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INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA, A.C.
POSGRADO EN CIENCIAS EN BIOLOGIA MOLECULAR
“Título de la tesis”
(Tratar de hacerlo comprensible para el público general, sin abreviaturas)
Tesis que presenta
Karina Elisa Rosales Pérez
Para obtener el grado de
Maestra en Ciencias en Biología Molecular
Director de la Tesis:
Dr. Samuel Lara González
San Luis Potosí, S.L.P., noviembre 2018
Caracterización bioquímica y estructural del factor
de transcripción Clp y del complejo Clp/ADN
Constancia de aprobación de la tesis
La tesis "Caracterización bioquímica y estructural del factor de transcripción Clp y del complejo Clp/ADN" presentada para obtener el Grado de Maestra en Ciencias en Biología Molecular fue elaborada por Karina Elisa Rosales Pérez y aprobada el veintinueve de noviembre del dos mil dieciocho por los suscritos, designados por el Colegio de Profesores de la División de Biología Molecular del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C.
Dr. Samuel( ara González Directo· ele la tesis
~-Dr. Juan Francisco Jiménez Bremont
Miembro del Comité Tutora!
Dra. Martha Leti ia Santos Martínez Miembro del Comité Tutora!
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Créditos Institucionales
Esta tesis fue elaborada en el Laboratorio de Biología Estructural de la División de Biología Molecular del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica,
A.C., bajo la dirección del Dr. Samuel Lara González.
Durante la realización del trabajo el autor recibió una beca académica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (No. de registro 611368) y del Instituto
Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A. C. Este trabajo fue financiado a través del proyecto de Ciencia Básica SEP- CONACYT No CB2011-
168710 y por el proyecto CONACYT INFRA-2013-01No 204373.
1 PI CYT
Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica/ A.C.
Acta de Examen de Grado
El Secretario Académico del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., certifica que en el Acta 183 del Libro Primero de Actas de Exámenes de Grado del Programa de Maestría en Ciencias en Biología Molecular está asentado lo siguiente:
En la ciudad de San Luis Potosí a los 29 días del mes de noviembre del año 2018, se reunió a las 10:00 horas en las instalaciones del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., el Jurado integrado por:
Dr. Juan Francisco Jiménez Bremont
Dra. Martha Leticia Santos Martínez Dr. Samuel Lara González
a fin de efectuar el examen, que para obtener el Grado de:
Presidente
Secretaria
Sinodal
MAESTRA EN CIENCIAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
sustentó la C.
Karina Elisa Rosales Pérez
sobre la Tesis intitulada:
IPICYT IPICYT IPICYT
Caracterización bioquímica y estructural del factor de transcripción Clp y del complejo C/p/ADN
que se desarrolló bajo la dirección de
Dr. Samuel Lara González
El Jurado, después de deliberar, determinó
APROBARLA
Dándose por terminado el acto a las 11:30 horas, procediendo a la firma del Acta los integrantes del Jurado. Dando fe el Secretario Académico del Instituto.
A petición de la interesada y para los fines que a la misma convengan, se extiende el presente documento en la ciudad de San Luis Potosí, S.L. ., México, a los 29 días del mes de noviembre de 2018.
Mtra. Jefa del
Dr. Horacio Flores Zúñiga Secretario Académico
INST/Tl.iTO P • T• SINO
! DE INVESTIGACIÓN ''. CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA, A, C
i'
1 PICYT · ;ECRETARIA ACADEMIO..
v
Dedicatorias La presente Tesis está dedicada a mi mamá, porque siempre has estado a mi lado
brindándome tu apoyo y consejos para hacer de mí una mejor persona. Gracias
infinitas porque cuando todos los caminos se cierran siempre me brindas un
abrazo caluroso y palabras motivantes, que me impulsar a continuar.
A mi amado esposo por sus palabras de aliento cuando las situaciones se
complican, por su amor y por brindarme el tiempo necesario para realizarme
profesionalmente. Este proyecto no fue fácil, pero siempre estuviste motivándome
y ayudándome soy afortunada de tenerte como cómplice de vida.
A mi querida familia, por enseñarme que con esfuerzo e integridad se pueden
lograr grandes cosas.
Al Doctor Samuel por permitirme formar parte de su grupo de trabajo, por la
confianza depositada, por su infinita paciencia y el conocimiento transmitido.
A mis compañeros y amigos, quienes sin esperar nada a cambio compartieron su
conocimiento, alegrías y tristezas y a todas aquellas personas que durante estos
dos años estuvieron a mi lado apoyándome.
Gracias a todos.
vi
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT).
Al Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT).
Al Dr. Samuel Lara González por la dirección y apoyo en este trabajo.
A los miembros de mi comité tutoral, Dr. Juan Francisco Jiménez Bremont y Dra.
Martha Leticia Santos Martínez, por las aportaciones en la tesis.
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Contenido
Constancia de aprobación de la tesis ii Créditos institucionales iii Acta de examen iv Dedicatorias v Agradecimientos vi Lista de tablas viii Lista de figuras ix Abreviaturas x Resumen xi Abstract xii Introducción 2 Materiales y Métodos 6 Evaluación de la expresión y solubilidad de proteínas 6 Expresión de la proteína Clp 6 Purificación por afinidad a níquel 7 Desalinización 8 Cromatografía por afinidad a heparina 8 Desplazamiento térmico 9 Formación del complejo Clp-ADN 9 Ensayos de cristalización 10 Crio conservación y montado de los cristales 10 Determinación de la estructura de Clp, refinamiento y análisis 11 Resultados y Discusión 12 Evaluación de la expresión y solubilidad de proteínas 12 Desplazamiento térmico 12 Purificación por afinidad a níquel 13 Desalinización 13 Purificación por afinidad a Heparina 14 Formación del complejo Clp-ADN 14 Ensayos de cristalización 15 Determinación de la estructura de Clp 16 Estructura de Clp 19 Conclusiones 20 Referencias 37
viii
Lista de tablas
Tabla I. Condiciones evaluadas en el ensayo de estabilidad térmica. 21 Tabla II. Condiciones evaluadas en el segundo ensayo de estabilidad
térmica. 22
Tabla III. Condiciones en las que crecieron cristales de Clp Xac y Clp-ADN. 23 Tabla IV. Aditivos usados para optimizar las condiciones de cristalización. 26 Tabla V. Datos cristalográficos y estadísticos de la recolección de datos y
refinamiento. 27
Tabla VI. Datos estadísticos de validación por MolProbity. 28
ix
Lista figuras
Fig. 1 Alineamiento de las secuencias de Clp tanto de X. campestris
cómo de X. axonópodis.
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Fig. 2 Evaluación del tiempo de incubación y concentración de IPTG
para la expresión de Clp en BL21 (DE3) Star.
30
Fig. 3 Ensayo de estabilidad térmica 31
Fig. 4 Purificación de la proteína recombinante por afinidad a Níquel 32
Fig. 5 Cromatografía de afinidad a Heparina. 33
Fig. 6 Cristales de Clp de Xanthomonas axonopodis 34
Fig. 7 Densidad electrónica en la estructura de Clp de Xanthomonas
axonopodis
35
x
Abreviaturas
AMPc Ciclic adenosin monophosphate
cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate
CAP Catabolite activator protein
c-di-GMP Ciclic diguanosil monophosphate
Clp Crp like protein
CV Column Volumes
COOT Crystallographic Object-Oriented Toolkit
DSF Difusible signal factor
EPS Exopolysaccharide
IMAC Inmobilized Metal Affinity Chromatography
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
MR Molecular Replacement
Ni-NTA Niquel-nitrilotriacetic acid
PDB Protein Data Bank
PHASER Program for phasing macromolecular crystal structure
PHENIX Python-based Hierarchical Environment for Integrated Xtallography
QS Quorum sensing
RPF Regulator pathogenicity factors
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Xac Xanthomonas axonopodis pv. citri
Xcc Xanthomonas campestris pv. campestris
xi
Resumen
Caracterización bioquímica y estructural del factor de transcripción Clp y del complejo Clp/ADN
Las bacterias del género Xanthomonas son de un alto interés agrícola y
económico, a causa de que son bacterias fitopatógenas y por lo tanto
responsables de enfermedades en plantas como la podredumbre negra o cáncer,
en cultivos como tomates, pimientos, cítricos o frutas, entre otros. Estas bacterias
poseen un factor de transcripción global de virulencia llamado Clp el cual es un
homólogo estructural de la proteína activadora por catabolito (CAP, también
conocida como CRP) de ahí que reciba el nombre de Clp, por sus siglas en inglés
CRP like protein. Clp es de interés en la súper familia CRP/FNR debido a que
puede unirse a ADN sin necesidad de un ligando y cuando su une a éste, que es
c-di-GMP, Clp es inhibido, caso contrario a su homólogo CAP. Es de un gran
interés conocer el mecanismo por el cual Clp reconoce e interacciona con su sitio
de unión en el ADN y de igual forma con c-di-GMP. En el presente trabajo se
expresó Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli, y se evaluaron las
condiciones para una mejor expresión de la proteína recombinante. Mediante la
técnica de desplazamiento térmico se identificó un amortiguador que le
proporciona mayor homogeneidad y estabilidad térmica y conformacional a la
proteína recombinante. La purificación se realizó mediante dos pasos
cromatográficos el primero por IMAC y el segundo por afinidad a Heparina. Se
realizaron ensayos de cristalización tanto de la proteína recombinante como en
complejo con ADN, utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Con
los cristales obtenidos para Clp, se realizaron experimentos de difracción de rayos
X, obteniendo un patrón de difracción de 2.6Å de resolución con el cual se resolvió
su estructura.
Palabras clave: CAP, Factor de Transcripción, Interacción Proteína-ADN, Cristalización, Reemplazo Molecular.
xii
Abstract
Biochemical and structural characterization of the interaction of the transcription factor Clp with its binding site in DNA
Bacteria of the genus Xanthomonas are of high agricultural and economic interest,
because they are phytopathogenic and therefore responsible for diseases in plants
such as black rot or cancer in crops such as tomatoes, peppers, citrus or fruit,
among others. These bacteria have a global virulence transcription factor called
Clp which is a structural homologue of the catabolite activating protein (CAP) or
also known as CRP hence it is called Clp, for its acronym in English CRP like
protein. Clp is of interest in the CRP / FNR super family because it can bind to
DNA without the need for a ligand and unlike its more-studied homologue CAP the
binding to its ligand (c-di-GMP) only causes its inhibition. It is of great interest to
know the mechanism by which Clp recognizes and interacts with its binding site in
DNA and in the same way with c-di-GMP. In the present work, Clp was expressed
in strain BL21 (DE3) Star of Escherichia coli, the conditions for a better expression
of the recombinant protein were evaluated. By means of the thermal displacement
technique, a buffer was identified that provides greater homogeneity and thermal
and conformational stability to the recombinant protein. The purification was carried
out by means of two chromatographic steps, the first by IMAC and the second by
affinity to Heparin. Crystallization tests were carried out on both the recombinant
protein and on the DNA complex, using the technique of vapor diffusion in sitting
drop. Several crystals were tested in X-ray diffraction experiments, a complete
dataset was collected from a single crystal and the structure of apo Clp was
obtained at 2.6Å.
KEY WORDS. CAP, Transcription Factor, Protein-ADN interaction, Crystallization, Molecular Replacement.
1
Caracterización bioquímica y estructural del factor de transcripción Clp y del complejo Clp/ADN
Rosales-Pérez K.E.1, Lara-González S.1*
1 IPICYT, Laboratorio de Biología Estructural, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, San Luis Potosí, México. *Autor de correspondencia: Samuel Lara-González, Tel. 01(444)834200 ext. 6239 Correo electrónico: Samuel.laripicyt.edu.mx
2
INTRODUCCIÓN
Las bacterias del género Xanthomonas producen la goma de xantana, la cual tiene
diversas aplicaciones en la industria farmacéutica y alimenticia como agente
estabilizante o espesante1. Estas bacterias también fabrican grandes cantidades
de exopolisacáridos (EPS) y son capaces de secretar enzimas extracelulares
incluyendo proteasas, pectinasas y endoglucanasas, los cuales se han
considerado importantes factores de virulencia causantes de la enfermedad de
podredumbre negra en una amplia variedad de plantas comerciales alrededor del
mundo, especialmente las crucíferas y rutáceas. El mecanismo por el cual éstas
bacterias causan estas enfermedades es penetrando al sistema del xilema de las
plantas a través de heridas o bien por los hidatodos2, que son estructuras
generalmente presentes en los bordes de las hojas por medio de las cuales
secretan agua. Estos hidatodos facilitan el ingreso bacteriano hasta llegar al
xilema; una vez ahi las bacterias crecen y desarrollan de lesiones cloróticas en
forma de V que se extienden desde el borde de la hoja3,4
Para la formación de biofilm y de los factores de virulencia, existe un sistema de
fosfotransferencia de dos componentes que transmite una señal ambiental al
interior de la bacteria con la consecuente expresión de genes de respuesta; el
mecanismo denominado Quorum sensing (QS), detecta la densidad celular,
responsable de la regulación de genes por medio de la secreción y detección de
señales químicas denominadas autoinductores.5,6 Para la adaptación de la
bacteria a su entorno es crucial que el QS detecte cuándo una molécula señal
alcanza determinada concentración, para que la bacteria exprese determinados
genes7. En el caso de Xanthomonas campestris el QS en condiciones de alta
densidad de población regula de manera positiva los factores de virulencia
(producción de EPS, secreción de enzimas hidrolíticas y formación de biofilm); el
sistema de dos componentes está constituido por la quinasa histidínica RpfC, que
tiene un domino transmembrana, un dominio receptor de señal REC, un dominio
HTP (del inglés, histidine phosphotransferase) y su regulador de respuesta RpfG,
éste último tiene los dominios REC y HD-GYP. Por lo tanto, a baja densidad de
3
DSF la RpfC está unida a RpfF (DSF sintasa), dejando al regulador RpfG inactivo
y cómo resultado el nivel de c-di-GMP es elevado permitiendo así que éste se una
a el factor de transcripción Clp; cómo consecuencia de ésta unión, Clp no puede
unirse al ADN blanco8. Caso contrario; la disminución intracelular de c-di-GMP
activa a Clp, propiciando la expresión de los genes involucrados en la patogénesis
de Xanthomonas, incluyendo a aquellos que codifican para enzimas extracelulares
como la endoglucanasa EngXCA y la manasa ManA.9 Para comprobar la
regulación transcripcional de éstos factores de virulencia se realizó una deleción
del gen de Clp, lo cual tiene como consecuencia una reducción severa en la
producción de EPS y enzimas extracelulares incluso mayor que la deleción de rpfF
y rpfG. Con respecto a la formación de biofilm, Clp juega un papel dinámico en su
regulación en respuesta a las alteraciones en los niveles de c-di-GMP4,10. Debido a
que actúa como activador cuando se une al gen manA y de forma inversa como
represor en su unión al gen xag. El gen manA está implicado en la dispersión de
biofilm y el segundo gen xag en la formación de biofilm11,12. Estos hallazgos
sugieren que la unión de Clp con c-di-GMP cuando se encuentra en niveles
elevados influye en factores involucrados en la formación de biofilm, ésta unión
Clp-c-di-GMP previene que el factor de transcripción se una a ADN y por lo tanto
la expresión del gen manA disminuye pero por el contrario se expresa el gen
xag.11
Clp es un factor de transcripción que recibe éste acrónimo de “CAP like proteín”
debido a que comparte 45% de identidad en secuencia de aminoácidos y un
RMSD de 0.99 Å en alineación de estructuras con su homólogo más estudiado en
Escherichia coli CAP (Catabolite activator protein), y máximo representante de la
familia CRP/FNR a la cual también pertenece Clp. En esta familia de reguladores
transcripcionales sus miembros forman homodímeros y tienen un dominio N-
terminal que constituye el sitio de unión a su efector y un dominio C-terminal que
comprende el motivo hélice-giro-hélice de unión a ADN13. En el caso específico de
Clp su efector es c-di-GMP y contrario a CAP la unión a su efector inhibe la unión
de Clp al ADN blanco. El sitio de unión de Clp con su efector c-di-GMP no está
bien definido; sin embargo, el modelado sugiere que el nucleótido se une en un
4
sitio localizado entre el dominio cNMP (N-terminal cyclic mononucleotide) y el
dominio de unión a ADN a diferencia de CAP que se une en el dominio cNMP14.
Chin Ko-Hsin y colabores, cristalizaron XcClp (Clp en X. campestris) en ausencia
de cAMP y ADN, resolvieron la estructura por remplazo molecular (MR) usando
como modelo de búsqueda a EcCAP (CAP de E. coli) en complejo EcCAP-cAMP-
ADN (PDB 2CGP) y determinaron que la estructura apo de XcClp es muy similar a
la estructura del complejo EcCAP-cAMP-ADN, las cuales pudieron empalmarse
con excepción de los primeros 21 residuos del N-terminal. Así mismo concluyen
que el dominio N-terminal es el característico a CAP, constituido por ocho cadenas
de barriles β anti paralelas flanqueadas por dos α-hélices. El dominio C-terminal
consiste en tres α-hélices y cuatro barriles β anti paralelos con dos α-hélices (αE y
αE) conectados por un loop entre los residuos 198-200 lo cual constituye el motivo
HTH (hélice-giro-hélice) característico de la familia. Una diferencia estructural
entre XcClp y EcCAP es que la primera forma de un dímero simétrico con cada
subunidad adoptando una forma cerrada adecuada para la unión a ADN; y la
segunda adopta una estructura de un dímero no simétrico, con una subunidad
abierta y la otra cerrada, la cual solo se vuelve simétrica cuando es cristalizada en
presencia de cAMP y ADN.
En EcCAP los residuos S84 y E130 son cruciales en el sitio de unión e interacción
con el AMP cíclico, sin embargo estos residuos corresponden a E99 y R150 en
XcClp respectivamente, E99 es un residuo grande con carga negativa lo que
implica un cambio dramático para la posible unión de cAMP con XcClp14, esta
ausencia de efector se ve compensada con la formación de un puente salino E99-
R150, lo que sugiere que posiblemente c-di-GMP tenga otro sitio de unión.
Con respecto a la unión a ADN en XcClp el residuo D162 (G142 en EcCAP) forma
dos puentes de hidrógeno con la cadena lateral del residuo D159 lo que provoca
un acercamiento entre las hélices αC y αD, primer requerimiento para la unión a
ADN. Así mismo se necesita de un residuo que propicie la interacción de la hélice
αD con la αF hélice, en EcCAP esta función corresponde a A145, el cual
corresponde en XcClp a V165 un residuo hidrofóbico que empuja y orienta a la
hélice αF para la interacción con ADN15.
5
En nuestro grupo de trabajo en el 2015 se empezó a trabajar con Clp de X.
campestris y X. axonopodis, (Fig.1) debido al alto porcentaje de identidad entre
ambas (98%), logrando la correcta clonación de los genes sintéticos de Clp para la
expresión de E. coli con el objetivo de tener la proteína de Clp fusionada a una
etiqueta de seis histidinas (6XHis) en el extremo N-terminal y clonado entre dos
sitios de restricción de las enzimas Hind III y Nde I del vector pET28-PPS, cuyas
clonas fueron verificadas por secuenciación en el Laboratorio Nacional de
Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LANBAMA). Sin embargo, los
rendimientos de ambas proteínas no permitían hacer ensayos de cristalización.
Por lo que estas dos secuencias se analizaron en programas que evalúan la
propensión a cristalizar como lo son: XtalPred-RF, Crysalis, PDpredictor,
CRYSTALP2 y SECRET y con base en los resultados obtenidos se decidió
trabajar en la optimización del rendimiento de Clp de X. axonopodis. Por lo que el
objetivo de este trabajo fue identificar las condiciones para lograr una buena
expresión de Clp de X. axonopodis, en las que la proteína se mantenga soluble y
estable, así como desarrollar el protocolo para la purificación de la misma y poder
utilizarla en ensayos de cristalización y resolver su estructura tridimensional.
6
MATERIALES Y MÉTODOS
Evaluación de la expresión y solubilidad de la proteína
Se evaluó la expresión de Clp en la cepa de E.coli Bl21 (DE3) Star con diferentes
tiempos de inducción (2, 5, 8 y 16 h), temperaturas de incubación (37 y 28°C), y
concentraciones de IPTG (Isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside) 0.2, 0.4, 0.6, 0.8
y 1.0 mM.
Se realizaron dos protocolos de expresión; en el primer protocolo a evaluar se
prepara el pre-inóculo con células BL21 (DE3) Star transformadas con la
construcción pET28pps_Clp en 50 ml de medio LB líquido adicionado con
kanamicina (50µg/ml). El pre-inóculo se incuba a 37°C durante 12h a 190 rpm
(revoluciones por minuto) con éste se inocula medio LB fresco (en una dilución
1:25) el cual se incuba hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm entre 0.6 -
0.8. Una vez alcanzada la densidad óptica se induce la producción de proteína con
0.2mM de IPTG y así evaluar las diferentes condiciones de tiempo y temperatura
de incubación antes mencionadas16,17. En el segundo protocolo, se prepara el pre-
inóculo en las condiciones antes mencionadas y una vez que se obtiene una
DO600nm entre 0.6 y 0.8 se induce la producción de la proteína con diferentes
concentraciones de IPTG para evaluar la influencia de éstas en la expresión y se
incuba a 28°C por 16 h, se tomó una alícuota antes y después de la inducción y se
evaluó en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12%.
Expresión de la proteína Clp
Se descongelaron en hielo 50µl de células competentes BL21 star por 10 minutos;
después se agregó 1 µl del vector con la construcción pET28pps_Clp, se mantuvo
en hielo por 20 min, posteriormente se le dio un choque térmico a 42°C por 45 s e
incubar en hielo por 2 minutos. Posteriormente se le añadió 500 µl de medio Luria-
Bertani (LB) se incubó por una hora a 37°C con agitación constante a 190 rpm.
Los tubos se centrifugaron a 6000 rpm, se retiraron 400 µl de medio LB, el
precipitado se resuspendió y se resembró en placas de agar con kanamicina, las
cuales se incubaron a 37°C por 16 h.
7
A partir de estas colonias se prepara el preinóculo en 50 ml de medio LB con
kanamicina y se incubó a 37°C durante 12 horas.
Posterior a la incubación se inoculó un litro de medio LB fresco con kanamicina se
incubó a 37°C con agitación constante a 190 rpm hasta que alcanzó una densidad
óptica de 0.6 nm. Una vez alcanzado se hizo un choque térmico a 4°C por 2 h y
posteriormente se indujo la expresión con una concentración final de 0.2mM de
IPTG, la expresión se hizo a 28°C durante 16 horas con agitación constante a
190rpm. El precipitado de las células se guardó a -20°C hasta su uso. La
expresión fue analizada mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-
PAGE al 12%.
Purificación por afinidad a níquel
Para purificar Clp del extracto celular, al término de la inducción, se centrifugan las
células a 10,000 rpm durante 10 minutos, se desecha el sobrenadante y éstas
células son re suspendidas en 25 ml del amortiguador optimizado (25mM Tris-HCl
pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM) y las
células se sonican 7 min 30 seg con pulsos de 15s ON/30s OFF a 50% de
amplitud. Después se centrifugan a 12,000 rpm a 4°C por 15 min. Se recupera la
fracción soluble, la cual se transfiere a una columna de agarosa Ni-NTA de
Qiagen.
La columna Ni-NTA de Qiagen es equilibrada con 5 volúmenes de columna del
amortiguador optimizado. La elución se realiza con un gradiente escalonado de
imidazol de la siguiente forma: en el primer lavado se usan 10 volúmenes de
columna (CV) del amortiguador de lisis adicionado con 10mM de imidazol, se hace
un segundo lavado con 6CV de amortiguador de lisis adicionado con 50 de
imidazol y por último un lavado con 4CV usando el amortiguador de lisis con
500mM de imidazol. Las fracciones eluidas se colectan y son sometidas a
electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) al 12%.
La proteína recombinante, presente en las fracciones que eluyeron, se mezclaron
e incubaron con 5 unidades/mL de la proteasa PPS a 4°C durante toda la noche
para eliminar la etiqueta de histidinas. Se tomó muestra antes y después de la
8
incubación con la proteasa y el corte fue evaluado por medio de SDS-PAGE al
12%.
Desalinización
La proteína recombinante es desalada por filtración en gel con una columna
sephadex g-25 PD10 (GE Healthcare). En un primer paso se evaluó la cantidad de
KCl necesario en el buffer, para determinar la metodología de desalinización que
se adecue a Clp de X. axonopodis.
Primero se lava la columna adicionando 25ml de agua milliQ, y se desecha el
sobrenadante, después la columna es equilibrada con 25 ml del amortiguador a
ser evaluado, cada uno mantiene constate las siguientes condiciones: 25mM Tris-
HCl pH 7.5, Glicerol 15%, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM y lo que se modifica
es la concentración de KCL; de la siguiente forma: sin KCl, con 50mM, 100mM y
150mM de KCl según corresponda. Se adiciona 2.5 ml de la muestra proveniente
de la purificación por níquel, el frente en este caso es colectado para evaluar y por
último se adiciona 3.5 ml del amortiguador a la columna y se colecta ésta elución.
Este protocolo se repitió para cada uno de los amortiguadores a evaluar.
Se toman muestras tanto del frente y la elución de cada una de las condiciones y
se evalúan mediante SDS-PAGE al 12% y se mide la concentración de proteína
por el método de Bradford.
Cromatografía por afinidad a heparina
Una vez que la proteína es desalada por filtración en gel con una columna
sephadex g-25 PD10 la elución es filtrada por una membrana de 0.2µm e
inyectada en el equipo AKTA-FPLC (GE Healthcare) usando una columna de
afinidad a heparina HiTrap Heparin HP (GE Healthcare)18, previamente equilibrada
con el amortiguador (25mM Tris-HCl pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 500 mM, LiCl
25mM, β-mercaptoetanol 1mM). Se utilizaron dos amortiguadores para la
purificación por afinidad a heparina; el amortiguador A que contenía Tris-HCl pH
7.5 25mM, Glicerol 15%, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM y el amortiguador B
contenía 25mM Tris-HCl pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 1M, LiCl 25mM, β-
9
mercaptoetanol 1mM. La proteína se recupera haciendo un gradiente lineal de
50% a 100% de amortiguador B, usando un flujo de 2ml/min y se colectaron
fracciones de 3 ml cada una, las cuales se sometieron a SDS-PAGE al 12%.
Desplazamiento térmico
La técnica de desplazamiento térmico (Thermal Shift Assay) también conocida
como Thermofluor, se realizó en una placa de PCR de 96 pozos y el equipo usado
fue un RT-PCR 7500 Fast (Applied biosystems). El volumen final de la muestra fue
de 40µl, la proteína Clp de Xanthomonas axonopodis se ajusta a una
concentración final de 0.1 mg/ml, se incuba junto con el fluoróforo SYPRO orange
(Invitrogen) con una concentración final de 5X y con cada una de las condiciones a
evaluar, entre ellas tipo de amortiguador, uso de sales, detergentes, etc. Las
cuales se encuentran en la Tabla 1. El rango de temperatura que se evaluó fue de
25°C a 95°C y los datos de fluorescencia emitida se analizaron y graficaron en
Excel; ajustándolos a la ecuación de Boltzman para obtener la Tm (melting
temperature) con el complemento Solver de Excel19,20.
