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EVALUACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO DE HOJAS Y RAMAS DE ESPECÍMENES DE
HERBARIO: ESTUDIO DE CASO EN ESPECÍMENES DE PSYCHOTRIA Y
PALICOUREA DEPOSITADOS EN EL HERBARIO FORESTAL UDBC.
Trabajo de Grado en modalidad Investigación – Innovación
JENNIFER CATHERINE CASTILLO REYES
JOHANNA CAROLINA PERALTA PARRADO
DIRECTORA
ROCÍO CORTÉS BALLEN
Ingeniera Forestal MSc. Ph.D
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y DE RECURSOS NATURALES
PROYECTO CURRICULAR DE INGENIERÍA FORESTAL
2019
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RESUMEN
Los especímenes botánicos depositados en los herbarios constituyen un recurso invaluable
de ADN que no se ha aprovechado lo suficiente. Las investigaciones sobre este tema se han
centrado en la extracción de ADN de las hojas de los especímenes, sin embargo, las ramas
no se han evaluado de manera exhaustiva. Con el objeto de conocer la posibilidad de extraer
ADN de las ramas de los especímenes de herbario, evaluamos el rendimiento de la extracción
en hojas y ramas comparado con tejidos de hoja deshidratados en sílica gel. Se utilizaron
especímenes de los géneros Psychotria y Palicourea depositados en la colección del herbario
UDBC. Aunque se obtuvieron valores de concentración y pureza de ADN mayores en los
tejidos deshidratados en sílica gel, también se pudo extraer ADN de las hojas y ramas de los
especímenes botánicos. Las ramas de los especímenes de herbario son un recurso valioso
como fuente de ADN que se debe explorar con más detalle ya que al ser comparadas con las
hojas, representan ventajas tales como afectar en menor grado la integridad de los
especímenes, no alterar de manera significativa la eventual descripción de las plantas y
disminuir la posibilidad de extraer ADN de un organismo diferente.
Palabras clave: CTAB, Extracción de ADN, especímenes de herbario, ramas, sílica gel
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ABSTRACT
Botanical specimens deposited in herbaria are invaluable sources of DNA not used
sufficiently. Research on this topic has focused on the extraction of DNA from specimen
leaves, however, branches have not been evaluated exhaustively. In order to know the
possibility of extracting DNA from branches of herbarium specimens, we evaluated the DNA
quantity and quality in leaves and branches of botanical specimens treated with alcohol,
compared to leaf tissues dehydrated in silica gel. We used specimens of the genera Psychotria
and Palicourea deposited in the collection of the UDBC herbarium. DNA concentration and
purity values were higher in dehydrated tissues in silica gel compared to DNA extracted from
leaves and branches of botanical specimens. Branches of herbarium specimens are valuable
sources of DNA that should be explored in more detail because, when compared to the leaves,
they represent advantages such as affecting the integrity of the specimens to a lesser degree,
not altering significantly the eventual description of the plants, and decreasing the possibility
of extracting DNA from a different organism.
Palabras clave: CTAB, DNA Extraction, herbarium specimens, branches, silica gel.
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ........................................................................................................................................................ 2
ABSTRACT ...................................................................................................................................................... 3
ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................................... 4
ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................................................................... 4
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................... 5
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................ 5
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................ 9
RESULTADOS ................................................................................................................................................14
DISCUSIÓN .....................................................................................................................................................19
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................................................25
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura1. Protocolo de extracción de ADN ........................................................................... 12
Figura 2. Concentración de ADN promedio para los tres tejidos ......................................... 15
Figura 3. Pureza de ADN promedio para los tres tejidos (260/280) .................................... 16
Figura 4. Pureza de ADN promedio para los tres tejidos (260/230) .................................... 17
Figura 5. Análisis de correspondencia .................................................................................. 19
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Categorización de las variables concentración, edad y altitud ............................... 10
Tabla 2. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de concentración.................. 15
5
Tabla 3. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (260/280) ............. 17
Tabla 4. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (230/260) ............. 18
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su excelente aporte en
nuestra formación profesional, al Laboratorio de Biología Molecular y al Herbario Forestal
Gilberto Emilio Mahecha por la disposición y por permitirnos el desarrollo de esta
investigación. A nuestra directora Rocío Cortés Ballén por darnos la oportunidad de
participar en un proyecto que aporta gran conocimiento científico, por su continua
colaboración, sus enseñanzas, valiosos consejos, confianza y paciencia a lo largo de esta
investigación. A nuestro evaluador James R. Richardson. Al profesor Juan Camilo Dumar
por su importante asesoría en el análisis estadístico. A nuestros padres, hermanos y amigos
por creer siempre en nosotras, y demostrarnos su amor a través de la motivación y apoyo
incondicional. A la causalidad de poder realizar con éxito este trabajo en equipo, disponer de
las capacidades necesarias y la fluidez en su elaboración. A todas las personas que de una u
otra forma contribuyeron en el desarrollo de este trabajo.
INTRODUCCIÓN
El ADN antiguo (ADNa) es aquel obtenido de los restos de organismos muertos, así como
de las muestras tomadas a organismos vivos que han sufrido procesos autolíticos o
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diagenéticos, o que han sido fijadas de alguna forma (Herrmann & Hummel, 1994). El
ADNa incluye desde el tomado a tejidos de fósiles, momias, o insectos preservados en ambar,
hasta el de tejidos embebidos en parafina, fijados en líquido, o especímenes preservados en
colecciones biológicas (Hummel & Herrmann, 1994). En la década de los 80´s se realizaron
los primeros trabajos exitosos en la extracción de ADNa como por ejemplo el de Higuchi,
quien secuenció un fragmento de ADN a partir de un musculo disecado de Equus quagga,
una especie que llevaba extinta cerca de 100 años, o el caso de Pääbo, quien extrajo ADN
humano a partir de una momia egipcia de 2.400 años de antigüedad (Izagirre, Duran, De la
Rua, 1997; Saiz, Álvarez, Martínez, Álvarez & Lorente, 2012).
Los especímenes de herbario son una fuente potencial de ADNa. Las colecciones depositadas
en los herbarios constituyen un recurso invaluable de ADNa ya que en ellos se encuentran la
mayoría de plantas del mundo, incluyendo especies de distribución restringida, nuevas para
la ciencia, extintas o con algún grado de amenaza, a las que se puede acceder fácilmente sin
necesidad de invertir altos costos en recolectar material vivo en un punto geográfico
específico (Särkinen, Staats, Richardson, Cowan, & Bakker, 2012). Debido a que estas
colecciones son una fuente fundamental de material en estudios filogenéticos, desde la
década de los 90 se han realizado investigaciones relacionadas con la extracción de ADNa
de los especímenes de herbario (e.g. Savolainen, Cuinoud, Spichiger, Martínez,
Crevecoeur & Manen, 1995; Pääbo, Poinar, Serre, Jaenicke-Despres, Klause, Vigilant
& Hofreiter, 2004; Adams, 2011; Mazo, 2011). Teniendo en cuenta que los especímenes
nunca fueron colectados con la intención de extraer ADN, existen limitaciones para la
obtención de ADNa amplificable (Erkens, Cross, Maas, Hoenselaar, & Chatrou, 2008;
Staats et al., 2011). Dentro de los factores que afectan la extracción de ADNa de los
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especímenes se encuentran, por ejemplo, la edad (el tiempo desde su colección), las
condiciones de secado, la preservación y almacenamiento de las muestras, la interacción que
ha tenido con sustancias químicas, así como el pH y la humedad (Neubig et al., 2014).
A pesar de las limitaciones se ha logrado extraer ADN de material de herbario preservado en
diferentes condiciones y de diferentes edades (Drábková & Kirschner, 2002; Erkens et al.,
2008; Agostini, Lüdtke, Echeverrigaray & de Souz-Chies, 2011; Staats et al., 2011;
Särkinen et al., 2012). Sin embargo, se han detectado problemas tales como la degradación
del ADNa debido a los tratamientos químicos de preservación de los especímenes, que no
permite obtener concentraciones de ADN muy altas. Adicionalmente, un problema particular
en las plantas es la cantidad de metabolitos secundarios que poseen, especialmente
abundantes polifenoles, asi como azúcares, y otros posibles inhibidores de la PCR que
además pueden eventualmente provocar errores en las secuencias de ADNa. ( Drábková &
Kirschner, 2002; Erkens et al., 2008; Agostini et al., 2011; Staats et al., 2011; Särkinen
et al., 2012).
En las plantas, el tejido foliar es el que se ha preferido para la obtención de ADNa. Sin
embargo, existen registros de extracción de ADNa de tejidos lignificados, específicamente
de madera del tronco de especies arbóreas (Deguilloux, Pemonge, & Petit, 2004;
Deguilloux, Pemonge, Bertel, Kremer, & Petit, 2003; Deguilloux, Pemonge, & Petit,
2002; Liepelt et al., 2006). La extracción de ADNa de la madera representa un reto aún
mayor que la extracción en tejido foliar, considerando que una gran proporción de madera
está constituida por células muertas (duramen) y una menor proporción por células vivas
(albura). Al igual que el tejido foliar, el ADNa obtenido de la madera puede presentar un
porcentaje alto de sustancias que pueden inhibir la PCR ( Deguilloux et al., 2002). Existen
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varios estudios que evaluaron la extracción de ADNa de madera de roble (Quercus spp), con
muestras de diferentes edades y procedencias, que fueron sometidas a diferentes tipos de
secado, en los que se logró aislar ADNa amplificable, aunque solo en fragmentos cortos de
regiones con un gran número de copias (Dumolin-Lapègue, Pemonge, Gielly, Taberlet, &
Petit, 1999; Deguilloux et al., 2002; Deguilloux et al., 2003). Del mismo modo, se ha
podido aislar ADNa de madera Cyclobalanaposis spp. de la familia Fagacea (Ohyama,
Baba, & Itoh, 2001), así como de varias especies de Dipterocarpaceas tropicales
(Rachmayanti, Leinemann & Gailing, 2006; Rachmayanti, Leinemann, Gailing &
Finkeldey, 2009) y de diferentes especies de los géneros Eucalyptus, Pinus y Cupressus con
hasta 1000 años de edad (Liepelt et al., 2006), en donde se evidencia el éxito que puede tener
el tejido lignificado para la extracción de ADN amplificable.
Los tejidos de las ramas de los especímenes de herbario no se han evaluado de manera
exhaustiva como fuente de ADNa. Sólo se cuenta con un estudio de Asif & Cannon (2005),
quienes extrajeron ADN de la madera de diferentes procedencias de la especie Gonystylus
bancanus. Del total de muestras estudiadas, varias provenían de madera procesada, mientras
que sólo tres provenían de especímenes de herbario. En general, los resultados arrojaron alta
degradación en el ADN con fragmentos que oscilaron entre 50 pb y 10 kpb. Sin embargo, las
muestras obtenidas de ramas de especimenes de herbario obtuvieron el mejor rendimiento de
ADN (50 ng/µl) de todas las muestras analizadas.
Los géneros Psychotria y Palicourea son dos de los más grandes de la familia Rubiaceae.
Psychotria incluye alrededor de 1000 especies de distribución Pantropical (Taylor, 2016),
mientras que las cerca de 600 especies de Palicourea se restringen al Neotropico (Taylor,
2018). En el Catálogo de Plantas y Líquenes De Colombia, Delprete & Cortes-B. (2015)
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registraron 224 especies de Psychotria y 161 de Palicourea, sin embargo, cerca de 80 de las
especies incluidas en Psychotria han sido recientemente sinonimizadas bajo el género
Palicourea (eg. Taylor & Hollowell, 2016; Taylor, 2017, 2018). Los dos géneros se
encuentran bien representados en las colecciones de los herbarios del país. Por ejemplo, en
el Herbario Forestal UDBC se registran más de 500 especímenes de cada género. Teniendo
en cuenta la representatividad de los géneros en la colección del Herbario Forestal, así como
su cercanía filogenética, Psychotria y Palicourea constituyen un excelente modelo para
evaluar la posibilidad de extraer ADN de especímenes de Herbario.
Este proyecto comparó el rendimiento de la extracción de ADN en hojas y ramas de
especímenes de los géneros Psychotria y Palicourea depositados en la colección del herbario
UDBC. Específicamente, evaluamos la posibilidad de extraer ADN de las ramas de los
especímenes de herbario y estimamos las diferencias entre la concentración y pureza del
ADN obtenido en hojas y ramas de los especímenes. Además, evaluamos la influencia de la
edad y procedencia del espécimen en la concentración de ADN obtenido.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
Se realizó un diseño experimental en arreglo factorial completamente al azar, con tres
tratamientos:
Tratamiento 1: Tejido foliar deshidratado en sílica gel (blanco), abreviado como “Sílica gel”
Tratamiento 2: Tejido de ramas tomado de espécimen botánico, abreviado como “Madera”
Tratamiento 3: Tejido foliar tomado de espécimen botánico, abreviado como “Herbario”
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Las variables analizadas fueron concentración y pureza, evaluada por las relaciones 260/280
y 260/230 y las variables independientes de edad y altitud. Se realizaron dos repeticiones con
sub-muestras de 51 especímenes en cada tratamiento.
Se realizó una previa categorización de las variables para facilitar los análisis respectivos, de
la siguiente manera:
Categoría/
Variable
Concentración
(ng/ul)
Edad(meses)
Altitud
(msnm)
Alta >500 >125 2001-3500
Media 100 - 500 68-125 1001-2000
Baja <100 <68 0-1000
Tabla 1. Categorización de las variables concentración, edad y altitud
Preparación del Material vegetal
A partir de la base de datos de la colección de tejidos deshidratados en silica gel disponible
en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas se seleccionaron 102
ejemplares, 46 del género Psychotria y 56 del género Palicourea. Los ejemplares
seleccionados fueron sometidos al mismo proceso de colección usado en el Herbario Forestal
UDBC, en el cuál los especímenes se alcoholizan en campo con una solución de alcohol al
70% y posteriormente se secan a una temperatura de 60ºC durante 24 horas. De los 102
ejemplares seleccionados, el 80% fueron colectados en el año 2017, mientras que el 20% se
colectaron antes de esta fecha (Anexo 1). La altitud a la que fueron colectados los
especímenes se puede ver en el anexo 1. De cada espécimen de herbario se tomó una muestra
de hoja y de rama.
Los tejidos se procesaron de la siguiente manera:
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Tejido foliar deshidratado en silica gel: Se pesaron entre 19 y 23 mg de tejido en un tubo
eppendorf de 1,5 µl el cual contenía 3 perlitas de acero inoxidable.
Tejido foliar y de ramas tomado de especímenes botánicos: Con ayuda de pinzas y aguja de
disección se procedió a quitar los restos de pegamento que quedaban en las muestras a causa
del montaje del espécimen. Se pesaron de 19 a 23 mg tejido en un tubo eppendorf de 1,5 µl
el cual contenía 3 perlitas de acero inoxidable en el caso de las hojas y 0,417 g de arena estéril
en el caso de la madera. La madera se astilló lo más fino posible con un bisturí antes de
pesarla. Una vez pesados todos los tejidos se llevaron a la Biopulverizadora “Mini-
BeadBeater 16 Ring Rack”, por 30 segundos o hasta obtener un polvo fino.
Extracción de ADN
Con base en la técnica propuesta por Doyle & Doyle (1987), se utilizó el método de
extracción CTAB modificado. Las modificaciones siguieron los lineamientos señalados en
los protocolos internos del laboratorio de Biología Molecular del Jardín Botánico de
Edimburgo RBGE. Con base en los resultados de experimentos realizados previamente, las
muestras se mantuvieron a -20 ºC durante una semana antes de iniciar la fase de lavado del
ADN. En la figura 1 se muestra un resumen de protocolo utilizado en el proceso de extracción
de ADN.
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Concentración y Pureza del ADN
Se analizó la cantidad y pureza del ADN por nano-espectrofotometría en un nanodrop 2000
de Thermo Fisher, obteniendo datos de concentración de ADN en ng/uL y relación de
absorbancias 260/280 y 260/230 nm.
Análisis de la información
Se generó una base de datos con 238 especímenes, en donde se registró la siguiente
información: número de colección, nombre de colector, especie, fecha de colección, zona de
vida de la procedencia, altitud y edad del espécimen (tiempo transcurrido desde la fecha de
colección hasta la fecha de extracción). Finalmente se depuro la base a 102 especímenes, los
demás fueron descartados en su mayoría porque en alguno de los tres tejidos no había
respaldo o debido a que el material no alcanzaba el peso suficiente para realizar la extracción.
Se analizaron las media estadísticas y su desviación estándar en los parámetros de
concentración y pureza. Los Supuestos de normalidad se probaron mediante las pruebas de
Shapiro-Wilks y Kolmogorov- Smirnov. Se realizó un análisis de varianza de una vía no
paramétrica (prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis), y comparaciones múltiples con el
fin de evaluar la existencia de diferencias significativas para cada uno de los tratamientos.
Finalmente se realizó un Análisis de Correspondencia, para identificar si existía o no relación
entre los datos obtenidos y las variables independientes: edad y altitud usando el paquete
estadístico Past 3 para Windows.
