GENETICA MOLECULAR
AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULARASIGNATURA:
UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Gen Mol
PROFESOR TITULAR: DR. VICTOR ROMANOWSKI
PROFESOR ADJUNTO: DRA. PATRICIA AGOSTINO
LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
TURNO NOCHE:
BLOG: http://genmol.blog.unq.edu.ar/Gen Mol
TEMAS DE LAS CLASES TEORICAS
•Estructura del material genético.•Replicación del DNA.
•Mutaciones y reparación del daño en el DNA.
•Recombinación.
•Mecanismos de transposición.•Transcripción.
•Regulación de la expresión génica.•Traducción.
•Direccionamiento de proteínas.
•Organismos transgénicos y terapia génica.
•DNA recombinante y estudios cromosómicos.
•Técnicas corrientes en genética molecular.
1º PARCIAL
2º PARCIAL
A LO LARGO DEL
CUATRIMESTRE
Gen Mol
Bibliografía recomendada
•Biología Molecular de la célula. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland Publishing, Inc. Catálogo biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 1996, 2002 y 2004).
•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall. (y ediciones anteriores). Catálogo biblioteca UNQ: 572.8 LEW (edición 1995, Gene V).
•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés). Catálogo biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 2001 y 2005).
•Lehninger. Principles of Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. (2008), 5º edición (en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España). Catálogo biblioteca UNQ: 572.3 LEH.•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial McGraw-Hill.
Gen Mol
www. pubmed.com
Información actualizada y sitios de interés
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books
Gen Mol
Cronograma (primeras clases) Gen Mol
Extracción de ADN de tejidos humanos
Alumnos + algunos familiares por vía materna
ADN nuclear
ADN mitocondrial
Gen Amelogenina
Identificación sexual
Deleciones en el cromosoma
Y
Herencia Materna
Amplificación por PCR y análisis de polimorfismos
Total: 5 trabajos prácticos
Gen Mol GENETICA MOLECULAR,
LABORATORIOS
Se realizará una extracción de ADN humano para su posterior amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los alumnos extraen su propio ADN a partir de muestras de mucosa bucal. Se suman también muestras de familiares por vía materna.
TP 1: Extracción de ADN a partir de muestras de mucosa bucal
Extracción con cloroformo-isoamílico.Semi-cuantificación
mediante electroforesis en gel
de agarosa.
2 clases
Gen Mol
El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de mujeres de aquéllas provenientes de varones.
TP 2: Caracterización del sexo mediante la amplificación por PCR del gen de
amelogenina. Gen Mol
Amplificación de AMG por PCR.
Resolución en gel de agarosa 2%
2 clases
A diferencia del DNA nuclear, la herencia del DNA mitocondrial es exclusivamente materna. Esta unidad incluye la amplificación por PCR de una región del DNA mitocondrial de 312 pb (conocida como secuencia de Anderson) y su posterior digestión enzimática para poder visualizar el patrón de RFLPs característico de cada muestra. La visualización de RFLPs se realiza mediante la técnica de electroforesis en geles de arcrilamida.
TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por PCR de un fragmento de ADN
mitocondrial.
Amplificación por PCR fragmento ADNmit
Digestión con enzima MnlI
Visualización patrones RFLP 3 clases
Gen Mol
Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la producción de células espermáticas, conocidas como AZF (azoospermia factor). Deleciones en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad masculina.
Se utilizarán los conceptos aprendidos (como PCR multiplex) para el estudio de microdeleciones correspondientes a la región de los genes AZF y su correlación con infertilidad y cáncer testicular.
TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma Y asociadas con infertilidad
masculina.
2 clases
Gen Mol
FORMA DE EVALUACION
Teoría:
•Dos exámenes parciales y un integrador.
•Se promociona con 7 (siete) o más puntos en los parciales.
Trabajos prácticos:
•80% de asistencia
•Informe de TPs
•Exposición de trabajos
•Examen de TPs
REGIMEN DE ESTUDIOS DE LA UNQ
http://www.unq.edu.ar/advf/documentos/5006e6bcefbf8.pdf
ARTICULO 11°: Se considerará ausente a aquel alumno que no se haya presentado a las instancias de evaluación pautadas en el Programa de la asignatura.
Gen Mol
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Introducción sobre los siguientes temas:
Estructura química y estabilidad. DNA A, B y Z.
Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.
RESUMEN DE LA CLASE
Clase de hoy:
Efecto hipercrómico.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Estructura del RNA.
Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización.
Gen Mol
DNA
RNA
transcripción inversa
transcripción y replicación de RNA
replicación de DNA virus a DNA
retrovirus y retroelementos
virus a RNA
transcripción
traducción
proteínaplegamiento (folding),
procesamiento, direccionamiento
(targeting)
procesamiento de RNA
splicing, edición, modificación de nucleótidos y de extremos 5´y 3´
reparación recombinació
n
El dogma central de la biología El dogma central de la biología molecularmolecular
Expandiendo aun más el dogma: non-coding RNAs (microRNA, etc.)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Rugosas (R): inofensivas
Lisas (S): virulentas
1928: Frederick GriffithInfección con dos cepas
de Streptococcus pneumoniae
(S)
(R)
(S) inactivada
(R) + (S) inactivada
Las primeras evidencias
Griffith showed that adding heat-killed virulent bacteria (harmless to mice) to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal, virulent, encapsulated bacteria.
Un poco de historia…
El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M. (1944) fue la primer evidencia
directa de que el DNA es la base de la información genética
Extract from heated smooth (S) bacteria
treatment with protease (digests proteins)
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mice died
Extract from heated smooth (S) bacteria
treatment with DNAase (digests DNA)
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mice lived
DNA carries genetic information
¿Como se demostró que el DNA es el responsable de la herencia?
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Determinaron que el DNA es el material
genético en el bacteriófago T2
Alfred Hershey y Martha Chase (1952)
32P experiment 35S experimentESTRUCTURA DEL MATERIAL
GENETICO I
Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos
nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes
principales:
•Azúcar: una pentosa.
•Ácido fosfórico
•Bases nitrogenadas:
purinas y pirimidinas
La naturaleza química de los ácidos nucleicos
A, G, T, C están presentes en el ADNA, G, U, C están presentes en el ARN
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Nomenclatura
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Bases inusuales
Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: •Hipoxantina, •Xantina, •2-metiladenina,•7-metilguanina•6-metil-aminopurina.
Ejemplos de bases pirimidínicas:•5-metilcitosina (propia del DNA)•5-hidroximetil citosina (HMC): sustituye a la citosina en los fagos T-pares.
En los RNA de transferencia (tRNA) se encuentran •Ribotimidina, •Dihidrouridina, •Seudouridina•Inosina (I).
Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de RNAs.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
•La composición de bases varía de una especie a otra.
•La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie.
•La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T.
•La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G= %C.
•La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C).
•La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.
REGLAS DE CHARGAFF (fines de la década del ‘40)
Para el DNA doble cadena (dsDNA)
La estructura del DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
% de bases en distintos organismos
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
HMC = hidroximetil-citocina
La estructura del DNA
•Patrón helicoidal del DNA.
•Dos periodicidades a los largo del eje, una primaria de 3,4 A y una secundaria de 34 A.
PATRON DE DIFRACCION DE RAYOS X
"The instant I saw the picture my mouth fell open and my pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress card number 68-16217.
Principios de la década del ‘50
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructura del DNA: la doble hélice(1953)
• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente
• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice
• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hélice
G C A T
• El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo
James Watson & Francis Crick, 1953, Nature, vol 171,
737-738
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La estructura del DNA• Cadenas antiparalelas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Fuerzas que estabilizan la doble hélice
• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión)
• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica
• Interacciones iónicas:
- Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos
- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el DNA
(divalentes más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la
estructura del RNA)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas
Comparación de las formas A, B y Z del DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
DNA A: 75% agua(esporos), Na+
DNA B: 92% aguaWatson & Crick
DNA Z: poli-pur-pyr, -GCGC… alta [Na+]
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras inusuales
Palíndromos (palindromes)
Repeticiones en espejo (mirror repeats)
Horquillas (hairpins)
Cruciformes (cruciforms)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras inusuales: triplex DNAs
Apareamiento tipo Hoogsteen
Estables a pH bajos (citocina protonada, C+)
H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.
Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.
H-DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras inusuales: cuadruplex DNADNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.
Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructura del RNA
El RNA es químicamente más reactivo que el DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Typical right-handed stacking pattern of single stranded RNA. The bases are shown in gray, the phosphate atoms in yellow, and the riboses and phosphate oxygens in green.
La estructura del RNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Secondary structure of RNAs. (a) Bulge, internal loop, and hairpin loop. (b) The paired regions generally have an A-form right-handed helix, as shown for a hairpin.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Las moléculas de ssRNA pueden exhibir conformaciones variadas
Estructuras secundarias en RNA
tRNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Las células producen
varios tipos de RNA
Tipos principales de RNA que fabrican las células
Tipo de RNA Función
mRNARNA mensajeros, codifican proteínas
rRNA
RNA ribosómicos, forman la estructura básica de los ribosomas y catalizan la síntesis de proteínas
tRNA
RNA de transferencia, cruciales en la síntesis de proteínas como adaptadores entre el mRNA y los aminoácidos
snRNA
RNA pequeños nucleares, participan en varios procesos nucleares, incluyendo la maduración del pre-mRNA
snoRNARNA pequeños nucleolares participan en el procesamiento y modificación química de los rRNA
Otros RNA
Participan en diversos tipos celulares, como la síntesis de los telómeros, la inactivación del cromosoma X y el transporte de proteínas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
1-5 % 80 %
10-15 %
Perkins et al., 2015. Expanding the ‘central dogma’: the regulatory role of nonprotein coding genes and implications for the genetic liability to schizophrenia. Molecular Psychiatry (2005) 10, 69–78
Los RNAs no-codificantesESTRUCTURA DEL MATERIAL
GENETICO I
Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos
• Medio ácido y alcalino• Densidad de flotación
(ultracentrifugación en gradientes de densidad)
• Espectro UV• Temperatura de desnaturalización
(estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hidrólisis química en medio ácido
Ácidos fuertes: escinden tanto los enlaces
fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos.
Ácidos débiles: escinden los enlaces N-
glicosídicos. Los enlaces de las purinas son más
lábiles que los de las pirimidinas. Se obtiene
ácido nucleico sin bases púricas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hidrólisis química en medio alcalino
RNAClivaje del
enlace fosfodiester
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor
densidad.
Densidad de los ácidos nucleicos
Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:
= 1,660 + 0,00098(G+C)
DNA Densidad (g/ cm3) % (G+C)
Polímero A-T 1.675 0
Diplococcus pneumoniae 1.700 42
Escherichia coli 1.710 51
Serratia marcescens 1.716 55
Mycobacterium phlei 1.732 73
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Desnaturalización del
DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Doble cadena (ds)
Simple cadena (ss)
Desnaturalización del DNA
Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm (temperatura de melting)
DESNATURALIZACION POR CALOR
Cálculo de Tm
•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4
•Oligonucleótidos largos:Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N) (N=longitud del oligo)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA
Parámetro Efecto sobre Tm Efecto sobre la velocidad de renaturalización
Composición de bases
Incremento de Tm con el aumento del %G-C
No ejerce efecto
Longitud<150 bp; incremento de Tm con el incremento de longitud; >500 bp no hay efecto
Incrementa la velocidad con la longitud
Fuerza iónica Incremento de Tm con el aumento de [Na+]
Optimo a 1.5 M Na+
% bp mismatch
Disminuye Tm con el aumento de %mismatch
Disminuye la velocidad con el aumento de %mismatch
Concentración No ejerce efecto Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]
Agentes denaturalizant
es
disminuye Tm con el aumento de [formamide], [urea]
Optimo a 50% formamide
Temperatura - Optima a 20°C por debajo de Tm
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Efecto hipercrómicoThe purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Renaturalización• La desnaturalización es un proceso reversible• Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA
Algunos usos experimentales de la hibridación de ácidos nucleicos:
•PCR•Southern blot •Northern blot •in situ hybridization •D-loop or R-loop mapping •Cot curves
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Avances científicos
• Disociación y reasociación de las hebras complementarias del DNA (hibridación de sondas)
• Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes usando cada una de las hebras de la doble hélice como molde para la copia)
• PCR (amplificación de un segmento de DNA en un tubo de ensayo)
• Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa de retrovirus)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Avances científicos
• Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar DNA en forma precisa)
• Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA: permite la construcción de moléculas recombinantes)
• Enzimas de restricción + ligasa = DNA recombinante (ingeniería genética)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hibridación Reasociación de secuencias
complementarias
secuencia blanco + sonda
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
• DNA: Southern blot
• RNA: Northern blot
• Marcación radioactiva, fluorescente, quimioluminiscente, etc.
Southern blot
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
PCR (Polymerase chain reaction)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
En resumen…
Estructura química y estabilidad del DNA.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)
Efecto hipercrómico.
Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Naturaleza química de los ácidos nucleicos.
Tipos de estructura de DNA (A, B, Z).Estructura y tipos de RNA.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Gen Mol
Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos.