Conceptos generales de Biología Molecular. Extracción de DNA y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Olga Redondo GonzálezMIR 3 Análisis ClínicosHospital Universitario de Guadalajara, 25 abril 2007
ObjetivosConceptos básicos: estructura del DNATipo de muestraObtención de la muestraCaracterísticas de la muestra: Pureza/ ConcentraciónAmplificación de fragmentos de DNA mediante “Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)”Análisis e identificación de fragmentos:
ElectroforesisEnzimas de RestricciónHibridaciónSecuenciación
1869 Miescher. Primer aislamiento del DNA
1944 Abery. El DNA y no la proteína, contiene la información genética
1953
1957 Kornberg. DNA polimerasa I
1959 Severo Ochoa. Polinucieótido-fosforilasa, síntesis de ARN
1961 Marmur y Doty. Renaturalización del DNA, especificidad e hibridación de los ácidos nucleicos
1962 Alber, Nathans y H. Smith. Nucleasas de restricción
1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana. Código genético
1967 Geller. DNA ligasa
1972-73 Boyer, Cohen, Berg. Técnicas de clonaje del DNA
1975 Southern. Hibridación y transferencia sobre gel, para la detección de secuencias específicas de DNA
1985
1975-77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert. Métodos rápidos de secuenciación del DNA
Etapas principales del desarrollo de la tecnología del DNA recombinante
Watson y Crick. Modelo de doble hélice del DNA
Mullis y cols. PCR
Watson y Crick. Modelo de doble hélice del DNA
Mullis y cols. PCR
En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de la doble hélice para la estructura del DNA,basados en los resultados de los rayos X de Franklin y Wilkins.
La Real Academia de las Ciencias de Suecia concede el Premio Nobel en Química 1993, a Kary B. Mullis, USA, por su invento del método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR).
Estructura del DNA
Enrollamiento de la cromatina
3.4 nm
Doble hélice y Fibra de cromatina
Núcleo de la célula eucariota
Cromosoma
2 nm
(2´-desoxi-D-rribosa)
0.34 nm
5´
5´
3´
3´
Tipo de muestraCaracterísticas de la muestra: DNA = “huella genética”
¿De dónde se obtiene la muestra? De cualquier tipo de célula nucleada:
Sangre TejidosCélulas bucalesRaíces de peloSemenVellosidades corialesLíquidos biológicos
ESTABILIDAD
MUTABILIDAD
1 mg de DNA = 150.000 células6.6 pg de DNA/célula
Evolución especies
Patologías
Precauciones
Sangre + Solución hipotónicaTejido + Homogeneizador
Fase Acuosa
Fase Orgánica
Ácidos Nucleicos
Proteínas
Lípidos,Proteínas
+ 300 µl Buffer de Extracción (SDS al10% P/V)PELLET
Extracción Fenol: CH3Cl (1:1)
Fase acuosa
Precipitación: 0.1 V AcNa 0.3M + 2.5 V Etanol
Incubar 1 h a –70ºC ó 24 h a -20ºC
Resuspender pellet en 30 µl de solución amortiguadora de TE. Agitación suave 37ºC, 2h.
Incubar 1 hora a 55ºCInactivar 10´a 98ºC
Centrifugación
SDS= dodecil sulfato de sodioTE= Tris 2 mol/L, EDTA 0.25 mol/L pH 7.5
Precauciones:Sensibilidad al cizallamiento
¡Ojo con las DNAsas!
Obtención de la muestra
+ 15 µl Proteinasa K
Características de la muestraConcentración:
Espectrofotometría
[ DNA ] = A 260 * 50µg * dilución
Fluorometría
Pureza:
1 Unidad de Absorbancia a 260 nm = 50 µg/ml de doble hebra de DNA ó 40 µg/ml de hebra sencilla de DNA o RNA.
2.2 ≥ A260/ A280 ≥ 1.8
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1985, K. Mullis y cols.
1) Identifica el fragmento de DNA que nos interesa2) Genera “in vitro” grandes cantidades de ese fragmentoa partir de una cantidad mínima del mismo
¿Para qué sirve?:
¿En qué se fundamenta?: “mimetiza” el proceso de replicaciónque tiene lugar “in vivo”
1) Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse porcalor/frío2) Propiedad de las polimerasas de reparar el DNA que se fragmenta, añadiendo bases complementarias sobre la hebra sencilla, siempre y cuando se encuentren un fragmento de doble cadena
D A S
95ºC
50-60ºC
70ºC
Programa de PCR
Anillamiento
Síntesis
Desnaturalización
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
Tiempo
Primer ciclo
Segundo ciclo
Tercer ciclo
Tª (ºC)
100
80
60
Electroforesis (EF)Ácidos nucleicos: moléculas polianiónicasuniformemente cargadas que pueden migrar en un campo eléctrico.Geles:
poliacrilamida fragmentos < 500 pb;agarosa (fragmentos 200 pb-50Kb). EF en gel de campo pulsante (agarosa al 1%).
Visualización: colorante bromuro de etidio, marcaje radiactivo (32P).Identificación fragmentos de DNA por tamaño:
Virus/ bacteriasDeleciones
Enzimas de restricción“In vivo”
Reconocen y cortan el DNA de doble hélice en sitios específicos (secuencias de reconocimiento) endonucleasas.Origen bacteriano: supervivencia a lisis por fagos (no existente en eucariotas).
“In vitro”Localizan secuencias mutadas dentro del genoma.
Extremos cohesivos 5´ Extremos cohesivos 3´
Extremos romos
Secuencias de reconocimiento de algunos enzimas de restricción
Secuencias de bases palindrómicas, 4-6 pb↑↓: enlaces fosfodiéster hidrolizados por el enzima de restricción (sitio de corte)N: cualquier base
M1 M2DNA normal
-ACCATG-
-TGGTAC-
DNA mutado
-ACCGTG-
-TGGCAC-El enzima de restricción no reconoce la secuencia
400 pb
100 pb 300 pb 400 pb
M1 M2WM400 pb
300 pb
100 pb
Hibridación molecularFundamento: Apareamiento de dos secuencias nucleotídicas por complementariedad de basesC-G y A-T
Utilidad:- Reconocimiento de secuencias “diana”por apareamiento con secuencias conocidas (SONDAS).
Detección:Radioactiva (32P)Fluorescente (fluorocromo)Quimioluminiscente (luminol)
Tipos: Northern, Southern y Western blot.