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RESULTADOS
Concentración de ADN
Se realizaron un total de 306 extracciones. Se repitieron aquellas muestras que se alejaban
considerablemente de los datos obtenidos en la mayoría de las muestras con el objetivo de
descartar posible error humano. Para las muestras de sílica y herbario, la mayoría de los datos
de concentración varió entre 100 y 500 ng/µl, con una representación de 39% y 50%
respectivamente. En el caso de la madera, se encontraron concentraciones menores de 100
ng/µl en un 48 % de las muestras.
La concentración promedio de ADN obtenido presenta alta variación en cada uno de los
tejidos. Se evidencia que del tejido secado en sílica gel se extrajeron concentraciones más
altas con respecto a los otros tratamientos (promedio 452,42 ng/µl). Estos resultados
contrastan con los obtenidos en el tratamiento madera, en donde se obtuvieron menores
concentraciones de ADN (prom195,63 ng/µl) (figura 2). Aunque se presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p=0,00**), se puede observar en el análisis de comparaciones
múltiples, que madera y hojas de herbario se comportan de manera similar mientras que el
tejido preservado en sílica gel presenta las mayores diferencias en la media de concentración.
(Tabla 2)
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Figura 2. Concentración de ADN promedio para los tres tejidos
TEJIDO SIGNIFICANCIA GRUPOS
HOMOGÉNEOS
SÍLICA 190,16 A
HERBARIO 145,86 B
MADERA 124,48 B
Tabla 2. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de concentración
Pureza del ADN
Relación 260/280
Alrededor de 21.24% de las muestras poseen un valor de absorbancia entre 1,7 y 2 nm, por
lo cual se catalogan como muestras puras, libres de proteínas. De estas un 13.4% corresponde
16
a sílica gel, un 2.29% a madera y 5.5% a muestras provenientes de hojas de herbario. Las
muestras contaminadas con proteínas representan el 78.76 % de total, de estas un porcentaje
menor corresponde al tratamiento de sílica gel con un 19.93%, un 31.04% de las muestras a
madera y un 27.77% a muestras a herbario.
Se encontraron diferencias significativas en la relación de absorbancia 260/280 (p=0,00**),
en donde únicamente el tratamiento sílica gel alcanzo valores promedio de pureza aceptables
de ADN con 1,7. Los tratamientos madera y herbario obtuvieron valores de pureza promedio
de 1,54 y 1,42 respectivamente, indicando la posible contaminación con compuestos
aromáticos o proteínas. (Figura 3). De igual manera las mayores diferencias se encuentran
entre el tejido de sílica gel y los tratamientos madera y herbario (Tabla 3).
Figura 3. Pureza del ADN promedio para los tres tejidos (260/280)
TEJIDO SIGNIFICANCIA GRUPOS
HOMOGÉNEOS
SÍLICA 196.42 A
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HERBARIO 135.77 B
MADERA 128.31 B
Tabla 3. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (260/280)
En general, el tratamiento con mayor cantidad de muestras puras con absorbancias entre los
1,7 y 2 nm, corresponde al material almacenado en sílica gel, con 40,2% del ADN
considerado puro y un restante 59.8% impuro. Del mismo modo, el tratamiento herbario
presenta un total del 16,66% de las muestras puras y un 83,33% de muestras con ADN
impuro. En el tercer lugar en términos de pureza según la relación 260/280 nm, se encuentra
el tratamiento madera con tan solo un 6,86% de muestras con ADN puro.
Relación 260/230
Figura 4. Pureza del ADN promedio para los tres tejidos (260/230)
18
Se encontraron diferencias significativas en la relación de absorbancia 260/230 (p=0.0031),
en donde ningún tejido alcanzó valores promedio de pureza aceptables (>2,0nm). El
tratamiento sílica gel obtuvo un promedio de pureza de 0.60, el tratamiento de madera un
valor promedio de 0,45 y el tratamiento de herbario obtuvo un valor promedio de 0.52,
indicando la posible contaminación con compuestos fenólicos, sales y otros contaminantes
(Figura 4). De igual manera las mayores diferencias se encuentran en el tejido de sílica gel.
(Tabla 4).
TEJIDO SIGNIFICANCIA
RANGO
GRUPOS
HOMOGÉNEOS
SÍLICA 173.6 A
HERBARIO 155.15 AB
MADERA 131.78 B
Tabla 4. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (230/260)
En resumen, para la relación de 260/230 nm, se consideraron un 100% de las muestras
impuras, excepto para el material secado en sílica gel con una única muestra pura, que
representa el 0,98% del total de las muestras.
Análisis de la altitud de la colección y edad de las muestras
En el Análisis de Correspondencia para los diferentes tejidos, se pueden ver comportamientos
similares entre la relación de la concentración-edad. En las edades mayores se encuentran un
total de 21 especímenes, que representan 63 datos de concentración, de los cuales 20
concentraciones se ven afectadas por la edad. En la Figura 5 se puede observar que
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indistintamente del tejido, las concentraciones se van agrupar de acuerdo a su categoría de
concentración, en donde las concentraciones altas tienen una mayor varianza y muestran una
relación con altitudes y edades altas.
Figura 5. Análisis de correspondencia entre las variables altitud y edad para los tejidos
sílica gel, madera y herbario
DISCUSIÓN
La madera de especímenes de herbario como fuente de ADN
De acuerdo a los resultados obtenidos, es posible extraer ADN proveniente de madera de
especímenes de herbario que han sido alcoholizados en campo. Aunque en varios estudios se
había logrado extraer ADN de madera seca (e.g. Dumolin et al., 1999; Deguilloux et al.,
2003; Deguilloux et al., 2002; Liepelt et al., 2006; Rachmayanti, et al., 2009), sólo se
registra un estudio en el que se extrajo ADN de la madera proveniente de especímenes de
herbario, en el cual se usaron tres colecciones (Asif & Cannon, 2005) que, aunque fue un
buen indicio, no es un número estadísticamente representativo. Por el contrario, reportamos
por primera vez el éxito en la extracción de ADN de madera de 102 especímenes de herbario.
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Teniendo en cuenta que los especímenes fueron alcoholizados en el momento de la colección,
que es una técnica generalizada en la recolección de material botánico, los resultados
obtenidos demuestran que las ramas de los especímenes de herbario constituyen un recurso
valioso como fuente de ADN.
La mayoría de los estudios que han evaluado la extracción de ADN de especímenes de
herbario utilizan tejido foliar (Drábková & Kirschner, 2002; Agostini, Lüdtke,
Echeverrigaray & de Souz-Chies, 2011; Erkens et al., 2008; Staats et al., 2011; Särkinen
et al., 2012). Sin embargo, la posibilidad de extraer ADN de las ramas de los especímenes
de herbario presenta ventajas respecto al tejido foliar relacionadas con la integridad de los
especímenes, con la reducción del número de caracteres morfológicos que se “pierden” al
mutilar el espécimen botánico, así como con el aumento de la probabilidad de extraer ADN
del organismo deseado. La extracción de ADN de las ramas de las colecciones botánicas
afecta en menor grado la integridad de los especímenes ya que el área de tejido que se toma
es mucho menor al área tomada a una muestra de hoja. Mientras que para obtener entre 19 y
23 mg de tejido se utilizó un área entre 3 y 5 cm² de tejido foliar, dependiendo de la textura
de la hoja, para la obtención de la misma cantidad de tejido de madera se utilizó un área de
la rama que osciló entre 0.6 y 1.2 cm². Una ventaja adicional de extraer ADN de la madera
de la rama de especímenes es que, contrario a las hojas, las ramas tienen pocos caracteres
morfológicos que se incluyen en las descripciones botánicas. En una descripción taxonómica
promedio se describe solamente la forma, textura y presencia de indumentos de las ramas,
mientras que de las hojas se describen muchos caracteres, por ejemplo, la forma, el margen,
los diferentes grados de venación, el indumento y la textura, entre otros (e.g. Taylor, 2016,
2017, 2018). Además, las ramas de los especímenes tienen la ventaja de disminuir la
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probabilidad de extraer ADN de un organismo diferente asociado al tejido colectado. La
mayoría de las veces las ramas de los especímenes de herbario se encuentran libres de
hepáticas, musgos, hongos y líquenes, mientras que las hojas suelen tener en la superficie
diversas especies asociadas. Por todas las razones señaladas, al comparar los tejidos de hojas
y ramas de las colecciones botánicas para la extracción de ADN, el uso de una porción de
alrededor de 2 cm de la rama de un espécimen afecta en menor grado su integridad, no altera
significativamente la eventual descripción de la planta, y disminuye la posibilidad de extraer
ADN de un organismo diferente.
La madera versus las hojas de especímenes de herbario como fuente de ADN
De todos los tejidos evaluados, las porciones de hoja deshidratadas en silica gel presentaron
la mayor concentración y pureza (relación 260/280) de ADN. Estos tejidos fueron colectados
intencionalmente para la extracción de ADN, y no sufrieron los procesos de degradación
causados por el secado a altas temperaturas, o por la aplicación de alcohol, que se consideran
dos de las principales causas de la degradación del ADN en los especímenes de herbario (e.g.
Pyle & Adams, 1989; Neubig et al., 2014). Desde la propuesta hecha por Chase & Hills
(1991), de colectar hojas en silica gel en el campo, esta práctica se generalizó debido a lo
útil, barata y práctica que resulta ser. Nuestros resultados reafirman lo valioso de esta
práctica, y confirman los resultados obtenidos por Särkinen et al. (2012), quienes evaluaron
diferentes métodos de preparación de especímenes para la obtención de ADN, y concluyeron
22
que la deshidratación en sílica gel era el mejor método de secado comparado con el uso de
calor o alcohol.
No se obtuvieron diferencias significativas al comparar la concentración y pureza del ADN
obtenido de las hojas y madera de los especímenes previamente alcoholizados. Se podría
esperar que los tejidos más resistentes protegerían de una mejor forma el ADN, tal como lo
señalan Herrmann & Hummel (1994) en el caso de huesos y semillas. En nuestro caso, la
corteza de la madera podría actuar como una barrera de protección contra el efecto del
alcohol. En este sentido, Asif & Cannon (2005) encontraron que el ADN de la madera se
encontraba mejor preservado que el de las hojas y lo atribuyeron al secado rápido de las
muestras, que pudo haber afectado más a las hojas que a la madera. Por otra parte,
considerando que todas las células del tejido foliar se encontraban vivas al momento de la
colección, mientras que en la madera algunas células ya se encontraban muertas, podría
esperarse una mayor concentración de ADN en el tejido foliar. Teniendo en cuenta que no
encontramos diferencias significativas en la concentración y pureza del ADN obtenido de
tejido foliar y de madera, podríamos considerar que la corteza no actúa como una barrera de
protección, ni que el número de celulas muertas al momento de la colección influyeron en la
concentración y pureza de ADN de los especímenes previamente alcoholizados.
Se encontró que es indiferente el tratamiento que se use para la extracción de ADN, pues el
valor de concentración se mantuvo entre los rangos asignados, es decir, sin importar si la
fuente de ADN provenía de material de herbario ( madera u hoja), o provenía de tejido foliar
almacenado en el banco de sílica gel, el resultado de la concentración obtenida se mantuvo
dentro del rango alto, medio o bajo para cada espécimen, por lo tanto el material de herbario
es una fuente de ADN equiparable con el tejido foliar deshidratado en sílica gel y teniendo
23
en cuenta, para el caso específico de colecciones botánicas almacenadas en herbarios, las
ventajas que sobresalen en el uso de madera sobre las hojas, este resultado demuestra que es
posible hacer uso de la madera de especímenes de herbario como fuente de ADN con la
posibilidad de obtener un resultado de concentración de ADN equiparable al obtenido del
material deshidratado en sílica gel.
La Edad del espécimen en la obtención de ADN
De las 306 muestras evaluadas, sólo 63 tenían edades mayores a un año. Por consiguiente,
no contamos con una muestra suficiente para determinar el efecto de la edad en la
concentración y pureza de ADN de especímenes de herbario. Sin embargo, los resultados
muestran una tendencia inversa entre la edad y la concentración de ADN. Es decir, que se
obtuvo ADN más puro y en mayores concentraciones en los especímenes más jóvenes. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos por Erkens et al. (2008), quienes encontraron una
disminución en la concentración de ADN por cada año de aumento de la edad en muestras
de diferentes especies de Zehneria sp. Para poder evaluar la influencia de la edad en la pureza
y concentración de ADN, es necesario evaluar ejemplares que abarquen un rango de tiempo
más amplio. En nuestro caso no fue posible debido a que la edad se limitaba a los especímenes
de herbario que tuvieran muestra de tejido en el banco de sílica gel.
A pesar de que se muestra una relación entre las variables edad y altitud en una categoría alta
con la variable concentración en esta misma categoría, cabe aclarar que debido a la falta de
estandarización en el número de especímenes por cada edad evaluada e igualmente el número
24
de especímenes por altitud registrada, no se establece una relación directa entre estas
variables con el resultado de concentración obtenido.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Las ramas de los especímenes de herbario son un recurso valioso como fuente de ADN, pues
al ser comparado con las hojas, afecta en menor grado la integridad de los especímenes, no
altera de manera significativa la eventual descripción de la planta y disminuye la posibilidad
de extraer ADN de un organismo diferente. Teniendo en cuenta que no se encontraron
diferencias significativas en la concentración y pureza del ADN extraído de tejido foliar y de
madera de los especímenes, se podría pensar que la corteza de la madera no actúa como
barrera de protección del ADN, ni que el número de células muertas de la muestra en el
momento de la colección influyen en la concentración y pureza del ADN. Se evidenció una
tendencia en la disminución de la concentración del ADN con el aumento de la edad de los
especímenes, en donde las mayores concentraciones y la mayor pureza de ADN se
encontraron en los especímenes más jóvenes.
Se recomienda evaluar un mayor número de variables tales como el grosor y el color de las
hojas, la relación corteza-madera en la rama, así como un rango mayor de edad de los
especímenes, con el objeto de aprovechar el invaluable recurso que representan los
especímenes botánicos como fuente de ADN.
25
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adams, R. P. (2011). DNA from herbarium specimens: II. Correlation of DNA degradation
with humidity. Phytologia, 93(December), 351–359.
Agostini, G., Lüdtke, R., Echeverrigaray, S., & de Souz-Chies, T. T. (2011). Genomic DNA
extraction from herbarium samples of Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) and Polygala
L. (Polygalaceae). Conservation Genetics Resources, 3(1), 37–39.
https://doi.org/10.1007/s12686-010-9277-3
Asif, M. J., & Cannon, C. (2005). DNA Extraction From Processed Wood : A Case Study for the
Identification of an Endangered Timber Species ( Gonystylus bancanus ). International
Society for Plant Molecular Biology, 23(June), 185–192.
Chase, M. W., & Hills, H. H. (1991). Silica Gel: An Ideal Material for Field Preservation of
Leaf Samples for DNA Studies. Taxon, 40(2), 215. https://doi.org/10.2307/1222975
Deguilloux, M. F., Pemonge, M. H., & Petit, R. J. (2002). Novel perspectives in wood
certification and forensics: Dry wood as a source of DNA. Proceedings of the Royal
Society B: Biological Sciences, 269(1495), 1039–1046.
https://doi.org/10.1098/rspb.2002.1982
Deguilloux, M. F., Pemonge, M. H., Bertel, L., Kremer, A., & Petit, R. J. (2003). Checking
the geographical origin of oak wood: Molecular and statistical tools. Molecular Ecology,
12(6), 1629–1636. https://doi.org/10.1046/j.1365-294X.2003.01836.x
Deguilloux, M.-F., Pemonge, M.-H., & Petit, R. J. (2004). DNA-based control of oak wood
26
geographic origin in the context of the cooperage industry. Ann. For. Sci, 61, 97–104.
https://doi.org/10.1051/forest:2003089
Drábková, L., & Kirschner, J. (2002). Comparison of seven DNA extraction and
amplification protocoles in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant
Molecular Biology, 20(June), 161–175.
Dumolin-Lapègue, S., Pemonge, M. H., Gielly, L., Taberlet, P., & Petit, R. J. (1999).
Amplification of oak DNA from ancient and modern wood. Molecular Ecology, 8,
2137–2140. https://doi.org/10.1046/j.1365-294X.1999.00788.x
Erkens, R. H. J., Cross, H., Maas, J. W., Hoenselaar, K., & Chatrou, L. W. (2008).
Assessment of age and greenness of herbarium specimens as predictors for successful
extraction and amplification of DNA. Blumea: Journal of Plant Taxonomy and Plant
Geography, 53(2), 407–428. https://doi.org/10.3767/000651908X608052
Herrmann, B., Hummel, S., New, S.-V., Berlin, Y., London, H., Tokyo, P., … Budapest, B.
(1994). Ancient DNA.
Izagirre, N. & De La Rúa, C.(1999): “An mtDNA analysis in ancient basque populations
implications for haplogrop V as a marker for a major paleolithic expansion from
southwestern Europe”, Am. J. Hum. Genet. 65, pp. 199-207
Liepelt, S., Sperisen, C., Deguilloux, M. F., Petit, R. J., Kissling, R., Spencer, M., …
Ziegenhagen, B. (2006). Authenticated DNA from ancient wood remains. Annals of
Botany, 98, 1107–1111. https://doi.org/10.1093/aob/mcl188
Mazo, L. (2011). Evaluación y comparación de 3 protocolos de extracción y amplificación
27
del adn contenido en exsicados de orquídeas conservadas en colecciones de herbario.
Pontificia Universidad Javeriana. https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
Neubig, K., Whitten, M., Abbott, R., Elliott, S., Soltis, D., & Soltis, P. (2014). Variables
affecting DNA preservation in archival plant specimens. In W. Applequist & L.
Campbell (Eds.), DNA Banking for the 21st Century (Firts Edit, pp. 81–136). Trujillo,
Perú: Graficart SRL.
Ohyama, M., Baba, K., & Itoh, T. (2001). Wood identification of Japanese Cyclobalanopsis
species (Fagaceae) based on DNA polymorphism of the intergenic spacer between trnT
and trnL 5′exon. Journal of Wood Science, 47(2), 81–86.
https://doi.org/10.1007/BF00780554
Pääbo, S., Poinar, H., Serre, D., Jaenicke-Després, V., Hebler, J., Rohland, N., … Hofreiter,
M. (2004). Genetic Analyses from Ancient DNA. Annual Review of Genetics.
https://doi.org/10.1146/annurev.genet.37.110801.143214
Pyle, M. & Adams, R. (1989). In situ preservation of DNA in plant specimens. Taxon 38:
576-581.
Rachmayanti, Y., Leinemann, L., & Gailing, O. (2006). Extraction, Amplification and
Characterization of Wood DNA from Dipterocarpaceae. Plant Molecular Biology
Reporter, 24, 45–55.
Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., & Finkeldey, R. (2009). DNA from processed
and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Science
International: Genetics, 3(3), 185–192. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2009.01.002
28
Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., & Bakker, F. T. (2012). How to
open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PloS
One, 7(8), e43808. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043808
Staats, M., Cuenca, A., Richardson, J. E., Vrielink-van Ginkel, R., Petersen, G., Seberg, O.,
& Bakker, F. T. (2011). DNA damage in plant herbarium tissue. PloS One, 6(12),
e28448. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028448
Taylor, C. 2016. Rubiacearum Americanarum Magna Hama Pars XXXI: More New
Neotropical Species and Morphological Notes for Psychotria (Psychotrieae). Novon
24(4): 413-434.
Taylor, C. & V. Hollowell. 2016. Rubiacearum Americanarum Magna Hama Pars XXXV:
The New Group Palicourea sect. Nonatelia, with Five New Species (Palicoureeae).
Novon 25(1): 69-110.
Taylor, C. 2017. Rubiacearum Americanarum Magna Hama XXXVII: The New Group
Palicourea sect. Chocoanae with of the Chocó Biogeographic Region, with Two New
Species (Palicoureeae). Novon 25(3): 322-342.
Taylor, C. 2018. Rubiacearum Americanarum Magna Hama Pars XXXVIII: A New
Circumscription of Palicourea sect. Bracteiflorae, an Andean Radiation with Several
New Species (Palicoureeae). Novon 26(1): 66-138.
Anexo 1. Lista de los especímenes del Herbario Forestal UDBC evaluados
N° Nombre científico Colector N° colección
Año Región Altitud
(msnm)
1 Palicourea acuminata M. Reina 60 2018 Santander 1850
29
2 Palicourea acuminata S. Combita 77 2018
Santander 2086
3 Palicourea angustifolia R. Cortés 2420 2018
Santander 2000
4 Palicourea aschersonica
R. Cortés 3371 2014
Cundinamarca 2174
5 Palicourea berteroana R. Cortés 3316 2005
Antioquia 573
6 Palicourea berteroana R. Cortés 3327 2017
Antioquia 678
7 Palicourea bertieroides R. Cortés 3336 2017
Antioquia 719
8 Palicourea brachiata R. Cortés 3312 2017
Antioquia 573
9 Palicourea brachiata R. Cortés 3319 2017
Antioquia 573
10 Palicourea guianensis J. Ruiz 124 2017
Meta 498
11 Palicourea guianensis R. Cortés 2636 2017
Tolima 495
12 Palicourea guianensis R. Cortés 3126 2014
Boyacá 1295
13 Palicourea guianensis R. Cortés 3129 2014
Boyacá 1277
14 Palicourea guianensis R. Cortés 3381 2014
Cundinamarca 1703
15 Palicourea guianensis R. Cortés 3382 2002
Cundinamarca 1703
16 Palicourea nitidella R. Cortés 3234 2008
Vaupés 193
17 Palicourea nitidella R. Cortés 3243 2008
Vaupés 193
18 Palicourea ovatistipula R. Cortés 3313 2007
Antioquia 573
19 Palicourea quadrilateralis
R. Cortés 3325 2003
Antioquia 678
20 Palicourea quadrilateralis
R. Cortés 3326 2005
Antioquia 678
21 Palicourea racemosa R. Cortés 3388 2008
Chocó 5
22 Palicourea rosea R. Cortés 3310 2008
Antioquia 573
23 Palicourea sanluisensis R. Cortés 3315 2008
Antioquia 573
24 Palicourea sanluisensis R. Cortés 3321 2008
Antioquia 865
25 Palicourea schlimii R. Cortés 2458 2008
Santander 2000
26 Palicourea solitudinum J. Richardson
2017-16 2008
Chocó 5
27 Palicourea solitudinum J. Richardson
2017-17 2009
Chocó 5
28 Palicourea sp. J. Ruiz JRM3 2010
Meta 498
30
29 Palicourea sp. R. Cortés 2479 2012
Boyacá 2739
30 Palicourea sp. R. Cortés 2863 2012
Valledupar 2000
31 Palicourea sp. R. Cortés 3329 2013
Antioquia 678
32 Palicourea sp. R. Cortés 3332 2017
Antioquia 719
33 Palicourea sp. R. Cortés 3358 2017
Cundinamarca 2286
34 Palicourea sp. R. Cortés 3361 2017
Cundinamarca 2176
35 Palicourea sp. R. Cortés 3362 2017
Cundinamarca 2176
36 Palicourea sp. R. Cortés 3363 2017
Cundinamarca 2176
37 Palicourea sp. R. Cortés 3364 2017
Cundinamarca 2176
38 Palicourea sp. R. Cortés 3365 2017
Cundinamarca 2176
39 Palicourea sp. R. Cortés 3366 2017
Cundinamarca 2176
40 Palicourea sp. R. Cortés 3370 2017
Cundinamarca 2125
41 Palicourea sp. R. Cortés 3372 2017
Cundinamarca 2174
42 Palicourea sp. R. Cortés 3375 2017
Cundinamarca 1703
43 Palicourea sp. R. Cortés 3376 2017
Cundinamarca 1703
44 Palicourea sp. R. Cortés 3378 2017
Cundinamarca 1703
45 Palicourea sp. R. Cortés 3379 2017
Cundinamarca 1703
46 Palicourea sp. R. Cortés 3380 2017
Cundinamarca 1703
47 Palicourea sp. R. Cortés 3387 2017
Chocó 5
48 Palicourea sp. R. Cortés 3389 2017
Choco 5
49 Palicourea stellata M. Medina 362 2017
Santander 2415
50 Palicourea triphylla R. Cortés 3220 2017
Vaupés 289
51 Palicourea triphylla R. Cortés 3246 2017
Vaupés 192
52 Palicourea triphylla R. Cortés 3249 2017
Vaupés 192
53 Palicourea triphylla R. Cortés 3274 2017
Vaupés 192
54 Palicourea violacea R. Cortés 3103 2017
Boyacá 1600
55 Palicourea violacea R. Cortés 3105 2017
Boyacá 3200
56 Palicourea woronowii R. Cortés 3263 2017
Vaupés 192
31
57 Psychotria aff. carthagenensis
R. Cortés 2834 2017
Guajira 500
58 Psychotria aff. sylvivaga
R. Cortés 2419 2017
Santander 2000
59 Psychotria aff. sylvivaga
R. Cortés 2460 2017
Santander 2000
60 Psychotria anceps R. Cortés 3101 2017
Boyacá 1231
61 Psychotria anceps R. Miranda 137 2017
Meta 498
62 Psychotria aschersoniana
M. Reina 310 2017
Santander 2000
63 Psychotria brachiata J. Navarro 229 2017
Antioquia 573
64 Psychotria brachiata M. Correa 2732 2017
Caquetá 242
65 Psychotria brachiata R. Cortés 3108 2017
Boyacá 1101
66 Psychotria brachiata R. Miranda 196 2017
Meta 498
67 Psychotria carthagenensis
R. Cortés 3286 2017
Vaupés 192
68 Psychotria carthagenensis
R. Cortés 3344 2017
Antioquia 201
69 Psychotria cf sylvivaga R. Cortés 3409 2017
Magdalena 650
70 Psychotria cf tendlen R. Cortés 3414 2017
Magdalena 650
71 Psychotria cooperi R. Cortés 2660 2017
Chocó 43
72 Psychotria cuspidata M. Reina 292 2017
Santander 1850
73 Psychotria erythrocephala
S. Ángel 226 2017
Santander 2000
74 Psychotria glomerulata J. Richardson
2017-13 2017
Chocó 5
75 Psychotria hejdada W. Ariza 8004 2017
Santander 1200
76 Psychotria humboldtiana
R. Cortés 3290 2017
Vaupés 190
77 Psychotria longicuspis R. Cortés 3252 2017
Vaupés 192
78 Psychotria longicuspis R. Cortés 3259 2017
Vaupés 192
79 Psychotria luxurians S. Ángel 219 2017
Santander 2000
80 Psychotria micrantha W. Ariza 8013 2017
Santander 1200
81 Psychotria microbotrys R. Cortés 3251 2017
Vaupés 192
82 Psychotria poeppigiana J. Richardson
2017-12 2017
Chocó 5
32
83 Psychotria poeppigiana R. Cortés 3227 2017
Vaupés 193
84 Psychotria rosea W. Ariza 8040 2017
Santander 1200
85 Psychotria sacciformis R. Cortés 3348 2017
Antioquia 201
86 Psychotria saltatrix R. Cortés RC2463 2017
Santander 2000
87 Psychotria sp. E. Sastoque 139 2017
Meta 498
88 Psychotria sp. J. Richardson
2017-28 2017
Chocó 5
89 Psychotria sp. J. Richardson
2017-47 2017
Chocó 5
90 Psychotria sp. R. Cortés 1693 2017
Meta 467
91 Psychotria sp. R. Cortés 2197 2017
Guainía 200
92 Psychotria sp. R. Cortés 2872 2018
Caquetá 147
93 Psychotria sp. R. Cortés 3297 2018
Vaupés 180
94 Psychotria sp. R. Cortés 3299 2018
Vaupés 180
95 Psychotria sp. R. Cortés 3311 2014
Antioquia 573
96 Psychotria sp. R. Cortés 3314 2014
Antioquia 573
97 Psychotria sp. R. Cortés 3322 2008
Antioquia 865
98 Psychotria sp. R. Cortés 3323 2008
Antioquia 865
99 Psychotria sp. R. Cortés 3415 2008
Magdalena 650
10
0
Psychotria sp. S. Ángel 295 2008
Nariño 1409
10
1
Psychotria sp. S. Ángel 302 2009
Nariño 1409
10
2
Psychotria violacea J. Mendoza 137 2009
Meta 498