Detección de Mutaciones
y diagnóstico prenatal
Curso de Genética Molecular
Ciencias Biológicas
Universidad de Jaén
Detección de mutaciones: Objetivos
•Detección de enfermedades hereditarias
•Detección de polimorfismos asociados a predisposición frente
a enfermedades
•Detección de polimorfismos genéticos asociados a resistencias a
•enfermedades
•Genética forense: Identificación de haplotipos específicos
•Genética de poblaciones: Caracterización molecular de
poblaciones humanas
•Farmacogenómica: Polimorfismos genéticos asociados a
respuesta diferencial a fármacos
Detección de mutaciones: Técnicas clásicas
•RFLP: Anemia falciforme
•PCR específica de alelo: Microorganismos resistentes a drogas
(usa la variante Stoeffel de la Taq polimerasa)
•ASO (Allele Specific Oligonucleotide Hybridization)
•Fluorímetro acoplado al termociclador
•Medición fluorescencia directa del tubo de
PCR
•Varios tipos de marcaje fluorescente del
producto de PCR
Específico: TAQMAN, Scorpions, etc...
Inespecífico: SYBR green
PCR en tiempo real
Detección de mutaciones: Fluorescent ResonanceEnergy Transfer (FRET)
Transferencia de energía dependiente de la distancia entre dos fluorocromos adyacentessin emisión de un fotón. El donador y aceptor deben estar muy próximosEl espectro de excitación del aceptor debe
solapar el espectro de emisión del donadorEl dipolo de transición del donador y aceptor
deben estar en paralelo
Detección de mutaciones: Rotura química o enzimática del heterodúplex
TCAGCAGCCG
TCGGCAGCCG
TCGGCAGTCG
TCAGCAGTCG
TCGGCAGCCG
ADN silvestremarcado
TCAGCAGTCG
ADN mutante
mezclar, desnaturalizar y renaturalizarCuatro productos posibles
Añadir un agente modificante específico de cadena simple, pe hidroxilamina (específico de C)Añadir una endonucleasa de cadena simple
sin modificación sin modificación sin modificaciónTCAGCAGCCG
Desnaturalizar, romper con piperidina y separar por gel
Silvestre Heterocigoto Mutante
Hibridación individuos mutantes
Hibridación ADN individuos silvestres
Oligo hibridación perfectaOligo mutación interna
Secuencia de referencia
Detección de mutaciones: Microarrays de oligonucleótidos
Imagen real después de escáner
Prevención de las enfermedades genéticas
SituaciónAlgunas enfermedades genéticas pueden ser tratadas con
mayor o menor éxito, sin embargo la mayoría son incurables. El patrón de transmisión de estas enfermedades es predecible
en muchos casos
ConclusiónLa prevención es el mejor sistema para manejar las
enfermedades genéticas
La prevención incluye
Chequeo genético (screening)Consejo genético
Diagnóstico prenatal
Chequeo genético (screening)
Detección precoz de homocigotos enfermos:dependiente de test baratos, algún beneficio en el diagnóstico y
consejo genético dada la probabilidad de que otros miembros de la familia puedan estar afectados. Ejemplos: fenilcetonuria,
homocistinuria, galactosemia, fibrosis quística, hipotiroidismo y anemia falciforme.
Detección de heterocigotos portadores:Se aplica a poblaciones con una alta frecuencia de portadores y
permite el diagnóstico prenatal y la selección de hijos no enfermos. Ejemplo: Tay-Sach enfermedad incurable común en poblaciones
judías (1/20 portadores)
Chequeo genético
Extracción de sangre total y aislamiento de células mononuclearesExtracción de fibroblastos de piel a partir de biopsia
Extracción directa de ADN genómico o ARN
Análisis de mutaciones o anomalías cromosómicas
Inmortalización convirus de Epstein-Barrgeneración de líneas
celulares
Consejo genético I
¿Para quién?
Parejas con familiares afectados por una enfermedad hereditaria que desean conocer la probabilidad de tener descendencia enferma
Parejas pertenecientes a grupos o poblaciones de riesgo
Pasos previosRevisar los informes clínicos previos
Preparar un pedigrí para determinar el patrón de herencia (autosómicos dominantes, recesivos, ligados al X, anomalías cromosómicas). No puede realizarse consejo genético para
enfermedades con origen multifactorial (malformaciones congénitas, arteriosclerosis, enfermedades mentales, etc...)
Resultados:Cálculo de probabilidadesOpciones reproductivas
Casos simples:
autosómica dominante o recesiva y ligado al X, fáciles de calcular
normalmente pueden ser enfermedades muy raras
Consejo genético I I
Casos complicados:
no se heredan de manera simple y el riesgo de recurrencia se deriva
de la frecuencia de la enfermedad entre parientes (riesgo empírico),
problemas con la penetrancia, anticipación, mosaicismo de la línea
germinal, expresividad variable, fenocopias, infidelidad...
Teorema de Bayes
Probabilidad previa (PP): antecedentes de la persona
Probabilidad condicional (PC): dependientes de la edad, análisis bioquímicos o fenotipo de la descendencia
Probabilidad conjunta (PX): PC*PP
Probabilidad relativa (PR): PX de estar afectado/ PX de estar afectado+ PX de no estar afectado
Consejo genético I I I
Aplicación del Teorema de Bayes
Un hombre de 50 años de edad cuyo padre murió de Huntington deseaconocer la probabilidad de que su hijo desarrolle la enfermedad
enfermedad autosómica dominante que aparece entre los 25 y los 55 años de edad
(1/10)/(1/10+1/2)=1/6Relativa
½1/10Conjunta
11/5Condicional
½½Previa
No portadorPortadorProbabilidad
Diagnóstico genético prenatal
Indicaciones principales:
Edad avanzada de la madre
Padres con translocaciones cromosómicas equilibradas
Algún hijo previo con anomalías cromosómicas
Enfermedad monogénica (pareja portadora de enfermedad
hereditaria tipo error innato del metabolismo) con
marcadores genéticos disponibles
Malformaciones fetales debidas a enfermedades
monogénicas que no tienen ningún tipo de marcador
genético o bioquímico
Diagnóstico genético prenatal
Técnicas de diagnóstico prenatal
Análisis suero sanguíneo de la madre (alfa fetoproteína)
detección de defectos en el tubo neural y aneuploidías
Ultrasonografía fetal, detección de anomalías morfológicas
Toma de muestras fetales:
Células coriónicas (citogenética, marcadores
bioquímicos)
Amniocentésis (citogenética, marcadores
bioquímicos)
Biópsia fetal (piel, hígado, etc.) detección de
enfermedades hereditarias de la sangre.