aplicara siempre que conozcamos la distribucion de partida (siempre
que conozcamos la precision o tolerancia de los metodos o instrumentos analiticos), se emplean otros
tests basados en Ia distribucion t que se aplicaran siempre que la precision o tolerancia tengan que
estimarse en el propio experimento mediante la realizacion de medidas repetidas. Estos tests se
denominan test t.
El problema de comparar medias con valores conocidos es bastante frecuente en quumca
analitica tanto en Ia deteccion de errores sistematicos como en Ia comprobacion de Ia pureza de lotes. Por
ejemplo, hemos comprado un lote de mineral de pureza 67 y queremos comprobarlo tomando una serie
de muestras y analizandolas. Otro ejemplo, hemos puesto en marcha en nuestro laboratorio un metodo
analitico para determinar azufre en carbon y queremos verificar su exactitud mediante el analisis de una
muestra certificada con contenido 1,07 . ·
Para responder a ambas cuestiones necesitamos conocer los intervalos de confianza de los
resultados obtenidos, por lo que sera preciso realizar determinaciones repetidas (de muestras distintas en
el primer caso, de Ia misma muestra en el segundo) para estimar las variabilidades aleatorias (de muestreo
en el primer caso, de analisis en el segundo). Partiendo
por
tanto de un set de n resultados de media X y
de desviacion estandar s,
El
intervalo de confianza viene dado por:
-
x=p±t J;z
y podemos considerar que el valor conocido difiere del valor medido si Ia longitud del intervalo ±ts/..Jn es
inferior a Ia diferencia entre ambos valores. Esto es, si
no
hay posibilidad de que ambos valores esten
en
el mismo intervalo.
En
notacion matematica:
Despejando t
se
tiene:
La
t que aparece a la derecha de la desigualdad es la que se encuentra
en
las tablas al nivel de
probabilidad escogido y con los grados de libertad con que se conoce s. Por tanto, lo fulico que hay que
hacer es verificar si la desigualdad se cumple (se rechaza Ia hipotesis nula y queda probado que hay
diferencias significativas) o no nose rechaza la hipotesis nula).
En la practica, al termino izquierdo de la desigualdad se le denomina t experimental, y a Ia t de Ia
derecha (la tabulada) t critico.
[21]
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.
rema
:
muoouccwn a
a .., um :m
Y el test se reduce a que si se verifica que te tc , entonces se rechaza la hipotesis nula y se
acepta la altemativa (hay diferencias).
Te hago notar que lo que has demostrado es que la probabilidad de que las diferencias observadas
sean debidas a causas aleatorias y no a diferencias reales, es inferior a la considerada como nivel de
confianza adecuado (habitualmente el 5%). Otra observacion importante, es que t, como ya comentamos
en su momento, no es nada mas que una medida de la diferencia entre dos parametros (en este caso una
media y un valor conocido) normalizada por el error o imprecision (en este caso s/raiz(n)).
Para aclarar la mecanica resolvamos el ejemplo 21:
En el ami/isis de Ia muestra de referencia, el analista obtuvo un resultado media de
26
,07 ppm, con una
desviaci6n estimdar de 0,46. El valor certificado (conocido) es 25,3 ppm.
El
ctilculo de t experimental
aplicando /a formula anterior, da un resultado de:
t
= l u xi Fn = (26
o7-
25 3
fi
= 4 42
e s ' ' 0,46 '
El valor de t que aparece en las tab/as para el 95 de confianza y 6 grados de libertad es 2 45,
inferior
al
calculado experimentalmente. Esto quiere decir que la probabilidad de que las diferencias
entre el valor conocido y e l determinado sean debidas a errores aleatorios son inferiores a/ 5 . Por
tanto existe una gran probabilidad
>
95 ) de que sean debidos a errores sistemtiticos.
Si se conoce la distribucion de partida, se puede emplear el test z.
28.- Para verificar
si el
matraz aludido anteriormente estti descalibrado, se realizaron replicas de la
medicion, de
forma
que los pesos obtenidos fueron: 20,0610; 20, 0589; y
20
,0623. Aplica el test z
para
verificar la posible descalibraci6n. Aplica tambien el test
t.
Comenta los resultados obtenidos mediante
ambos tests.
4.4. Comparaci6n de dos medias
Este caso es muy frecuente en todos los procesos de toma de decisiones, y particularmente en el
control de los resultados analiticos. Primero porque en la mayor parte de las ocasiones no es posible
disponer de muestras certificadas -estandares- y lo que hacemos es comparar el metodo de uso o nuevo
con un metodo oficial , y segundo porque muy a menudo en un experimento tratamos de estudiar el
efecto que provoca un cambio en algun parametro. En ambas situaciones disponemos de dos conjuntos de
datos (ambos afectados por una imprecision) y tenemos que averiguar si son diferentes o no. El
tratamiento de los datos debe ser distinto seglin si
se
puede considerar que las desviaciones standares -s
de los dos conjuntos de datos son similares o no.
a Son similares:
Se determina una s conjunta a traves de la siguiente expresion:
s= (nt-1) sy+(n2-l)
n1+n2-2
[22]
y se determina la t experimental como anteriormente a traves de la expresion:
te CXt xv
sv
i
+ £ [23]
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V Ferreira ·
29.- Para la determinacion del grado alcoh6lico se utiliza un metoda basado en la rejlexi6n de
ultrasonidos. Este metoda no es oficial y debe ser calibrado peri6dicamente utilizando el metoda de
picnometria. Para la calibraci6n se analiza un vino 6 veces
par
ambas tecnicas. Los resultados fueron:
Metoda instrumental: 12,21; 12,23; 12,19; 12,26; 12,20; 12,29
Picn6metro: 12,31; 12,27; 12,23; 12,29; 12,32; 12,34
;_Debe volver a calibrarse el instrumento? Nota: Se conoce que las precisiones de ambos metodos son
practicamente iguales.
29bis.- Deduce la expresi6n para el test t anterior basandote en la
forma
en la que se pro
pagan
los
errores.
b) Las varianzas no son similares Nota: La similaridad en este caso se debe evaluar mediante un test
estadistico que veremos posteriormente)
n este caso no es valido realizar una estimaci6n conjunta de la varianza, y la t experimental debe
calcularse de forma directa aunque solo aproximada) a traves de la ecuaci6n:
y el nfunero de grados de libertad puede estimarse con la ecuaci6n:
st
1 = nt nz _
2
g {st
2
nt
ll2
nt 1
nz
1
[25]
30.- La tabla siguiente expresa la concentraci6n de albumina en giL en el suero sanguineo de 8 hombres
y 8 mujeres adultos sanos. ;_Difieren ambas medias?
Hombres 37 39 37 42 39 45
39
42
Mujeres
44 40 39 45 47 47 43
41
31.- La siguiente tabla proporciona la concentraci6n de tiol mM) en sangre de dos grupos de
voluntarios,
el
primer grupo es normal y el segundo sufre artritis reumatoide. ;_Difieren
significativamente ambos grupos en su contenido de tiol?
Normal 1.84
1.92 1.94 1.92 1.85 1.91
2 07
Reumatico 2.81 4.06 3.62 3.27
3.27
3 76
4.5. Prueba t
p r
parejas
A menudo ocurre que interesa comparar los resultados obtenidos por dos metodos analiticos
distintos muestra a muestra. Esto es, no se analiza una muestra repetidas veces con dos metodos, sino que
se analizan varias muestras una vez por cada metodo,
ya
sea porque hay poca cantidad de muestra o
porque interesa estudiar un rango de concentraciones amplio, o porque se desea hacer el estudio a lo largo
del tiempo para eliminar factores ambientales y puntuales. Por ejemplo, si se ha desarrollado un metodo
nuevo para analizar los az\lcares presentes en productos agricolas y se desea contrastar su exactitud con la
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(JU M CA
A NAL CA
AV ANLAUA
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n roauccwn a
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., m mema
del metoda clasico habitualmente utilizado. Puesto que las muestras analiticas pueden ser tremendamente
diferentes, (maiz, cocos, peras, remolacha, algarrobas .. ), nos interesa que el contraste se realice no sobre
el analisis repetido de un tipo de muestra (por ejemplo maiz), sino que abarque un amplio rango de
muestras. Cogemos entonces muestras de todos estos materiales y cada una de elias se analiza una vez
con cada uno de los metodos.
La estrategia a seguir consiste en hacer
el
test t sobre las diferencias entre los resultados
proporcionados por los metodos para cada muestra. Si los metodos conducen a respuestas
estadisticamente comparables, la media de las diferencias no debe diferir significativamente de cero.
Entonces es cero y aplicamos la comparacion de una media con
un
valor conocido.
32.- asiguiente tabla proporciona
Ia
cantidad en mg/mL de clorhidrato de efedrina encontrada en
preparaciones farmaceuticas de Ephedrine Elixir B.P., por dos metodos diferentes: espectroscopia uv de
derivadas y un metoda ojical. Ia cantidad nominal era de 3 mg/mL). Pruebe si los resultados obtenidos
por
ambos metodos difieren significativamente:
Muestra Numero
Metoda de derivadas
Metoda oficial
2.964 2.913
2
3.030 3.000
3 2.994
3.024
4.6.- Pruebas
de
1 y 2 colas
Hasta ahora hemos considerado en el estudio de los tests de significacion, que
la
diferencia entre
dos medias podria tener Iugar en cualquier direccion. Lo mismo daba cual fuera mayor,
ya
que lo unico
que nos interesaba verificar era si existian diferencias significativas entre ambas o no. Sin embargo en
numerosos experimentos sabemos de antemano que es posible que una de elias sea mayor que la otra, y
esto
(y
solo esto) es lo que queremos probar. Entonces nos interesa considerar el area de solo una de las
"colas" de la distribucion normal. Esto es, el 5% de los elementos de la poblacion que consideramos no
normales" son aquelios elementos que tienen el valor mayor (o menor) del parametro en cuestion.
32bis.- Si el factor peso se distribuye de forma normal en una cadena de producci6n de tornillos, con
una media 0.1500 g y con desviaci6n estimdar 0.0070 g, determina cual sera el rango de tamanos que
consideraremos normales para establecer una prueba
de
una cola a=0.05). Tras realizar una
reparaci6n en
Ia
cadena
de
producci6n, se sospecha que se producen tornillos mayores. Un tornillo
tornado al azar peso 0.1616 g 1,Conjirma esta medici6n dicha sospecha?
Es conveniente comprender bien estos conceptos para no cometer errores al emplear las tablas.
Muchas de las tablas mas habitualmente empleadas proporcionan los valores de t correspondientes
directamente a la suma de las dos colas. Esto es, cuando tomamos la t del 95%, es la que corresponde a
dos areas de cola del 2,5% por cada uno de los ados de la distribucion. Debemos escoger la
correspondiente a una P doble. Si solo nos interesa una cola, el valor tabulado que hemos de tomar es el
del 90% (dos colas del 5% de area). El tomar una cola o dos colas depende de
la
pregunta que nos
hacemos antes del experimento. Si la pregunta es ,SOn diferentes .. ?, entonces dos colas; si la pregunta es
(,es este valor mayor (o menor) que este otro .. ), entonces una cola.
33.- Algunos alcoholes alilicos pueden determinarse par formaci6n de
un
derivado coloreado con Ia
vainillina. Se desea estudiar
si
el aumento de Ia temperatura de reacci6n ejerce una mejora sabre el
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44 V Ferreira ·
rendimiento de esta. Para ella, una misma muestrafue procesada a temperatura ambiente y a 60°C y se
midi6
Ia
Absorbancia del complejo formado a 608 nm Los datos obtenidos se muestran a continuaci6n:
25°C
0,209 0,212
0,223 0,215 0,
217
6 °C 0,232 0,219 0,224
0,220 0,21 7
1
Cual seria el resultado si nuestro interes hubiera sido determinar si
Ia
temperatura altera en cualquier
sentido) el rendimiento de la reacci6n?
4.7.- ltest F para
a
comparacion de desviaciones estandar
Sabemos ya que una caracteristica que debe ser conocida en todo sistema de medida es su
precision
al igual que
en
general, toda poblacion debe
ser
conocida no solo
por su
valor central sino
por
su dispersion de valores. Hasta ahara hemos empleado solo los valores centrales para comparar sets de
datos, pero
una estrategia muy util, y necesaria en muchas ocasiones, consiste en comparar las
dispersiones que existen entre dos (o mas sets de valores).
Un
ejemplo, se esta estudiando el pelaje de
dos poblaciones de animales, una de las cuales ha permanecido aislada por muchas generaciones mientras
que la otra
ha
sufrido numerosos procesos de mestizaje. Si demosttaramos que
la
poblacion mestiza posee
una
dispersion mayor
en
el atributo estudiado (pelaje: tipo de pelo, color, grosor . .), podriamos postular
la
presencia en esta poblacion de alelos de
un
gen que no estan presentes en
la
otra. Otro ejemplo, si alguien
nos propane un nuevo metoda de analisis ( o de muestreo) nos interesara determinar no solo si su
exactitud es comparable a la del metoda tradicional, sino tambien saber si su precision es mejor, similar o
pear.
Esta estrategia es muy util en el disefio de experimentos y en Ia toma de decisiones, como
veremos posteriormente
en
el epigrafe correspondiente
al
Analisis de Ia V arianza.
De
momenta nos
vamos a centrar
en
Ia comparacion de dispersiones de dos poblaciones, en particular de las precisiones de
metodos analiticos. En concreto, supongamos que hemos analizado una misma muestra repetidas veces
por dos metodos distintos. En el primer metoda hemos obtenido un valor promedio XJ y una desviacion
estandar s
1
•
En
el segundo, x
2
y s
2
•
Para
comparar precisiones el test t no es adecuado, y se utiliza
un
test en el que se considera Ia
razon de las dos varianzas muestrales. A dicho cociente se le denomina F:
F ~
s
[27]
donde las varianzas se colocan de forma que el valor de F sea siempre mayor que 1.
Recuerda que las desviaciones estandar no son mas que estimaciones realizadas con pocas
muestras, del parametro de dispersi6n de
la
poblaci6n, cr. Si
no
existiera incertidumbre en la estimaci6n
de
a
a partir de s, y los metodos tuvieran Ia misma precision (la misma
cr
, el cociente F seria
exactamente 1. Si encontraramos, en este caso hipotetico, un cociente distinto de 1
>
1
por
convenio)
seria sin Iugar a dudas, sefial inequivoca de que las precisiones son distintas. Pero desafortunadamente,
existe
una
incertidumbre en Ia estimaci6n de cr a partir de s. Como consecuencia de lo cual aunque el
cociente no sea 1 no podemos decir que sean significativamente distintas. Ahara bien, no es lo mismo que
dicho cociente F sea mucho mayor que 1 que solo un poco mayor que 1. Si el cociente fuera mucho
mayor, seria casi seguro que si que son distintas las precisiones. Como siempre, es posible determinar
cuanto mayor que 1 tiene que
ser
el cociente anterior
para
decidir si son distintas asumiendo una cierta
probabilidad de equivocarse. Este valor estadistico de F esta tabulado, y se trabaja con el de forma
parecida a como lo haciamos con Ia distribucion t. Por supuesto dicho valor sera tanto mayor cuanto
peores sean nuestras estimaciones ( cuantos menos grados de libertad), y cuanto mayor nivel de confianza
se requiera. El cociente F es tambien una distribuci6n de probabilidades derivada de
la
normal. Como las
distribuciones z y t, se encuentra
en
tablas estadisticas (una de elias en el anexo a estos apuntes), de forma
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n roouccwn a
a
., mema
tJ
que se puede conocer el valor F critico para un experimento deterrninado. El F critico es el valor del
cociente por encima del cual solo existe una probabilidad dada pequefia de aparici6n de dicho valor por
causas aleatorias.
Habitualmente se trabaja con un nivel de confianza del 95 (p<0,05), y de nuevo se aplica el
concepto de 1 o 2 colas.
La
estrategia a seguir en estos problemas es:
a) Deterrninar las medias y las desviaciones estandar.
b) Calcular el cociente F (recordar que F siempre
>1)
c) Buscar en la tabla el valor de F que se corresponde con los grados de libertad empleados en las
estimaciones de s
(numerador) y s
2
(denominador).
d) Si dicho valor F de Ia tabla es mayor que el F calculado, las diferencias observadas entre las
dos varianzas pueden ser aleatorias (no se rechaza la hip6tesis nula), si es menor, las diferencias son con
un 95 de probabilidad (o con el nivel de confianza empleado), debidas a causas reales no aleatorias
(rechazamos la hip6tesis nula).
34.- Se propane un nuevo metoda p r a determinacion de Pb. Se obtuvieron los siguientes resultados
para una muestra de aguas residuales que fue analizada 6 veces p r cada uno de los metodos
considerados, el estcmdar y el propuesto:
Media ppb)
s ppb)
518 9,3 Metodo estcmdar
521 4,2 Metodo Propuesto
t,Es a precision del metodo propuesto significativamente mejor que
a
del metodo estandar?
35.- Prueba con los datos del problema 33
si
a temperatura causa variaciones significativas en a
precision del metodo.
4.8.- La prueba Q de Dixon para
a
eliminacion de datos erroneos errores crasos)
A veces aparecen datos discordantes. En ocasiones son debidos a un error humano, (un error
accidental de pipeteo, o de trascripci6n), y pueden ser facilmente descartados (resulta obvio), pero
despues de eliminar los resultados obviamente estaban mal, alin pueden quedar resultados an6malos, y
muy distintos de lo esperado. El incluir estos resultados o no es una cuesti6n a menudo muy importante,
ya que los valores mas extremos ejercep. una influencia muy importante sobre la media.
La
cuesti6n que
se plantea es si dichos resultados aparentemente an6malos pueden ser debidos a un error craso y deben
ser por tanto rechazados o no.
La
respuesta a esta pregunta
ha
implicado el disefio de varios tests
estadisticos para resolverla. Uno de los mas sencillos (aunque no precisamente el mejor) es el test de la Q
de Dixon. Dicho test esta basado
en
el calculo de un parametro
Q
a partir de los datos experimentales, y
posteriorrnente este valor se compara con uno tabulado:
Q
=
(Valor sospechoso-Valor mas cercano )/ (Valor mas grande- Valor mas pequefio) [28]
De nuevo los valores Q estan tabulados para una P = 0.05, y si se supera el valor tabulado
( critico) podemos rechazar el valor an6malo con una probabilidad del 95 de no cometer un error.
36.- La siguiente lista de valores se obtuvo a/ medir el contenido de Zn de unas muestras determinadas.
59,2; 60,3; 59,8; 58,6; 56,3;
Pruebe si el valor anomalo 56,3 puede ser descartado.
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6
V Ferreira ·
1
Y
sial
repetir las medidas encuentra los siguientes datos? 59,8; 60,5; 58,9; 59,5?
Otros ejercicios.
37.- En una cata de productos alimenticios 9 catadores estan valorando de 0 (estimulo nulo) a 5
(estimulo maximo) la caracteristica ''frutal de un alimento y comparandola con la del mismo alimento
al que se le ha aplicado un cierto tratamiento que deberia revertir en una mayor caracteristicafrutal.
Catador
I 2 3 4 5 6 7 8 9
Producto base
I.5 0.5 2
0
2.5 0.5
2.5
0.5
I
Producto tratado 2.5
2.5
3 3
2.5 3 I.5
2.5 2
1,Han
aumentado de forma significativa las caracteristicas ''frutales de dicho alimento?
38.- Se comparo un nuevo metoda espectroscopico de absorcidn atomica de llama
para
determinar
antimonio en la atmosfera con el metoda colorimetrico recomendado. Para muestras de atmosfera
urbana se obtuvieron los siguientes resultados:
N° Muestra Metoda propuesto Metoda estandar
I
22,2 25,0
2 I9,2
I9
,5
3
I5,7 I6 6
4
20,4 2I 3
5
I9,6 20,7
6
I5,7 I6,8
1,Dijieren significativamente los resultados obtenidos
por
los dos metodos?
39
.- Los siguientes datos proporcionan la recuperacion de Bromuro (ppm) adicionado a muestras
vegetales medido mediante un metoda cromatografico. La cantidad aiiadida a cada vegetal fue la misma:
Tomate
777
790 759 790 7
70
758 764
Pepino 782
773 778 765 789
797 782
a Prueba si la recuperacion en los vegetales tiene varianzas que difieran significativamente.
b
Prueba
silas
tasas de recuperacion medias difieren significativamente.
40.- En un proceso de concentracion por evaporacion con un disolvente se comparan dos sistemas de
rejlujo. Se midiola recuperacion de ana/ito a lo largo del proceso:
Columna de Vigreux: 59; 63; 58; 65; 62; 60; 6I
Evaporacion con Nitrogeno: 58; 67; 52; 6I; 57; 53; 63
1 Difieren los procesos en variabilidad y en recuperacion de forma significativa?
4I.-
Verifique de los datos expuestos a continuacion si el data 2,07 es un valor anomalo: I ,84; I ,92;
I,94; I ,85; I ,9I; 2,07
4.9. Tests para verificar el tipo de distribucion de un set de datos
En algunas ocasiones resulta importante conocer si un set de datos se aparta de forma notable de
Ia distribuci6n normal. Si
se
apartan de
Ia
distribuci6n normal
es
posible que
no
podamos aplicar
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tema : ntro ucc n a
a
m ometna
+I
directamente algful test estadistico, y que los resultados deban ser transformados (por ejemplo trabajar
con sus logaritrnos).
En
otras ocasiones,
el
averiguar que una serie de datos no esta normalmente
distribuida constituye una evidencia de que debe haber algun factor no aleatorio incidiendo sobre el
sistema, por lo que este tipo de test nos permitiria confrrmar la incidencia de esos factores.
Una primera posibilidad es, por supuesto, una inspeccion de la curva (tabla) de frecuencias de los
datos, que nos revelara si los datos se distribuyen de una forma uniforme en tomo a una media, o si por el
contrario, la distribucion muestra conjuntos de datos separados entre si. Esta apreciacion visual puede
materializarse en dos parametros cuantitativos utiles para evaluar si la distribucion es significativamente
diferente de la normal. Estos parametros son dos caracteristicas de toda distribucion poblacional (al igual
que la media y la desviacion estandar), pero estan relacionados con la forma de la distribucion.
El primero de estos parametros se denomina coeficiente de asimetria, h y mide la simetria de la
poblacion. Para cualquier atributo de una poblacion que se distribuya de forma simetrica, el coeficiente
de asimetria es 0, y su intervalo de confianza es
±
t raiz(6/n).
En
la distribucion gaussiana este parametro
es obviamente
0.
En las distribuciones con cola hacia la derecha, este parametro es mayor que
0,
y si la
cola es hacia la izquierda, menor que cero. Matematicamente esta relacionado con la tercera derivada
de la funcion de distribucion.
El segundo parametro esta relacionado con la cuarta derivada de la funcion de distribucion y se
denomina curtosis muestral.
La
curtosis mide la altura o grado de achaparramiento de una
distribucion. Poblaciones de datos con la misma media, desviacion estandar y coeficiente de asimetria se
pueden diferenciar en su curtosis. Una funcion de distribucion normal tiene una curtosis 3, las funciones
mas bajas, como la distribucion uniforme, tienen curtosis inferiores a 3, y las funciones de distribucion
mas altas (que concentran mas puntas en tomo a
la
media para una misma S) tienen curtosis superiores
a 3.
En
la practica, los programas estadisticos suelen trabajar con el coeficiente de curtosis muestral,
a
2
=curtosis-3, de manera que la gaussiana tenga su a
2
=0. El intervalo de confianza de este parametro es
±
t raiz(24/n)
Hay otras estrategias estadisticas de gran importancia para verificar si los datos de una poblacion
se distribuyen de acuerdo con una cierta distribuci6n de referencia (no solo con la normal). Estos tests
tienen una gran importancia en la formulaci6n y contraste de hipotesis y estan basados en el estudio de
las frecuencias acurnuladas. El objetivo basico es comparar las frecuencias acurnuladas observadas con
las esperadas en la distribucion de referencia, por ejemplo una distribucion normal. Los dos tests que
presentaremos son el de la chi cuadrado
X
2
y el test de Kolmogorov-Smimov. El primero esta basado
en
la distribucion chi-cuadrado que es una distribuci6n muy importante derivada de la normal y que se
emplea fundamentalmente en aquellas investigaciones en las que se mide la frecuencia con la que ocurre
un
cierto hecho (por ejemplo en investigaciones medicas). Desafortunadamente solo puede emplearse
cuando el ntimero de datos en el set es relativamente grande (habitualmente n>50). El test de
Kolmogorov-Smirnov es un test no parametrico (que no presupone que los datos se deban distribuir
normalmente) que puede emplearse en cualquier caso y que esta bas ado en
el
calculo de probabilidades.
Para aplicar el test de la chi cuadrado, segmentamos el set de datos en j intervalos consecutivos y
calculamos el ntimero de observaciones dentro
de
cada intervalo (frecuencia
Yi ·
A continuaci6n,
calculamos el
ntimero de observaciones esperadas por intervalo, t; Este ntimero de observaciones
esperadas por intervalo sera el correspondiente
al
que daria una distribucion normal (si
es
esta la
distribucion que queremos comprobar) y
lo
podemos obtener a partir de la tabla de Ia distribucion
z.
Posteriormente, calculamos el parametro
x
2
mediante la expresi6n:
x
=
_ _
J
[29]
Y comparamos este valor de chi cuadrado con la correspondiente distribucion con j-1 grados de
libertad. Una tabla chi cuadrado se encuentra
en
el
anexo. El ejemplo siguiente muestra Ia forma de
operar.
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48
V Ferreira·
42.- En el ami/isis de 50 vinos se han obtenido los siguientes valores de grado alcoholico. Se quiere
saber si podemos considerar que el grado alcoholico
de
un vino se distribuye de forma normal.
Muestra Grado Muestra Grado Muestra
grado
1 12,0 18 13,2
35
12,6
2 11,0 19
14,0
36
13,0
3 11,3
20
12,4 37 14,1
4 11,5 21 12,1
38
11,2
5 12,1 22 11,9
39
11,5
6 10,8
23
14,2 40 11,7
7 13,1 24 12,9 41 11,5
8 13,2 25 12,0 42 13,4
9
12,0 26 12,1
43 13,0
10
12,5 27
12,5 44 12,6
11
14,0
28
11,2 45 12,8
12 11,3 29 12,4 46 12,9
13
11,2
30
12,7
47 14,2
14
10,8 31 13,8
48
12,3
15 12,6 32 13,2
49
12,7
16
12,7
33
12,3
50 12,4
7 13,5 34 12,3
Lo primero que debemos hacer es ordenar los datos, y determinar el maximo, el minima, la
media y la desviacion estandar. El minima es 10,8, el maximo14,
2,
la media es 12,5 y la desviacion
0,9.
Ahara debemos determinar el numero de intervalos y su extension en que vamos a dividir a la poblacion.
Cuando el numero de elementos es muy grande n> 400) se suelen hacer 20 grupos. Cuando es mas
pequeno se calcula
Ia
extension de los intervalos dividiendo el rango
par Ia
raiz del numero de datos. En
nuestro caso (14,2-1
0,8/raiz 50)=0,48::::{),5,
y dividiremos
Ia
poblacion en los siguientes interval
as:
Intervala Free Intervala Free Intervalo
.free
10,5 a 11,0 2 12,0 a 12,5 12 13,5 a 14,0 2
11,0 a 11,5 6 12,5 a 13,0 11
14,0a
14,5 5
11,5 a 12,0
5
13,0 a 13,5 14,5 a 15,0
0
Lo siguiente es contrastar esta distribucion con
Ia
normal, para lo que debemos conocer cual
seria Ia frecuencia esperada en cada uno de los intervalas en una distribucion normal cuyo centro fuera
12,5 y su desviacion
0,9.
Esto
esfacil
de hacer,
ya
que lo unico que debemos hacer
es
convertir los datos
de cada intervalo en coordenadas
z.
Por ejemplo, el intervalo 10,5 a 11,0, se corresponde con el
intervala - 2,20 a -1,67 en coordenadas
z.
La probabilidad de este intervalo es 4, 75-1,39=3,36 . Como
tenemos 50 elementos, lafrecuencia esperada sera 1,
7
En
Ia
tabla siguiente se muestran estos calculos:
Izda int cha int Prob izq Prob. dcha free. Esp. fobservada cocientes chi
10 5
11 0 0 013 0 048 1 7
2
0 0
11 0 11 5 0 048 0 133 4 3 6 0 7
11 5 12 0 0 133 0 289 7 8 5 1 0
12 0 12 5
0 289 0 500
10 5 12 0 2
12 5 13 0 0 500 0 711 10 5 0 0
13 0 13 5 0 711 0 867 7 8 7 0 1
13 5 14 0 0 867 0 952 4 3 2 1 2
14 0
14 5 0 952 0 987 1 7
5
6 2
14 5 15 0
0 987 0 997
0 5 0 0 5
x2=
9 94
Como el valor critico de
;
para
7
grados de libertad es 14, 1, no puede decirse que la
distribuci6n no sea normal. Todos estos calculos se pueden realizar facilmente en una hoja de calculo o
directamente en un programa estadistico.
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ema
ntro uccwn
a a ., u m merna
43.- Un jefe de producci6n de
una
empresa quimica desea comprobar si la riqueza de una materia prima
que le suministra un tercero se distribuye de forma normal con una media 72,5 y
una
desviaci6n 2,5.
Para ella ha recopi lado los am:ilisis de los lotes de materia prima recibidos durante los dos ultimos anos.
Los
resultados, ya ordenados
par
recuencias son los siguientes:
Riqueza
No de casas
Menos de 70
8
Entre
70y
71 12
Entre 71 y 72
14
Entre 72 y 73
16
Entre 73 y 74
19
Entre 74 y 75
14
Entre 75 y 76
9
Mas de 76
1
Total 93
La distribuci6n chi tambien la podemos emplear para ver si nuestros datos se ajustan a cualquier
otra distribuci6n. Esto es muy util para determinar si sobre conjuntos de datos agrupados por frecuencias
hay factores que inciden de forma significativa.
44.- Se
ha
realizado un seguimiento del numero de averias observadas en un
ana
en cada 100
cromat6grafos de distintas marcas. Los resultados han sido 24, 17, 11 y 9 para las marcas A, B,
C
y D.
;,Puede asumirse que unas marcas
son
mas robustas
que
otras, o dichas frecuencias corresponden
al
azar?
Si
las averias ocurrieran
par azar
, esperariamos que
fueran
iguales
para cada fabric
ante y
podriamos
suponer que
el numero de averias observada al ana sigue una distribuci6n
normal
con Ia misma
media
en todos los casas y una cier ta desviaci61}. Una estimaci6n de dicha media es el promedio de averias par
fabricante: (24+ 17+ 11 +9)/4=61/4=15,25
Como
en este
caso
nuestra hip6tesis nula es que el numero de roturas
par
fabricante y
ana
es el mismo
para todos los
fabric
antes, la frecuencia esperada es 15,25.
Ahara
se construye la tabla
chi
como anteriormente
Fabricante Free. Observada
Free. Esperada
Cocientes chi
A
24
15,25 5,020
B
17
15,25 0,201
c 11
15,25 1,184
D 9 15,25 2,561
~
8,966
Como
el valor critico e ~
para
3
grados
de libertad es 7,81,
queda
demostrado que
las
averias no
han
ocurrido puramente par azar, y
par
tanto hay que concluir que las averias dependen del fabricante.
45.- Una industria tiene 5 tanques de reacci6n para la preparaci6n de un
mismo producto
, y
se
desea
saber
si
los tanques funcionan de forma similar.
Para
ella se ha medido el numero de veces que ha sido
necesario interrumpir la operaci6n de
cada
tanque a lo largo de 2 anos de trabajo (10 veces el tanque
1
15
el 2, 8
el
3
19 el
4 y
22 el
5). Determina
si
hay evidencias de que unos tanques funcionan
pear
que
otros.
Por ultimo veremos la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se trata de una prueba sencilla en la que
lo que se comparan son las curvas de frecuencia acumulada entre la distribuci6n esperada que puede ser
la normal, o puede ser otra distinta) y la distribuci6n esperada. Ellistado
e
datos se ordena de menor a
mayor y se calcula para cada data su frecuencia relativa acumulada frecuencia observada). A
continuaci6n, se calcula la distancia z de cada data y la frecuencia relativa acumulada correspondiente a
dicho z frecuencia esperada). Finalmente se computa la diferencia entre los valores de frecuencia
observada y esperada. La diferencia maxima se compara con el valor critico que se muestra en las tablas.
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50
V Ferreira ·
Veamos su aplicaci6n con un ejemplo.
45bis.- nuna industria de sintesis un cierto producto se fabrica por lotes. Se ha medido Ia
riqueza de los ultimos 10 lotes y se
de
sea saber si Ia variable riqueza sigue una distribuci6n normal. Los
datos han sido:
10,5 14,9 9,8 9,6 9,3 10,2 8,8
9 1
15,3 13,8
(media= 11,13 desviaci6n=2,51)
La
hip6tesis nula es que
Ia
distribuci6n es normal con media 11,13
y
cr=2,51. Los datos se ordenan
y
se
presentan como en
Ia
tabla mostrada a continuaci6n
Datos
ordenados
8,8
9,1
9,3
9,6
9,8
10,2
10,5
13,8
14,9
15,3
Frecuencia Frecuencia
acumulada acumulada
observada
z esperada
10,0 -0,93 17,7
20,0 -0,81 21,0
30,0 -0,73 23,4
40,0 -0,61
27,2
50,0 -0,53 29,9
60,0 -0,37 35,6
70,0
-0,25 40,1
80,0
1,06
85,6
90,0 1,50
93
,3
100,0
1,66
95,1
Diferencia maxima=29 9
Diferencia critica=24,1 (a.=0,05)
diferencias
7,73
0,99
-6,64
-12,8
-20,1
-24,4
-29,9
5,56
3,29
-4,88
Por tanto, se rechaza Ia hip6tesis nula
46.- Estudia los valores de absorbancia
del
ejemplo 4 pagina 21), y aplicando Ia
prueba
de
Kolmogorov-Smirnov, determina
si
se
distribuyen de
forma
normal.
Distribuci n e referencia
A
H
I L
0,11
dm x
1
~ / ---.....
f.?.
........
........
~ n . . ,
.......
Distribuci n experimental
n
-2 -1 ,5
-1
-0,5 0 0,5
1
1,5 2
coordenada z
47.- Aplica el test de Kolmogorov-Smirnov para verificar silos
2
primeros datos de contenido en grado
alcoh6lico
del
ejercicio
42
se distribuyen de
forma
normal.
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Tema 2. Descomposici6n de Varianzas y aplicaciones
analiticas
1 Concepto
y
utilidad
El analisis de la varianza ANOVA)
es
una poderosa tecnica estadistica utilizada para
separar y estimar las distintas fuentes de variacion que acruan sobre un cierto conjunto de
datos y determinar cuales de ellas ejercen un efecto suficiente como para influenciar el
conjunto de datos por encima del error aleatoric o experimental achacable a todo proceso de
medicion. La forma de trabajar del ANOVA es una forma un tanto peculiar y diferente
ala
que hemos visto hasta ahora, pero hay varias razones por las que interesa conocer bien sus
fundamentos.
• n primer lugar porque la forma e pensar ANOVA esta ligada
ala
forma en la
que han de conducirse las experimentaciones, cualquier experimentacion, lo cual
es de necesario conocimiento para cualquier quimico o cientifico experimental. La
contribucion mas importante del ANOVA y del analisis factorial es que cualquier
diseiio experimental debe permitir una adecuada evaluacion del error experimental
o aleatoric.
• En segundo lugar porque el ANOV A nos va a proporcionar una herramienta para
realizar comparaciones mucho mas complicadas que las que nos permiten los tests
estudiados en el capitulo anterior. Los tests z o t que vimos en el capitulo anterior
solo pueden emplearse para comparar un par de resultados, ahora podremos
comparar toda una serie.
• n tercer lugar, porque el ANOVA y su manera de plantear un problema forman
parte de un gran ntimero e tecnicas y tests estadisticos empleados para establecer
modelos acerca del comportamiento de la realidad. Muchos de estos modelos los
necesitaras en tu desarrollo profesional, cualquiera que sea tu especialidad, y
necesitas estas familiarizado con su estructura y forma e uso.
• En cuarto lugar, porque el ANOVA nos va a permitir conseguir llevar a cabo
alguna de las tareas mas importantes para alguien que trabaja con metodos de
analisis:
lade
separar las fuentes
e
incertidumbre que intervienen en la formacion
de incertidumbre del resultado final. En particular nos permitira distinguir la
incertidumbre debida a la medicion de la debida al muestreo, y nos permitira
diseiiar como
hade
realizarse el muestreo, o como hay que mejorar la medicion
para ajustar la incertidumbre a una requerida.
2. Fuentes e variacion
En cualquier conjunto de datos que podamos considerar resultados replicados de
varias muestras analiticas distintas, el conjunto de los resultados del comportamiento de un
reactor durante un tiempo, los datos de contenido en cierto componente de un grupo de
personas, ... ), nos encontraremos con que no todos los datos son iguales, sino que habra una
serie de diferencias entre ellos. Dicho de otra forma, en todos los casos existe una dispersion
del parametro e interes en el conjunto de la poblacion y,
si
se cumplen los presupuestos de
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54 V. Ferreira
normalidad, dicha dispersion se podria medir a traves
de
la desviacion estandar de todos los
elementos del grupo. Podemos imaginar esa dispersion como el resultado aditivo
de
la
presencia
de
las distintas fuentes
de
variacion que acruan sabre dicho grupo
de
datos.
Tomemos como ejemplo el conjunto de pares de datos obtenido del seguimiento de un
reactor industrial durante varios dias y en varios puntas del reactor (los datos indican
rendimiento
en ):
dia 1 dia 1 dia 2 dia 2 dia 3
dia 3
replica 1
replica 2
replica 1 replica 2
replica 1 replica 2
punta A
26 27 32 32 28 27
punta B
30 29 35 36 33 32
punta C 27 27 29
30
28
28
La variabilidad de dicho conjunto de 18 datos es debida a las siguientes fuentes de
variac
on:
1.
la que hay entre replicas, que es la variabilidad analitica. Esta fuente de variacion
se denomina error experimental o error aleatorio, o simplemente error.
2. la heterogeneidad existente entre las distintas partes del reactor (variabilidad
muestral). A esta fuente de variacion
la
podemos denominar factor espacio o
muestral.
3. la variabilidad del estado de reactor en el tiempo (que es el data que nos interesa).
A esta fuente de variacion la denominaremos factor tiempo.
Par tanto, podemos afirmar que la variabilidad total observada en el conjunto
de 18
datos es debida a la suma de las contribuciones de estas tres fuentes de variacion . Como
ya
sabemos como se propagan o combinan errores aleatorios o variabilidades, sabemos que la
varianza
total=
suma de varianzas analitica, muestral,
de
factor.
La obtencion de la variabilidad del reactor en el tiempo no se puede hacer
de
forma
directa (cogiendo las medias de los 6 resultados de cada dia),
ya
que las variaciones entre
dichas medias tambien seran debidas en parte a las variabilidades analitica y muestral. Pues
bien, el ANOVA, nos permitira ser capaces
de
obtener las distintas fuentes
de
variacion,
de
compararlas entre si, y
de
determinar si dichas fuentes de variacion tienen una repercusion
real y significativa en el sistema en estudio.
En general, las fuentes
de
variacion encontradas en un conjunto de datos son:
• La debida a los errores aleatorios en la medicion (SIEMPRE EXISTEN)
• La originada par otros factores aleatorios (variabilidad espacial, variabilidad
temporal. ..
.
• La originada par la presencia de uno o varios factores de efecto fijo o controlado
(temperatura, tiempo, almacenamiento .. ), cualquier factor que podamos modificar
y que es objeto de estudio.
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3.-
escomposicion de las distintas fuentes de variacion del ejemplo del reactor
Las 3 fuentes de variacion que
actUan
sobre el reactor pueden ordenarse segtin su
facilidad para ser aisladas. La variacion analitica (precision) es la que mas facilmente se
puede aislar, ya que basta realizar una serie de medidas repetidas de una rnisma muestra para
deterrninarla. La segunda de ellas es
la
causada por la heterogeneidad del reactor. No es
posible conocerla si antes no hemos deterrninado la analitica,
ya
que para medir la
heterogeneidad hemos de tomar muestras
de
distintas partes del reactor y analizarlas, por lo
que los datos en los que nos basamos llevan incluida la incertidumbre derivada de la
imprecision analitica. Finalmente, la variabilidad temporal del reactor es
lamas
compleja en
el sentido de que para poder deterrninarla hemos de conocer previamente las otras dos, ya que
inevitablemente para comparar la composicion del reactor en dias distintos hemos de tener en
cuenta la heterogeneidad muestral y la imprecision analitica.
Este hecho es el que motiva el diseiio experimental aplicado en este caso. Se hacen
replicas analiticas de cada una de las muestras extraidas del reactor para poder deterrninar
previamente la variabilidad analitica, y cada dia se toman 3 muestras del reactor para poder
medir la heterogeneidad muestral. A este disefio experimental se le denornina FACTO RIAL.
En este caso de dos factores (factor espacio y factor tiempo).
Veamos como se deterrninan las distintas variabilidades.
a)
Aislarniento de la variabilidad analitica
De cada una de las 9 muestras
3
par dia) extraidas del reactor se han realizado dos
analisis.
Par
tanto, en ausencia de errores sistematicos o crasos, las diferencias que existan
entre cada par de replicas han de deberse entera y exclusivamente a la imprecision del metoda
analitico. Esto es, cada una de las 9 desviaciones estandar calculadas a partir de las 9 parejas
de replicas analiticas rnide el rnismo parametro: la imprecision analitica. Por tanto, la mejor
estimacion de
la
variabilidad analitica la obtendremos si ponderamos esos 9 valores.
Sustituyamos cada pareja de datos por una media y calculamos su desviacion estandar, con lo
que la tabla de datos original queda de la siguiente manera:
Dia 1*
Dia2 Dia3
Punta A
26,5 (0,707)
32,0 (0,000) 27,5 (0,707)
Punta B
29,5 (0,707) 35,5 (0,707)
32,5 (0,707)
Punta C
27,0 (0,000) 29,5 (0,707) 28,0 (0,000)
Entre parentesis se dan los valores de desviaci6n estandar.
Y ahora agrupemos las 9 desviaciones estandar como
ya
sabemos:
Este dato estima la variabilidad analitica con 9 grades de libertad.
b) Aislarniento de la variabilidad muestral
Para deterrninar la variabilidad muestral hemos de comparar las medias obtenidas para
cada una de las tres muestras extraidas cada dia. Sin embargo, hemos de ser conscientes,
de
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56
V. Ferreira
que estas medias (por ejemplo 26.5; 29,5
y
27,0, para el primer dia), no difieren solo por
representar la composicion de tres muestras extraidas de distintas partes del reactor, sino
tambien como consecuencia de la imprecision analitica en su determinacion. Para verlo claro
piensa
en
que hubieras cogido una Unica muestra
y
la hubieras analizado tres pares de veces.
Las tres medias no tendrian porque ser iguales, y de hecho el teorema central del limite nos
dice que la desviacion estandar de esas tres medias sera
la
de la poblacion original dividida
por la raiz del nllinero de elementos que componen esa media. Esto es, si la composicion no
variara espacialmente dentro del reactor (la variabilidad muestral es cero), la varianza de las
medias seria = ?{ . or otra parte, sabemos que el intervale de confianza de cada una
de las medias viene dado por
la
expresion,
donde f l se refiere al valor cierto de composicion de la muestra analizada. Por el contrario, si
la
variabilidad analitica fuera cero, las medias obtenidas
en
el analisis replicado (las replicas
serian iguales en este caso) serian justamente el valor cierto de composicion de cada una de
las muestras extraidas. n ese caso, esta claro que la varianza de estas tres medias seria la
varianza muestral, s nd
=
s?n o .
n
el caso general en que ni
la
variabilidad analitica
sea
cero
(que nunca lo es), ni la muestral sea nula, la desviacion estandar que obtenemos de las tres
medias (26,5; 29,5 y 27,0), sera una estimacion de la variabilidad muestral aumentada en la
analitica corregida por dos.
En concreto:
2
2 2
Sa
s -
md mto 2
Ahora bien, esta observacion se repetira en los tres trios de medias que tenemos (un
trio por dia), por lo que la mejor estimacion de la desviacion de las medias (y por tanto de la
muestral) sera la combinacion de las tres. Vamos a hallarlas, reduciendo la tabla anterior a
tres medias y tres desviaciones estandar:
Las de las medias ponderadas es:
Smd
=
1,607
2
3,014
2
2,754
2
=
2 53
3
Con 2 x 3=6 grados de libertad
Por tanto:
2
2
=
2
- Sa = 2 53
2
-
0
•
333
= 6 234 > = 2 49
S mto S md 2 2 S mto
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Cuya estimaci6n tiene tambien 6 grados de libertad.
Para calcular la variabilidad debida
al
factor tiempo, y al igual que hicimos antes,
podemos ahora escribir el intervale
de
confianza de cada una de las tres medias de la tabla
anterior:
2
tz
a
- md - -
mto
2
x_ t . f j - x _ t J3
Esto es, las tres medias de esta tabla son diferentes entre
s
por dos razones, una
porque corresponden a distintos dias (variabilidad temporal que quiero determinar), y otra
porque cada una viene afectada
de
una incertidumbre combinada
de
la muestral y la analitica.
(El mismo razonamiento de antes valdria: imagina que las tres medias procedieran
de
3
grupos
de
3 muestras analizadas por duplicado que hubieran sido sacadas en el mismo
instante)
La desviaci6n estandar de estas tres medias esta por tanto relacionada
de
la siguiente
manera con las tres fuentes de variaci6n:
2 2
2
=
2 Smto Sa: : :> 2
=
3
45
> =
86
Smd Stemp 3 6 Stemp Stemp
Moraleja: Todo disefio experimental tiene que permitir separar las fuentes de
variaci6n aleatoria
de
las que pueda producir el factor a estudio. Mediante un disefio
experimental adecuado, y si los presupuestos de normalidad se cumplen, el ANOV A nos
permitira aislar las distintas fuentes de variaci6n que acttlan sobre el conjunto de datos.
El disefio de experimentos debe tener en cuenta la existencia de todas las fuentes de
variaci6n que existen en un determinado sistema y tratar
de
obtener una estimaci6n de su
magnitud mediante el uso adecuado
de
replicas. A cada fuente de variaci6n que acrua sobre el
sistema se le denomina FACTOR.
AI
conjunto de variaciones aleatorias (que son las de
medici6n mas otras variabilidades ambientales) se le denomina habitualmente ERROR. Los
factores pueden ser de efecto fijo (que son los factores que habitualmente queremos estudiar,
por ejemplo el efecto
de
la temperatura o del pH en una reacci6n quimica, o el efecto
de
un
tipo
de
abonado
en
el rendimiento de una plantaci6n), o aleatorios, que son tipicamente los
relacionados con la heterogeneidad muestral y el muestreo (en terminos tanto de espacio
como
de
tiempo). El nfunero de valores
de
un factor que consideramos se denominan
NIVELES de dicho factor. Por ejemplo, si para evaluar el efecto
de
la temperatura
realizamos mediciones a tres temperaturas diferentes, el factor temperatura decimos que tiene
tres niveles. Para evaluar el efecto de un factor hace falta, como minimo, dos niveles.
AI
tipo de disefio experimental derivado del reconocirniento de la existencia de
factores y de la necesidad de aislar la influencia de los factores jerarquicamente inferiores, se
le denomina disefio factorial. El ejemplo con el que hemos comenzado el capitulo es un
disefio factorial complete de dos factores (espacio y tiempo ), ya que el tercer factor (error
experimental o aleatoric) no se cuenta porque siempre existe. Los factores espacio y tiempo
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58 V. Ferreira
tienen tres niveles. El nillnero total de experimentos es 3 puntos de muestreo) x 3 dias) x 2
replicas muestra) 18.
A continuacion vamos a exponer en detalle la forma en que el ANOVA trabaja en un
caso mas sencillo, aquel en el que solo hay un factor a estudio.
4. ANOVA e un factor de efecto fijo o controlado:
Supongamos que estamos disefiando un metodo analitico y decidimos estudiar el
efecto de una de las variables que tenemos bajo control, por ejemplo el pH. El interes de este
control viene determinado por la necesidad de determinar:
1.- .Con que exactitud y precision debo regular el pH para obtener una precision y
exactitud analitica adecuadas?
2.-
i Si
el pH ejerce un efecto significativo sobre la sefial analitica,
curu
es el valor
optimo de pH?.
Para contestar estas cuestiones he de tener en cuenta que cualquier medicion que haga
dependera no solo del pH factor controlado), sino tambien
de
la variabilidad analitica. Para
tener una idea real de la importancia del factor, debere ser capaz de computar el valor de la
variabilidad analitica. Para ello, planteo el experimento de la siguiente manera: voy a medir la
sefial analitica a 4 pHs distintos 3,20; 3,25; 3,30; y 3,35), realizando a cada pH 4 medidas.
Para evitar efectos indeseados en los resultados de mi tabla he de tomar una
precaucion muy importante, que es ALEATORIZAR el experimento. Esto quiere decir que
no voy a realizar las medidas siguiendo un orden cronologico ordenado, sino que lo hare de
forma aleatoria. Supongamos que puedo realizar 4 medidas por dia.
Si
realizara cada dia las
medidas correspondientes a un pH, mis resultados podrian venir afectados por un efecto
desconocido casual o aleatorio) del dia. Por ejemplo,
sil s
medidas a pH 3,20 las realizo el
lunes y ellaboratorio no esta bien termostatizado, podria ocurrir que las medidas de ese dia se
hubieran realizado a una temperatura inferior a las de los otros dias. Si la temperatura
ejerciera un efecto importante sobre la medida,
el
efecto de la temperatura se sumaria
al
del
pH, conduciendome a unas conclusiones erroneas. Este efecto podria atenuarse si cada dia
realizo medidas a todos los pHs. Si sigo un orden estricto empezando por
el
pH mas bajo),
resultara que todas las medidas a pH 3,20 se han realizado l misma hora, y antes que todas
las demas. Esto es arriesgado. De nuevo podria ocurrir que alglin factor no contemplado en el
disefio del experimento tiene efecto, complicandome la vida y haciendome llegar de nuevo a
conclusiones erroneas. Por ejemplo, si el pHmetro no lo recalibro de forma continua y solo lo
hago al comienzo de la jomada como se realiza en muchos laboratorios), podria haber un
sesgo constante en las medidas
de
los otros pHs.
Para conseguir una aleatorizacion real, y puesto que las replicas son independientes,
debo realizar medidas a los 4 pHs cada dia y decidir
de
alguna forma realmente aleatoria
el
orden en que se analizaran las muestras. En concreto, podria coger la baraja espafiola y
asignar las espadas al pH 3,20, bastos al 3,25, copas al 3,30 y oros al 3,35 , y decidir el orden
en que se realiza el analisis sacando las cartas. Obtenemos los datos de la tabla siguiente
unidades relativas). En superindice se muestra
el
orden en que se realizaron las medidas cada
dia.
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pH Rep 1
Rep
Rep3
Rep4
lunes) martes)
miercoles)
jueves)
3,20
8
8j
9
2
3
8 7
1
19e
3,25 8 8
1
19,0
4
8 7
2
8
6
3
3,30 8 6
2
8 5
2
8
4
4
8 7
4
3,35
8
8 0
1
8 1
3
7
9
1
Sobre este conjunto de 16 datos existen dos posibles fuentes de variaci6n
La
debida al
pH
cuya existencia he de comprobar)
La debida al error aleatoric de la medida que seguro que existe)
Otras fuentes no contempladas en el modelo que al haber aleatorizado el
experimento es de esperar se cancelen y queden incluidas dentro de los errores
aleatorios).
Nota: l haber aleatorizado, la variabilidad analitica
ya
no se refiere solo a la imprecision del metodo de
medida, sino que tambien incluye la variabilidad asociada a la variacion aleatoria de parametros ambientales que
puedan afectar al resultado de la medicion.
Este diseiio de experimentos es un diseiio Factorial complete aleatorizado en el que
consideramos 4 niveles del factor y 4 replicas. El nfunero total de ensayos es 4 pHs) x 4
replicas a cada pH)
=
16.
El Amilisis de
la
Varianza comienza el proceso de resoluci6n del problema
formulando la hip6tesis nula siguiente:
Todas las variaciones que aparecen en Ia tabla se deben solo a los errores a/eatorios
esto es: el pH ejerce una influencia NULA sabre e/ sistema).
A partir de este memento, el ANOVA
va
a seguir un proceso de descomposici6n de
varianzas similar al que
ya
realizamos anteriormente. En primer lugar calcularemos
la
varianza analitica ponderando las cuatro varianzas de los cuatro grupos de replicas uno
por
pH).
En
segundo lugar calcularemos la varianza de las cuatro medias de los cuatro grupos.
Esa varianza, de acuerdo con lo
que
expusimos anteriormente, deberia descomponerse de la
siguiente manera:
2
2 2 Sa
s +-
m
pH 4
Ahora bien, si la hip6tesis nula es cierta, entonces
SpH
es cero y la expresi6n anterior
se convertiria en:
2
2 Sa
Smd 4
Por tanto, si
la
hip6tesis nula es cierta,
la
varianza de las medias multiplica
da
por 4)
deber ser equivalente o sea no significativamente diferente) de la varianza analitica. Para
comprobar este extreme tan solo tendremos que aplicar un test F. Si el test F nos indicara que
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60 V. Ferreira
existen diferencias significativas entre ambas varianzas, esto quiere decir que la hipotesis
nula no puede ser cierta. Entonces y solo entonces podremos decir que hemos demostrado
que el pH ejerce una influencia significativa sobre
la
sefial analitica.
Una
vez demostrado
esto, se puede aplicar el test t para comparar entre las distintas medias.
Vamos a realizar el proceso paso a paso.
a) Estimacion de Ia
varianza
dentro de los grupos (determinacion de Sao, en general, de
S
0
.
En
este camino voy a tratar de calcular la variabilidad hipotetica total del sistema
midiendo exclusivamente las variabilidades aleatorias que en nuestro ejemplo en particular
estan relacionadas tan solo con
la
imprecision analitica. Calculo la varianza para cada
conjunto de cuatro medidas replicadas:
pH
media s
s2
3,20
18,95 0,238
0,0567
3,25
18,77
0,171 0,0292
3,30 18,55 0,129 0,0167
3,35
18,05 0,129 0,0167
Calculo ahora la media ponderada de todas estas varianzas, que es la mejor estimacion
de la variabilidad analitica, y si
la
hipotesis nula fuera cierta, seria tambien una buena
estimacion de
la
varianza de
la
poblacion original.
Esta estimacion tiene h (n-1) grados de libertad, siendo h el nillnero de grupos y n el
2 = S ~ = 0,0567 + 0,0292 + 0,0167 + 0,0167 =0 0298
a h 4
nillnero de elementos dentro de cada grupo. En este caso esta estimacion de
la
varianza
analitica tiene 12 grados de libertad.
b Calculo de Ia
varianza
entre grupos (Determinacion de Ia
varianza
de las medias y de
Ia
varianza
del factor). Las medias de los cuatro grupos son distintas entre si
por
dos
razones, en primer lugar porque se trata de medidas a distinto pH, y en segundo lugar porque
cada media representa al valor verdadero de
la
sefial a un
pH
determinado con una
incertidumbre asociada que es ± t sa "Vn (de acuerdo con el teorema central del limite). Por
esta razon, la varianza de las medias tendria que ser
s d
=
s H ~ a =
0,152
Teniendo esta estimacion h-1= 3 grados de libertad. Ahora bien, bajo la hipotesis nula Sp es
cero, por lo que si la hipotesis nula es cierta: s;d =
s;
y
4
2
Sa 0,152 X 4 = 0,609
A este valor 0,609 se le denomina
varianza entre
grupos.
c) Comparacion de ambas varianzas. Basta con aplicar el test F para demostrar que la
varianza entre grupos es mayor que la varianza dentro de grupos:
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=
0
•
609
= 20 44
3
2
0 0298
El valor critico encontrado
en
las tablas de F
para
una cola
ya
que solo nos interesa
comprobar si
la
varianza entre grupos es mayor que lade dentro de grupos) es 3,49.
Por tanto la varianza entre grupos es significativamente mayor que la varianza entre
grupos y eso quiere decir que la hipotesis nula es falsa, esto es; que el factor controlado p
ejerce una influencia significativa y real sobre el sistema.
En
concreto sabemos que la variabilidad asociada al
pH
es:
2
2 = 2
_Sa=0152-0,0298=0144
Sp Smd
4 4
d Calculo de las diferencias minimas significativas
Una vez (y solo
una
vez) que se ha demostrado que existe
una
influencia significativa
del factor,
es
posible aplicar el test t para determinar que medias de grupos difieren entre si:
donde s es
la
variabilidad aleatoria calculada dentro de grupos. En el caso frecuente de que
n
=n2:
Puesto que
el
termino s (2/n)
0
•
5
es el mismo
para
todos los casos, y puesto que
la
tc es
la misma tambien
para
todas las medias,
en
Iugar de calcular
el
t experimental para cada par
de medias, lo que se hace es calcular la minima diferencia que tiene que haber entre las
medias para que pueda ser considerada significativa. En
la
ecuacion anterior el numerador se
convierte en D, y sustituimos
:e:
por el tc encontrado en las tablas con h (n-1) grados de
libertad):
D
= sV
h(n-1)
En nuestro caso:
=
X
2,18
=
0,27
Ahora podemos construir
una
tabla de doble entrada para calcular todas las diferencias
entre las medias, marcando
con
un asterisco las que sobrepasan D:
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6
V Ferreira
pH 3,2 3,25
3,3 3,35
pH
medias 18,95 18,775 18,55 18,05
3,2 18,95
0
3,25 18,775 -0,175
0
3,3 18,55 -0,4 -0,225
0
3,35 18,05 -0,9 -0,725 -0,5 0
Puede verse que de las cuatro medias de que disponemos, tan solo las diferencias entre
las medias correspondientes a las parejas de pHs 3,20 y 3,25 y 3,25 y 3,30 no superan la
Minima Diferencia Significativa, pero que entre 3,30 y 3,35 ya hay una diferencia
significativa y si la diferencia de pH es superior a 0,05 siempre hay diferencias. Por tanto no
solo hemos demostrado que el pH ejerce un efecto significative, sino que debe ser controlado
con una precision superior a las cinco centesimas para evitar que afecte de forma negativa a
la precision del metodo. En cuanto a cual es el pH optimo, si el objetivo es obtener una sefial
maxima, el pH mejor de los ensayados es el inferior.
5.- La tabla del Amilisis de Ia Varianza
El Analisis de la varianza se desarrollo en la primera mitad del siglo pasado de la
mano de Fisher. En esa epoca nose podia disponer de mas herramientas de calculo que de las
reglas de calculo y de las tablas de logaritrnos, por lo que es comprensible que se dedicara un
gran esfuerzo a la simplificacion de los calculos. Ese esfuerzo se concretaba en estrategias
operativas que yen formas de trabajar que han perdurado hasta hoy. En particular se evitaba
el trabajo con desviaciones estandar (para no tener que extraer la raiz) y aun con varianzas, y
se trabajaba con lo que se denomina cuadrados, tal y como se muestra a continuacion:
El numerador se denomina
suma de cuadrados.
s-
/L x; x ) ~
- l[ ------------
A la varianza se le denomina
cuadrado medio
La forma de operar la podemos ilustrar con el ejemplo que acabamos de ver acerca del
efecto del pH. La tabla de datos queda de la siguiente forma:
pH Rep 1
Rep Rep3 Rep4
medias
3,2 18,8
19,2 18,7
19 1
18,95
3,25 18,8 19
18,7 18,6
18,775
3,3 18,6 18,5 18,4 18,7 18,55
3,35 18,2 18 18 1 17,9 18,05
media global 18,58125
a) La variabilidad dentro de grupos se calcula restando
la
media de grupo a cada una
de las 4 replicas del grupo correspondiente:
pH Rep 1 Rep 2 Rep3 Rep4
3,2
-0
15 0,25 -0,25 0,15
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3 25
3 3
3 35
0 025
0 05
0 15
0 225
-0 05
-0 05
-0 075
-0 15
0 05
-0 175
0 15
-0 15
Al elevar al cuadrado cada una de estas diferencias se obtienen los correspondientes
cuadrados, y la suma de todos los cuadrados es lo que denominamos la suma de cuadrados
dentro de grupos:
pH Rep 1
Rep
Rep 3
Rep4
sumas
3 2 0 0225 0 0625 0 0625 0 0225 0 17
3 25 0 000625 0 050625 0 005625
0 030625 0 0875
3 3 0 0025 0 0025 0 0225
0 0225 0 05
3 35 0 0225 0 0025
0 0025 0 0225 0 05
Suma global 0 3575
Esta suma de cuadrados dentro de grupos tiene 12 grades de libertad. Al dividirla por
este dato obtenemos la varianza, que en la nomenclatura ANOVA se denomina cuadrado
medio:
Cuadrado medio dentro grupos es 0,3575/12=0,02979
b a variabilidad entre grupos la calculamos sustituyendo cada dato por la diferencia
que hay entre su media de grupo y la media global:
pH Rep 1 Rep 2
3 2 0 36875 0 36875
3 25 0 19375 0 19375
3 3 -0 03125 -0 03125
3 35 -0 53125 -0 53125
Rep3
0 36875
0 19375
-0 03125
-0 53125
Rep4
0 36875
0 19375
-0 03125
-0 53125
Al elevarlos al cuadrado y sumarlos obtenemos los correspondientes cuadrados y
suma de cuadrados:
pH Rep 1
Rep
Rep 3
Rep4
cuadrados
3 2 0 13598 0 13598
0 13598 0 13598 0 54391
3 25 0 03754 0 03754 0 03754 0 03754 0 15016
3 3 0 00098 0 00098 0 00098
0 00098 0 00391
3 35 0 28223 0 28223 0 28223 0 28223
1 12891
1 82688
Esta suma de cuadrados entre grupos tiene 3 grados de libertad. Como anteriormente,
al
dividir la suma de cuadrados por los grados de libertad obtenemos el cuadrado medio entre
grupos:
Cuadrado medio entre grupos = 1 82688/3=0,60896
Dato que coincide con la varianza entre grupos anteriormente calculada.
El cociente F coincide con el cociente entre el cuadrado medic entre grupos por el
cuadrado medic dentro de grupos:
F=0,60896/0,02979=20,4405, con 3 y
2
grados de libertad.
Todos estes resultados se ordenan
en
una tabla como la siguiente que es la tradicional
tabla de analisis de la varianza, yes
la que nos proporcionara cualquier programa estadistico.
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64
V. Ferreira
Fuente de variaci6n
Grados de
Sumade Cuadrado Medio F
Libertad
Cuadrados
Entre grupos
3 1,82688
0,60896 20,4405
Dentro grupos error)
2
0,3575 0,02979 P=0,0001
TOTAL
5
2,18438
La fila encabezada por TOTAL, es Uri calculo de la variabilidad total del sistema.
Como es facil de comprender, esta variabilidad es simplemente la suma de los cuadrados de
las diferencias entre cada uno de los 16 datos individuales
y l
media global,
y
se calcula tal
y
como se explic6 anteriormente. Primero calculamos las correspondientes diferencias:
p Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4
3 2 0 21875 0 61875 0 11875 0 51875
3 25 0 21875 0 41875 0 11875 0 01875
3 3 0 01875 -0 08125 -0 18125 0 11875
3 35 -0 38125 -0 58125 -0 48125 -0 68125
Y luego los cuadrados
y
sus sumas:
p Rep 1
Rep Rep3 Rep4
cuadrados
3 2 0 04785 0 38285
0 01410
0 26910 0 71391
3 25 0 04785 0 17535 0 01410 0 00035 0 23766
3 3 0 00035 0 00660 0 03285 0 01410 0 05391
3 35 0 14535
0 33785
0 23160 0 46410
1 17891
2 18438
6. l modelo subyacente al ANOVA
Siguiendo en detalle lo que hemos hecho al aplicar la estrategia clasica, se pone de
relieve que basicamente lo que hemos hecho ha sido descomponer el conjunto de datos
originales en una media global, una contribuci6n debida al pH
y
un error o residual. Por
ejemplo, el primero de los datos replica 1
de
pH 3,20)
lo
hemos descompuesto de la
siguiente forma:
18,8 = 18,581+0,3687-0,15
18,581 es la media global, 0,3687 es la contribuci6n o efecto del pH 3,20
y
-0,15 es el
residual, que no es mas que la diferencia de ese dato con respecto
l
media de grupo. La
suma 18,581 +0,3687=18,95 es el valor estimado por el ANOVA para una medida realizada a
pH 3,20. Los estimados se denotan por y
Esto puede generalizarse para los 6 datos del ejemplo:
De forma que el dato yij que corresponde al dato
n°
j del tratamiento pH) i, puede
considerarse como la media global, mas la contribuci6n del tratamiento pH) i
correspondiente, mas su termino de error o residual. En terminos matriciales:
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[
18 8
18,8
18,6
18,2
0 bien,
19,2 18,7
19,0 18 7
18 5 18 4
18,0
18 1
[
0,219
0,219
0,019
-0,381
19
,11 [18,58
18 6
18 58
18 7 18 58
17,9 18 58
0,619
0 119
0,419 0,119
-0 081 -0,181
-0 581 -0,481
18 58 18 58
18 58 18 58
18 58 18 58
18 58 18 58
18 58
1
r
0 37
0 37 0 37
0 3
7
1
r-0,15
0 25 -0,25
0,225
07
5
-0 05 -0,15
18 58 0 19
0 19 0 19
0 19 0,025
18,58 -0 03 -0 03 -0 03
-0 03
0 05
18 58 ,53 -0 53 -0 53
-0 53
0 15
-0 05 0 05
0,519
1
r 0 37
0,019 0 19
0 119 -0 03
- 0 681 - 0 53
0 37 0 37
0 19
0 19
-
0 03
-0 03
-0 53 -0 53
0 3
7
1
r-Q,l5 0 25 -0,25 0 15
1
0 19 0,025 0 225 075 175
- 0,03 0,
05
- 0 05 - 0 15 0 15
-0 53
0 15
-0 05 0 05 -0,15
0 15 1
-0,175
0 15
-0,15
Donde la primera de las matrices ahora contiene los diferencias entre cada dato con la
media general. Al elevar al cuadrado cada uno de los elementos de las matrices y hacer
la
suma, obtenemos las correspondientes sumas de cuadrados, que cumplen
la
igualdad:
2,1843
=
1,827 0,357
lo que se corresponde con los mismos datos contenidos
en
la tabla ANOVA.
El modele ANOVA,
por
tanto es
un
modele aditivo simple, que nos permite
descomponer cualquier conjunto de datos en
la
contribucion de los distintos factores que
sobre ellos inciden y en
un
termino residual. Desde el punto de vista aritmetico,
la
descomposicion anterior se puede aplicar a cualquier conjunto de datos, pero esto no quiere
decir que
la
aproximacion ANOVA sea valida.
En
principio, esta aproximacion es valida en
l
caso en que los datos de poblacion original procedan de 4 subsets de distinta media y la
misma desviacion tipica. En ese caso, el modele ANOVA permite reducir el conjunto de
datos inicial a la aportacion de cada tratamiento por lo que de ser cierto, podriamos prescindir
tanto de los residues como de los datos originales y concentrar nuestra atencion en el efecto
de los tratamientos.
En
la practica, seria imprudente realizar esta simplificacion sin mas
comprobaciones,
ya
que los datos pueden venir afectados de fuentes de error no contempladas
en el experimento y que de conocerse harian variar de forma notable las conclusiones
extraidas sobre ellos, tal y como ya discutimos al hablar de la aleatorizacion.
Muchos de los efectos supyacentes que pueden afectar a la interpretacion real de los
resultados, pueden hacerse patentes al estudiar los residuales. Por ejemplo, si el tercer dia se
hubiera estropeado el pHmetro o
e
sistema de medida, los residuales obtenidos ese dia
podrian ser particularmente altos. Observa que esto solo lo podrias verificar caso de haber
aleatorizado completamente el experimento. En particular es precise estudiar:
La distribucion de los residues deberia ser
una
distribucion
aproximadamente normal con centro
en
cero
La
relacion entre la magnitud del residue y
la
magnitud de la respuesta
que se estudia representando los residues frente a los valores estimados
por
el modele
La
distribucion con el tiempo de los residues
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66
V. Ferreira
Cualquier otra representaci6n de los residuos frente a una variable que
se
considere pueda ser interesante temperatura de laboratorio, analista, dia
de
la semana .. )
Histograma de los residuos:
Histograma residues
menor/igual- entre .{),15 entre .{),05 entre 0,05 mayor a o,15
0,15 .{),
05
0,05 0,15
lue
El histograma nos indica que en este caso, los residuos no parecen distribuirse
de
forma normal,
ya
que los residuos mas grandes son mas frecuentes. De hecho
10
de los
residuos tienen una magnitud superior a 0,149. Podemos aplicar alguna de las pruebas citadas
en el capitulo anterior para verificar la normalidad. La curtosis muestral que a la vista del
histograma es el parametro que puede desviarse de la normal), arroja un valor de -1,18,
claramente por debajo del 0 esperado, lo que muestra que la distribuci6n es mas chata que la
normal. Sin embargo, el intervalo de confianza de este parametro raiz 24/n)) es 1,23, por
lo
que no podemos afirmar que la distribuci6n se aparta de la normal de forma concluyente. De
la
rnisma forma, la maxima diferencia entre las curvas de frecuencia acumulada observada y
la
normal te6rica 0,147-hazlo como ejercicio-) es bastante inferior al valor requerido para el
test de Komogovov-Srnimov 0,213).
La representaci6n
de
los residuos frente a los estimados se puede apreciar en la figura
siguiente:
realdualea va eaUmadoa
0,3
.
•
,2
.
•
.
0
1
. .
.
1
•
18,1 18,2 18,3 18,4
18,5 •
18,8 18,7 18,8 18,9
.
),1
.
• •
),2
.
. ),3
La figura tampoco muestra un comportarniento que podamos calificar de anormal,
aunque nos indica que los residuos tienden a hacerse mas grandes cuando los estimados son
may ores. De hecho, 6 de los valores residuales may ores de 0,14 corresponden a las medidas
realizadas a pHs 3,2 y 3,25, que son los que proporcionan seiiales mas altas. Ademas, los
Unicos
residuales que superan el valor 0,2 corresponden a estas medidas. Dicho de otra forma,
la distribuci6n no normal de los residuos parece deberse fundamentalmente al hecho de que
los residuos correspondientes a los estirnados mas altos son mas altos. La forma de la grafica
es tipica, ya que
se
puede apreciar que aparece una tipica forma de embudo con la abertura
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colocada
en
el lado derecho y sugiere que a mayor magnitud, mayor desviacion. Desde el
punto de vista analitico esto quiere decir que aunque la
mayor sefial se obtiene a un pH 3,20,
esta sefial es mas imprecisa. Sin embargo, todo esto se queda
en
observaciones, ya que las
diferencias entre las desviaciones a
pH
3,2 y 3,35 no son significativas, tal y como indica el
correspondiente cociente F:
Siendo el valor critico 9,27. Por lo que no tenemos pruebas de que dicha observacion
no sea debida a causas puramente aleatorias. Sin embargo, hemos obtenido
una
interesante
informacion que podriamos contrastar disefiando nuevas experiencias por ejemplo,
estudiando con mayor detalle lo que le ocurre a
la
precision analitica a dos
pHs
distintos), lo
que enriquece el proceso experimental.
reslduos
v
dlo
0,3
.
0,2
.
.
.
0,1
. .
•
0,5
1
1,5
a
2,5 3 3,5
4 5
•
. . .
•
.
La representacion de los residues frente al dia de la semana se muestra a continuacion:
En
esta representacion se puede apreciar que no hay un efecto importante del dia que
podamos achacar a causas no aleatorias. Para comprobar si el factor dia ejerce
un
efecto
significative
en la
magnitud de los residues, podemos realizar un ANOVA de un factor sobre
los residues. La tabla de ANOVA correspondiente se muestra a continuacion y de nuevo
confirma que el efecto no es significative.
Origen de las Suma de Grados de Promedio de
variaciones cuadrados libertad los
Entre grupos
Dentro de los
grupos
Total
0 081875
0 275625
0 3575
cuadrados
3 0 027291667 1 188208617
2 0 02296875
15
Probabilidad Valor critico
para
0 355507716 3 490299605
Como ejercicio haz la representacion frente al orden
en
que se hizo
la
medicion)
7.- Factor
e
efecto aleatorio teoria del muestreo
El factor de efecto aleatoric mas importante con el que se
ha
de enfrentar el quimico
es el derivado del muestreo. Noes posible analizar un estanque para deterrninar su contenido
en material organico, pero este debe ser conocido.
No
podemos analizar todas las pastillas
fabricadas
por
una industria farmaceutica, pero la cantidad de principia activo debe ser
conocida.
Lo
que hacemos entonces es tomar muestra que es Ia primera etapa del metodo
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68
V. Ferreira
analitico ), esto es, tomamos una pequefia fracci6n de la poblaci6n el estanque, o el lote de
pastillas constituyen l poblaci6n). A partir de esta muestra tomada estimaremos las
propiedades de l poblaci6n original. Por supuesto que esta muestra debe ser aleatoria, esto es
todos los individuos de l poblaci6n cada una de las pastillas, o cada una de las unidades de
volumen del estanque) tienen que tener la rnisma probabilidad de ser elegidos.
Para evitar ambiguedades en ellenguaje, a cada una de las fracciones de muestra la
llamaremos incremento de muestra, y al grupo de las fracciones muestra bruta. Como los
materiales el estanque, las pastillas), no son homogeneos, deberemos tomar varios
incrementos de muestra elegidos al azar. Estos incrementos, bien por
separado, bien despues
de mezclarse, senin analizados y el resultado del analisis sera la media aritmetica obtenida en
cuantos analisis se hayan realizado. Este resultado ira afectado de dos fuentes de
incertidumbre, l analitica y
l
muestral. Por consiguiente, para estimar la incertidumbre
global del resultado y por tanto para disefiar el proceso analitico 6ptimo mas adecuado, sera
preciso conocer ambas dos fuentes de variaci6n. El ANOVA puede utilizarse con el fm de
separar ambas fuentes de variaci6n.
Vamos
ver
su aplicaci6n con el siguiente ejemplo:
Deseamos deterrninar el contenido
en
principio activo de un lote de medicamento
formado por 1.000.000 de tabletas. Se tomaron para ello 10 tabletas elegidas al azar, y sobre
cada una de elias se realizaron 3 medidas del principio activo por una tecnica cromatografica.
Tableta
e
medicion
a
medicion
3a
medicion
1 2.92
2.98 2.97
2
3.02 3.06 3.00
3 3.10 3.01 3.08
4 2.87 2.91
2.83
5 2.82 2.85
2.84
6 3.11 3.14
3.08
7
3.14
3.16 3.18
8 3.09 3.07
3.13
9 3.19 3.14 3.19
10 2.82
2.80 2.78
Estimacion de
Ia
varianza dentro de los grupos replicas analiticas)
Esta varianza es debida tan solo, a los efectos aleatorios que acruan sobre l medida, y
no a los del muestreo. La calculamos como l media de las varianzas de cada una de las
1 2
=10
L xij-xJ
=
0,95 ·10 3
triadas de datos:
con 20 grados de libertad.
Estimacion de
Ia
varianza entre los incrementos de muestra.
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Esta varianza es debida tanto a los efectos aleatorios que actuan sobre la medida como
a la variabilidad existente entre los incrementos de muestra y que es consecuencia del
proceso de producci6n industrial, son diferencias reales). La calculamos como la varianza
entre las medias de las triadas de datos con 9 grados de libertad):
Como
ya
sabemos, esta varianza de las medias es debida
l
variabilidad muestral
2
md =
0,0184
real que bajo la hip6tesis nula es despreciable) aumentada en la variabilidad analitica
corregida por el nlimero de replicas de cada media:
Ahora bien, si la hip6tesis nula es cierta,
La varianza entre grupos es por tanto,
2 2
Seg = md X
3
=
0,0552
Para comprobar estadisticamente que las variaciones originadas por el muestreo no
son despreciables, basta con aplicar el test F a estas las varianzas entre grupos y dentro de
grupos:
=
0,0552
=
5
8
0 95 ·10-
3
,
,
Siendo el F critico para 9, 20; 2,393, por lo que queda demostrado que la
heterogeneidad muestral ejerce un efecto significative.
Descomposicion de a varianza total
De nuevo se tiene:
2
2 2 s 2
-3
d
=s
___ _
> s =
0 0184-0 95
·10 = 0,0181
m mto 3 mto
Errores en el muestreo estrategia de muestreo
Una vez que hemos deterrninado la varianza asociada al muestreo, junto con la
varianza analitica, podremos optimizar el esquema de muestreo mas analisis que mejor se
adapte a nuestras necesidades. Esto supone elegir cual es el esquema de muestreo mas
adecuado, deterrninar cuantos incrementos de muestra se extraeran del sistema y cuantas
veces se analizaran bien por separado, bien la mezcla bruta).
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70
V. Ferreira
r
esquema de muestreo: Como se indic6 en el ejemplo anterior:
Se
toman h incrementos
de muestra y cada incremento se analiza n veces. En esta estrategia se obtiene una media final
promedio
de l sh
medias
den
replicas. La varianza de la media de las medias es:
y el intervale de confianza de dicha media resultado final es
2
2 2
San
S
s -
md
mto
n
Donde
test
calculado con los grados de libertad con que se conoce la varianza de muestreo.
2 2
J l = X± S md = X± S
mto
San
Jii
h nh
En la practica, sin embargo, en lugar de emplear t emplearemos la distribuci6n z , ya que en
las operaciones en las que se estudia la variabilidad de un rimestreo se suele disponer
de
un
nillnero
de
grados de libertad lo sufientemente grandes como para que t y z sean
practicamente coincidentes.
° esquema de muestreo: Se toman h incrementos de muestra y antes
de
analizarse se
mezclan. De la mezcla se realizan n medidas. En este caso el resultado final es la media de las
n replicas analiticas realizadas sobre la muestra bruta o compuesta. El intervale de confianza
del resultado finales en este caso:
Donde igualmente t esta calculado con los grados de libertad con que se conoce l varianza
de muestreo.
Problemas:
2 2
J l = X±
S mto
San
h n
1.- Sabemos a
partir
de experiencias previas que
Ia
varianza debida al muestreo es 10 y
Ia
debida al
metoda analitico 4.(en unidades arbitrarias). Calcula
Ia
varianza de
Ia
media
para
los siguientes
esquemas de muestreo:
a) Se taman 5 incrementos de muestra, se mezclan y se realiza un ana/isis p or duplicado.
b Se taman 3 incrementos de muestra y se analiza cada una por duplicado.
c) Se taman 2 incrementos de muestra y se analizan
por
triplicado.
2.- Se desean conocer las varianzas de medici6n y muestrales del contenido de Nitr6geno Aminico de
un campo de soja. Para determinarlas se tomaron 5 muestras aleatorias de 10 g de soja , y se analiza
cada muestra por triplicado. Se obtuvieron los siguientes valores:
...... ....
.
... ~ ...... ..........
r
d i ~ i 6 ~
f
i ~ i ~ · · · · . .........
3
; . l
r·
· · _ · · _ · : · : · : · : - - · : ·
· · : · : · : · : ~ · : : : · : · : · c : : · : · : · : · : · · · : · : : : : : r § i : :.T·· ··· · : · : · : · : · : · : · : : · · : · : · : c : · ~ : ~ · : · : · : · : : : : :
~
: ; c : ~ ~ ~ : : ~ = : J
............ 13
........
...
J J.1,7
. ··i_····-······ .1. - - - - · · · - - - - - 1
9 l . .
}_Q,} .......................
................
n l _1,2 .. .
. ?,
?
........... J
u
.z J
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Determina la variabilidad achacable al muestreo y la causada por el metoda analitico.
Comenta los resultados y propon que estrategia de muestreo es la mas adecuada
para
mejorar los
intervalas de confianza de la media. ;,Merece la pena invertir tiempo y dinero
en
mejorar la precision
del ana/isis?
3.- En la puesta a punta de un proceso cromatografico se desea conocer con que exactitud y precision
se debe controlar la temperatura. Para ella se monitorizan los tiempos de retencion de los analitos a
distintas temperaturas, realizandose esta medida
por
triplicado. Aplicando el metoda de la minima
diferencia significativa determina que oscilacion minima de temperatura causa diferencias
significativas en los tiempos de retencion. Haz un estudio de los residuos.
[ : : : :
f ~ ~ P i . ~ q f . ~ i . q
___ _
1
a me_licion 2°
e d i c i 6
; · - ~ ~ ~ - - ~ ~ ~ i i i ~
~ j ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1
~ ? . _Q_Q __________________ __ _____ 5 } 2 __ _,;, .......... . ~ § ,,.....
• · · ~ ? . ~ . . 9 . . L i
5,39
1
5,38
~ L
J
.. ................. . .9.
5,
3
§ 5,
3 9 - - - - - - - - - - - ~ } 2 ___________
L .
.
.
?. .U................
- ~ - - - - - - - - - - - _________________ 1 2 . __ ___
____ ;_
................
. . ~ 9 . . ......................
;
55,20 i 5,39 f 5,41
;
5,40
;
------------·----·5
---
5
---
,
-
2---5
---·---------------·-r--------_
5. ._,-_4
_
2
-_------- i.·
-------5 4-0-------------T----- ............5
.........
1.......................
. . . - - - - - - - - - _______ ..:;, ...........................
55,
3
o
·
..........
1 . 2
i
5,
4 2
1
_________
}
..
1
.
L
...______
j
55,35
1 . . ? . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . 5,45 _______?..r1.1. _______
_j
4.- Los siguientes resultados muestran el porcentaje del agua intersticial total recuperada al
centrifugar muestras de piedras areniscas tomadas de diferentes profundidades.
Profundidad
m)
Agua recuperada 0/o)
7
33.3 33.3 35.7 38.1 31.0 33.3
8
43.6 45.2 47.7 45.4 43.8 46.5
16
23 72.5 70 .4 65.2 66.7 77.6 69.8
Demuestre que el porcentaje de agua recuperada difiere significativamente de diferentes
profundidades. Uti/ice el metoda de la menor diferencia significativa.
5.- Resuelve aplicando el ANOVA ·el problema 33 del tema
1.
Haz un estudio completo de los
residuos.
6. El departamento de control de residuos
y
medioambiente de una gran empresa qufmica
tiene que determinar cual es
Ia
cantidad vertidapar ana de un cierto contaminante. Para ella
monitoriza el ejluyente a lo largo de varios meses, realizando controles una serie de dfas
aleatoriamente distribuidos) en cuatro distintos puntas de toma de muestra. Los resultados
se muestran a continuaci6n:
Dia
Punta Punta
Punta C
Punta D
1
2,2
3,5 2,7 1,9
2
3,6 2 2,4 3,3
3
4,9
4,1
5,4 5,2
4 4,3 5,1
3,6 5
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72
V Ferreira
5
1,7
3,3
2,5 2,9
6
4,5
6,3
4,7 4
7
3,8
3,2
2,3 2,9
8
3,3
2,8
4,2
4,1
9 5,7 5
4,2
5,1
10
5,3
4,2
4,7
3,9
Determina
a) ;,Cuantos puntas de muestreo se deberiancolocar para determinar la composici6n diaria
con un
10
de precision (a=0,05)?;
b)
Manteniendo el numero
de
puntas de muestreo inicial
4),
;,cuantos dias del afio debe monitorizar el efluyente
para
conocer la composici6n media
anual del vertido con una precision de ±0,5 (95 ) ?; c) como b pero con el numero de puntas
de muestreo determinados en a).
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Tema 3. Calibraci6n de Metodos Analiticos
1. Funciones de calibracion
Una gran parte de los analisis que se realizan en la actualidad emplean tecnicas instrumentales
tales como la espectroscopia de absorci6n ultravioleta-visible, absorci6n y emisi6n at6mica o
cromatografia de gases y
de
liquidos.
En
todas estas tecnicas, la muestra es sometida a un cierto
estimulo energetico y se mide la respuesta a dicho estimulo absorci6n de luz, emisi6n de luz,
diferencia de potencial, corriente electrica, cambio en el indice de refracci6n .. ). Dicha medici6n se
realiza mediante un dispositivo capaz de convertir dicha forma de energia en una sefial electrica que
puede ser procesada de forma digital. Por tanto, podemos decir que las tecnicas instrumentales
generan una sefial electr6nica que esta relacionada con la concentraci6n o masa de analito presente en
la muestra. La relaci6n existente entre la sefial y la concentraci6n o masa puede ser muy variable. En
algunos casos, como en la Absorci6n Molecular, disponemos de una expresi6n te6rica la ecuaci6n de
Beer) que nos relaciona ambos parametros. En otros casos, como en la mayor parte de los detectores
que se emplean en cromatografia de gases, no hay una teoria que proporcione una ecuaci6n
relacionando concentraci6n y sefial. No importa. Por la forma en la que se realiza el trabajo, lo mas
practico es realizar un calibrado del instrumento introduciendo disoluciones de concentraci6n
conocida, realizando su medici6n, y posteriormente generando una ecuaci6n empirica que relacione la
sefial con la concentraci6n. Incluso en el caso de la absorci6n molecular, en el que la ecuaci6n
es
conocida nadie suele ir a la biblioteca a buscar el coeficiente
de
absorci6n molar del analito en
cuesti6n, para aplicar la ecuaci6n
de
Beer y determinar la concentraci6n. Esto no es practico y no
funcionaria por la cantidad de parametros adicionales que no conocemos. Esta ecuaci6n empirica que
relaciona la sefial medida con la concentraci6n
es
fundamental en el analisis instrumental y la
podemos denominar
funcion de calibracion.
Para determinarla, lo mas frecuente es preparar una serie tipicamente entre 3 y 6) de
disoluciones de calibrado de estructura matricial disolvente, reactivos) lo mas parecida a la de las
muestras. Las disoluciones tendran concentraciones distintas y deberan cubrir todo el intervalo de
concentraciones que nos interese calibrar esto es, las muestras a analizar deberan tener
concentraciones comprendidas entre el calibrado mas diluido y el mas concentrado .
La
funci6n de
calibraci6n en la inmensa mayor parte de los casos es una linea recta.
En
primer lugar, porque en la
mayor parte de las tecnicas analiticas mas importantes la relaci6n entre la concentraci6n y la sefial
es
lineal en un cierto intervalo de concentraciones). En segundo lugar porque el procesado matematico
de funciones mas complejas es mas complicado y lleva asociada una mayor imprecision. En tercer
lugar, porque aunque la relaci6n sefiallconcentraci6n no sea lineal, probablemente podemos buscar un
intervalo pequefio en el que dicha funci6n pueda aproximarse por una linea recta. Si esto ultimo no es
posible o practico, se pueden emplear otras funciones de calibrado pero su tratamiento esta fuera del
alcance del presente curso
. - ---------------------------------------
0,6
0,5
senal medida en
Ia
muestra
0 1
concentraci6n determinada
~ ~ ~
~ ~ ~
0
5
10 15 20 25 30 5
concentrac 6n mg l)
Figura :
Tipica
recta de calibrado
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74
V Ferreira
Alternativamente, puede que una pequefia transformacion de la sefial o de la concentracion
nos proporcione la relacion lineal adecuada. Este es el caso de la Absorcion de luz, en el que la sefial
realmente medida no es la Absorbancia, sino la Transmitancia.
La
relacion entre la Transmitancia y la
concentracion es de tipo exponencial. El logaritmo cambiado de signa) de la transmitancia es la
Absorbancia, que guarda una relacion lineal con la concentracion. Los datos obtenidos en el analisis
de las muestras de calibrado se representan frente a la concentracion tal y como se indica en la figura
1. La
concentracion se coloca en el eje de abcisas, y la sefial en el de ordenadas.
Ese conjunto de datos se debe ajustar a una recta de ecuacion
y=
bo b
1
x para disponer de una
ecuaci6n que relacione la sefial con la concentraci6n. Cuando se analiza una muestra de concentracion
desconocida, lo que se hace es interpolar el resultado de Ia medicion esto es, Ia sefial pura o
transformada matematicamente) en dicha recta tal y como se muestra en
Ia
figura 1.
En este epigrafe vamos abordar de una forma elemental las siguientes cuestiones:
1.- ,Como podemos verificar si los datos obtenidos en el analisis de las disoluciones de
calibrado realmente se pueden ajustar a una recta?
2.- ,Como se construye la recta? ,que incertidumbre tenemos en su conocimiento?
3.- ,Cuai es Ia imprecision asociada a
Ia
determinacion de Ia concentracion de un analito en
una muestra empleando Ia recta de calibrado?
4.- ,Como se debe disefiar el proceso de calibracion y analisis para que la incertidumbre sea
minima.
5.- ,Que mas informacion relacionada con el metoda de analisis nos aporta la funcion de
calibracion?
2. Linealidad de a funcion de calibracion
Para averiguar si la relacion entre la sefial y la concentracion responde a una recta, lo mejor es
construir la figura correspondiente representando los pares de puntas sefial/concentracion obtenidos en
el analisis de las disoluciones de calibrado tal y como se hizo en la figura 1. Pero ademas, hay un
parametro estadistico que nos permite evaluar el grado de correlacion lineal entre dos variables. Este
parametro es el coeficiente de correlacion momento-producto o coeficiente de correlacion de Pearson.
Su expresion es la siguiente:
~ ] x ; - x) Y;- .Y ]
r ;
~ L x ; -x)2) L Y;
-.Y 2 ,
[1]
donde Xi e Yi corresponden a la concentracion/sefial del punta de calibracion i, y x e , son los
promedios de las Xi e Yi, respectivamente. El punta definido
par
las coordenadas
x
se denomina
centroide de la regresion.
Si dos variables estan muy correlacionadas esto es, si realmente y=cte x), su coeficiente de
correlacion es 1.
Si estan anticorrelacionadas y=-cte x) este coeficiente es -1, tal y como puedes
comprobar sin mas que sustituir en la ecuacion 1 cada valor de y
par
su correspondiente cte x. Si no
tienen ninglin tipo de correlacion, r es 0.
Tomemos los siguientes pares de datos: a) 1 ,2); 2, 4); 3, 6); 4, 8) y b) 1,6); 2, 2); 3, 8);
4, 4). La representacion de ambas series se puede vera continuacion:
r no es mas que un parametro estadistico empleado para medir la significatividad de la
9
9
R = 1+
8
•
7
6
•
6
.
5
R -
0
•
4
•
3
•
2
•
1
0 0
0
4
0
1
2
3 4
5
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correlacion entre dos variables. Para un geologo, la existencia de un coeficiente de correlacion r=O
,S
puede ser indicia de una importante correlacion entre dos variables. En quimica analitica, para
considerar poder emplear funciones lineales de calibracion satisfactorias, r debe ser mayor de 0,99, y a
veces incluso de 0,998. En cualquier caso,
es
conveniente siempre trazar la gratica porque incluso tras
coeficientes muy altos muy cercanos a 1) pueden esconderse tendencias no lineales importantes que,
sin embargo, son facilmente detectadas par supervision visual.
Se puede determinar Ia significatividad de una correlacion empleando el siguiente estadistico
t:
i
Jn-
t ~
a relacion entre la sefial y la concentraci6n no es lineal mas que en un cierto intervalo. El
interval a en el que la relacion se mantiene, se denomina rango lineal del metodo o del instrumento).
Obviamente, este intervalo es un parametro de calidad importante de los metodos y de los
instrumentos de analisis y debe ser conocido. Hay instrumentos de analisis para los que la relacion
lineal se mantiene a lo largo de varios ordenes de magnitud. Par ejemplo, el detector de ionizacion a Ia
llama FID) comunmente empleado en los cromatografos de gases mantiene una respuesta lineal
durante mas de 7 ordenes de magnitud desde 10 picogramos basta
0 1
mg). Sin embargo, el detector
de indice de refraccion empleado en HPLC raramente mantiene Ia linealidad a lo largo de mas de un
arden de magnitud. El que la respuesta generada par un instrumento o detector sea lineal no garantiza
que el metoda lo sea. Par ejemplo, aun empleando un FID como detector, el intervalo lineal de
calibrado puede ser muy reducido si el metoda de analisis esta basado en
Ia
inyeccion de los vapores
del espacio
de
cabeza en equilibria sabre un solido o un liquido.
I. - Estudia el comportamiento lineal de los siguientes pares de datos obtenidos en el ami/isis de un
mismo set de disoluciones de calibrado por distintos metodos de ana/isis y determina en todos los
casos:
a Ia validez del ajuste lineal, el intervalo de calibraci6n lineal y el coeficiente de correlaci6n-
b Caso de que el ajuste lineal no sea posible, determina si se trata de la inexistencia de
correlaci6n entre la senal y la concentraci6n, o a
la
existencia de un tipo de relaci6n
diferente a la lineal.
concentraci6n
OI
O
I5
0 2
0 26
0,3I
0,39
0,
45
0,
5I
0,57
Senali
I
I ,5
2, I
2 5
3,2
3 8
4, I
4,3
4,3
La recta de regresion
ey
sobre x
Sena/2
0 6
I 7
I ,4
2 5
3 8
3 6
4 I
5,3
5
7
Sena/3
I
I 6
2 I
2 8
3,5
4 9
5 8
7
9
Sena/4
2
4
3
I
5
8
4
2
4
Existen diversas formas de generar una recta que represente de Ia mejor manera posible una
serie de pares de valores. a mas comtin emplea el denominado metoda de los minimos cuadrados.
Se
denomina asi porque lo que hace es buscar aquella recta, de todas las posibles, para Ia que la suma de
los cuadrados de los residuos el residua es
Ia
diferencia entre el valor observado de
Yi
y el estimado,
Y; para todos los pares de datos Xi,Yi) sea minima. No nos vamos a entretener en su deduccion
matematica y presentaremos directamente las expresiones que nos permiten calcularlos:
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76
V
Ferreit a
pendiente
[ ]
ordenada en el origen
[3]
Conocidos ambos panimetros, para determinar la concentraci6n de una muestra desconocida,
no hemos mas que sustituir el valor de sefial obtenido en la medicion de la misma, y
0
, en la ecuaci6n
de la recta y despejar el valor de la concentracion,
XQ:
Yo bo
x
= [4]
bl
Esta es la denominada recta de regresion de y sobre x. Y aunque parezca extrafio, no es la
misma recta que se obtendria si representaramos Ia
c o n c e n t r ~ i o n
en ordenadas y Ia sefial en abcisas.
a
razon por la que esto es asi, es que
la
recta de regresion de y sobre x supone que la abcisa la
concentracion) se conoce de forma perfecta, sin imprecision,
y
que
la
imprecision esta asociada a la
medida, o sea a Ia sefial. Este supuesto se adapta bastante bien a Ia realidad de Ia medici6n
en
quimica,
ya que las disoluciones de Ia recta de calibrado se pueden preparar con mucha mayor precision de la
que la mayor parte de las tecnicas instrumentales de analisis proporcionan. Si representaramos Ia
concentracion
en
ordenadas y Ia sefial
en
las abcisas, estariamos bajo el supuesto opuesto, esto es,
estariamos considerando que el error mayor tiene Iugar en Ia estimacion de Ia concentracion de las
disoluciones de calibrado y que el de medicion es despreciable. Este supuesto no se corresponde con
Ia realidad.
Tanto Ia pendiente como la ordenada en el origen llevan asociadas una incertidumbre. Estas
incertidumbres se pueden computar en forma de varianza) como sigue:
primero se calcula
la
varianza media de los residuales,
L Y ; -
2
s
= __ __;
n-2
[5]
donde los
Y
son los valores estimados y n el nillnero de pares de puntos de l a recta de calibrado. Este
parametro es parecido a la varianza de una poblacion, con las siguientes variaciones: a) en Iugar de la
diferencia frente a la media, se computa frente al valor estimado; b) el numero de grados de libertad de
una regresion lineal son n-2 y no n-1, como es el caso en el calculo de una varianza muestral. Esto es
debido a que
en una
regresion se necesitan dos parametres pendiente y ordenada
en
el origen) para
definir el conjunto de datos.
A continuacion se calculan las varianzas asociadas tanto a Ia ordenada en el origen como a la
pendiente,
s ; ; ; = : :
o '( -)2
nL J X; x
[6]
[7]
Finalmente, Ia incertidumbre en Ia determinacion de
un
valor de concentracion por
interpolacion de la sefial obtenida en Ia medicion en Ia correspondiente recta de calibrado viene dada
por Ia siguiente formula:
sY
s
b
I
[8]
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donde m es el mimero de mediciones replicadas que se han realizado de la muestra problema, Yo la
seiial media obtenida en el analisis de la muestra, y n el nfunero de puntos en la recta.
Al
determinar
una
concentraci6n por
interpolaci6n en
la recta, su intervale de confianza viene definido
por
tanto por:
1.1.=
Xo
± n 2So
Donde Xo es el
valor
de
concentraci6n obtenido
por interpolaci6n en la
recta,
So es el
valor
de
desviaci6n obtenido
con la
ecuaci6n [8], y t es el estadistico con n-2 grados de libertad. Una
representaci6n de los
intervalos
de confianza
obtenidos con la
recta construida
con
los
datos
de la sefial 1 del problema 1
se muestra
a continuaci6n.
4. - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - -- - - - - -- - .
/
. ..-
3 5
, . L _ ..
Y o 1····················· · ···· ·············································· ·································· · ··· ··························
- ~
v(.--r
, . ~ / ~
2,5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -; / ; - ~ : . _ _ _ , . ' - ~
- + - -
--f-. - : - - - - - - - - - - -1
/ .. ..--
r - - - - - - - - - - - - - - - ~
~ ~
- - - - + - - - ~ - + - - - - - - - ~
. ..r _ / ,..
......"'
/
_ .. ..
1,5 - - - - - - - - - -/ ~ _ _ _ , . . 4 - _ , . . , . : . - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - l
/ .. ..--
/ /
/
interwlo de conftenza
, - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - t = : : : : ; = = : ; r - - - - - - - ~
+ - - - ~ - - - - . - - - - - - - - - ~ - - - - - -
- - ' - ~ T ~ - - ' - - - - - - - - - - - 1
0 0,
05
0,1 0,15 0
,2
0,
25
0,3
Xo
0,35 0,4 0,45
Concentracl6n
2.- Con los datos del problema I que se ajustan a una recta construye Ia correspondiente recta de
regresi6n calcula los intervalos de confianza tanto
de Ia
pendiente como de
Ia
ordenada en el origen
y determina Ia concentraci6n con sus correspondientes intervalos de confianza de una disoluci6n
cuya senal
p r Ia
tecnica I fue de 3 I5.
Una simple inspeccion visual de la ecuacion [8] y de la figura anterior nos permite extraer las
siguientes conclusiones acerca de la precision en toda medicion que emplee una recta de calibrado:
1.- Cuantas mas replicas de la muestra, mejor. Aunque a partir de 3 datos la mejora es
residual.
2.- El nfunero de puntos
en
la regresion juega un doble efecto en la incertidumbre de
una
concentracion interpolada. Por una parte afecta directamente a la imprecision S
0
,
y por otra
parte afecta a los grados de libertad con que conocemos t. Es conveniente que n sea por tanto
no inferior a 6.
3.-
La
cercania de la muestra al centroide de la regresion es muy importante.
La
maxima
precision se da en el centro.
efe to n puntas en regresi6n
0,2 -r-----------------
---------------
L
0,18 ---------,..........._: - - - - - - - - - - - - - - - - - -.--/
- 7 ' - - - - - - l
0
6
+-----------' --:
----::--------:=::::-----
-
0,14
.J-------------======:::::::::.-------------1
0,12 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~
0,1 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~
0,08 r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~
006 --------: , -----------------------:=------l
------------------
0,04
= = =
: : i ~ ~ i i m i i i i M m ; j ~ ~ = j
,02
0,5
1,5 2,5
S o ~ a l
3,5 4,5
- - - n = 3
-
---
n=4
n•5
- t--n=6
-n=e
-r\ '10
· - - ~ - - n=20
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78
V
Ferreira
Efecto
de
m (n=6)
0,04
0,035
0,03
m=1
0,025
- - - -m=2
m=3
0,02
M m=5
0,015
m=10
0 01
·· · ·· m=2
0,005
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5
Seftal
Algunos de esos efectos se visualizan en las figuras anteriores.
3.- Para investigar Ia posible existencia de efectos de Ia matriz en un metoda de ana/isis se han
realizado sendas rectas de calibraci6n en dos medias matriciales diferentes . Comprueba
si
hay
evidencias significativas de dicho problema aplicando el test t a las correspondientes pendientes y
ordenadas en el origen.
Concentraci6n Matriz I Matriz 2
10
8 7 13 2
15
10 6 15 3
20 12 6
17 5
25 14 4 19 5
30 16 5 21 7
35 18 6 23 7
4. El modelo subyacente a a regresion
4.1 Recta de Regresi6n
y
ANOVA
Desde el punto de vista estadistico, Ia recta de regresion esta muy relacionada con el analisis
de Ia varianza, porque como el, Ia recta de regresion es un modelo aditivo simple que nos permite
simplificar y predecir el comportamiento de un sistema natural. Como vimos en los epigrafes
anteriores el ANOVA nos permite separar las fuentes de variacion que intervienen en un sistema, de
forma que Ia variabilidad total se considera Ia suma de Ia variabilidad deb da al factor o a los
factores) mas Ia debida al error experimental. En el caso de Ia regresion ocurre algo muy similar.
La
variabilidad del conjunto original de datos se descompone en Ia explicable por el modelo lineal Ia
recta de regresion) yen Ia debida al error que es Ia varianza contenida en los residuales). Esto es, los
residuales son
Ia
parte de variacion del sistema original que no es explicada por Ia recta y constituye el
error aleatorio.
El modelo de regresion establece que un resultado dado,
Yi
se
puede descomponer
de Ia
siguiente manera:
yi=bo +
b1xi
+error= valor estimado
+valor
residual, Y = y +
£ ;
donde Y;=
b
+
h
1
X ; ,
o en notacion matricial:
Y
=
XB
+
R
=
Y
+ R donde
Y
contiene los datos de seiial originates es un vector columna),
B es
Ia
matriz horizontal que contiene los parametros de
Ia
regresion boy
bl),
X es la matriz que
contiene los datos de concentracion.,
Yes
un vector columna que contiene los valores estimados, y R
es otro vector columna que contiene los residuales.
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[
Y1]
[1 x1]
[ 1] [Y1] [ 1]
· · · = 1 · · ·
0
b
1
]
+ · · ·
=
· .·
·
+ · · ·
Yn 1 xn &n Yn &n
La variabilidad del conjunto de datos Y original, se computa como la
suma
de los cuadrados
de las diferencias de cada
i
frente ala media j i como de costumbre. La variabilidad retenida
por
el
modelo puede calcularse mediante
la
suma de los cuadrados de las diferencias de los valores
estimados frente al valor
j i
, y frnalmente
la
variabilidad no explicada por el modelo y englobada en el
termino error, se calcula como
la
suma de los cuadrados de los residuales.
En
terminos matriciales,
esto deriva de la igualdad anterior restando a ambos miembros j i :
Por lo que de forma exactamente igual que en el caso NOVA, se han de cumplir las
siguientes igualdades entre las correspondientes sumas de cuadrados:
Y; - ji
2
= Y;- ji
2
£
Y entre los correspondientes grados de libertad:
n-1=1 n-2
El
primer termino de los cuadrados se corresponde con
la suma
de cuadrados denominada
Total,
el
segundo es la suma de cuadrados
de la
Regresi6n, y
el
tercero el Residuo o Error.
De manera analoga al NOVA, en la regresi6n lineal tambien se formula una hip6tesis nula.
Esta hip6tesis es que la relaci6n observada entre los pares de datos xi.
Yi
es puramente aleatoria, no
existiendo efecto del factor concentraci6n en
la
magnitud de la sefial medida.
Para
aceptar o rechazar
dicha hip6tesis se calcula una F entre el cuadrado medio residual y el cuadrado medio
de
regresi6n y
los datos se ordenan como en la tabla de
NOV
A tradicional.
3.-
La
tabla de ANOVA obtenida para
Ia
regresion de
Ia
senal sabre
Ia
concentracion con los siete
primeros pares de datos del problema 1 se muestra a continuacion: [los datos son los siguientes:
0,1;
1),
0,15; 1,5), 0,2; 2,1), (0,2
6;
2,5), 0,31; 3,2), 0,39; 3,8), 0,45; 4,1)]
Sumade Gl
Media
F
fS ig.
ruadrados
'(::uadriztica
Regresion 7,983
1
7,983
409,472
000
Residual
9,747E-02 5
1,949E-02
Total 8,080 6
a Variables predictoras: Constante), CONCENTRACION
b Variable dependiente: SENAL
explica como se ha obtenido esta tabla y deduce las formulas para su cizlculo.
4.2. Descomposici6n
e
los residuales de
a
regresi6n
Hay dos posibles razones por la que los residuales pueden ser altos, y merece
la
pena saber
diferenciar entre ambas.
En
primer Iugar los residuales podrian ser altos si el metodo es impreciso,
aunque la linealidad sea muy buena.
En
segundo Iugar el metodo podria ser muy preciso pero ser poco
lineal. La unica forma posible de averiguar cual de estas dos causas es
la
responsable, o al menos de
saber
en
que proporci6n contribuyen ambas al tamafio de los residuales, es realizando h analisis
replicados de los n calibrados, de forma que para cada punto de concentraci6n xi, dispongamos de h
sefiales Yij· Los cuadrados asignados entonces a los residuales pueden descomponerse en imprecision
suma de los cuadrados
de
las diferencias de cada una de las replicas frente a su correspondiente valor
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80
V Ferreira
media) yen falta de ajuste (suma de los cuadrados de las diferencias entre Ia media de las replicas y el
valor estimado
.
Esto es:
ij
ij
4.- Considera los datos obtenidos en
el
ami/isis repetido
de
disoluciones de calibrado por dos
tecnicas distintas:
Calibrado
Tecnica 1 Tecnica 2
10
mg/L
0 28
0 32
10
m14 L
0 36
0
33
20mg/L
0 46
0 51
20
mg/L
0 57 0 53
30 mg/L 0 69 0 65
30 mgll
0 75 0 65
Realiza en
ambos casas
los calculos
de
las ecuaciones de Ia recta y
del
coejiciente
de
regresi6n.
Cage
los residuales y calcula las contribuciones de
Ia
imprecision y de Ia falta de ajuste. Haz un
diagn6stico
acerca de
ambas
tecnicas y
prop6n
Ia
mejor
soluci6n.
4.3. Diagn6stico del modelo mediante el estudio de los residuales
Ademas de separar las fuentes de error en los residuales, su estudio puede resultar muy util
para realizar un diagnostico de Ia regresion. La regresion lineal tal y como
Ia
hemos vista, esta
asentada en una serie de presupuestos. Alguno de elias ya lo conocemos (el error en X es
despreciable), pero hay otro que no hemos enunciado
de
forma explicita (aunque se desprende de
lo
anterior). Este presupuesto es que los residuales
se
deben distribuir de forma absolutamente aleatoria,
y por tanto,
Ia
representacion de los mismos, bien frente al tiempo, bien frente al eje X, no debe
revelar Ia existencia de ningtin patron o modelo. Las siguientes figuras ilustran las distintas
situaciones.
0
0 0 0
..
0
0
0
0
0
-
0
-
r
0
0
r
0
;::l
;::l
;::l
0
0
0
0
-
Cll
Cll
Q
Cll
Q
Q
tiempo
1 <
concentraci6n
1 <
1 <
La primera de las figuras denota que el residual va aumentado conforme fuimos analizando las
muestras de calibrado (que deberian haberse introducido siguiendo un arden aleatorio. Esto nos esta
indicando que
Ia
precision de nuestro metoda vario a
lo
largo del tiempo, y que las ultimas medidas
que hicimos eran mucho mas imprecisas que las primeras. Esto puede ser un indicia de que algtin
instrumento dejo de funcionar
de
forma correcta en un cierto momenta (por ejemplo un medidor de
pH, una sonda de temperatura ...).
La segunda de las figuras denota un comportamiento totalmente normal. No se observa ningtin
patron. Es
lo que
deberiamos esperar tanto en
Ia
representacion residuaVconcentracion como
residuaVtiempo.
a
tercera de las figuras nos ilustra un efecto parecido al que observamos en
Ia
primera. Aparece una forma de embudo caracteristica que nos indica claramente que
Ia
imprecision
aumenta con Ia concentracion. Este efecto es frecuente en analisis instrumental, ya que en muchas
ocasiones el error absoluto no se mantiene constante al cambiar Ia concentracion, mientras que si que
lo hace el error relativo. En este frecuente caso Ia recta de regresion tal y como Ia hemos calculado no
es
adecuada y debe calcularse una recta
de
regresion que de mas peso a los datos mas precisos. A este
tipo de rectas se les denomina rectas de regresion ponderadas.
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5. Rectas de regresion ponderadas
Si la desviacion relativa permanece constante,
y la
absoluta aumenta de forma proporcional a la
concentracion, se puede introducir la siguiente ponderacion donde
ro
es la ponderacion que
introduciremos al punto i de la recta
de
calibrado):
1
{ i [9]
X
Esta ponderacion no puede aplicarse de forma directa, logicamente, en el caso de que una de las
concentraciones sea cero.
Otra ponderacion posible es corregir cada punto de la recta de regresion por su imprecision, medida
como varianza:
1
{ i
=
sy
[1 0]
Ahora se calculan los nuevos centroides de la regresion:
L{J ;Y;
[11]
[12]
y
a continuacion los nuevos parametros de la regresion:
[13]
[14]
Ejemplo. Tras un estudio previa de residuales, un laboratorio analitico ha determinado que
Ia
varianza de Ia senal aumenta de forma proporcional a Ia concentraci6n,
por
lo que ha decidido
construir una recta de calibrado ponderada. Para obtener los correspondientes factores de
ponderaci6n h decidido determinar /a.senal cinco veces a cada concentraci6n. Se da
Ia
senal media
y Ia desviaci6n estimdar a cada valor de concentraci6n:
X
0 1
10
20
30
40
50
y
4
21,2
44,6
61,8
78
105,2
Si
0,71
0,84
0,89
1,64
2,24
3,03
Lo primero es calcular los factores de ponderacion aplicando la formula 10
y
las nuevas coordenadas
del centroide mediante la
11 y
12,
Wi
1,984
1,417
1,262
w x/L wi
0,037
2,652
4,725
w y/L wi
1,485
5,623
10,537
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82
0,372
0,199
0,109
2,087
1,492
1,019
4,300
2,909
2,144
X V y V
L.=5,343 L.=12,013 L.=26,999
V erreira
A continuacion se determina la pendiente y la ordenada en el origen como es habitual pero empleando
las formulas 14 y 15, en las que los productos cruzados y la suma de cuadrados de x estan ponderadas:
Xi-Xw Yi-Yw w(xi-Xw)
2
w(xi-Xc}(Yi-Yw)
-11,913 -22,999 281,54 543,53
-2,013 -5,799 5,74 16,55
7,987 17,601 80,53 177,47
17,987 34,801 120,29 232,73
27,987 51,001 156,10 284,47
37,987 78,201 157,17 323,56
L.=801,38 L.=1578 31
Par
lo que la pendiente de la recta ponderada es 1,969 y la ordenada en el origen 3,339. Esta recta es
bastante parecida a la que obtendriamos empleando la regresion normal y=2,818+1,985 x) pero al
estar su centroide mas cercano al origen proporciona menos error en la zona inferior de x.
La otra ponderacion posible es la 1/x. En ella, los factores de ponderacion y las coordenadas del
centroide son:
Wi
Wi X/ i.Wi wi y/L.wi
10
0,0978
3,9107
0 1 0,0978 0,2073
0,05 0,0978
0,2180
0,0333 0,0978
0,2014
0,025 0,0978 0,1906
0,02 0,0978 0,2057
X V
Y V
L.=10,228 L.=0,5866
L.=4,9337
Y realizando los calculos correspondientes, se obtiene la recta de calibrado de ecuacton
y=3,792+1,946 x, parecida a las anteriores pero cuyo centroide se sima todavia mas cerca del origen.
La
comparacion de los residuos obtenidos par las tres tecnicas se muestra en la figura siguiente.
5
4
3
'
u
'
1
• regresi6n normal
1;
:::1
tl
0
• ponderaci6n 1/s2
·u;
c;n
il
1nn
f
-1
0
" ponderaci6n
1 x
-2
r
l
-3
-4
"
-5
estimados
Como puede apreciarse, no hay excesiva diferencia en el tamafio de los residuales, tan solo se observa
que el punta primero el residual mas pequefio corresponde a las rectas ponderadas y que en el punta
mas alto ocurre lo contrario.
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nlo
que si que hay una diferencia radical es en la forma de los intervalos de confianza de los valores
detetminados en una recta o en otra. n la recta ponderada, la varianza de los residuales y las
incertidumbres en el calculo de la ordenada en el origen y en la pendiente se obtienen mediante las
formulas siguientes:
Finalmente, los intervalos de confianza de una concentraci6n determinada par interpolaci6n
son:
sy
s
I
[18]
n 2
[19]
ws es el factor de ponderaci6n empleado en la sefial de la muestra)
La representaci6n de los intervalos de confianza se muestra en la figura siguiente.
-10 10 20
3 40 5 6 7
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84 V.
Ferreira
6. Calibracion por adicion estandar
6.1. Efecto matriz
Las rectas de calibrado, en particular sus pendientes, son la mejor herramienta de que
disponemos para verificar si un metoda de amilisis o una tecnica instrumental viene afectada por lo
que denominamos efectos de la matriz. Baja esta denominacion nos referimos a un conjunto mas o
menos complejo de efectos causados
par
diferencias en la estructura matricial de las muestras y de las
disoluciones de calibrado que tienen como consecuencia la alteracion de la relacion existente entre la
sefial
y
la concentraci6n. Por ejemplo, en la determinacion de hierro en plasma sanguineo par
Espectroscopia de Absorcion Atomica puede ocurrir que a igualdad de concentracion de hierro, no
den la misma respuesta una disolucion sintetica (conteniendo agua, hierro patron
y
un tampon) que
una muestra real (que contiene proteinas, grasas, distintos acomplejantes . . . Esta diferencia de
comportamientos entre las disoluciones de calibrado, par fuerza sinteticas, y las muestras reales es
fuente
de un
gran nfunero de errores que deben ser detectados y corregidos. Para detectarlos lo mejor
es comparar las rectas obtenidas en el analisis de disoluciones sinteticas y las obtenidas en el analisis
de muestras reales a las que hemos afiadido cantidades conocidas de analito. Si no hubiera efectos de
la matriz, las rectas obtenidas en ambos casas deberian tener la misma pendiente. Para comparar
ambas pendientes, basta con aplicar un test t sabre ambos datos empleando las desviaciones de las
pendientes tal
y
como se calcularon en e1 epigrafe 3.
6.- Para verificar si un metoda de
am
i /isis de THT (tetrahidrotiofeno) en aguas residuales
pr
esenta
efectos de
Ia
matriz se han analizado una serie de disoluciones de calibrado obtenidas disolviendo
distintas cantidades de THT en agua y una serie
de
disoluciones de agua residual a las que se les ha
anadido cantidades crecientes de T T Campara ambas rectas y determina si se puede afirmar si el
metoda esta fibre de efectos de
Ia
matriz o
no.
calibrados
Concentraci6n (mg/L)
Senal
M. tr d des as
opa as
Concentraci6n anadida
(mg/L)
senal
0
0,067
1 2
3 4 5
0,081
0,094
0,109 0,124
0,136
El estudio de regresi6n de ambos sets de pares de datos nos proporciona los siguientes resultados:
pendiente recta normal
Ordenada recta normal
pendiente recta adici n
Ordenada recta adici n
0,01454 desviaci n 1
0,00156
0,01397
desviaci n
2
0,0669
0,000173
0,000201
Como las desviaciones
de
sendas pendientes son muy parecidas, cociente F=1,35
p
=0,37)
pod
emos
hallar una desviaci6n conjunta ponderando cada una
por
sus grados de libertad:
Desviaci6n conjunta= 0, 000186
y
ahara no enemas mas que aplicar el test t correspondiente:
t
0 01454-0,01397 4
33
0 0 0 0 1 8 6 ~
par
lo que Ia diferencia entre ambas pendientes
es
significativa con una probabilidad 0,0019 y par
tanto hemos demostrado
Ia
existencia de efectos
de
Ia matriz.
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Caso de que ambas pendientes sean significativamente diferentes, no es posible realizar el
calibrado de la muestra con la recta construida mediante el analisis
de
disoluciones sinteticas,
ya
que
estariamos introduciendo un error sistematico con signo defmido), y de magnitud desconocida, ya
que lo mas probable es que la relaci6n sefial/concentraci6n no solo sea diferente entre estandares y
muestras, sino que lo sera tambien entre muestras distintas con estructuras matriciales diferentes. Ante
este problema se pueden intentar distintas estrategias, bien dirigidas a la mejora de la sefial, bien
dirigidas a emplear otro tipo de calibraci6n. Para mejorar la sefial se puede intentar lo siguiente:
a) diluir la muestra con lo que podriamos conseguir que el efecto causado por los
componentes de la matriz distintos del disolvente, disminuya en intensidad
b) introducir alglin paso de limpieza para elirninar de forma total o parcial las
sustancias causantes del problema.
c) Introducir un paso de aislamiento, de forma que el analito se transfiera a una fase
diferente, aislandolo del resto de componentes de la matriz
d) Introducir un estandar intemo que se comporte de forma similar al analito.
AI
hacer esto, la sefial con la que trabajaremos no sera la sefial directa, sino la sefial
relativa a la de estandar intemo. Si ambas moleculas se comportan de manera
parecida frente a los componentes de la matriz, el problema podria estar resuelto.
e)
Si
es posible, se puede realizar la recta de calibrado en una matriz identica a lade
la muestra
Si ninguna de estas estrategias funciona o si complica excesivamente el procedirniento
de
analisis, puede optarse por emplear una recta de calibrado especifica para cada muestra, mediante el
metodo de la adici6n estandar.
6.2.
l
metodo de
a
adicion esttindar
Si no es posible realizar un calibrado con disoluciones sinteticas, debe realizarse el calibrado
por adici6n estandar. Como explicamos anteriormente, de lo que se trata es de afiadir cantidades
crecientes y conocidas de analito sobre la muestra,
de
forma que conozcamos en una matriz identica a
la de la muestra cual es la sefial asociada a una cierta concentraci6n de analito esto es, cual es la
sensibilidad o pendiente de la recta de regresi6n).
La ecuaci6n de la recta de adici6n estandar y
=
b
0
b
1
x esta representada en la figura inferior.
Puede apreciarse que la sefial de la muestra es justamente la ordenada en el origen si el experirnento
esta bien disefiado, la ordenada en el origen de la recta es una estirnaci6n de la sefial de la muestra
mejor que la obtenida en la medici6n directa).
r--------------------------------------------.
iii
•C
C
II
concentraci6n
en a muestra
adicion estandar
2
-0,05
concentracion aliadida
4
6
La concentraci6n se calcula entonces dividiendo la sefial estirnada para la muestra esto es,
I
a
ordenada
en
el origen de la recta), por la sensibilidad o sea, por la pendiente).
Puedes comprobar que en el caso del problema anterior Ia concentraci6n de Ia muestra es:
C=ordenada/Pendiente=O 066910 01397=4 79 mg/L
i por l contrario dicha concentraci6n se hubiera deterrninado interpolando Ia sefial de
Ia
muestra
en Ia recta de calibrado construida con disoluciones sinteticas
l
resultado obtenido hubiera sido
4 50mg/L.
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86
V
Ferreira
Desde el punto de vista matematico, esta concentraci6n no se
ha
determinado por
interpolaci6n en la recta de calibrado, sino por extrapolaci6n de la misma, tal y como se muestra en la
figura construida con los datos del problema 6). Por esta raz6n nose pueden aplicar de forma directa
la ecuaci6n [8] para el calculo de la imprecision. En su lugar se debe aplicar la siguiente formula.
s 1
2
s ~ - y [17]
0
b
n
b
2
~ x i
2
de donde se deduce que la precision crece cuantos mas puntos introducimos y cuanto mayor intervalo
de x cubrimos.
Puedes comprobar que para el caso anterior,
la
imprecision es 0,107 mg/L.
l metodo de la adici6n estandar tal y como lo hemos explicado es particularmente sensible al
problema enunciado al introducir las rectas ponderadas una incertidumbre de la sefial creciendo con
la concentraci6n), ya que es fundamental asegurar que los residuales de la medida correspondiente a la
muestra en la correspondiente recta de calibrado son pequefios. Si se tiene la precauci6n de que la
cantidad de muestra adicionada no sea excesivamente grande,
~ s t
es poco probable que ocurra. Si por
el contrario se detecta dicho problema sera preciso que la recta de adici6n estandar sea una recta
ponderada. n dicho caso, el error estandar del resultado extrapolado se puede estimar mediante la
siguiente ecuaci6n:
sY
s
0
b
1
1
2
m
[18]
En cualquiera de los casos, los intervalos de confianza de la respuesta vienen defmidos por la
expresi6n:
X
0
± 1:n 2So
7.- Rectas de calibrado como parametros de calidad y diagnostico de metodos de analisis
La recta de calibraci6n contiene informacion muy importante con respecto a la calidad de un
metodo de analisis.
La
pendiente esta relacionada con la sensibilidad, aunque para poder hacer
comparaciones es preciso detallar un gran mimero de condiciones. Su estudio ademas nos puede servir
para diagnosticar cambios en la sefial al cambiar la matriz lo que denominamos efectos de la matriz)
tal y como vimos anteriormente. La ordenada
en
el origen esta relacionada con el limite de detecci6n
del metodo.
7.1- Limite de deteccion de
un
metodo que emplea calibracion lineal
Como ya comentamos anteriormente, si se cumplen los requisitos que hacen posible la
aplicaci6n del metodo de los minimos cuadrados para construir una recta de calibrado, la ordenada en
el origen de la recta de calibrado constituye
una
muy buena estimaci6n del valor de la sefial del blanco
y ademas la varianza de los residuales constituye una muy razonable estimaci6n siempre que se
cumpla el presupuesto de varianza independiente de la concentraci6n) de la varianza del blanco.
Una
defmici6n aceptable de limite de detecci6n es la siguiente:
Es la concentraci6n de analito que proporciona una sefial igual a la de
la
ordenada en el origen
aumentada en 3 veces su desviaci6n estandar. Esto es, la concentraci6n para la que la sefial es b
0
+3Sb
0
,
donde Sbo se calcula como se indica en el epigrafe 5.3.
7.
Determina el limite de detecci6n del metoda presentado en el problema
5
Emplea ambas rectas
ponderada y normal) y discute los resultados.
7 2.- Otros usos de las rectas de regresion
Las rectas de regresi6n tambien pueden emplearse para comparar dos metodos de analisis.
n
particular, si tenemos
un
metoda de
referenda
frente al que queremos comprobar un nuevo metodo de
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analisis, podriamos analizar un conjunto de muestras al menos 8) por ambos metodos y estudiar la
regresi6n existente entre los datos obtenidos por el metodo nuevo y los obtenidos por el metodo de
referenda. Como el modelo de regresi6n que hemos estudiado parte del supuesto de que no hay error
en x, el metodo de mayor precision habitualmente el de referenda)
es
el que debe colocarse en este
eje. i ambos metodos fundonan de forma satisfactoria, deberemos obtener una recta de pendiente 1 y
ordenada en el origen cero. Desviaciones de la pendiente indicarian una inadecuada calibrad6n en uno
de los casos. Desviadones de la ordenada en el origen indicarian una interferencia o una mala
correcci6n del fondo. Para realizar la comparaci6n con criterio estadistico, se debe aplicar el test t para
comparar un valor con un valor conoddo.
8.- Se esta comparando
un
nuevo metoda para Ia determinacion de
Plomo
en
piensos
frente a un
metoda de referencia. Para ella, se analizaron 10 muestras distintas por ambos metodos. Empleando
Ia recta de regresion entre ambos set de datos, comprueba si
el
nuevo metoda proporciona resultados
comparables
a/ de
referencia no olvides que
el
metoda de referencia debe ir en
el
eje de abcisas).
muestra
Metoda
Referencia
Nuevo Metoda
1
0 16
0 19
2
0,35
0 36
3
0,59
0,63
0,05
0,05
5
0,23
0 27
6
0,98
1,01
7 8
0 73 0 056
0,81 0,055
9
0,43
0,44
10
0 17
0,21
La recta de regresi6n tambien puede emplearse para verificar si una distribuci6n de
datos se ajusta a la normalidad. Esta utilidad esta basada en el hecho de que la curva
de
frecuencia acumulada de la distribuci6n normal, que es una sigmoide, cuando la frecuencia se
representa en escala logaritrnica, pasa a convertirse en una linea recta. Por lo tanto,
si
representamos el logaritmo de la frecuencia acumulada frente al valor absolute o
transformado en z), debemos obtener una recta, coeficiente de regresi6n lineal alto y un
estudio de los residuales no nos debera mostrar indicios de comportarnientos no lineales).
9.- Calcula Ia concentracion de Ia muestra de abono utilizada en Ia adicion estandar del problema
10. Campara
el
resultado obtenido con
el
que se obtiene por interpolacion del data de ana/isis de Ia
muestra en Ia recta de calibrado obtenida mediante el ana/isis de disoluciones de calibrado
sinteticas.
11.- Se esta estudiando
el
papel del pH sabre
una
senal analitica de Pb. Los resultados se tienen en Ia
tabla
siguiente. Exam na Ia posible existencia de una relacion lineal entre
el pH
y Ia senal generada.
Considera
en
Iugar de pH Ia concentracion de H+, y averigua si Ia relacion puede
ser
lineal.
pH
1 2 3 4
3.20 18.8 19,2
18 7
19,1
3 25
18,8 19,0 18 7 18 6
3 30 18 6
18,5 18 4
18 7
3 35 18,2 18,0
18,1 17,9
12.- Estudia Ia
posibilidad
de que Ia variacion de tiempos de retencion con Ia Temperatura que
se
ha
estudiado
tenga unaforma
lineal.
Encuentra en ese caso Ia ecuacion de Ia recta correspondiente, los errores de Ia pendiente y Ia
ordenada en
el
origen, y predice cual sera
el
tiempo de retencion
si
Ia temperatura del sistema es de
55. 50°C.
1
Cual sera
el
intervala de confianza de esta prevision?
L ~ . : ~ ~ ~ ~ t ~ ~ l i ~ . ~ . ~ i _ q ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ] ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ i i ~ ¥ _ q ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ r = ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ i 2 ~ 4 I ; J ~ ~ ~ ~ - ~ : : . I ~ ~ : : : ~ ~ ~ ~ i i . ~ ~ i £ ~ ~ ~ : : ~ ~ : : : : : : l
~
..
_ _ }.}8
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5
_§
_________
:
_
_________
l ~ . Q L ____________j
________________ L_
l } § ___
...
_ J _
l ? l _ ________________
55 10 5 38 5 39 5 39
-------------------;--------------------------------------Y-------------·-·-------·;;..--------------··-··-----------··--- e
__________ ~ _ }
_____________
j_______ __ _ } 9 _
_______
L L ' f Q __l
_ _ _
__
_ _
39 _ ;
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V.
Ferreirp
13.- Los siguientes resultados muestran el porcentaje del agua intersticial total recuperada
al
centrifugar muestras de piedras areniscas tomadas de diferentes profundidades.
Agua
recuperada 1/o)
Profundidad m)
33.3 33.3
35.7 38.1 31.0 33.3
8
43.6 45.2 47.7 45.4 43.8
46
.5
16
73.2 68.7 73.6 70.9
72.5 74.5
23
72.5 70.4 65.2 66.7 77.6 69.8
Investiga si la dependencia existente entre la profundidad y la cantidad de agua intersticial es lineal.
que rango de profundidades podrias hacer la suposici6n de que la relaci6n es lineal, y con que
error?.
14.- La respuesta de un ensayo colorimetrico
para
glucosa GLU) se contro/6 con la ayuda de
soluciones estimdard de glucosa. Determina el coeficiente de correlaci6n a partir de los siguientes
datos y comenta los resultados.
Concentraci6n de GLU,
mM
Absorbancia
0 2 4 6 8 1
0.002 0.150 0.294 0.434 0.570 0.704
15.- Se obtuvieron los siguiente resultados cuando se analizaron una serie de soluciones estimdar de
plata
por espectrometria de absorci6n at6mica de llama:
Concentraci6n ng/mL
Absorbancia
0 5 1 15 2 25 30
0.003 0.127 0.251 0.390 0.498 0.625 0. 763
Determina la pendiente y la ordenada en el origen de la grajica de calibraci6n, junto con sus limites
de confianza.
Estima los limites de confianza
para
las concentraciones de
plata
en una muestra que proporciona
una absorbancia de 0.308, 0.314, 0.347 y 0,312 en cuatro ana/isis separados.
Estima ellimite de detecci6n del ana/isis.
16.- El contenido de oro de una muestra de agua de mar concentrada se determin6 por
espectrometria de absorci6n at6mica mediante el metoda de las adiciones estandar. Los resultados
obtenidos fueron los siguientes:
Oro aiiadido, ng por mL
de muestra concentrada
Absorbancia
0 10 20 30
4 5
60 70
0.257 0.314 0.364 0.413 0.468 0.528 0.574 0.635
Estima la concentraci6n de
Au
en agua de mar, y determina sus limites de confianza.
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Tema 4. VALIDACION Y CONTROL E
C UD D
EN QUiMICA
ANALiTICA
Contenido:
Introduccion, Validacion de metodos de ami/isis. Concepto. Validacion de Ia exactitud y
trazabilidad. Vision general
de Ia
Validacion
de
metodos de ami/isis. Ensayos
de
control y
puesta en marcha. Una vision general del concepto de Calidad en transparencias);
Normalizacion en transparencias); Trabajo en entornos regulados BPL en transparencias);
Acreditacion de laboratorios
en
transparencias)
1 Introducci6n
La Quimica Analitica siempre se ha preocupado por la calidad de sus resultados, y
desde hace mas de 100 afios ha incorporado elementos estadisticos para seguir y controlar
dicha calidad. La mayor parte de dichos elementos han sido expuestos en los capitulos
anteriores y puede decirse, por tanto, que forman parte del tronco esencial de la quimica
analitica. Sin embargo, la palabra calidad y mas concretamente el trio de palabras control de
calidad hoy tienen unas acepciones que van mucho mas alla de las fronteras de nuestra
ciencia y que nos afectan de una forma rotunda.
Para empezar se habla de sistemas de calidad o incluso de sistema de calidad total,
refiriendose a que las acciones de una determinada empresa o laboratorio se encuentran
sometidas a una serie de protocolos y normas de planificaci6n, ejecuci6n y documentaci6n
verificadas por una empresa o instituci6n neutral o estatal, seglln el caso. Este tipo de
empresas para poder asegurar la integridad de su propio sistema, acaban relacionandose con
proveedores que tambien estan integrados en un sistema de calidad similar. En este sentido, el
resultado mas visible de estar integrado en un sistema de calidad es recibir una certificaci6n
de un organismo oficial, tipo certificado ISO 9000 o similar. Los laboratories analiticos por
supuesto no se sustraen a ese mismo sistema, en principia voluntario.
Pero es que ademas, algunos laboratories suministran datos de importancia vital
(seguridad alimentaria, medioambiental, de farmacos, cosmeticos, juguetes
..
), por lo que van
a tener unas exigencias de calidad todavia mas estrictas, constituidas por lo que denominamos
las Buenas Practicas de Laboratorio (BLP s o GLPs). Estas normativas son de obligado
cumplimiento para dichos laboratories, pero se han convertido en un estandar de referenda al
que voluntariamente se someten otros laboratories.
Por tanto en este capitulo hemos de hablar de calidad,
de
su concepto, de los sistemas
de calidad y de su aplicaci6n particular a los laboratories analiticos. Antes sin embargo,
habremos de tratar de los parametres de calidad mas importantes del producto de un
laboratorio analitico, que no son otros que la exactitud e incertidumbre de los resultados.
Dichos parametres de calidad dependen en primera instancia de la calidad del metodo de
analisis y en segundo lugar de como se pone en marcha este en un laboratorio en concreto.
Estas dos cuestiones seran tratadas en cierta profundidad en el epigrafe validaci6n de metodos
analiticos presentado a continuaci6n.
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92
V erreira
2. V ALIDACION
DE METODOS DE
ANALISIS.
ON EPTO
2.1. Concepto
La validacion de un metodo de amilisis es el proceso seguido para confirmar que todas
las etapas del proceso analitico empleado para un analisis dado son adecuadas para su
finalidad y que el metodo en su conjunto proporciona unos resultados de las caracteristicas de
calidad adecuadas ( exactitud, precision, tiempo, coste).
La validacion (o revalidacion) del metodo debe realizarse
1. Tras su desarrollo y antes de su empleo en analisis de rutina. Esta es la
validacion completa. Se realizara primeramente en un laboratorio, pero si el
metodo ha de ser de aplicacion general, esta validacion habra de ser realizada
en varios laboratories diferentes.
2. Siempre que se modifiquen las condiciones operatorias o se ponga el metodo
en un laboratorio distinto. Esta es una validacion parcial, pero que en algunos
casos puede tener mucha complicacion.
3. Al ponerlo en marcha tras un tiempo de reposo. Se trata de una validacion
minima, basada en un chequeo de idoneidad.
4.
Durante su uso normal. Mediante las correspondientes operaciones de control.
5.
Siempre que el control indique que el metodo esta proporcionando resultados
defectuosos (fuera del rango previamente definido como aceptable . En este
caso es preciso localizar el problema, solucionarlo y pasar al punto 3.
Logicamente la extension del trabajo de validacion depende en gran medida del caso
en que nos encontremos. El trabajo mas importante hay que hacerlo en el momento en que el
metodo acaba de ser desarrollado y es por hi por donde comenzaremos. Tal vez
no
te
enfrentes con la tarea de validar completamente un metodo novedoso nunca, pero aprender
como se hace, por que y que consideraciones es preciso hacer, es una escuela interesantisima
de quimica analitica que pondra a prueba tu sentido comful y tus conocimientos de
quimiometria y de quimica analitica. Ademas te sorprenderia ver la dificultad que a veces va
asociada a la puesta en marcha de un metodo de analisis no muy bien conocido y
el
esfuerzo
de
validacion que hay que desarrollar.
En esta primera parte nos vamos a cefiir exclusivamente a metodos de analisis
cuantitativo normales , esto es, metodos cuyo objetivo es la determinacion de analitos en
cantidades no traza. En un epigrafe posterior generalizaremos el problema de la validacion a
otros tipos de metodo.
2.2. La validacion de
un
metodo recien desarrollado
En este epigrafe no discutiremos acerca de como se desarrolla y optimiza un metodo
de analisis, sino que nos situaremos en el momento en que la optimizacion del mismo ya va
llegando a su final. Tendremos, por tanto, un protocolo mas o menos optimizado que nos
permitira generar una sefial de analito en uno o varios tipos de muestra. A partir de aqui h de
comenzar lo que denominamos el trabajo
de
validacion, cuya mision en este caso
es:
1.
determinar como ha de realizarse la calibracion,
2. determinar la calidad de los resultados surninistrados por el metodo (precision y
exactitud),
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3. fijar el tipo de ensayos de control que debenm realizarse durante su
funcionamiento para garantizar que
se
mantiene la calidad
Las tres cuestiones anteriores, particularmente las dos primeras, no pueden resolverse
de forma cronologica ya que una depende de otra. Otra cosa que es preceptivo recordar en
este punta, es que la precision y exactitud, deben ser coherentes con los requisitos de la
informacion requerida, tal y como expusimos al comienzo del primer capitulo. Finalmente,
otra puntualizacion que debe realizarse es que no hay lineas predefinidas y comfunnente
acordadas acerca de como debe realizarse este proceso, por lo que lo expuesto a continuacion
es fruto de mi experiencia y reflexion personal, y sin duda viene afectado del sesgo
caracteristico de quien ha trabajado mucho mas en el campo del analisis cuantitativo
organico.
3.- VALIDACIONDE
L EX CTITUD
Y
TR Z BILID D
DEL METODO
La exactitud de un metoda es la propiedad analitica mas importante y preciada. Sin embargo,
su determinacion y medida es dificil y esta sometida a controversia, por cuanto en su
definicion interviene un concepto casi filosofico como es
el
valor verdadero de concentracion
de analito en una muestra. En los casas en los que se dispone de estandares certificados de
referenda o CRM Certified Reference Material), el termino concentracion verdadera es
sustituido por el
de
concentracion aceptada como verdadera , pero si no disponemos de un
CRM, la definicion de la exactitud por si no nos es de gran ayuda para determinar si nuestro
metoda es exacto.
Resulta mucho mas util emplear un concepto denominado trazabilidad, que es
bastante mas intuitivo y pragmatico. a trazabilidad es una propiedad de las medidas y de los
metodos. Diremos que una medida tiene trazabilidad si somas capaces de forma inequivoca
de relacionar dicha medida con la masa de analito patron. En la practica esto quiere decir que
podemos garantizar que la sefial final medida es:
a) de todo el analito presente en la alicuota de muestra procesada o de una
fraccion de proporcionalidad perfectamente conocida del mismo
b) solo del analito y no de cualquier otra especie interferente
c) proporcional a la concentracion de analito
d) que la constante o uncion de proporcionalidad entre sefial y concentracion
son perfectamente conocidas
Balanza
calibrada
Alicuota
muestra
pesada
Muestra
preparada
Alicuota
medida
t
iiioo
. . . _
--? i l l i i i i
. . . _
c:::ms
· .
Masa .........
. . .
Analito
patron
Seiial
Figura : Trazabi idad de un resultado
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94
V Ferreira
Lo que en general hay que hacer para poder demostrar que un metodo garantiza la
trazabilidad de los resultados se resume en
la
figura
2
Discutamos cada paso de los
mostrados en dicho organigrama.
3.1. Evaluacion de a precision
•
Curiosamente, lo primero que se debe hacer para determinar la trazabilidad (y
exactitud) del metodo es determinar
si
nuestro metodo recien optimizado es suficientemente
precise. Si no hay una evaluacion de la precision no dispondremos de criterios para
determinar si el resultado es trazable. Si la precision no es suficientemente satisfactoria, el
metodo tiene que ser re-optimizado o desechado ya que la precision de la medida es un
requisite irrenunciable cualquier proceso de medicion.
El estudio lo podemos dividir en dos partes, evaluacion inicial y formal. En la
evaluacion inicial podemos comenzar estudiando el analisis replicado de muestras sinteticas a
una concentracion intermedia. Si los resultados son satisfactorios pasaremos a la evaluacion
f o r m ~ l
si son insatisfactorios es precise re-optimizar o cambiar el metodo.
·;::: >
no 1-------_.
Estudio recuperaci6n
Estudio interferencias
proporcionales i
\ . (efectos de matriz y otros) ,.-·
00
..
0000000
- 0000MOOOO -OOOOOOOOOOO
OM-000000000000000
0
00000
0000
0-000-00
0 0000000000000
00000
00 0 0000000000 0000000
00 0000-0 0 00 0000 0000-00
M
00 00oOo-ooO_o___ , , _ _ _ _000
-•
0
0 0 0 000
...
Figura : Verificaci6n de a trazabilidad de un metoda
En este ultimo caso pueden estudiarse por separado las distintas etapas del metodo
para aislar aquella con mayor efecto en la imprecision, o puede considerarse si es el caso , el
uso de alglin tipo de estandar interne que corrija la imprecision .. por desgracia las posibles
fuentes de irreproducibilidad son muchas y en ocasiones son muy dificiles de detectar.
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Si la reproducibilidad con disoluciones sinteticas es suficiente, pasaremos a una
determinacion mas completa
de
la precision
del
metoda. Como todo parametro que ha de
validarse, habra de tenerse en cuenta la regla de oro de la validacion:
vali dar to
do
el metoda
Validar todo el rango de concentraciones
Validar todo el rango de matrices (muestras)
La precision se habra de determinar a distintas concentraciones de analito y en tantos
tipos de muestra (matrices) como sea necesario. En el caso de la precision, su estudio alcanza
diversos niveles
segU.n el esfuerzo experimental y el nllinero de var1aoles consideradas. El
nivel mas bajo es la repetitividad, que es la precision que se obtiene realizando las replicas en
un rnismo dia y con las
m1smas
condiciones operatonas.
hl
mvel siguiente es el de l
reproducibilidaa mtermedla, en el que las replicas se realizan en dias diferentes y empleando
01stmtas condiciones operatorias, pero dentro del.mismo laboratono. P' ara determinar el nivel
mas alto
e
precision, es precisa la mtervenci6n de distintos laboratorios. En ese caso la
denorninamos reproducibilidad propiamente dicha. Obviamente en los estudios iniciales nos
quedaremos con la reproducibilidad intermedia, a la que denominaremos sencillamente
reproducibilidad.
3.2.- Linealidad y rango dinamico del metodo
Una vez que tengamos la garantia
de
que el nietodo genera sefiales al menos
repetitivas, el siguiente paso es considerar la relaci6rt existente entre la sefial y la
concentracion, que en la mayor parte de los casos sera lineal. Al'igual que hicimos en el caso
de la precision, iremos de mayor a menor complejidad. Lo primero es estudiar la linealidad y
rango lineal con disoluciones sinteticas conteniendo los patrones ae analito en concentracion
conoc1da.
S1
la relac1on no- fuera neal, seria preciso considerar una transformacion
matemat1ca de la sefial (que puede ser desde la extraccion de logaritmos, una raiz cuadrada o
la introduccion de
algU.n
estandar intemo
.
Una vez conseguida una relacion Sefial/Concentracion satisfactoria, es preciso fijar el
rango dinarnico del metoda y estudiar la linealidad en muestras reales. Esto se consigue
mediante la tecnica de la adicion estandar, pero esta tecnica solo
se
puede realizar sobre
disoluciones, por
lo
que los pasos previos realizados sobre solidos no quedaran validados en
este momenta.
3.3.- Determinacion de a exactitud como ausencia de errores sistematicos)
Si tenemos un metoda que nos proporciona sefiales precisas a varias concentraciones
y en las matrices de interes, y es ademas lineal, tenemos.ya mucho ganado. Lo que nos queda
por demostrar ahora es que la sefial es solo de analito y no de alguna especie interferente, y
que la relacion sefial/concentracion (funcion de calibracion) es conocida e independiente de la
muestra en particular que se vaya a analizar. Dicho de otra forma, lo que nos queda es
averiguar que el metoda puesto en marcha esta exento de errores sistematicos.
La forma mas directa de verificar la presencia potencial de algU.n error sistematico es
mediante el uso de muestras certificadas. Si la aplicacion del metoda a una muestra
certificada proporciona un resultado que difiere significativamente del valor certificado,
podemos concluir la existencia
de algU.n
error sistematico.
Si
el resultado del analisis del
CRM no difiere significativamente del valor certificado, la presencia de algU.n error
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V
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sistematico es mas improbable. Para poder concluir de forma taxativa que no hay errores
sistematicos, seria conveniente el analizar distintos CRM conteniendo el analito a distinta
concentradon en tantos tipos de muestra como se quieran analizar con el metodo. En caso de
problemas, los datos de analisis de varios CRMs nos proporcionarian una informacion clave
para el diagnostico de la situacion. En la practica pocas veces se toma esta precaucion.
Desafortunadamente, hay muchos problemas analiticos para los que no hay CRM
disponibles, particularmente dentro del mundo del analisis organico. En este caso podriamos
hacer uso de un metodo de referenda distinto del que esta bajo validacion. Para ello seria
necesario disponer de un metodo y validado y adecuado para el analisis del analito bajo
estudio en las muestras de interes. Caso de que dicho metodo existiera, se analizarian varias
muestras cubriendo el rango de concentraciones y de tipos matrices) por ambos metodos.
Finalmente, se aplicaria cualquier test estadistico de los que
y
hemos visto en los capitulos
anteriores para verificar que los datos generados por ambos metodos no difieren.
De nuevo de forma desafortunada, nos
encontraremos con que en pocas ocasiones
disponemos de ese otro metodo de referenda
mue
hacer entonces?
Entonces debemos realizar un estudio sistematico que nos permita verificar la
trazabilidad de los resultados proporcionados por nuestro metodo. Para ello hemos de cubrir
tres objetivos: a) verificar la
l .O
existenda de interferendas aditivas; b) verificar la
recuperacion en
fos
procesos de tratamiento de muestra; y c) verificar la no existencia de
i n t e r r e r e n c ~ s
proporcwnales tl.mdamentalmente deefectos de la matriz).
3.4. Estudio de interferencias aditivas
Una interferenda aditiva esta causada por la presencia en una o varias muestras de
alguna sustanda que produce una sefial que confundimos con la del analito. La
presencialausencia de interferencias aditivas esta ligada l complejidad de la muestra y l
selectividad de la tecnica de analisis. Las interferencias aditivas nos van a producir un error
sistematico por exceso y por lo general variable en las distintas muestras.
En muestras simples, en las que los interferentes potenciales son conocidos, se puede
verificar su existencia mediante el estudio de muestras sinteticas. Este estudio consiste en
preparar lo que se denomina un blanco de muestra, que es una muestra similar a la real pero
carente de analito:
Ejemplo 1.- Determinacion de o en un metal o aleacion por EAA. Los interferentes
potenciales son el resto de metales presentes o potencialmente presentes en la
aleacion. Estudiar sefzal de Mo en disoluciones sinteticas conteniendo los otros
me ales.
Ejemplo 2.- Determinacion de un principia activo en un farmaco
por
HPLC.
Interferentes potenciales: Otros principios activos presentes en el farmaco
y
excipientes. Estudiar sefzal del analito en ausencia de ana/ito y presencia de
excipientes otros principios activos
Este tipo de ensayo solo se puede realizar en aquellos casos en los que la composicion
de la muestra es conocida y podemos disponer de sus componentes.
En muestras complejas en las que los interferentes potenciales son en su mayor parte
desconocidos e indeterminacies solo puede verificarse empleando una tecnica de analisis que
proporcione una seiial multidimensional caracteristica del analito. Veamos varios ejemplos.
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Ejemplo
1
Se quiere determinar un compuesto aromatico (etilbenceno)
par
cromatografia de gases con detecci6n FID. El cromatograma de las muestras
conteniendo el ana/ito no muestra evidencia de coeluci6n de otras sustancias con el
ana/ito (los picas de ana/ito se ven gaussianos). Para confirmar la no presencia de
interferentes, se inyectan varias muestras en una columna similar pero conectada a
un espectr6metro de masas. El estudio del espectro
de
masas a lo largo del pica
confirma la no presencia de ninguna sustancia coeluyente en ninguna de las
muestras. Se confirma lo que denominamos la pureza del pica .
Ejemplo 2.- Se quiere determinar una vitamina par formaci on de un complejo
coloreado con un reactivo organico. Para verificar que la sefial espectrofotometrica
(descontada la Absorbancia del blanco) es enteramente debida al ana/ito, se
comparan los espectros de absorci6n uv-vis (220-900 nm) de distintas muestras con
los espectros obtenidos de patrones. En todos los casas, las bandas de absorci6n en
la zona del maximo mostraron una identidad espectral completa.
3.5.- studiode a recuperacion de analito
Los estudios de recuperacion, entendida como rendirniento en los oroceso _s_
de
tratarniento de muestra, tienen como objetivo determinar que proporcion de analito se pierde
en las etapas prev1as a la medicion. Esta perdida puede ser una fuente de importante error
sistematico y tambien aleatorio) en aquellos metodos en los que el tratarniento de muestra
deberia idealmente conseguir transferir todo el analito a la fase finalmente analizable en el
instrumento lo que los analiticos denorninamos transferir cuantitativamente).
Hay muchos metodos de analisis en los que estos estudios no tienen la rnisma
importancia, puesto que dicha transferencia cuantitativa no se pretende, generalmente porque
se piensa que se puede reproducir con calibrados la transferencia parcial de analitos. Uno de
los casos mas caracteristicos es el estudio de volatiles mediante tecnicas del espacio de
cabeza estatico.
En cualquiera de los casos es conveniente realizar este tipo de estudios es rni opinion
personal). El porcentaje de analito finalmente transferido a la alicuota de medida no solo
puede indicar la existencia de perdidas de analito en algtin paso del analisis, sino que nos
proporciona una indicacion de la robustez del metodo.
La forma de llevar a cabo este estudio es mediante un experimento estandar de
recuperacion. n estos experimentos se adicionan masas conocidas de analito a distintas
muestras y se analizan siguiendo l metodo a estudio tanto las
muestras
como las muestras
adicionadas. l incremento de sefial obtenido entre cada muestra dopada y su original sin
dopar se compara con la seiial que produce en el instrumento una masa similar de analito.
Ejemplo.- Se estan comparando dos metodos para la determinacion de etilbenceno
en
agua par GC-FID. El primer metoda emplea una extracci6n del ana/ito en un sorbente y
su posterior termodesorci6n directa automatica en el sistema GC-FID; el segundo
metoda es un metoda de espacio de cabeza, en
el
que 10 mL de agua se colocan en un
vial de 20 mL, se termostatizan a 50°C y se introduce en el cromat6grafo un volumen del
gas 1 mL) en equilibria con el agua dentro del vial. Para el calculo de la recuperaci6n
se tom6 una muestra de agua y se fortific6 con dos niveles de etilbenceno 1 0 y 90
ng/
mL),
analizandose
par
ambos metodos las muestras fortificadas y el agua original.
Par otra parte se prepararon dos disoluciones estandar en pentano del ana/ito 1 00 y 900
ng
/jiL). Puesto que en ambos metodos se procesan 10 mL de agua, la cantidad de ana/ito
presente en las alicuotas de ensayo es 100 y 900 ng. a sefial correspondiente a estas
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masas se calcu/6 inyectando 1 j L de las disoluciones de pentano directamente en el
cromat6grafo. Los resultados mostraron que a masa transferida en el primer metoda es
e/84±2 y n el segundo tan solo el 6,2±0,
7 .
Comentarios al ejemplo. El experimento
ha
puesto
de
relieve la perdida de un 16% de analito
en el primero de los metodos.
La
recuperaci6n es bastante alta, independiente de la
concentraci6n y previsiblemente constante muestra a muestra ( esto se habra de demostrar
posteriormente). Por tanto, seria posible en este metodo realizar una calibraci6n por
estandar
extemo y realizar posteriormente la correcci6n por el 16% perdido. En el segundo de los
casos tenemos un metodo con una transferencia muy baja de analito. Esto nos alerta acerca de
varias cuestiones.
n
primer lugar
no
es posible realizar la calibraci6n con un estandar
extemo y hacer la correcci6n correspondiente al 93,8% perdido. Esto seria un disparate que
llevaria asociada una enorme incertidumbre. En segundo lugar nos indica que este metodo va
a ser probablemente muy dependiente de pequefias variaciones ambientales y/o operatorias,
esto es, va a ser muy poco robusto. En este caso parece mas recomendable realizar una
calibraci6n por estandar intemo (tomando como estandar un is6mero del etilbenceno) a partir
de
muestras de agua conteniendo cantidades conocidas de .etilbenceno.
3.6.- studio de interferencias proporcionales
Las interferencias proporcionales hacen que la misma cantidad
de
analito produzca
una sefial analitica diferente en funci6n de la muestra analizada. n los metodos
instrumentales esto puede ser causado por una larga serie de problemas, mas o menos
caracteristicos de las distintas tecnicas y metodos.
A modo de ejemplo podemos citar los siguientes:
En Espectroscopia de Absorci6n At6mica a la llama todo aquello que afecta a la
viscosidad
de
la disoluci6n que es aspirada a traves del venturi de entrada va a provocar
una variaci6n de sensibilidad. Si estamos analizando muestras de viscosidad diferente
entre elias y con los patrones tendremos graves problemas cuantitativos.
En cromatografia
de
gases capilar realizando la inyecci6n en split, cualquier cambio de
composici6n que afecte a como
se
evapora el extracto inyectado en el cromat6grafo,
puede producir cambios en la proporci6n de analito que realmente entra
en
la columna.
Por tanto, si estamos analizando extractos sucios conteniendo alta cantidad de material
no volatil, las condiciones de vaporizaci6n de los mismos seran muy diferentes de las de
los calibrados.
En cualquier metodo en el que realicemos una extracci6n o proceso de separaci6n no
cuantitativos, pequefios cambios en las caracteristicas de la muestra (pH, contenido de
organicos, constante dielectrica, fuerza i6nica, viscosidad, presencia de acomplejantes... ),
o
de
las condiciones ambientales (pH, material empleado, operador ... ), pueden llevar
asociadas cambios en la cantidad de analito recuperado.
Como puede apreciarse, el origen del problema son las diferencias de contenido en
componentes diferentes al analito que puedan tener las muestras a analizar. Se trata de
componentes desconocidos y a menudo inespecificos, por
lo
que los englobamos dentro del
concepto de matriz y al efecto lo denominamos efecto matriz. Los efectos matriz son la
distorsi6n mas grave que puede afectar a nuestro conocimiento de la relaci6n
Sefial/Concentraci6n. Su efecto en la calidad
de
los resultados puede ser doble. Por un lado se
trata de un error sistematico,
ya
que las mayores diferencias de comportarniento se daran
habitualmente entre las disoluciones de calibrado (que no contendran en absoluto los
componentes que generan el efecto matriz) y las muestras (que contendran cantidades
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variables de los componentes que causan el efecto matriz). Por otra lado es una fuente
importante de incertidumbre, ya que aunque seamos conscientes de su existencia y realicemos
el calibrado en una matriz promedio , seguini habiendo pequefias variaciones en la relacion
SI
en funcion de la composicion particular de cada muestra.
Otra observacion que puede hacerse acerca
de
la naturaleza
de
los efectos de la
matriz, es que dada su naturaleza, todos aquellos metodos en los que no hay transferencia
cuantitativa de analito en algful paso del analisis son mucho mas sensibles a su existencia.
Si
reconsideramos los ejemplos expuestos en la determinacion del etilbenceno, es facil
pronosticar cual de los dos metodos es mas susceptible de sufrirlos. Un efecto matriz en un
analisis de agua puede estar causado por la cantidad de materia orgamca generica que
contenga el agua y que facilite la disolucion del etilbenceno. Es poco probable que dicho
efecto matriz afecte a la retencion del analito en el sorbente del primer metodo, pero es casi
seguro que dicho efecto matriz afectara a la proporcion de etilbenceno en el vapor que esta en
equilibria con el agua. Como ademas la cantidad que se esta transfiriendo es muy pequefia,
cualquier pequefio cambio tendra un efecto dramatico desde el punto de vista porcentual. Una
disminucion en
1
de la cantidad total transferida causara un error por defecto de mas del
15%. La constatacion de este hecho es la razon por la que el estudio de recuperacion tiene
importancia.
Para detectar los experimentos de la matriz se pueden hacer varias experiencias:
a)
Mediante un experimento de recuperacion de sefial
b) Mediante un experimento de adicion estandar
a) Mediante un experimento de recuperaci6n de sefial parecido al expuesto en el calculo
de
la recuperacion. Como en aquella ocasion, se escogeran un cierto nfunero de
muestras (intentando cubrir el rango de tipos de muestras a analizar), se fortificaran
con uno o preferiblemente dos niveles de analito (intentando cubrir el rango de
concentraciones a analizar) y se analizaran tanto las muestras originales como sus
alicuotas fortificadas siguiendo el metodo. En esta ocasion, sin embargo, el
tratamiento de los datos es muy diferente.
Nose
compararan las sefiales obtenidas con
las que producirian masas conocidas y equivalentes en la alicuota de medida, como se
hizo anteriormente, sino que el incremento de sefial asociado a la fortificacion se
transformara en concentracion al dividirlo por la pendiente
de
la recta de calibrado
construida con estandares. La comparacion de las masas obtenidas siguiendo este
proceso y las realmente afiadidas, nos dara una estimacion de la intensidad de los
efectos matriz. La diferencia ·entre la masa afiadida estimada y la real se expresa como
porcentaje y se denomina recuperacion. Veremos luego un ejemplo.
b) Mediante un experimento de adici6n estandar. Realizaremos una adicion estandar
completa y compararemos la pendiente obtenida en la recta de adicion con la de la
recta de calibrado tal y como se expuso en el tema correspondiente a la calibracion (lo
que equivale a demostrar que la concentraci6n determinada por interpolacion y
extrapolacion no difieren). Este es el primer paso, porque si encontramos que existen
efectos de la matriz, el siguiente es estudiar
si
estos efectos son de una intensidad
suficiente, no solo para diferenciar la S/C entre muestras y calibrados
lo
que ya se ha
demostrado, sino para que muestras diferentes generen diferentes relaciones S/C.
Ejemplo. Seis muestras e grasa han sido dopadas con cantidades conocidas de un
aldehido E-2-nonenal). Las muestras dopadas y las originales sin dopar se han
analizado siguiendo el metoda propuesto.
a
recta de calibrado del metoda, obtenida
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100
V
Ferreir(l
mediante el ancilisis
de
extractos sinteticos es Sefia/=0, 00390+0,1983C, donde
C
esta
expresada en ng/mL y Ia sefial en unidades
de
area relativa a/ estandar inferno. Las
sefiales obtenidas en los ana/isis son las siguientes:
Muestr Seiial Seiial Concentraci6n
a
muestra dopado adicionada
1
1,07
47
3,8909 14,0
2 1,5506
4,2289 13,2
3
0,2419
3,2368 15,4
4 3,8509 6,0993
11
,9
5
9,1157 11,8036
13 7
6
1,8481 5,1109
16,2
Determina si hay evidencias
de
efectos de
Ia
matriz.
Para resolver este problema,
lo
que vamos a hacer es determinar las concentraciones
de muestra y dopado, restarlas y compararlas con
Ia
concentraci6n adicionada real.
recuperaci6n
Cmuestra
Cdoe.ado
Cadicionada
Creal
Di&rencia
5,3999 19,6016
14,201 7 14,0 0,20
101,4
7 7998 21,3061 13,5063 13,2 0,31
102,3
1,2002
16
,3031
15,1029 15,4 -0,30
98,1
19
,3999
30
7383
11,3384 11,9 -0,
56
95,3
45,9496 59,5043
13,5547
13,7
-0,15
98
,9
9,3001
25
, 7539 16,4539 16,2 0,25
101,6
Un simple test
por
parejas comparando las concentraciones adicionadas, real y
determinada, da los siguiente resultados: media diferencias=-0,04; desviaci6n
diferencias=0,35; t=0,28; v=5;resultado no significativo.
Observa que
da
lo mismo restar las concentraciones que restar las sefiales y dividirlas por la pendiente. Otra
observaci6n fundamental es que el termino recuperaci6n en este caso tiene un significado netamente diferente
del expuesto en el punto 3.5. Ahi se referia a la recuperaci6n de analito en los procesos de tratamiento de
muestra aqui se refiere a la capacidad de nuestro sistema
de
medida para interpretar adecuadamente la sefial en
distintos tipos de muestra. Una recuperaci6n alta en este caso no indica que no haya perdidas fisicas de analito
durante el tratamiento de muestra indica que si las hay estan adecuadamente corregidas por el sistema de
calibraci6n escogido.
a
denominaci6n recuperaci6n es claramente equivoca y es preciso especificar claramente
a que nos referimos.
Es posible que con los pasos anteriores ya hayamos conseguido verificar que el
metodo proporciona resultados con trazabilidad. Pero tambien lo es que no como
consecuencia de la aparici6n de alglin problema ligado bien
ala
existencia de interferencias
a la existencia de perdidas importantes o a la existencia de efectos de la matriz. a soluci6n
de estos problemas queda fuera del alcance del presente texto y nos hemos de limitar a
formular
alglin tipo de pautas o recomendaciones de caracter muy general.
La existencia de interferencias requiere la re-optimizaci6n del metodo a fm de incluir
alguna etapa de aislamiento o enmascaramiento que mejore la selectividad de la seiial.
Dependiendo del caso esto puede ser muy complicado y poco practico por lo que puede ser
recomendable incluso el cambio de estrategia de detecci6n.
La existencia de perdidas en las etapas de aislamiento no tiene porque ser un problema
en tanto y en cuanto sea un factor previsto tal y como se explic6. Lo que sera preciso por
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supuesto, es que la calibraci6n tenga en cuenta este hecho. Como ya dijimos, el problema
asociado a una baja recuperaci6n es la escasa robustez del metoda tanto a cambios en
condiciones ambientales como a cambios de composici6n matricial.
La existenda de efectos de la matriz puede ser superada con un esfuerzo en la
calibraci6n del
metoda. En los casas de tecnicas multicomponente muchos problemas de
precision, de recuperaci6n y de efectos de la matriz pueden ser resueltos con un estandar
interne que se comporte
de
una forma similar
al
analito. Esto explica porque algunos analisis
particularmente dificiles requieren el uso de estandares internes que son la rnisma molecula
marcada isot6picamente con C
3
o con deuterio (tecnica de calibraci6n conocida como
diluci6n isot6pica). Finalmente, y en el caso de que no exista o no
se
pueda emplear dicho
estandar interne, la existencia de efectos de la matriz tiene una soluci6n quimiometrica, que
es emplear el metoda de adici6n estandar como estrategia de calibraci6n. Esta elecci6n
obligada implica multiplicar el esfuerzo analitico por factores entre 4 y 6, lo que no siempre
es viable.
3.7. Consideraciones fmales
Todas las indicaciones anteriores son utiles para el caso de que la exactitud del
metoda no pueda verificarse mediante el empleo de CRMs o de alglin metoda de referenda.
Como se indica, esta situaci6n se dara con frecuencia en el campo
el
analisis organico. De
hecho en este campo, fuera de las moleculas
de
pestiddas y contaminantes mas comunes y
peligrosos, no es
facil encontrar CRMs, ni metodos de referenda. En el campo del analisis
elemental, por el contrario, el nlimero y tipo de CRMs es bastante amplio, por lo que deben
ser la primera opci6n a considerar. En este campo tambien se dispone de bastantes mas
metodos de referenda.
En todo el proceso de validaci6n mostrado es precise el uso extensive de muestras
dopadas o fortificadas. Esta es la
Unica
soluci6n que tenemos para poder abordar el problema
de la existencia de errores sistematicos tal y como hemos vista, pero no debemos olvidar que
la preparaci6n de este tipo de muestras puede ser
mas complicada de lo que parece.
En primer lugar sera muy dificil, salvo en alglin producto industrial, el preparar
muestras dopadas s6lidas iguales a las muestras reales. En todo el trabajo con s6lidos las
etapas previas a la puesta en disoluci6n (ya sea mediante ataques, extracciones, lixiviaciones,
sublimaciones,...) no podran ser estudiadas mediante estas estrategias.
a
Unica soluci6n que
puede haber en estos casas es el uso de tecnicas de extracciones sucesivas, pero su
comentario y tratarniento es demasiado complejo para el presente capitulo.
En segundo lugar, incluso aunque la adici6n de analito se realice sabre una matriz
liquida, no tenemos la garantia de que el analito afiadido establezca el rnismo tipo de
asociaciones que el analito native. Por ejemplo, en muchos fluidos naturales (suero
sanguineo, savias vegetales, zumos, orina .. ) las moleculas organic as y por supuesto los
elementos metalicos y no metalicos, se encuentran formando distintas asociaciones complejas
no bien conocidas. Algunas de estas asociaciones responden a equilibrios rapidos, pero otras
se han formado al cabo del tiempo, por lo que
no
tenemos garantia de que podamos conseguir
una igualdad total de comportarniento entre el analito native y el afiadido.
A pesar de estas lirnitaciones no tenemos muchas mas alternativas que las aqui
expuestas.
4. Vision general de a validacion de metodos de amilisis
4.1. Parametros a validar segun el metodo
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1 2
V erreira
Como hemos visto, los panimetros mas importantes en la evaluacion de la calidad de
un metodo de analisis son la exactitud y la precision. Como la discusion anterior nos ha
mostrado, la exactitud esta relacionada, ademas de con la precision, con una serie de
propiedades secundarias de los metodos de analisis como son:
;;>
La linealidad y el rango lineal
;;> La selectividad ( o especificidad) de la sefial
;;> La existencia de efectos de la matriz
;;> Los limites de deteccion y de cuantificacion
;;>
La inercia del metodo (solidez y robustez)
No todos estos parametres deben ser evaluados en un proceso de validacion complete,
ya que en funcion del objetivo del metodo unos son
mas importantes que otros. La tabla
siguiente muestra que parametres deben validarse en funcion de los objetivos del analisis o
ensayo.
Parametro de calidad Cualitativo Cuantitativo Analisis
de
Parametres
trazas
fisico-quimicos
Exactitud
X X
X
Precision
X X X
Linealidad X
X X
Especificidad/selectivida
X X X
d
Limite de deteccion X
X
Limite de cuantificacion
X
Inercia (robustez)
X X
Fiabilidad X
Definiciones:
a Parametros
e
interes para metodos cuantitativos y semicuantitativos
Exactitud: A menudo se emplea la palabra veracidad, que se define como el grado de
acuerdo entre el valor medido (media de varias replicas) y el valor de referenda
aceptado. Se mide mediante el empleo de materiales de referenda, de blancos de
matriz fortificados, mediante el empleo de metodos de referenda, o mediante ensayos
inter aboratorio.
Precision: Se mide mediante la desviacion estandar relativa, o mediante el parametro
ISO, P, que es 2,83 veces la desviaci6n estandar. Como se apunto anteriormente, se
distinguen tres categorias: la repetibilidad, la reproducibilidad intermedia o la
reproducibilidad
Linealidad:
Se mide mediante la regresion lineal obtenida en el analisis
(preferentemente replicado) de
5
o mas) estandares de calibrado cubriendo entre el
80 y el 120 del rango de concentraciones que se espera que se encuentren las
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_
_
muestras. El rango lineal, es el intervalo de concentraciones en el que la relaci6n entre
la sefial y la concentraci6n se mantiene lineal.
Especificidad/selectividad. No
hay una forma comUnm.ente aceptada de medirlo, y su
medici6n depende del contexto. Un metodo especifico se refiere a que proporciona
sefial para un linico analito. Un metodo selectivo proporciona sefiales diferenciables
para distintos analitos. Un inmunoensayo es el prototipo de metodo especifico. Un
metodo cromatognifico de metodo selectivo.
Limite detecci6n:
Se define como
la
concentraci6n o masa que produce una sefial
igual ala de
la
ordenada en el origen aumentada
en
3 veces
su
desviaci6n estandar.
Limite cuantificaci6n: De forma analoga se defme como
la
concentraci6n o masa que
produce una sefial igual a la de la ordenada en el origen aumentada
en
10 veces su
desviaci6n estandar.
Inercia: La inercia hace referencia a la resistencia que presenta un metodo analitico a
proporcionar valores inexactos cuando se modifica ligeramente el valor operacional
de las condiciones experimentales. Se diferencia entre robustez robustness), referido
a modificaci6n de valores experimentales intrinsecos al proceso, T, pH,
concentraci6n de reactivos auxiliares .. ) y solidez ruggedness), que se refiere a la
modificaci6n de condiciones operacionales extrinsecas lote de producto de partida,
equipo instrumental, operador. ).
b Parametros especificos para metodos cualitativos de analisis
Fiabilidad: Es un parametro exclusivo de los metodos de an<Hisis cualitativo, y se
define como el porcentaje de aciertos de los ensayos realizados
en
alicuotas de la
misma muestra al identificar un analito. Se diferencia entre la relaci6n de falsos
positivos y relaci6n de falsos negativos.
La relaci6n de falsos positivos se define como
la
fracci6n porcentual de falsos
positivos sobre el total de negativos conocidos, esto es,
la
frecuencia con la que un
resultado negativo es err6neamente confundido con uno positivo error alfa).
La
relaci6n de falsos negativos
se define como la fracci6n porcentual de falsos
negativos sobre el total de positivos conocidos, esto es,
la
frecuencia con
la
que una
muestra conteniendo el analito es err6neamente clasificada como ausente. error beta)
4.2.- Tipos de validaci6n
a) Validaci6n intema o intralaboratorio. En ella interviene un linico laboratorio, sea el
que ha desarrollado el metodo, sea un laboratorio que quiere poner
en
marcha un metodo
desarrollado por otro laboratorio. Seglin el grado de conocimiento del metodo a poner en
marcha,
la
validaci6n puede ser:
Prospectiva: realizando un estudio completo de las caracteristicas analiticas del metodo
antes de su puesta en marcha y generalmente tras
su
desarrollo
Chequeos de validaci6n: una serie de pruebas de validaci6n menos completa que las
anteriores, y cuya finalidad es verificar que las caracteristicas documentadas
previamente validadas) del metodo se cumplen. Este tipo de chequeos se realizan
para poner en marcha en ellaboratorio un metodo de analisis originalmente propuesto
por otro laboratorio o instituci6n y del que
ya
existen datos de validaci6n.
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104 V
erreira
Chequeo
de
idoneidad: que son un conjunto de pruebas sencillas que se realizan
de
forma
rutinaria antes o durante cada serie o lote de anruisis
Validacion retrospectiva: El proceso de validacion no es un proceso finito limitado en el
tiempo, sino que es un proceso continuo en el que se van incorporando cada vez mas
datos que aumentan el conocimiento que tenemos tanto del metodo de analisis como
del funcionamiento de dicho metodo en nuestro laboratorio. Un ejemplo, si en un
metodo de anruisis decidimos que una prueba de idoneidad consiste en la inyeccion
(en un HPLC) de una disolucion patron diaria, tras varios afios de trabajo
dispondremos de un conocimiento muy grande del comportamiento de dicha
disolucion patron. Sabremos cual es el tiempo de retencion esperado de cada uno de
los analitos, su desviacion estandar y
el
limite a partir del cual consideraremos que la
columna debe ser cambiada o regenerada. Forman parte tanto de la validacion
retrospectiva como de los chequeos
de
idoneidad
el
uso
de
graficos en los que se
representa la evolucion de ciertos parametros
der
analisis (por ejemplo,
el
tiempo de
retencion, o el factor de asimetria de un pico). Estos graficos se denominan graficos
de
control que seran introducidos posteriormente .
b) V alidacion extema o interlaboratorio. Es un proceso de validacion complejo
acometido por varios laboratorios que realizan los mismos tipos de anruisis empleando los
mismos y en ocasiones distintos) metodos.
El
proceso suele ir coordinado por una autoridad
extema encargada de suministrar muestras similares a todos los componentes y de realizar el
estudio estadistico de los resultados. El resultado de estos ensayos sirve para medir
importantes parametros de los metodos de anruisis (como la exactitud y la precision) de forma
independiente de un Unico laboratorio de analisis.
4.3.-
tapas
en Ia validacion de
un
metodo
En el apartado 3 seguimos una serie
de
pautas para validar una parte fundamental de
un metodo de anruisis cuantitativo, pero no debemos olvidar que la validacion es un proceso
complejo que parte de las necesidades de un cliente potencial, y que acaba con la elaboracion
detallada de un documento normalizado de trabajo denominado Protocolo Normalizado de
Trabajo (PNT o SOP, Standard Operating Procedure) en el que se
hade
documentar todo el
trabajo
de
validacion y
de
control del metodo en cuestion.
La tabla siguiente muestra un esquema general ideal de las etapas seguidas en la
validacion completa de un metodo de anruisis generico.
tapas preliminares
1.- Iden tif icadon del problema 1Necesidades del cliente
2.- Seleccion del metodo Entre los
ya
desarrollados
3.- Desarrollo
de
un nuevo metodo pptimizacion
tapas
de validacion
4.- Precision
4.1 Repetibilidad
IDentro del dia
4.2 Precision intermedia Entre dias (analistas instrumentos)
4.3 Reproducibi lidad Entre laboratorios
5.- Linealidad y rango lineal
iBondad del ajuste
6.- Exactitud: veracidad
iMuestras
de referenda, muestras fortificadas, metodos de
referenda
7.- Limites de deteccion/cuantificacion IEstudio de blancos, determinacion de la sefiallruido
8.- Especificidad/selectividad IEstudio de interferencias
9.- Recuperacion
IMuestras fortificadas
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10.- Jnercia
iffit1uencia de pequefias variaciones en las condiciones operatorias
11.- Jncertidumbre
~ l c u l o en cada una de las etapas
12.- Control de calidad piseiio de los tests a realizar para el
control del metodo
( obligatoriamente blancos, muestras fortificadas ..)
13.- Idoneidad del sistema
~ s t b l e c i m i e n t o de criterios de aceptaci6n de los datos obtenidos en
fase rutina (graficos de control)
Etapas adicionales
14.- Documentaci6n del metodo Escribir todo el trabajo experimental y de validaci6n
15.- Descripci6n de todas las etapas
Preparar los Protocolos Normalizados de Trabajo (PNTs)
16.- Autorizaci6n para el uso del metodo
17.- Revision del metodo Actualizaci6n de los PNTs
5.- ENSAYOS DE CONTROL Y
PUEST EN
M RCH
Durante el proceso de validacion se han de disefiar cuales son los ensayos o pruebas
mas adecuados para realizar el control de calidad de
un
metodo. El control de calidad
realizado por el propio laboratorio agrupa todos los ensayos realizados para supervisar que el
metodo validado mantiene dentro de unos rangos especificados sus caracteristicas de calidad.
Esto incluye una serie de operaciones que deben quedar perfectamente descritas en los
Protocolos Normalizados de Trabajo, como son como deben encenderse los instrumentos, si
se realiza alglin test para verificar su correcto funcionarniento -pruebas de idoneidad del
sistema-, y ademas y fundamentalmente, la introduccion de una serie de muestras de control
dentro de la rutina analitica.
5.1.- Pruebas de idoneidad del sistema
Ironicamente se puede decir que uno de los problemas
mas grandes que nos
encontramos
en
el analisis instrumental, es que los instrumentos siempre proporcionan un
resultado, esten funcionando bien o esten funcionando mal. Esto es, un instrumento analitico
puede estar funcionando de manera defectuosa mucho antes de que los sistemas de
autocontrol del instrumento nos alerten de ello. Esta observacion debe ser tenida muy en
cuenta por todos los que trabajen con frecuencia en un laboratorio instrumental, a fin de que
incorporen como una obligacion inexcusable
la
realizacion de una serie de pruebas,
adicionales a los distintos chequeos que el propio instrumento realiza, antes del comienzo de
cualquier tanda de analisis, no antes de la medicion, sino antes si quiera de la pesada de las
muestras. Proseguir con el analisis de forma deliberada o inadvertida
en
un instrumento que
no esta funcionando de forma correcta es uno de los errores mas graves que se pueden
cometer
en
un laboratorio. En el mejor de los casos se perdera todo el tiempo empleado
en
el
analisis, pero con mucha frecuencia se pueden perder muestras linicas, se puede dafiar el
instrumento, o se puede generar informacion erronea.
El tipo de test dependera obviamente del instrumento y del analisis que estemos
realizando, siendo siempre mucho mas exigentes los requisitos de un analisis de trazas. Hay
instrumentos cuya estabilizacion y verificacion puede llevar mas de un dia (un sistema GC
MS para analisis de trazas), hay otros cuya estabilizacion y verificacion es practicamente
inmediata. En los sistemas mas exigentes se ha de llevar mucho cuidado y ser muy rigurosos,
pues cualquier error en la puesta
en
marcha puede facilmente demorar el trabajo dos o tres
dias. En mi experiencia con instrumentos "dificiles" es conveniente disefiar dos tipos de
pruebas de idoneidad. Una primera dirigida a la evaluacion del sistema de medida y una
segunda dirigida a su capacidad especifica para llevar a cabo el analisis
en
cuestion.
El ensayo para
la evaluacion de sistema debera cumplir una serie de requisitos:
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106
Sencillez y facilidad de preparaci6n
Estabilidad en composici6n
Trazabilidad
Rapido de
ej
ecutar
V.
Ferreira
Capaz de evaluar los parametros mas importantes y criticos del instrumento y
del metodo de
ana Iisis
Ejemplo. La cromatografia HPL en fase normal es una de las tecnicas cuya puesta
en
marcha y estabilizaci6n es mas dificil con una alta dependencia de las condiciones
ambientales y operatorias.
Para la evaluaci6n del sistema decidimos preparar una
disoluci6n facil de preparar de analizar. La disoluci6n contenia vainillina ~ f e n i l e t n o l y
acetato
de
feniletilo en concentraci6n prefijada. Estos tres componentes son estables faciles
de
preparar
de
separar de detectar. Su analisis en condiciones prefijadas nos permitia
evaluar en poco mas de 15 minutos:
a
La
selectividad de la columna
b
La eficiencia de la columna y sistema cromatografico
c La posible existencia de problemas de quimisorci6n
c La sensibilidad del detector y el correcto funcionamiento general del sistema
Esta prueba fue incorporada independientemente del analisis que se fuera a hacer a
continuaci6n como una veri.ficaci6n de
que el sistema funciona correctamente. Despues de
obtener un resultado satisfactorio pero solo entonces se introducia la segunda prueba
especifica
para
el metoda de ana/isis que se fuera a realizar.
5.2. Muestras operaciones de control
El control de un metodo se realiza mediante el analisis por todo o parte del metodo de
una serie de muestras de control.
a
naturaleza de estas muestras depende del caso particular
en que nos encontremos, pero suelen incluir:
Ana.Iisis de disoluciones estandar. Una disoluci6n conteniendo los analitos en un
disolvente apropiado. Esta disoluci6n se empleara habitualmente como parte
de
las
pruebas de idoneidad del sistema anteriormente comentadas. Puede ser interesante
realizar un segundo analisis de esta disoluci6n
al
acabar el lote de muestras para
analizar y antes de apagar el instrumento de medida. De esta forma, dispondremos
de una valiosa informacion acerca del estado real de nuestro sistema.
Analisis de blancos. Un analisis realizado aplicando el procedimiento analitico
completo, pero sin incluir la muestra. Este tipo de ana Iisis son particularmente
importantes en el analisis
de
trazas, y sobre todo en aquellos casos en los que se
conoce la facilidad del sistema para sufrir
algU n
tipo de contaminaci6n. En
realidad podemos distinguir distintos tipos de blancos . El mas completo pero
que no siempre
se
puede conseguir seria una muestra exenta de analito. El
segundo nivel es el blanco de sistema, en el que el procedimiento analitico se
aplica por completo pero sin incluir muestra. Hablaremos con
mas detalle en el
tema del analisis de trazas.
Analisis de muestras reales empleadas como referenda. Una muestra estable
seleccionada por ellaboratorio o un grupo de laboratorios y cuyas propiedades han
sido establecidas de antemano. De nuevo estas condiciones no pueden ser siempre
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conseguidas, pero si es posible se trata
e l
forma mas eficaz de controlar la
calidad de un metodo de amilisis. En algunos casos (muestras clinicas) hay
muestras de este tipo suministradas por empresas. Se trata de materiales cuya
exactitud conocida es inferior a la
e
un CRM, pero que resultan adecuados para
el control
Analisis de muestras sinteticas empleadas como referencia. Una mezcla e
analitos en un medio similar a la matriz, y cuya estabilidad y propiedades
analiticas se han establecido
e
antemano.
Analisis de CRMs. Este tipo de muestras es muy caro, por lo que su uso esta
limitado a la validaci6n y no al control. Sera precise acudir a su uso cada vez que
sea necesario verificar la exactitud del sistema.
Habitualmente se debe introducir una muestra e control por cada serie de analisis, y
el esfuerzo asignado al control no debe superar
el
20 del total.
Ejemplo.
Se ha desarrollado en un cierto laboratorio un nuevo metoda
para Ia
determinacion
del principia activo de un farmaco por HPLC con detecci6n uv-vis. l metoda incluye Ia
trituraci6n del preparado y su disgregaci6n en una disoluci6n agualmetanol a/ 50 . Esta
disoluci6n es .filtrada y se inyecta en el HPLC. El protocola
de
control de calidad del metoda
incluye las siguientes operaciones:
a) (Test de adecuaci6n del sistema) Antes
de
la inyecci6n de muestras en
el HPLC, se inyectara una disoluci6n conteniendo 10,0
mg
/L del principia activo en
metana/. El cromatograma debera mostrar un pico a 12,3 : :
0,
5 min y dar un area de
125000:1:4500 mV, empleando condiciones estandarizadas de trabajo en el HPLC.
b) Cada lote de ami/isis (que comprende 20 muestras) incluira un blanco
preparado con el agualmetanol empleado en la extracci6n, y una muestra
de
referenda.
l
blanco no debera mostrar
ningU.n
pico al tiempo
de
retenci6n del
ana/ito. La muestra de referenda se prepar6 tomando un lote de 1000 pastillas,
triturandolas y homogeneizando el polvo triturado. Seguidamente este polvo
homogeneo se analiza en dias sucesivos, encontrandose que su concentraci6n es
8,2:1:
0,2 mg/L. Por consiguiente, sabemos que el 95 de los resultados de Ia muestra de
referenda estaran en el intervala
8,
2 : :
0,
4
mg
/
L.
5.3.- epresentacion de los datosde control
Los resultados obtenidos en los ensayos de control de calidad se suelen representar en
un diagrama de control. En nuestro ejemplo anterior tendriamos 3 diagramas de control, uno
correspondiente al tiempo e retenci6n de la disoluci6n estandar, otro a su area, y otro
procedente e la concentraci6n e la muestra e referencia. Estos diagramas de control
se
construyen tal y como se indica en la figura:
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108
Area +3S
Linea e acci n superior
13175 ·
Area
+2S
Linea e alerta superior
129500 ·······························································*···*············································· .........................
*
* *
25000·5-- - - - - - - - - - - - - -*- . . . . . - - - -A-r_ea_m_edia
esperada
12050
11825
: J ~ . ~ 9 . : .l : alerta inferior
Area
-2S
Linea e acci n inferior
Area
-3S
V
Ferreira
El diagrama de control resulta de ayuda para detectar la existencia de tendencias o
derivas en el comportamiento de un metodo o de cualquier proceso), ademas de establecer
una forma efectiva
de
determinar cuando el sistema esta dejando de funcionar como se
espera.
Si
un resultado aparece fuera de la linea de alerta, puede ser una cuesti6n aleatoria,
pero si
l siguiente esta tambien fuera de esta linea, debe aceptarse que l metodo esta fuera
de
control. Igualmente, si un resultado cae fuera de Ia linea de acci6n, sabemos que es casi
seguro que l metodo esta fuera de control. De manera analoga, y puesto que en un metodo de
analisis las variaciones se supone que son aleatorias, la presencia consecutiva de un nillnero
grande
de
puntos en la misma region por encima o por debajo de la media), puede ser
indicativa de una falta de control.
Los Protocolos Normalizados de Trabajo deben especificar las acciones a tomar en el
caso
de
que el metodo caiga fuera
de
control. Estas acciones pueden ser muy variadas, y
pueden implicar desde una sencilla operaci6n de mantenimiento mas o menos rutinario
limpieza de un detector, sustituci6n de un fungible...), hasta requerir la revalidaci6n del
proceso
de
analisis.
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Referencias recomendadas:
a Basica general
Estadistica y Quimiometria para Quimica Analitica, 4 Ed. J.C. Miller y J.N. Miller, Pearson
Education, Madrid, 2002
Quimiometria. G. Ramis, C. Garcia. Ed. Sintesis, Madrid 2001
Chemometrics. Matthias Otto. Wiley-VCH, Weinheim, alemania. 1999
b Avanzada
b I .- De Control de Calidad y quimiometria en
Qui
mica Analitica general
Quality Control in Analytical Chemistry. Kateman, G. Buydens, Wiley Interscience. New
York 1993. Una de las obras mas completas y pragmaticas cubriendo todos los aspectos
teoricos y practicos relativos a Ia quimiometria y el control de calidad
Chemometrics. Data Analisis for the laboratory and chemical plant. R.G. Brereton. Wiley
New
Cork, 2003
Handbook of Chemometrics and Qualimetrics.Vol 20 A : D.L. Massart, B. Vandeginste, L.
Buydens, S. DeJong P. Lewi J. Smeyers-Verbeke. (1997) Vol20
B:
B. Vandeginste, D.L.
Massart, L. Buydens, S. DeJong P. Lewi J. Smeyers-Verbeke. (1998) Elsevier. El texto de
referenda mas complete y serio de quimiometria.
b .- Acerca de los rudimentos de las distribuciones de probabilidad y su aplicaci6n en el diseno de
experimentos ANOVA y otras tecnicas):
Estadistica para Investigadores. Box, G.E.; Hunter,
W.G
.; Hunter
J. S.
Ed. Reverte, Madrid
1989. Todo un clasico
Disefio y analisis de Experimentos. D. Montgomery, Iberoamerica. Mexico 1991. Otro clasico
b3.- Acerca de la calidad y su aplicaci6n allaboratorio analitico
Garantia de Calidad
en
los laboratorios analiticos. R. Compafio, A. Rios. Ed. Sintesis, Madrid,
2002
La
calidad en los laboratorios analiticos. M. Valcarcel, A Rios. Ed. Reverte, Madrid 1992
Principios de Quimica Analitica. M. Valcarcel. Ed. Springer Iberica, Barcelona 1999
b4.- Manuales practicos de garantia de calidad en ellaboratorio
Laboratory Quality Assurance System. T.
A
Ratliff. Wiley Interscience.
New
Cork, 2003
A primer Good Laboratory Practice and current Good Manufacturing Practice for Analytical
Laboratories. L.Huber. Agilent Technologies. Germany 2003.
Guidelines for achieving quality in trace analysis. Ed.
Por
M.Sargent and G. Mackay, RSC
1995
b5.- Validaci6n de metodos analiticos
Validation and qualification in Analytical Laboratories. L. Huber. www.labcompliance.com
Development and validation of analytical methods. Ed. Por Riely, C.M.; Rosanske, T.W.;
Pergamon Press 1996. Dedicado particularmente al analisis farmaceutico.
Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. US Dep
.
of Health and Human
Services. www.fda.gov/cvm
b6.- Otros libros de interes
Estadistica aplicada a traves de Excel. C. Perez. Pearson Educacion, Madrid, 2002. Es un libra
practico acerca del manejo de Excel.
General Principles
of
Good Sampling Practice. Ed. N.T.Crosby y I Patel. RSC, 1995.
Contiene una serie de cuestiones practicas acerca del disefio e implantacion de un plan de
muestreo.
Manual de estadistica para quimicos. E.L. Bauer. Alhambra, 1974.
Un
autentico incunable de
estadistica para quimicos. Una
joy
ta
Information Theory in Analytical Chemistry. K.Eckschlager y D.Danzer. Wiley Interscience,
New York, 1994 Una obra para reflexionar acerca del significado de los procesos de medicion
en Quimica Analitica.
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I
DEFINICIONES DE C LID D
I
D Propiedad o con unto de propiedades inherentes a
una
cosa que
permiten apreciarla como igual, mejor o peor que las restantes
de su especie Diccionario Real Academia)
D
Grado de
acuerdo
en
los valores de las
propiedades
de un
producto, proceso o servicio con las
deseadas
de cara a
la
satisfaccion de unas necesidades
ISO)
D Grado en que un conjunto de rasgos diferenciadores inherentes
a
un
proceso cumple con unas necesidades o expectativas
establecidas, generalmente implicitas u obligatorias. lo que
garantiza la calidad del producto o servicio) ISO 9000)
Evolucion historica del papel de a
C LID D
y
su
control
D
Etapa primitiva:
Se inspeccionan todas las unidades
producidas
D
Etapa chisica 1930-1970):
Se introduce el control
estadistico de la calidad y el control estadistico de procesos
D
Etapa moderna 70s-80s):
Aseguramiento de la calidad.
Enfasis en la prevenci6n. Se estudia la totalidad del sistema
D Etapa
contemporanea:
Gesti6n de la calidad como
un
factor
estrategico. Aparici6n del concepto de calidad total
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volucion historica del papel de a C LID D y su control
Objettvo
Metodos epartamentos
Filosofia
Detectar
Estandares de
La calidad se
Primitiva
defectos nonnas
Inspeccion
comprueba
uniformidad
inspecciones
Uniformidad
Tecnicas
La calidad se
Control
optima estadisticas
Produccion controla de
forma optima
Prevenir Programas
y
Departamento de
Aseguramiento
desviaciones sistemas de calidad/ Todos
La calidad se
estudiando el
aseguramiento los
produce
sistema de a calidad
departamentos
Competitividad/
Planificacion
satisfaccion
Estrategica.
Gerencia/todos
La calidad se
Gestion optima los miembros de
necesidades
Movilizacion
Ia organizacion
gestiona
cliente
organizacion
3
Jerarquia
de
terminos y actividades basicas
de
a
garantia
de a calidad
calidad
GARANTIA DE
L
CALIDAD
4
112
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amino bacia sistema
e
a alidad
liil
A quiere comprar un producto a
a
empresa B
liil A se pone de acuerdo con B acerca de las caracteristicas que ha
de tener el producto y el precio que se pagara
liil A se pone de acuerdo con B en quien y como mide dichas
caracteristicas un laboratorio acreditado)
liil A exige a B que le garantice a calidad del producto a lo largo
del tiempo
liil B hace un estudio documentado de su proceso de produccion,
disena un sistema de control y le encarga a supervision a un
auditor que le dara un diploma que satisfara a A
liil B se ve obligado a exigir lo mismo a sus propios proveedores
5
oncepto de caUdad total
Suministradores
mpresa
Clientes
o laboratorio)
Materias primas
Personal
Instalaciones
Producto o servicio
Instrumentos
Equipos
que satisface las
Maquinaria
Procesos
necesidades del cliente
Reactivos etc
Calidad externa
Calidad interna Calidad externa
gesti6n
de la
Calidad Total)
01
Beneficios intemos: Derivados de estructura clara, de funcionamiento 6ptimo
Beneficios extemos: Mejor servicio, mayor eficiencia, mayor control de riesgos
6
113
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Nuevo enfoque
de
Ia calidad
ENFOQUE TRADICIONAL NUEVO ENFOQUE
Cumplir los estandares
Satisfacer las expectativas del
cliente
Cumplir el presupuesto Ai iadir valor
Detectar errores Prevenir errores
lnvertir dinero en calidad
Rentabilizar el dinero en forma de
competitividad
La
calidad requiere tiempo
La
calidad gestiona el tiempo de
forma optima
La
responsabilidad es de unos
La
responsabilidad es de todos
pocos
Elementos basicos de
un
sistema de Ia calidad
POLITICA DE LA CAUDAD
Objetivos y compromiso del organismo respecto a Ia calidad
Formulada
porIa
Direccion del organismo
Revision del
sistema de Ia calidad
PorIa Direccion
lnstalaciones y equipos
antemmiento
Verijicacion CalibraciOn
PROCESOS
Organizaci6n
FomJacion/Cualificacion
l : · · ~ ~ ~ ~ ~ :
Procedimientos
j
Instrucciones
j
\ ...........
~ . & i . . t r Q ~ __________ /
( ''AiiD1
Toilis
··--··
Internas l
t .......... J t ~ M
114
7
8
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omponentes del sistema de
a
calidad
Garantia de calidad Quality Assurance)
Control de calidad Quality Control)
Evaluacion de a calidad Quality Assessment)
M NU L DE CALIDAD
Identidad dellaboratorio; Actividades; Recursos y organizacion; Objetivo
de calidad
Procedimientos generales Procedimientos e
Plan de Evaluaci6n de
UNE 66900/ISO 9000) instrucciones tecnicas BPLs Ia calidad
Documentaci6n,
auditorias intemas, - Procedimientos de analisis Auditorias intemas
Gesti6n de equipos de - Procedimientos de
Auditorias extemas
medida y ensayo,
calibraci6n Sistema de revision del
tratamiento de
- Procedimiento de control program a
reclamaciones de calidad
9
CONCEPTO DE NORMALIZACION
Actividad consistente
en la
elaboracion, difusion y aplicacion de normas
con
el
objeto de:
1. Adaptar los productos, procesos y servicios a sus respectivas fmalidades
2. Evitar las barreras tecnicas a las transacciones comerciales
3. Facilitar la cooperaci6n tecnol6gica entre organismos y paises
4. Proteger
la
salud de las personas y animales y preservar el medio
ambiente
CONCEPTO DE NORMAS
Documentos que contienen especificaciones tecnicas de aplicacion
voluntaria, que son elaborados
por
consenso entre las partes interesadas
fabricantes, administracion, consumidores, universidades y centros de
investigaci6n, asociaciones profesionales , son aprobados
por
un
organismo de normalizaci6n reconocido y estan a disposicion del publico
10
115
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Ejemplos de productos
y
actividades objeto de normalizaci6n
.
Materiales vidrio, plastico, aleaciones)
. Productos aparatos de vidrio, tornillos, tarj etas de credito)
. Maquinas motores, electrodomesticos)
.
Metodos de toma de muestra
. Metodos de medida y ensayo
.
Terminologia relevante para
un
cierto campo
. Unidades del Sistema Intemacional de Unidades
. Sistemas de Gesti6n de la Calidad
.
Sistemas de Gesti6n Medioambiental
. Criterios generales de funcionamiento y evaluaci6n de los laboratorios
de ensayo
Organismos de N ormalizaci6n
FUNCION: Elaborar, revisar, aprobar difundir normas
OrganismosNacionales
AENOR Asociaci6n Espanola de Normalizaci6n Espana
Normas UNE
creada en 1986, tiene 130 comites tecnicos)
AFNOR Association Francaise de Normalisation Francia
ANSI American National Standards Institute USA
BSI British Standards Institution
U
DIN
Deutsches Instituts ft r Normung Alemania
NormasDIN
sec
Standards Council ofCanada Canada
Organismos Supranacionales
CEN Comite Europeo de Normalizaci6n Europa
NormasEN
integra los organismos de 19 paises)
ISO Organizaci6n Intemacional de Normalizaci6n
Normas ISO
integra a 130 paises, tiene 220 comites tecnicos)
ASTM American Society for Testing and Materials
USA
publica anualmente el ASTM standards)
12
116
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Ejempltls de productos
y
. u . : t i v i d a d c s ohjew d ~ nonnalizacL{m
1
r._ t - I { .. ' I . )
,.
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12
116
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Certificaci6n/Acreditaci6n
Certificacion: Proceso en el que un organismo independiente, mediante unos
procedimientos de evaluacion y verificacion, declara formalmente que un producto un
proceso o
un
servicio, debidamente identificado, satisface unos requerimientos
perfectamente especificados a menudo regulados por norma; en este caso reconocimiento
de Ia conformidad a una norma)
Acreditacion: Procesos en el que un
organismo autorizado
, mediante unos procedimientos
de evaluacion y verificacion, reconoce formalmente que una entidad es competente para
realizar unas tareas perfectamente especificadas.
l,Quien certifica?
n
organismo empresa) acreditado p r esta tarea
Certijicaciones importantes: sistemas de calidad conforme a normas ISO 9000
Sistemas de gestion medioambiental conforme a normas ISO 14000
l,Quien acredita?
Un organismo autorizado por
el
gobierno) p r esta tarea
En
Espana: ENAC
3
Certificaci6n/Acreditaci6n
Certificaciones
• Productos
• Servicios
• Sistemas de la calidad ·
• Sistemas de gesti6n
medioambiental
• Personas
• Marcado CE segllil directivas
europeas
campo voluntario)
Acreditaciones
• Laboratorios de ensayo o calibraci6n
• Entidades de certificaci6n
• Entidades de inspecci6n
instalaciones electricas, instalaciones
frigorificas, lTVs, ... )
• Verificadores medioambientales
segllil criterios
UE
761/2001)
• Laboratorios de ensayo que realizan
estudios
en entomos regulados
por
Buenas Pnicticas de Laboratorio
campo ob/igatorio)
4
7
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Normalizaci6n en Europa perspectiva hist6rica
• 1957: Tratado de Roma. Libre circulaci6n de personas y bienes
• 1970-80: Limitaciones reales
ala
libre circulaci6n mediante normas y
especificaciones internas
• 1985: Resoluci6n Consejo de Europa ''Nuevo enfoque . Mecanismos
de control sobre las normas de los paises. Cuerpo de normas europeas
(rango de directivas, restringido a seguridad, salud, medio ambiente .
Calidad de producto regulado
por
normas tecnicas se establece
en
campo voluntario
• 1989: Resoluci6n Consejo de Europa Enfoque global . Condiciones
reconocimiento reciproco de resultados de pruebas de conformidad.
Acreditaci6n organismos evaluadores de la
o ~ f o r m i d a d
Referenda
normativa:
EN
ISO 9000 yEN 45000
• 1993: Creaci6n de la marca de conformidad
CE
• 1995: (en Espana) Laboratorios oficiales de alimentos han
de
acreditarse por ENAC mediante UNE-EN ISO 17025
Sistemas genericos de gesti6n de
l
calidad
SERlE
ISO
9000
../ Son normas que proponen modelos genericos para la implantaci6n y
mantenimiento de sistemas de gesti6n de la calidad
cuyo objetivo es
asegurar que lproducto/servicio satisfara a lo largo del tiempo los requerimientos
preestablecidos)
../ Lanzadas en 1987, revisadas parcialmente en 1994 y totalmente
remozadas en 2000
../
No
defmen las caracteristicas de un producto/servicio
../ Hacen hincapie en los aspectos organizativos (con incidencia en las
caracteristicas del producto)
../ Mas de 400000 empresas/organismos certificados a fmales
del2
(equipos electricos/6pticos, ind. metahirgica, construcci6n, instrumental analitico .. )
SERlE QS 9000 y SERlE EAQF
../ Sistemas especificos de la industria del autom6vil
15
16
8
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ISO 9000
• UNE-EN ISO 9000:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad.
Fundamentos y Vocabulario
• UNE-EN ISO 9001:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad. Requisitos
- Bloque 1: Responsabilidad de Ia direccion
- Bloque 2: Gestion de los recursos
- Bloque 3: Realizacion del producto enfasis en Ia definicion gestion
de los procesos, desde identificacion de requisitos del cliente basta
compras)
- Bloque 4: Medicion, analisis mejora evaluacion de Ia satisfaccion
del cliente, auditorias ...
•
UNE EN
ISO 9004:2000 Sistemas de gesti6n de la calidad. Directrices
para la mejora del desempefio
7
Trabajo en entomos regulados
Si un trabajo experimental se rea/iza en un entorno regulado deberia
ser posible
para
un inspector cuatro o cinco afios despues revisar los
archivos del trabajo y determinar facilmente quien como y
porque
se
realizo
e
trabajo de quien
era
a
responsabilidad que equipo se empleo
los resultados obtenidos que problemas se encontraron y como se
so/ucionaron
D.L. Weller. Anal Proc, 1998, 25: 199
Acreditaci6n
Sistemas regulados por las GLPs obligatorios)
• Sistemas regulados
por
las GMPs obligatorias)
• Sistemas regulados por la norma EN-IS0-17025 optativas*)
• Sistemas regulados por normas de certificaci6n normas ISO 9000) optativas)
*obligatoria para amilisis oficiales de alimentos
Certificaci6n
18
119
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; Quien tiene que cumplir con las regulaciones
GLP/GMP?
• Originalmente disefiadas para estudios de to:xicidad pre-clinicos
• Son generalizables a todos los trabajos realizados con mediciones
analiticas.
OBLIGATORIOS PARA:
Estudios de seguridad no clinicos para el desarrollo de drogas humanas y
veterinarias), aditivos alimentarios, nuevos componentes cosmeticos,
suplementos nutricionales para ganado, productos biol6gicos
Desarrollo de pesticidas agricolas; Desarrollo de quimicos t6xicos; Control
de alimentos aditivos y drogas ); Amilisis y control de explosivos
O OBLIGATORIOS PARA:
Investigaci6n basica; Desarrollo de nuevos metodos de analisis; Ensayos
empleados para derivar las especificaciones de un producto comercial .
Documentos reguladores
• Regulaciones FDA: http://www.fda.gov
• Directivas europeas: http://dg3.eudra.org
• Guias ISOIIEC, guia 25: Requisitos generales para la competencia de
los laboratorios de calibraci6n y ensayo. 1990, 56, CH-1211 Geneve
20. Switzerland. Se puede adiquirir on line en http://www.iso.ch) Este
es el documento basico reconocido intemacionalmente para la
ACREDITACION de laboratorios. Norma ISOIIEC 17025
2
12
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Historia de a calidad en ellaboratorio
Escandalo en los
laboratorios farmaceuticos
1908
1930
1931
1940
Contraste t
TestF
Diagramas de Shewhart
Sistemas de calidad industrial
(USA, 1974)
Nuevos panimetros de control de
la informacion analitica 1970 s
F ormaci6n de la Chemometrics
Redefinici6n Quimica Analitica
( obtenci6n de estrategias 6ptimas)
Evoluci6n de la quimica clinica
(Robotizaci6n y automatizaci6n)
Soci (1972)
Proteccion del consumidor medio ambiente. Hitos
historicos v re lllacion
2
l> Hasta 1974: Se asurne que los laboratorios fannaceuticos reportaban de forma
fiel y exacta los estudios realizados sobre farmacos
l> 1974. Varios escandalos (talidomida y otros). Datos inconsistentes, practicas
de laboratorio irregulares. Defectos en el disei io, conducci6n y docurnentaci6n
de los estudios (Hirsch, 1989)
l> 1976. Se emiten las regulaciones conocidas como GLP bajo el paraguas de
FDA
l>
1983.
La
EPA emite regulaciones similares para productos quimicos agricolas
e industriales
} >
Ambas directrices se incluyen en los protocolos mas generales GMP
} >
1983. La OCDE publica sus propias GLP
} >
1990. annonizaci6n de GLP europea
l>
90s, Establecirniento de acuerdos de reconocimiento bilaterales
2
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Peculiaridades del trabajo dellaboratorio
•
La
medida numerica de
Ia
calidad es dificil, cara y basada en pocas medidas
• Altisima dependencia del factor humano
•
La
mayor parte del personal esta altamente cualificado
• Gran facilidad de cambio de un proceso de anlilisis a otro
PREMISAS
DAJO LAS
QUE
DESCANSAN LAS DUENAS
PRACTICAS DE
LADORA
TO
RIO
• Un analista es capaz de realizar sus medidas de control y de evaluarlas
• Todo trabajador de un laboratorio puede y desea mejorar Ia calidad de sus
resultados
• Se debe establecer un
sistema
que de
a
analista el derecho y el deber de cumplir
conayb
Requisitos para trabajar de acuerdo con LPs
• Nombrar
un
director de estudios para estudios toxicologicos) con
funciones
de
aprobar los PNTs y
de
hacerlos cumplir puede ser o no
el jefe de laboratorio)
• Disponer de
una
unidad de Aseguramiento de la Calidad Quality
Assurance Unit) intema e independiente, designada por la gerencia.
• Disponer de personal cualificado adecuadamente mediante un
programa de formacion
23
• Disponer de Procedimientos Normalizados de Trabajo SOPs o PNTs).
Cubren defmiciones, administracion, operacion tecnica, trabajo con los
equipos
y
metodos de analisis
• Controles
y
sustancias de referencia. Totalmente identificados
concentracion, pureza estabilidad, origen, identidad, concentracion,
condiciones de almacenamiento
y
fecha de caducidad)
4
122
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La U nidad de seguramiento de Calidad
• Funci6n de control intemo,
p r
que instalaciones, personal, metodos, pn1cticas,
archivos, controles, PNTs, informes finales y archivos cumplen
con
lo pre-
establecido
en
GLPs
• Funci6n de correcci6n. Detecci6n y soluci6n de problemas
Actividades:
Mantener una copia del programa de estudios en marcha y de todos los
protocolos de los estudios de los que es responsable
Inspeccionar los estudios a intervalos adecuados, manteniendo informes
escritos adecuados de cada inspecci6n
Remitir periodicamente a la gerencia y al director del estudio informes del
estado de los estudios, problemas detectados y acciones correctoras
Determinar si las desviaciones observadas de los PNTs se realizaron
de
forma adecuada
Auditar el equipo de laboratorio y los informes del director
Los Procedimientos Normalizados de Trabajo
JPNTs oSOPs
25
Procedimientos escritos del programa de trabajo de laboratorio
Incluyen
• Operaciones de inspecci6n, limpieza, mantenimiento y calibraci6n
rutinaria de equipos
• Acciones que deben tomarse en caso de fallo
•
Metodos de analisis
• Defmici6n de los datos base
• Cualificaci6n del personal
•
Precauciones de higiene y seguridad
• Acceso autorizado a los equipos
•
Recepci6n, identificaci6n, almacenamiento, mezclado, muestreo de
muestras y sustancias de referenda
•
Documentaci6n, almacenamiento y recuperaci6n de datos
• Operaciones del personal de aseguramiento de la calidad
6
123
•
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Los Procedimientos Normalizados de Trabajo
PNTs o SOPs)
Se almacenan
en el
laboratorio
itulo
Distribuido a/departamento
Nfunero
Revisados por
los operadores
Numero de revisi6n
Defmenc6mo
se trabaja
PNT
al que reemplaz
-- ---1
Pecha de entrada en vigor
. . ~ : ; ; l
bj<ti
Sello empresa
Escrito por:..............................
Firmas
probado por.. ........................
Revisado por ..........................
Pagina 1
de
X
---1--- N° paginas
27
Otras claves para funcionar bajo GLPs
Disoluciones
y
reactivos:
etiquetadas indicando identidad concentraci6n requisitos de almacenamiento
y fecha de caducidad. En caso de botellas indicar fecha apertura
Sustancias de referenda:
debe conocerse la concentraci6n pureza forma de control estabilidad
se deber etiquetar como anteriormente ademas deben estar sometidas a tests
de pureza identidad y concentraci6n
Datos brutos todo dato necesario para reconstruir el informe final)
cada estudio debe tener su propio cuademo de laboratorio. Las paginas
numeradas y escritura solo en tinta. Las correcciones sin tachones.
Los ficheros originates tambien deben guardarse con una etiquetaci6n
adecuada
Almacenamiento archivo
Datos brutos documentos PNTs protocolos informes fmales y muestras
deben ser almacenados durante tiempo suficiente. Se debe identificar a la
rnn ~ l l P < m ln<: ~ r r . h i v n < :
8
124
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Otras claves para funcionar bajo GLPs
Personal
cada
seccion debe mantener un fichero actualizado con
la
descripcion de los
puestos
de
trabajo de los trabajadores a ella asignados, de su entrenamiento
experiencia, cursos de formacion, ..
deben incluirse los riesgos asociadas a cada trabajo
Equipos
deben
ser
del disefio capacidad apropiados para cumplir
con la
funcion
asignada, y deben estar en un lugar adecuado para asegurar su funcionamiento,
supervision, limpieza y mantenirniento. Debe pasar un
proceso de validacion.
onduccion de un estudio GLP
cada estudio debe tener
un
protocolo escrito antes de su comienzo. Cualquier
cambio justificado debeni estar documentado y autorizado
por
el director.
Las
muestras se identificaran adecuadamente, los datos se registraran directa y
nipidamente en tinta, cada
set
debe
ir
fechado firmado. Cualquier
correccion debe no oscurecer el original e
ir
tambien fmnada.
Validacion
Defmicion general
Evaluacion de procesos, productos o metodos de analisis para verificar que
cumplen los requisitos establecidos
Defmicion especifica para metodos de analisis
Proceso basado en estudios sistematicos de laboratorio mediante el que se
pone
de manifiesto
que
·
un
metodo analitico determinado posee
unas
caracteristicas de funcionamiento adecuadas a la aplicacion que se
le
quiere
dar
Que
debe validarse?
Los equipos, el software, los sistemas, los metodos los datos
validacion del equipo software: chequeo de acuerdo a las especificaciones
documentadas
validacion de metodos: determinacion de las caracteristicas analiticas del
metodo
sistema analitico instrumento, computador y metodo ,
test
de verificacion
datos: verificar
la
recepcion, archivado almacenamiento
de
los datos, para
garantizar su consistencia, integridad trazabilidad
personas. V erificar que tienen
la
formacion experiencia adecuada
estandares. V erificar pureza, identidad, concentracion estabilidad
2 :.1
30
125
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Validaci n
L,Cuando?
Instrumentos: antes del uso en rutina, despues de reparaciones y a intervalos
de tiempo regulares
Ordenadores y software: durante la instalaci6n, antes y durante uso de rutina y
tras cada update ·
metodos de anlilisis: antes del uso en rutina, despues de cada cambio. Ademas
debe realizarse un test de verificaci6n antes y durante cada uso rutinario
L C6mo?
Elaboraci6n de un plan de validaci6n
Formaci6n de equipos de validaci6n para instrun1entos complejos identificar
los equipos que requieren validaci6n, establecer prioridades, revisar el plan,
establecer procedimientos para la validaci6n de sistemas informaticos)
Elaborarun inventario incluyendo el estado de cada sistema en cuanto a
validaci6n
Establecer las especificaciones requeridas para cada instrumento
comparandolas con las especificaciones del fabricante
Establecer los tests de eficiencia requeridos para medir
la
calidad de las
especificaciones
Establecer los sistemas de archivo requeridos
por
GLP
Cuando debe validarse un metodo
I
Inmediatamente tras su desarrollo
Validaci6n completa:
r = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ~ ~ ·
intra/aboratorio o inter/aboratorio)
Al cambiar alguna condici6n operatoria
o al poner en marcha un metodo
validado en otro laboratorio)
l
ponerlo en marcha tras un cierto
periodo
Validaci6n parcial:
chequeo de va/idaci6n)
Validaci6n minima:
chequeo de idoneidad)
Operaciones de control
~ ~
Identificaci6n problema y
Durante su uso normal
Si el control indica resultados
defectuosos
chequeo de validaci6n
31
32
126
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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Ejempltls de productos
y
. u . : t i v i d a d c s ohjew d ~ nonnalizacL{m
1
r._ t - I { .. ' I . )
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12
116
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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6Que validar?
Panimetro de calidad Cualitativo Cuantitativo
Anallsis ae
x ~ m ~ t r o s
trazas
fis1co-qu m1cos
c
Jrxactitud
-..
X
Precision
X
r Jmite
de
detecci6n
X
Linealidad
X
Especificidad/selectividad
;
X X
Limite de cuantificaci6n
]
Inercia robustez)
,;:
X
Incertidumbre
00
X
X
REGLAS DE ORO DE LA VALIDACION:
../ Validar el metodo completo
X X
X X
X
X X
X
X
X
X X
../ Validar todo el rango de concentraciones objeto de estudio
../ Validar el metodo en todas las matrices objeto de estudio
6Como verificar
la
exactitud de
un
metodo?
33
1. La exactitud requiere que no haya interferencias y que se conozca perfectamente
la relaci6n entre la Sefial y la Concentraci6n funcion de calibraci6n)
2. La presencia/ausencia de· nterferencias esta ligada ala complejidad de la
muestra y a la selectividad de la tecnica de analisis. En muestras simples se
puede verificar mediante el estudio de muestras sinteticas. En muestras
complejas s6lo puede verificarse:
1. Mediante muestras certificadas de identica
estructura
matricial
2.
Comparando
datos con los de un metodo libre de interferencias
3. Empleando
una
tecnica de analisis que proporcione una seiial multidimensional
caracterfstica del analito
3. La relaci6n Sefial-Concentraci6n se puede estudiar mediante el analisis de
muestras sinteticas calibrados), de muestras dopadas o adicionadas) o mediante
experimentos de adici6n estandar. Los efectos matriz son la distorsi6n mas grave
que puede afectar a nuestro conocimiento de la relaci6n SIC
4. Por otra parte, la exactitud se puede comprobar pero no diagnosticar) mediante
el analiSlS de muestras de referencia, 0 por comparaci6n con metodos de
exactitud verificada
34
127
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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razabilidad de un metodo o resultado
() a-d _@
Alicuota Muestra Alicuota
~ ~ ~
Resultado
muestra d d d
p e s t ~ p ~ _ o ; J ~
Balanza
calibrada
Q
Masa
--<::" ;:
Alicuota
Analito med1da
patron
-
-
o
Reoptimizaci6n
Cambio metodo
UsoS .I.
Estudio interferencias aditivas
Estudio recuperaci6n
Estudio interferencias
L - - - - - - - - - 1
proporcionales
efectos de matriz y otros)
128
5
6
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Evaluacion
de
la exactitud de un metodo
validacion)
o Estudiar la relaci6n entre concentraci6n sefl al
o Determinar el rango dinamico del metoda
o Determinar
la
presencia de interferencias
o Determinar
la
existencia de efectos de
la
matriz
o Seleccionar
la
funci6n
de
calibraci6n
o Evaluaci6n de la inercia robustez) y comportamiento a largo
plaza
o Determinacion de parametros que deben ser controlados
Exactitud: Presencia/ausencia de interferencias
Muestras simples interferentes potenciales conocidos)
-
studiar
Ia seftal en
~ u s e n c i
de analito con los potenciales interferentes
- Ejemplo 1: Determinaci6n
deMo
en un metal o aleaci6n
por
EAA. Los
7
interferentes potenciales son el resto de metales presentes en Ia aleaci6n.
studiar
seiial de Mo en disoluciones sinteticas conteniendo los otros metales.
- Ejemplo
:
Determinaci6n de un principia activo
en
un farmaco
por
HPLC.
Interferentes potenclales:
Otros
principios activos presentes en el farmaco y
excipientes.
studiar
seftal del analito en ausencia de analito y presencia de
excipientes y otros principios activos
Muestras complejas interferentes potenciales desconocidos)
- Ejemplo 1: Analisis de contaminantes. Empleamos muestras libres de
contaminantes
para
estudiar Ia seftal. Determinaci6n GC-ECD de pesticidas
organoclorados en agua
- Ejemplo
:
Determinaci6n GC-MS en modo scan) de Ia oxima de E)-2-
nonenal en harinas
- Ejemplo 3: Analisis de anabolizantes por inmunoensayo. Confirmaci6n por
HPLC-MS
2
- Ejemplo 4: Analisis de Hg
en
material vegetal. Confirmaci6n
por
analisis de
muestras certificadas
38
129
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Muestra
preparada
Recuperaci6n
Muestra
Muestra
~
1
1
1
1
Disoluci6n
conteniendo
~
@
6
l
I
_Incren1ento
i l l ~
Recuperaci6n =
6
Recuperacion de etil benceno en SPE o SPME
lOmL
10
mL
agua
+
100 o 900
ng
39
r
1
1
1
Disoluci6n conteniendo
100 o 900
ng
Muestra
preparada
Recuperaci6n
=
6
Metodo SPE:
bajo nivel: 83
Alto nivel: 85
ncremento
i l l ~
Metodo SPME:
bajo nivel:
5
Alto nivel: 7
4
130
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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Exactitud: Efectos matriz
Tras determinar la relaci6n sei l.al/concentraci6n con calibrados sinteticos, y tras
determinar que no hay interferencias, debe comprobarse que la relaci6n
sei l.al/concentraci6n
no
cambia al cambiar de matriz. Posibilidades:
1 Comprobation que Ia pendiente de Ia recta de adicion no difiere de Ia de
calibrado con patrones sinteticos
o
equivale a demostrar que Ia
concentration determinada por interpolation extrapolation no difieren)
2 Mediante un experimento
estandar
de recuperation: Aditiones de masas
conotidas de analito a distintas muestras. Se analizan las muest ras las
muestras aditionadas. El incremento de area se interpola en Ia recta de
calibrado de patrones
para
determinar Ia masa adicionada. La relacion entre
Ia masa adicionada determinada Ia real se determina recuperati on. No debe
diferir de 100
3. Mediante un experimento de
recuperation
con muestras b lancas Oibres del
analito) aditionadas. Como antes, se analizan las muestras conteniendo
cantidades conocidas de analito. Las masas determinadas se comparan con las
aiiadidas determinando Ia recuperation
41
EFECTOS M TRIZ
Rel. S/C esperada en muestras
V ariabilidad entre muestras
Recta de calibrado
con estandares
Concentraci6n
42
3
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Recuperaci n de Sefial
Muestra
1
1
Muestra preparada
Muestra
Ca
1
ncremento
sefial
Recta de calibrado
pasa por origen)
concentraci n
I
Recuperacion
=
CiCa
Recta de calibrado
4
Exactitud Efectos matriz mediante adici n
estandar
Datos obtenidos en
un
experimento de
adici6n estlindar y en una recta de calibrado
para verificar Ia presencia de efectos
de
Ia
matriz.
Pendiente recta calibrado: 2,3173±0,184
Pendiente recta adici6n: 2,3554±0,195
t=0,42, diferencia no significativa
Concentraci6n determinada por
interpolaci6n: 0.498±0,09
Concentraci6n determinada por
extrapolaci6n: 0,493±0,10
No difieren significativamente. El metodo
esta libre de efectos de Ia matriz
Creal o
afiadida
ng/mL)
0
0,1
0,3
0,6
0,9
1,2
Sefial Sefial
Calibrados
Adici6n
estandar
0
1,175
0,253 1,423
0,75 1,8
1,453 2,6
1,992 3,284
2,856
44
132
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Exactitud. Efectos matriz mediante dopados
Seis muestras de grasa han sido dopadas con cantidades conocidas de un aldehido . Se
ha
determinado el contenido en este aldehido en las muestras dopadas sin dopar. Los
resultados son los siguientes:
Muestra C (muestra) C (dopada) Adicionado Adicionado
ng/mL ng/mL determinado real
1 5,4 19,4 12 14
2 7,8 20,8 14
3
3 1,2 16,2 13
5
4
19,4
30,4 14
5
46
59
12
3
6 9,3 25,3 15 16
Un simple test por parejas comparando las concentraciones adicionadas, real determinada, da
los siguiente resultados: media diferencias=0,33; desviaci6n diferencias=1,97; t=0,42; no
significativo
45
ateriales de referencia
Material o sustancia que tiene una o varias de sus propiedades suficientemente
bien establecidas como para calibrar un instrumento, validar un metodo o
asignar valores a un material.
Terminos relacionados: Material de Referencia Certijicado
Sustancia patron: Patron primario (99.98 ) o estdndar de trabajo
(>99 )
Requisitos: Homogeneidad, Estabilidad, Exactitud, Trazabilidad, Similitud
Uso: Son materiales caros de alta calidad no empleados de forma rutinaria en
control de calidad.
Organismos suministradores:
National Institute ofStandards and Technology NISI)
http://ts.nist.gov/srm
Community Bureau ofReference (BCR) http://www.irmm.jrc.be/
Laboratory of he Government Chemist (LGC) http://www.lgc.eo.uk/
Laboratoire National d Essais (LNE) http://www.lne.fr/
46
133
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Evaluaci6n de Ia precision
Grado de concordancia entre los resultados de ensayos independientes obtenidos
en unas condiciones bien defmidas IUP
AC
1998, ISO 1994 .
Se mide mediante una desviacion estandar.
Se distinguen tres niveles de conocimiento:
- Repetibilidad: Obtenida mediante el analisis replicado de una o varias
muest ras a lo largo de una misma serie de medidas
- Reproducibilidad intermedia: Obtenida mediante el analisis replicado de una
o
varias
muestras a lo largo de distintos dias y/o distintos instrumentos y
operadores
- Reproducibilidad: Obtenida mediante el analisis replicado de
una
o varias
muestras por distintos laboratorios empleando el mismo metodo
Puesto que la precision de la medicion depende de la concentracion de analito,
debe realizarse el estudio a niveles de concentracion diferente si el rango de
estudio es alto). Esto tiene ademas repercusiones sobre la calibracion
Si se estudian ademas distintas matrices la precision debe determinarse en todas
ell as
47
Ejemplo. Validaci6n de un metodo
por
comparaci6n con otro
referenda
Determinacion deN en piensos. Metodo de referencia: Kjeldahl; Metodo a prueba: Dumas
modificado
Muestra Dumas Kjeldahl
t
Diferencia
n=5) n=3)
Maiz
7,55 ±0,25
7,28±0,09 1,81 0,27
Cebada
10 ,54±0,06 10,63±0,08
1,92 -0, 9
Guisantes 18 ,20±0,30
17,89±0,10 1,69 0,
31
Semilla girasol 25,95±0,47 26,04±0,11 0,32 -0,09
Harina soja 38 ,88±0,45 38,73±0,44
0,41 0,04
Harina carne 51,83±0,59 51 ,83±0,25
0,02 0,15
Harina pescado 71 ,
55
±0,52 71,48±0,21 0,02
0
Pienso delicias 27,09±0,20 27,05±0,06 0,34 0,07
• Exactitud: La prueba t no muestra diferencias. La prueba t por parejas tampoco t=1,54). La
regresion de los resultados de ambos metodos da como pendiente 0,9986±0,007 y como
ordenada en el origen 0,126±0,25
• Precision: La varianza ponderada para el metodo dumas es 0,155; para Kjeldahl 0,0425. El
cociente F
3
,63) es significativo con p<0,05 48
34
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Puesta en funcionamiento de
un
metodo de analisis
Una vez optimizado validado,
la
puesta en marcha debe incluir:
Un sistema de verificaci6n de Ia idoneidad del sistema
Un sistema de control de Ia calidad de los resultados
Un sistema de archivo de resultados de control, que sirva para su evaluaci6n y
mejora continua
Chequeos de idoneidad
Son pruebas sencillas que permiten asegurar que el sistema en su conjunto reactivos,
instrumentos, operadores) estan listos para trabajar de forma adecuada. Sin no
proporcionan resultado positivo NO
se
puede proceder al anal isis
- Dependen del tipo de metodo y de los puntos criticos que se hayan o se vayan detectando)
- Son pruehas que se realizan ANTES del anlilisis
- Suelen consistir
en
el analisis en condiciones identicas a las de las muestras,
de
muestras
sinteticas de facil preparaci on y trazabilid ad
-
Su
objetivo mas frecuente es verificar el comportamiento del sistema instrumental , y son
mas importan tes y costosos cuanto mas complejo e inestable es este GC, HPLC).
En
ocasiones pueden incluir estudio de pureza
de
reactivos, de actividad enzimatica
- Ejemplos: Inyeccion en GC de una disolucion sintetica de concentracion conocida
para
evalua r tiempos de retencion, anchura de picos y seftal
- Analisis de un patron
de
concentracion conocida en EAA
49
Puesta en funcionamiento de un metodo de analisis
Pruebas de control de calidad de los resultados
Son un conjunto de pruebas que se realizan de manera simultanea o en el mismo lote) al
analisis de las muestras. Su fmalidad es demostrar que durante ese lote de analisis o en esa
muestra en particular el metodo de analisis funcion6 correctamente . Su evaluaci6n es por
tanto, a posteriori. Si Ia prueba no
es
satisfactoria, el resultado del analisis debe descartarse
- Como anteriormente, el tipo y naturaleza de pruebas depende del caso particular y
de los pasos que
se
hayan identificado se vayan identificando) como problematicos
- En las tecnicas de analisis multicomponente se pueden real izar las pruebas de
manera
simultanea
al
analisis de Ia muestra
- Son pruebas que se realizan AL MISMO TIEMPO que el analisis de las muestras
- Posibles pruebas son:
• El analisis de muestras sinteticas calibrados)
• El analisis de muestras adicionadas
• El analisis de muestras de referencia intema o externa)
• El analisis de blancos
• La inclusion de compuestos de control estandares o surrogados)
s
135
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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Seguimiento hist6rico de los panimetros de
control
dia2ramas de
Shewhart
e
escogen los parametros de control mas adecuados, se miden a lo largo de un cierto
periodo, y se determina su media y su desviaci6n. Con esos datos se construyen los
diagramas
de
control, tal y como se muestra a continuaci6n
AICa 3S
1317SO
129SOO
125000
12 SOO
118250
rea -3S
Area lS
inea de
occ1cin
pcnor
°de lote
136
51
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Tabla : Area de la cola
l
derecha de
un cierto valor z en la distribuci6n
normal estandar.
z 0 00
0 01 0 02 0 03
0 0
0,5000 0,4960 0,4920 0,4880
0 1 0,4602 0,4562 0,4522
0,4483
0 2 0,4207 0,4168 0,4129
0,4090
0 3
0,3821 0,3783 0,3745 0,3707
0 4
0,3446 0,3409 0,3372 0,3336
0 5 0,3085 0,3050
0,3015
0.29a1
0 6
0,2743 0,2709
0,2676 0,2643
0 7
0,2420 0,2389 0,2358 0,2327
0 8
0,2119 0,2090 0,2061 0,2033
0 9
0,1841 0,1814 0,1788 0,1762
1 0
0,1587 0,1562 0,1539 0,1515
1 1
0,1357 0,1335
0,1314 0,1292
1 2 0,1151 0,1131 0,1112 0,1093
1 3 0,0968 0,0951
0,0934 0,0918
1 4 0,0808 0,0793 0,0778 0,0764
1 5
0,0668 0,0655 0,0643 0,0630
1 6 0,0548 0,0537 0,0526
0,0516
1 7 0,0446 0,0436 0,0427 0,0418
1 8 0,0359 0,0351 0,0344
0,0336
1 9
0,0287 0,0281 0,0274 0,0268
2 0
0,0228 0,0222 0,0217 0,0212
2 1 0,0179 0,0174 0,0170 0,0166
2 2 0,0139 0,0136 0,0132 0,0129
2 3 0,0107 0,0104
0,0102
0,0099
2 4
0,0082 0,0080
0,0078 0,0075
2 5 0,0062 0,0060 0,0059 0,0057
2 6 0,0047 0,0045 0,0044 0,0043
2 7 0,0035 0,0034 0,0033 0,0032
2 8 0,0026 0,0025 0,0024 0,0023
2 9
0,0019 0,0018 0,0018
0,0017
3 0
0,0013
0,0013 0,0013 0,0012
3 1
0,0010
0,0009
0,0009 0,0009
3 2 0,0007 0,0007 0,0006 0,0006
3 3 0,0005 0,0005 0,0005 0,0004
3 4 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003
3 5 0,0002 0,0002
0,0002 0,0002
3 6 0,0002
0,0002 0,0001 0,0001
3 7 0,0001
0,0001 0,0001 0,0001
3 8 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
3 9
0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 09
0,4840 0,4801 0,4761 0,4721 0,4681 0,4641
0,4443
0,4404
0,4364 0,4325
0,4286 0,4247
0,4052
0,4013
0,3974 0,3936 0,3897 0,3859
0,3669 0,3632 0,3594 0,3557 0,3520 0,3483
0,3300 0,3264 0,3228 0,3192 0,3156 0,3121
0,2946 0,2912 0,2877 0,2843 0,2810 0,2776
0,2611 0,2578 0,2546 0,2514 0,2483 0,2451
0,2296 0,2266 0,2236 0,2206 0,2177 0,2148
0,2005 0,1977 0,1949 0,1922 0,1894 0,1867
0,1736 0,1711 0,1685 0,1660 0,1635 0,1611
0,1492 0,1469 0,1446 0,1423 0,1401 0,1379
0,1271 0,1251 0,1230 0,1210 0,1190 0,1170
0,1075
0,1056 0,1038 0,1020 0,1003 0,0985
0,0901
0,0885 0,0869 0,0853 0,0838 0,0823
0,0749 0,0735 0,0721 0,0708 0,0694 0,0681
0,0618 0,0606 0,0594 0,0582 0,0571 0,0559
o
0,0495 0,0485 0,0475 0,0465 0,0455
0,0409 0,0401 0,0392 0,0384 0,0375 0,0367
0,0329
0,0322 0,0314 0,0307 0,0301 0,0294
0,0262 0,0256 0,0250 0,0244 0,0239 0,0233
0,0207 0,0202 0,0197 0,0192 0,0188 0,0183
0,0162 0,0158 0,0154 0,0150 0,0146 0,0143
0,0125 0,0122
0,0119
0,0116 0,0113 0,0110
0,0096
0,0094
0,0091
0,0089
0,0087
0,0084
0,0073 0,0071 0,0069 0,0068 0,0066 0,0064
0,0055
0,0054
0,0052
0,0051 0,0049 0,0048
0,0041 0,0040 0,0039 0,0038 0,0037 0,0036
0,0031 0,0030 0,0029 0,0028 0,0027 0,0026
0,0023 0,0022 0,0021 0,0021 0,0020 0,0019
0,0016 0,0016 0,0015
0,0015 0,0014
0,0014
0,0012 0,0011 0,0011 0,0011 0,0010
0,0010
0,0008 0,0008
0,0008
0,0008 0,0007 0,0007
0,0006 0,0006 0,0006 0,0005 0,0005 0,0005
0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0003
0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0002
0,0002
.0,0002
0,0002 0,0002 0,0002 0,0002
0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
0,0000 0,0000 0,0000
0,0000 0,0000 0,0000
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
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V Ferreira
Tabla 2: Distribuci6n t de Student de dos
colas Valores de t que dejan fuera del
intervalo central
un
cierto porcentaj e de
elementos de l poblaci6n
dos colas
rados lib 0,25
0 1
1 2,41 6,31
2 1,60 2,92
3
1,42 2,35
4 1,34 2,13
5
1,30 2,02
6
1,27 1,94
7 1,25
1,89
8 1,24
1,86
9 1,23 1,83
10
1,22 1,81
15 1,20
1,75
20
1,18
1,72
30
1,17 1,70
50 1,16 1,68
Tabla 3: Distribuci6n t de Student de
una cola Valores de t que dejan a su
derecha un cierto porcentaje de
elementos de l poblaci6n
una cola
rados lib 0,25 0 1
1 1,00 3,08
2 0,82 1,89
3
0,76 1,64
4 0,74 1,53
5 0,73 1,48
6
0,72 1,44
7 0,71 1,41
8
0,71 1,40
9 0,70
1,38
10 0,70 1,37
15 0,69 1,34
20 0,69 1,33
30 0,68 1,
31
50
0,68 1,30
0,05
12,71
4,30
3,18
2,78
2,57
2,45
2,36
2,31
2,26
2,23
2,13
2,09
2,04
2,01
0,05
6,31
2,92
2,35
2,13
2,02
1,94
1,89
1,86
1,83
1,81
1,75
1,72
1,70
1,68
.138
0,025
0,01 0,001
25,45 63,66 636,62
6,21 9,92 31,60
4,18 5,84
12,92
3,50
4,60 8,61
3,16
4,03 6,87
2,97 3,71 5,96
2,84 3,50 5,41
2,75 3,36 5,04
2,69 3,25 4 78
2,63 3,17 4,59
2,49 2,95 4 07
2,42 2,85 3,
85
2,36
2,75
3,
65
2,31 2,68 3,50
0,025
0,01 0,001
12,71 31,82 318,31
4,30 6,96 22,33
3,18
4,54 10,21
2,78 3,75 7,17
2,57
3,36 5,89
2,45 3,14 5,21
2,36
3,00 4,79
2,31 2,90 4,50
2,26 2,82 4,30
2,23 2,76 4,14
2,13 2,60 3,73
2,09 2,53 3,55
2,04 2,46 3,39
2,01 2,40 3,26
7/21/2019 Conceptos Basicos de Quimiometria y Control de Calidad en Quimica Analitica
http://slidepdf.com/reader/full/conceptos-basicos-de-quimiometria-y-control-de-calidad-en-quimica-analitica 139/139
Grados
Tabla 4. Distribuci6n F de 1 cola. Valores de F que dejan a su derecha u 5 de los
elementos de la poblaci6n
rados libertad numerador
1 2 3 4 5
6
7 8 9
10 12
15 20 25 50
Iibertad 1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 243,9 245,9 248,0 249,3 251,8
denomi
2 18 51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40
19 41
19,43 19,45 19,46 19,48
nador 3 110,13 9,552 9,277 9,117 9,013
8 941
8,887 8,845 8,812 8,786 8,745 8,703 8,660 8,634 8 581
4 7,709 6,944 6 591 6,388 6,256 6,163 6,094
6 041
5,999 5,964 5,912 5,858 5,803 5,769 5,699
5 16,608 5,786 5,409 5,192 5,050 4,950 4,876 4,818 4,772 4,735 4,678 4,619 4,558
4 521
4.444
6 5,987 5,143 4,757 4,534 4,387 4,284 4,207 4,147 4,099 4,060 4,000 3,938 3,874 3,835 3,754
15 591 4,737 4,347 4,120 3,972 3,866 3,787 3,726 3,677 3,637 3 ,575 3 511 3,445 3,404 3,319
8 5,318 4,459 4,066 3,838 3,687 3 581 3,500 3,438 3,388 3,347 3,284 3,218 3,150 3,108 3,020
9 15,117 4,256 3,863 3,633 3,482 3,374 3,293 3,230 3,179 3,137 3,073 3,006 2,936 2,893 2,803
10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,135 3,072 3,020 2,978 2,913 2,845 2,774 2,730 2,637
11 14,844 3,982 3,587 3,357 3,204 3,095 3,012 2,948 2,896 2,854 2,788 2,719 2,646
2 601
2,507
12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,913 2,849 2,796 2,753 2,687 2,617 2,544 2,498 2 401
13 14,667 3,806 3 411 3,179 3,025 2,915 2,832 2,767 2,714 2 671 2,604 2,533 2,459 2,412 2,314
14 4,600 3,739 3,344 3,112 2,958 2,848 2,764 2,699 2,646 2,602 2,534 2,463 2,388 2 341 2 241
15 14,543 3,682 3,287 3,056
2 901
2,790 2,707
2 641
2,588 2,544 2,475 2,403 2,328 2,280 2,178
16 4,494 3,634 3,239 3,007 2,852 2 741 2,657 2,591 2,538 2,494 2,425 2,352 2,276 2,227 2,124
17 14,451 3,592 3,197 2,965 2,810 2,699 2,614 2,548 2,494 2,450 2 381 2,308 2,230
2 181
2,077
18 4,414 3,555 3,160 2,928 2,773 2 661 2,577 2,510 2,456 2,412 2,342 2,269 2 191 2 141 2,035
19 14,381 3,522 3,127 2,895 2,740 2,628 2,544 2,477 2,423 2,378 2,308 2,234 2,155 2,106 1,999
20
4 351
3,493 3,098 2,866
2 711
2,599 2,514 2,447 2,393 2,348 2,278 2,203 2,124 2,074 1,966
25 14,242 3,385 2 991 2,759 2,603 2,490 2,405 2,337 2,282 2,236 2,165 2,089 2,007 1,955 1,842
50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,199 2,130 2,073 2,026 1,952
1 871
1,784 1,727 1,599
Tabla 5. Distribuci6n F de 2 colas. Valores de F que dejan a
su
derecha
u
2,5 de los
elementos de la poblaci6n, dejando fuera un 5 en total.
rados libertad numerador
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 20 25 50
Grados
1 647 8 799,5 864,2 899,6 921,8 937 1 948 2 956
7
963,3 968,6 976,7 984,9 993 1 998 1 1008 1