Fluoróforos en bioquímica
• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínsecaagrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
0.4 ns en solución1-5 ns unido a DH
4.7 ns en solución(2.3 ns FMN)0.3-1 ns unido a prot.
Sondas fluorescentes para proteínas
DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1
Problema: autoquenching, fotosensible, pH
Prof. Gregorio Weber1916 - 1997
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
http://probes.invitrogen.com/handbook/
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG antibody/pH 8.0.
http://probes.invitrogen.com/handbook/
No autoquenching
Fotoestable
Sondas fluorescentes para membranas
DPH = difenil hexatrieno
LiposolubleEmisión polarizada
Ácido cis-parinárico
Ácido graso fluorescente, sensible a polaridad del solvente
Sonda fluorescente unida al ácido graso o fosfolípido
Colesterol = no fluorescente
Análogo fluorescente del colesterol
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
Sondas que se unen (no covalentemente) al ADN
Sondas que emiten en el NIR
Cianinas
Excitación en el visible con laser
No autofluorescencia
Sondas fluorescentes para detectar bioanalitos
Desactivación por cloruro Cl-
Cambioespectralpor Ca2+
Sondas fluorogénicas
Producto de la reacción es fluorescente – especificidad -
Formaciòn de sonda fluorescente por reacción con grupos amino
Medida de actividad enzimática por foramción de producto fluorescente
Product Spectra - JC-1/pH 8.2
Sondas fluorescentes para medir potencial de membrana
Adipocitos cargados con JC-1
(5 µM, 37ºC, 30 min) + 10 nM FCCP.
Exc. = 488 nm Em = entre 515–545 nm y 575–625 nm.
514/529585/590
Fluoróforos de vida media larga
• Pirenos (100 – 400 ns)
• Lantánidos (0.5 – 3 ms)
Eu (III), Tb (III)
Baja absorción (10 M-1 cm-1), se usan complejos metálicos conligandosorgáncios.
Emisión desde orbitales 4f, transición prohibida, lenta
Emisión no polarizada
• Complejo metal transición-ligando
Ru(II), Re(I), Os(II), ligando diimina
Eimisión por transferencia de carga metal-ligando, parcialmente prohibida
Emisión polarizada
τ larga, evita autofluorescencia
GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse