7/25/2019 Extraccin, Purificacin y Cuantificacin de cidos Nuclicos
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Genetista y Btlgo. Ruy Chacn Villanueva
TEMA 3: EXTRACCIN, PURIFICACIN Y
CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS
PILARES HISTRICOS
1953: Modelo de ADN de Watson y Crick
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ESTRUCTURA Y COMPOSICIN DE LOS
CIDOS NUCLICOS ANs)
cido Ribonucleico (ARN)azcar ribosa.
ARN monocatenario (ARNm,ARNt, ARNr).
cido Desoxirribonucleico(ADN) azcar desoxirribosa.
ADN bicatenario (lineal ocircular).
Bases nitrogenadas: Adenina,Timina, Guanina, Citosina,Uracilo.
ASPECTOS ESENCIALES PARA UNA BUENA
EXTRACCIN DE AN
OBJETIVOS:
Maximizar la cantidad de Ans. Maximizar la calidad de ANs. Remover inhibidores. Remover o inhibir nucleasas. Priorizar el AN de inters
(ADN, ARN?)
FACTORES INFLUYENTES:
Calidad de muestra. Cantidad requerida para
anlisis.
Pureza requerida paraanlisis. Tiempo disponible. Presupuesto disponible. Equipamiento adecuado.
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INHIBIDORES DE PCR EN ANs
AISLAMIENTO DE ADN: Animacin
https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc
https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOchttps://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOchttps://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc7/25/2019 Extraccin, Purificacin y Cuantificacin de cidos Nuclicos
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ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR UHOMOGENEIZACIN:
Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelularesy separar cidos nucleicos.
MTODOS FSICOS:
trituracin, choque osmtico:lisis hipotnica, choquetrmico, sonicacin.
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR UHOMOGENEIZACIN:
Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelularesy separar cidos nucleicos.
MTODOS QUMICOS:(detergentes: SDS, agentescaotrpicos, reduccin contioles).
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ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR UHOMOGENEIZACIN:
Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelulares yseparar cidos nucleicos.
DIGESTIN ENZIMTICA:Proteinasa K, lisozima
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DEPROTENAS:
Permite la eliminacinprogresiva de protenas y otroscontaminantes celulares.
Extraccin; fenol cloroformopara eliminacin de protenas,salting outcon acetato depotasio, acetato de amonio.
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ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DEPROTENAS:
Permite la eliminacin progresivade protenas y otroscontaminantes celulares.
Centrifugacin; ultracentrifugacin con gradientes.
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DEPROTENAS:
Permite la eliminacin progresivade protenas y otros
contaminantes celulares. Cromatografa;
penetrabilidad, intercambioinico, adsorcin selectiva.
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ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DEPROTENAS:
Permite la eliminacin progresivade protenas y otroscontaminantes celulares.
Separacin por afinidad; uninde cidos nucleicos a bolas
paramagnticas en presencia desales caotrpicas.
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
3. PURIFICACIN:
Separa los cidos nucleicos dedetergentes y sales.
Fase de precipitacin; con
etanol fro o isopropanol. Lavado de pellet; alcohol fro y
centrifufado.
Recuperacin o resuspensin:en agua o tampn.
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AISLAMIENTO DE ADN: Ejemplo en Plantas
https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4
CUANTIFICACIN DE ANs
ANs y oligonucletidospueden cuantificarse ensoluciones acuosas midiendola absorbancia A (DO) de luzUV.
Utilizar una muestra blancoo patrn.
ANs absorben a 260 nm. Protenas absorben a 280 nm. Contaminantes
(carbohidratos, pptidos,fenoles, compuestosaromticos, otros.) absorbena 230 nm.
https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd47/25/2019 Extraccin, Purificacin y Cuantificacin de cidos Nuclicos
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CUANTIFICACIN DE ANs
A 260 nm, A = 1, corresponden: 50 g/ml de ADN bicatenario. 37 g/ml de ADN monocatenario. 40 g/ml de ARN. 20 g/ml de oligonucletidos.
MEDICIN DE PUREZA
Cociente de pureza: A260/A280. (ADN puro 1.8; ARN
puro 2.0).A 260 / A 280 < 1,7Contaminacin con protenas
A 260 / A 280 > 1,7 < 2Buena calidad
A 260 / A 280 > 2Contaminacin con fenoles, cloroformo, etc,
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MEDICIN DE CALIDAD - DEGRADACIN
Corrida de un gel de agarosa dela muestra
Buena calidad: migracinhomognea a manera de banda.
Mala calidad: migracinheterognea a manera de sombra.
Ausencia: sin bandas ni sombras.
CONTROL DE CALIDAD DE ANs
Degraded RNA
DNA
28S18S
5S rRNA, tRNA,
and other small
RNA molecules
mRNA = background smear
high low MW
100 50 25 ng
Genomic DNA
markers
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Gracias por la atencin