Formación del Complejo Clp-ADN
Para la formación del dúplex de ADN de 38 pb (pares de bases) se utilizó la
secuencia consenso de unión a ADN de CAP. Utilizando dos secuencias de ADN
(Integrated DNA Technologies), 17-mer (5´ATTTCGAAAATTGTGAT) Y 19-mer
(5´CTAGATCACAATTTTCGAAAT), las cuales forman un palíndromo. La
hibridación del dúplex de ADN se hace en un termociclador Bio Rad utilizando una
rampa de disminución de temperatura de 0.1° C/s. La temperatura inicial es de
95°C y se reduce hasta 20°C, este protocolo se realiza por duplicado en el
termociclador.
La proteína purificada por afinidad a heparina es mezclada con el ADN en una
relación 1:1.5 (proteína: ADN) en presencia de 50mM de MgCl2 para la formación
del complejo.
10
Ensayos de Cristalización
La técnica utilizada para los ensayos de cristalización fue difusión de vapor en
gota sentada con el método de matriz esparcida.
La proteína purificada por afinidad a heparina, se cambia al siguiente amortiguador
25mM Tris-HCl pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 300mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol
1mM, mediante la columna sephadex g-25 PD10. Posteriormente es concentrada
a 10 mg/ml en un amicon Vivaspin turbo con una membrana de retención de
10kDa.
Para el complejo Clp/ADN primero se cambia la proteína al amortiguador 25mM
Tris-HCl pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 300mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM,
mediante la columna sephadex g-25 PD10, para posteriormente formar el
complejo Clp:ADN en una proporción 1:1.5 y por último concentrarlo a 15 mg/ml
en un amicon Vivaspin turbo con una membrana de retención de 10kDa.
Se usaron dos matrices de condiciones de cristalización; la primera de Hampton
Research (Kit Cristal Screen I y II) y el segundo de Molecular Dimensions (Kit
Morpheus I y Morpheus II). Para cada condición se utiliza 50 µL de precipitante,
las gotas se colocan en una proporción 1:1 (0.8 µL de proteína y 0.8 µL de
precipitante) las cajas son selladas y almacenadas a 14°C monitoreándolas
periódicamente con el microscopio estereoscópico.
Crio conservación y montado de los cristales
Una vez identificado un cristal de buena calidad, se cortó con cuidado el sello del
pozo en el que se encuentra, y con la ayuda de un crio-loop se pesca el cristal,
para después sumergirlo por unos segundos en la solución madre adicionada con
20% glicerol como solución crioprotectora, posterior a esto se pesca nuevamente y
se congelan instantáneamente "flash-frozen" en crio-viales que se encuentran
sumergidos en nitrógeno líquido, en un movimiento continuo y rápido. Los cristales
son almacenados en un contenedor con nitrógeno líquido (Dewar) para su
transporte. Cada cristal se mantiene en nitrógeno líquido mientras es transportado
y durante el experimento de difracción.
11
Se registró la ubicación y detalles de cada cristal cosechado y congelado. Una vez
colectado cada cristal es enviado al Laboratorio Nacional de Estructura de
Biomacromoléculas (LANEM) para realizarles a estos cristales la técnica de
difracción de rayos X.
Determinación de la estructura de Clp, refinamiento y análisis
Los datos de difracción que se obtuvieron del difractómetro del LANEM, por el
método de rotación, fueron integrados con el programa HKL 3000. Posteriormente,
los datos se analizaron con el programa xtriage de la plataforma PHENIX, para
corroborar la correcta asignación del grupo espacial y determinar la presencia de
posibles anomalías (twinning) y datos como el coeficiente de Mattheus o el factor
B del gráfico de Wilson.
Para la resolución del problema de fases se usó el método de remplazo molecular
(MR), utilizando cómo modelo de búsqueda la estructura de Clp de Xanthomonas
campestris (PDB: 3iwz) con el programa de PHASER, se determinan los valores
de la función de rotación (RFZ) y la de traslación (TFZ) para confirmar la certeza
de la solución.
El refinado se hizo con el programa phenix.refine; sólo en el primer ciclo de
refinado se realizó con el protocolo de simulated annealing, junto con los
siguientes parámetros: refinamiento cartesiano estándar con las coordenadas
XYZ, cuerpo rigido activo, con función de máxima verosimilitud, todas con
restricciones de simetría no cristalográfica. Para el segundo ciclo de refinado y los
subsecuentes, se ejecuta con los mismos parámetros a excepción de simulated
annealing.
Posterior a cada refinado se efectuaron los ajustes necesarios a las coordenadas
utilizando mapas de desidad electrónica (2Fo-Fc y Fo-Fc) de forma manual en el
programa COOT, después de varios ciclos de ajuste y refinamiento, la estructura
se sometió a validación en el programa MolProbity, disponible en
http://molprobity.biochem.duke.edu.
12
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la expresión y solubilidad de proteínas
Con el fin de obtener la proteína pura que nos permitiera realizar ensayos
funcionales y estructurales se evaluaron diferentes condiciones de expresión,
usando la cepa BL21 (DE3) Star de E. coli, debido a que esta cepa es deficiente
de la expresión de proteasas y como consecuencia disminuye el riesgo de
proteólisis de la proteína recombinante y por otro lado contiene la secuencia que
codifica para la RNA polimerasa T7 indispensable para la expresión en el vector
pET28, entre otros.
Una vez transformadas, las bacterias BL21 (DE3) star con el plásmido pET28 Xac
(del cual se corroboró su secuencia en el Laboratorio Nacional de Biotecnología
Agrícola Médica y Ambiental) se inició con el protocolo de evaluación de la
expresión antes mencionado y con base en los resultados obtenidos en los geles
SDS-PAGE al 12% podemos discernir y concluir que la mejor condición para una
mayor expresión de la proteína fue que, la temperatura y tiempo de incubación sea
a 28°C por 16 h, una temperatura de expresión más baja facilita la producción de
la proteína soluble y plegada. Por otro lado, en cuanto a la evaluación que se hizo
para conocer la concentración de IPTG necesaria para una mayor expresión, los
resultados muestran que ésta concentración no afecta significativamente la
cantidad de proteína obtenida (Fig. 2). Por lo que se decidió trabajar con una
concentración de 0.2mM de IPTG, basándonos en el hecho de que cuando
requerimos aumentar la solubilidad de las proteínas no es conveniente saturar los
mecanismos celulares de plegado y que el IPTG puede llegar a ser tóxico debido a
que no es metabolizado, por lo que se decidió usar la concentración más baja16,17.
Desplazamiento térmico
El ensayo de desplazamiento térmico fue un protocolo rápido y sencillo que nos
permitió la identificación de los componentes necesarios para que el amortiguador
aumentara la estabilidad y homogeneidad conformacional de la proteína
recombinante, lo cual podría permitir el mejorar notablemente la probabilidad de
13
éxito en la obtención de cristales19,20 debido a que se ha demostrado que una
estabilidad térmica aumentada se correlaciona con un orden estructural
incrementado y una menor flexibilidad de la proteína y cómo consecuencia final
incrementar las posibilidades de cristalizar la proteína. En una primera etapa se
probaron 96 condiciones diferentes, mencionados en la Tabla I, cuyos resultados
nos permitió seleccionar aquellos aditivos que mejoraban la Tm y que a su vez se
ajustaban mejor a la ecuación de Boltzman. Como segunda etapa en ésta
selección de aditivos, se eligieron a aquellos destacados en la primera etapa y se
hicieron 96 combinaciones diferentes (Tabla II) entre ellos, para la identificación de
aquel amortiguador que tuviera los aditivos que permitieran una TM relevante y
correcto ajuste a la ecuación de Boltzman. De esta forma fue posible determinar el
amortiguador de trabajo, el cual vamos a llamar a partir de este momento como
“amortiguador optimizado” y se compone de: Tris-HCl 25mM pH 7.5, Glicerol 15%,
KCl 500mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM presentando una Tm de 60.75±
0.15 C (Fig. 3).
Purificación por afinidad a níquel
En la purificación por afinidad a Níquel se usó el amortiguador optimizado (Tris-
HCl 25mM pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM)
y la columna de agarosa Ni-NTA de Qiagen de 5 ml. Como resultado se tuvo un
rendimiento de 11.26mg/L, con el amortiguador optimizado mejoró tres veces más
el rendimiento a lo obtenido en nuestro grupo de trabajo en 2016 por Pérez
Márquez21 (3mg/L). La proteína recombinante eluyó en su totalidad en el primer
lavado con 500mM de imidazol; cómo se puede observar en la Fig. 4. Para
eliminar la etiqueta de histidinas que hasta este punto aún tenía la proteína, se le
adicionó 5 unidades/ml de proteasa PPS y se incubó a 4°C toda la noche, lo cual
se comprobó mediante SDS-PAGE al 12% (Fig. 4).
Desalinización
Para poder colocar pruebas de cristalización se disminuyó la concentración de sal
con la finalidad de reducir la solubilidad de la proteína y de esta forma alcanzar la
14
súper saturación o el límite de solubilidad de la proteína y aumentar la
probabilidad de que se formen cristales; sin embargo, en el caso específico de
Clp, la concentración de sal no se pudo erradicar en su totalidad, porque la
proteína la requiere para su estabilidad; por lo que se decidió hacer un cambio de
amortiguador con menor cantidad de sal. Se evaluó este cambio con tres
diferentes concentraciones de KCl (50, 100, y 150mM), se colectó la muestra tanto
del frente, cómo de la elución y se evaluó con SDS-PAGE al 12%. Lo que nos
permitió determinar que la proteína recombinante puede ser cambiada a un
amortiguador que contenga Tris-HCl 25mM pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 150mM, LiCl
25mM, β-mercaptoetanol 1mM, para continuar con el siguiente paso de
purificación que es afinidad a Heparina.
Purificación por afinidad a Heparina
Para el último paso de purificación se usó la columna Hi Trap Heparin HP,
basándonos en que Clp tiene un punto isoeléctrico de 8.92 y que la heparina imita
la estructura polianiónica del ácido nucleico por lo tanto tiene la capacidad de
interaccionar con proteínas de unión a ADN18,22.
Clp de X. axonopodis eluyó a una concentración entre 600mM y 700mM de KCl,
cómo se puede ver en el cromatograma obtenido en el equipo AKTA-FPLC (GE
Healthcare) y lo cual fue corroborado con SDS-PAGE (Fig. 5). Se hizo la
cuantificación de estas fracciones colectadas, mediante el reactivo de Bradford y
el rendimiento final de Clp de X. axonopodis de esta purificación fue de 3.34mg/L.
Se observó que la proteína estaba pura por lo que éste fue el último paso de
purificación, para después ser cambiada al amortiguador que contiene Tris-HCl
25mM pH 7.5, Glicerol 15%, KCl 300mM, LiCl 25mM, β-mercaptoetanol 1mM con
el uso de la columna sephadex g-25 PD10 (GE Healthcare), y en seguida se
concentró la proteína hasta 10mg/ml para posteriormente hacer ensayos de
cristalización.
15
Formación del Complejo Clp-ADN
El complejo Clp-ADN se formó con la proteína recombinante de Clp de X.
axonopodis y la secuencia consenso del sitio de unión a ADN de CAP. En el
laboratorio contamos con dos secuencias de ADN; 17-mer
(5´ATTTCGAAAATTGTGAT) y 19-MER (5´CTAGATCACAATTTTCGAAAT); el
“annealing” del ADN de 38 pares de bases se ejecutó en el temociclador Bio-Rad,
en una rampa de 95°C a 20°C, haciendo por duplicado este protocolo. Como
resultado, se obtuvo una secuencia palindrómica de doble cadena:
5´ATTTCGAAAATTGTGAT|CTAGATCACAATTTTCGAAAT3´
3´TAAAGCTTTTAACACTAGATC|TAGTGTTAAAAGCTTTA5´
La proporción proteína:ADN utilizada fue de 1:1.5 y éste complejo se concentró
hasta 10mg/ml para colocar ensayos de cristalización
Ensayos de Cristalización
La técnica usada para los ensayos de cristalización fue la de difusión de vapor en
gota sentada. Esta sección de ensayos de cristalización está formada por dos
apartados, el primero de ellos son los ensayos hechos solo a la proteína
recombinante colocando un total de 374 condiciones y en el segundo al complejo
Clp-ADN del cual se colocó un total de 550 condiciones para propiciar la
cristalización de este complejo.
Las condiciones en donde se observó la formación de cristales para apoClp (Tabla
III) se repitieron con reactivos del laboratorio para evaluar diferentes relaciones
proteína:precipitante o bien se agregaron aditivos sugeridos por Hampton
Research al precipitante (Tabla IV).
De los cristales que crecieron, se seleccionaron las mejores condiciones, con base
en el tamaño, forma y definición del cristal, ésta fue la 31 del kit de Morpheus 1, la
cual está compuesta de la siguiente forma: 0.09M NPS (Nitrate Phosphate
Sulfate), 0.1M Sistema de buffer 2 (HEPES y MOPS) pH7.5, 50% v/v mezcla del
precipitante 3 (Glicerol y PEG 4000). Los cristales que se formaron con este
precipitante pueden observarse en la Fig. 6, uno de estos cristales difractó y se
obtuvo una colección de datos a 2.6 Å de resolución.
16
Con respecto a la formación de cristales del complejo Clp-ADN, se obtuvieron un
total de 19 cristales, de doce condiciones distintas (Tabla III), en dos formas
características; por un lado en forma de agujas y por el otro en forma tetragonal
similares a los obtenidos de apoClp (Fig. 6). Se observó que como común
denominador en estas doce condiciones se tenía el sulfato de amonio, por lo que
se decidió colocar gotas con reactivos de laboratorio usando sulfato de amonio y
los aditivos mencionados en la tabla VI, se obtuvieron seis condiciones en las que
creció el cristal (Tabla III). De los 19 cristales obtenidos, se seleccionaron los de
mayor tamaño y mejor forma y se enviaron a difracción de rayos X en el LANEM;
sin embargo, ninguno de ellos fue de la calidad suficiente para poder brindar un
patrón de difracción que pueda resolverse. Hasta el momento en el que se redacta
la presente tesis no se ha podido reproducir ninguna condición que brinde cristales
de mejor tamaño para difractar de nuevo.
Determinación de la estructura de Clp
La colecta de los datos de difracción de rayos-X se realizó a 100 K (-173°C) para
poder reunir la mayor cantidad de datos de un solo cristal (Fig. 6). El método para
la colección de los datos de difracción fue el de rotación, este método colecta los
datos de difracción mientras el cristal es rotado con pequeños incrementos, en
nuestro caso éstos incrementos fueron de 0.25 grados, se colectaron tres series
de datos del mismo cristal de 180, 90 y 180 grados (1800 oscilaciones). Es
importante mencionar que durante este proceso el cristal fue bañado
constantemente con nitrógeno, con la finalidad de reducir las vibraciones térmicas,
reducir el desorden y el daño por radiación, así mismo nos permitió una reducción
de datos más precisa. El patrón de difracción obtenido tuvo una resolución de
2.6Å.
El primer paso de la resolución de la estructura fue el indexado, que se realizó con
el software HKL300023, mediante el cual se asignaron los índices de Miller a las
reflexiones observadas; esta indexación nos permitió determinar que los cristales
pertenecían a un sistema cristalino monoclínico cuyo grupo espacial asignado es
17
P1211, las dimensiones de la celda unitaria: a= 67.613 Å, b=67.888 Å, c=108.817
Å, α = 90°, β = 103.649°, γ = 90° y 48.6% de contenido de solvente.
El grupo espacial corresponde a un sistema monoclínico en el cual los ejes
cristalográficos α y γ son igual a 90°.
Los datos se analizaron con el programa xtriage de la plataforma de PHENIX24. El
análisis mostró un coeficiente de Matthews de 2.57 Å3 Da-1, un factor B de Wilson
de 28.8218 y un pico máximo de la función de Patterson de 7.06% no
detectándose una pseudotranslación significativa. El análisis de twinning mostró
un valor ƖLƖ de 0.414 (El valor de 0.5 para no twinning y 0.375 para un twinning
perfecto) lo que indica que no hay una significancia estadística para twinning.
El problema de fases fue resuelto por remplazo molecular (MR), cómo modelo de
búsqueda se utilizó la estructura de Clp de Xanthomonas campestris (PDB: 3iwz)
en el programa de PHASER25.
Se obtuvo un LLG final de 5200, en cuanto a la función de rotación (RFZ) y la de
traslación (TFZ) mostró valores de 11.3 y 8.8 respectivamente; con 897 residuos
en la unidad asimétrica (ASU). Se detectaron dos dímeros por celda unitaria.
Valores para TFZ mayores a 5 generalmente indican una buena solución para el
modelo.
El refinado cristalográfico se realizó con phenix.refine, con los siguientes
parámetros, refinado cartesiano estándar con las coordenadas XYZ, uso del
espacio real (usa como objetivo el mapa de densidad de electrones), también se
usó refinamiento de cuerpo rígido "rigid-body"26 (refina la posición de regiones
definidas, sin cambiar la geometría); cómo función objetivo se usó ML (Máxima
verosimilitud), estas estrategias fueron ejecutadas con restricciones de simetría no
cristalográfica (NCS). El ajuste del modelo se hizo de forma manual, usando
Coot27 (Fig. 7). Sólo en el caso del primer refinado se realizó un protocolo de
templado molecular o "simulated annealing"; este algoritmo realiza una búsqueda
estocástica dentro de la región permitida para las variables de optimización. Este
proceso consiste en “simular” un sobrecalentamiento de tal forma que las
partículas del cristal se colocan al azar en la fase líquida, para después disminuir
la temperatura de forma gradual y lenta hasta que las partículas se organicen con
18
un coste bajo de energía a un estado estacionario en el que no ocurran cambios,
con el objetivo de que solidifique en una estructura cristalina perfecta.
Algunas regiones de la molécula tuvieron una densidad pobre, con un factor B de
60 A 85 Å2, comparado con el promedio observado para todos los átomos que es
de 36.45 Å2, lo que indicó que es una zona de elevada movilidad. Esta zona de
baja densidad coincide con la reportada por Chin y colaboradores como la zona en
la que los residuos (177 a 182) participan en la unión del péptido C-terminal de la
ARN polimerasa.
El refinamiento se hizo en rondas, cada una de 7 ciclos y tras varias rondas de
refinamiento y ajuste manual, se obtuvo un Rfree=0.2750 y Rwork= 0.2175 y un RMS
(bonds) de 0.009. Otros estadísticos de refinamiento se presentan en la Tabla VI.
Para comprobar la validez y calidad de la estructura terciaria obtenida se utilizó el
servidor en línea MolProbity28, el cual hace un análisis de validación de la
estructura, primero detecta si el archivo contiene una cantidad adecuada de
átomos H, de lo contrario brinda la opción de adicionarlos; una vez adicionados los
átomos se hace el análisis de la geometría y contacto de todos los átomos,
detecta si hay choques estéricos serios (clashscore, donde los átomos se solapan
más de 0.4 Å), también informa el porcentaje de residuos con rotámeros pobres,
valores atípicos de Ramachandran así como conformaciones favorables del
mismo, valores atípicos de la longitud de cadena principal, desviación atípica del
Cβ y el ángulo de enlace (análisis de geometría covalente) y éstos valores
detectados los muestra en el reporte kinemage en un código de colores tipo
semáforo e identificando el residuo involucrado en el error, posteriormente fueron
corregidos con COOT de forma manual28.
Como resultados de esta validación obtuvimos 0.36% de rotámeros pobres
(aquellos que poseen problemas en la rotación de sus cadenas laterales sobre el
esqueleto peptídico), 86.18% de rotámeros favorecidos, 97.8% del total de los
residuos se encontraron en regiones favorecidas y el 100% del total de los
residuos estuvieron en regiones permitidas. Con un clashscore de 8.5 y MolProbity
score de 1.49 éste último es una combinación logarítmica ponderada del
clashscore, el porcentaje de Ramachandran no favorecido y el porcentaje de
19
malos rotámeros de la cadena lateral, brindando un número que refleja la
resolución cristalográfica en la que se esperarían estos valores. Los resultados de
esta validación se muestran en la Tabla VI.
Estructura de Clp
Clp tuvo una estructura dimérica como la de otros miembros de la familia CRP. El
mapa de densidad electrónica permitió observar claramente los residuos del 15 al
229 de cada monómero de Clp (Fig. 7) a excepción de los residuos ubicados en la
zona que hacen contacto con la RNA polimerasa (del residuo 177 al 183),
correspondientes a la zona AR1 en CAP29,30. Aun después de varios refinamientos
esta zona permaneció con casi nula densidad electrónica, posiblemente debido a
su flexibilidad.
El dominio N-terminal consistió en ocho hebras beta antiparalelas flanqueadas por
dos hélices α. El dominio C-terminal en tres alfa hélices y cuatro hebras β anti-
paralelos, en esta zona se encontró el característico hélice giro hélice presente en
proteínas de unión a ADN compuesto por la α hélice de los residuos 190 al 197 y
la hélice α de los residuos 201 al 213 conectados por el loop de los residuos 198 al
200.
Cómo se mencionó anteriormente en la proteína EcCAP el residuo S84 es crucial
en el posicionamiento de su ligando cAMP; sin embargo, para la proteína Clp el
residuo correspondiente fue el E99 el cual interactúa con R150 (3.63 Å) un residuo
de carga negativa que impide que se una cAMP en esta zona, formando un puente
salino, lo que corrobora que éste segundo mensajero no tiene un sitio de unión
como se observa en CAP, por lo que el mecanismo de regulación de Clp es
diferente al de CAP, y explica por qué cAMP no tiene efecto en la patogenicidad
de X. campestris. (Fig. 7).
Con respecto al sitio de unión con ADN dos requerimientos deben de ser
cumplidos, el primero de ellos es que exista un acercamiento entre las hélices αC
y αD para que esto genere que se empuje la hélice αF y como segundo
requerimiento es que esta hélice αF cuente con un residuo abultado e hidrofóbico
interactúe con la cadena de ADN. En la estructura de Clp esto se cumplió, porque
20
el residuo D162 formó dos puentes de hidrógeno con la cadena lateral del residuo
D159 provocando un acercamiento entre las hélices αC y αD; así el resido V165 al
ser abultado a hidrofóbico empuja y orienta la hélice αF para una mejor interacción
con el ADN (Fig. 7).
Un alineamiento de las secuencias de Clp de X. campestris y de X. axonopodis
mostró que son cuatro los residuos sustituidos entre ambas especies. Mientras
que XcClp presentó los residuos L, T, R y S en las posiciones 2, 21, 132 y 172,
XaClp presentó los residuos P, A, K, y A en las mismas posiciones. Sin embrago,
los residuos mencionados presentaron la misma estructura que la observada en
Clp de campestrís, con un RMSD para la superposición global de ambas
estructuras de 0.681Å (Fig. 1).
CONCLUSIONES
Este es el primer reporte de la estructura cristalográfica de Clp de Xantomonas
axonopodis, en el cual se tomaron las siguientes consideraciones: para conservar
la solubilidad y estabilidad de esta proteína recombinante fue importante mantener
una concentración de KCl en el amortiguador por arriba de 150mM. La purificación
por afinidad a heparina brindó un rendimiento final de 3.34mg/L. Clp de X.
axonopodis al igual que su homólogo en X. campestris formó homodímeros, y
presenta el motivo HTH característico de la familia CRP; ésta estructura posee
una zona muy flexible, correspondiente a la zona de unión con el péptido C-
terminal de la ARN polimerasa. Clp de X. axonopodis posee cuatro residuos
diferentes en comparación con su homólogo X. campestris y presenta un RMSD
de 0.681Å en un alineamiento estructural. A pesar de la similitud con su homólogo
CAP, se propone que Clp tiene un sitio de unión diferente a su ligando alostérico
(c-di-GMP), debido a que E99 es un aminoácido de mayor tamaño en
comparación con el residuo S84 de CAP, que junto con el residuo R150 forman un
puente salino que ocupa la cavidad de unión a AMP cíclico que se observa en
CAP.
21
Tabla I. Condiciones evaluadas en el ensayo de estabilidad térmica
Compuesto Concentración Tm (°C)
Proteína sin
aditivo --- 54.9
Amortiguadores
Tris pH 8.0
25 mM 55.7
50 mM 54.0
75 mM 54.4
100 mM 54.4
Tris pH 8.5
25 mM 54.4
50 mM 54.4
75 mM 53.7
100 mM 54.1
Hepes pH 7.5
25 mM 55.6
50 mM 55.4
75 mM 55.3
100 mM 55.5
Hepes pH 8.0
25 mM 55.1
50 mM 55.0
75 mM 54.8
100 mM 55.3
MOPS pH 6.5
25 mM 56.1
50 mM 55.1
75 mM 55.3
100 mM 56.0
MOPS pH 7.0
25 mM 55.6
50 mM 55.0
75 mM 55.4
100 mM 55.6
MES pH 5.5
25 mM 55.6
50 mM 54.5
75 mM 53.8
100 mM 55.0
MES pH 6.0
25 mM 55.2
50 mM 54.6
75 mM 55.4
100 mM 55.1
Sales
NaCl
100 mM 54.1
150 mM 55.1
250 mM 54.8
300 mM 55.5
500 mM 56.7
600 mM 57.0
750 mM 57.4
1 M 58.7
KCL
100 mM 54.9
150 mM 54.5
250 mM 54.3
300 mM 55.4
500 mM 56.2
600 mM 56.3
750 mM 58.2
1 M 57.9
Compuesto Concentración Tm (°C)
Sales LiCL 25 mM 56.1
50 mM 55.9
75 mM 55.0
100 mM 54.8
MgCL 25 mM 54.0
50 mM 52.9
75 mM 53.3
100 mM 53.1
Agentes reductores
DTT 1 mM 55.3
2 mM 54.6
3 mM 54.5
5 mM 54.4
7 mM 54.6
10 mM 54.5
Beta- Mercaptoetanol
(BME)
1 mM 56.3
2 mM 54.9
3 mM 55.7
5 mM 55.9
7 mM 55.7
10 mM 56.3
aminoácidos, amino azucares
Glucosamina 1 mM 55.8
5 mM 56.2
10 mM 55.9
Glicina 1 mM 55.6
5 mM 54.7
10 mM 54.7
Prolina 10 mM 54.3
50 mM 55.4
Ácido Glutámico
10 mM 54.3
50 mM 53.1
L-Arginina 10 mM 50.1
50 mM 52.5
Quelantes y detergentes
EDTA 1 mM 54.2
5 mM 54.4
10 mM 53.7
Glicerol 5% 56.4
10% 58.0
15% 57.2
20% 60.0
22
Tabla II. Condiciones evaluadas en el segundo ensayo de estabilidad
térmica
Compuesto Tm (°C)
Amortiguadores Tris pH7.5, 25 mM 54.7
MOPS pH 6.5, 25 mM 55.8
HEPES pH 7.0, 25 mM 55.9
Aditivos Glicerol, 15% 59.1
KCl 500 mM 55.0
LiCl 25mM 56.1
Beta mercapto 1mM 54.7
Mezcla de amortiguador con todos los aditivos
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 60.8
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 60.8
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 60.6
Amortiguador mas un aditivo
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15% 58.7
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15% 59.0
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15% 59.5
Tris pH 7.5 25mM, KCl 500mM, 55.7
MOPS pH 6.5 25mM, KCl 500mM, 55.7
HEPES pH 7.0 25mM, KCl 500mM, 55.9
Tris pH 7.5 25mM, LiCl 25mM 55.4
MOPS pH 6.5 25mM, LiCl 25mM 56.1
HEPES pH 7.0 25mM, LiCl 25mM 56.6
Tris pH 7.5 25mM, BE-ME 1mM 55.9
MOPS pH 6.5 25mM, BE-ME 1mM 56.5
HEPES pH 7.0 25mM, BE-ME 1mM 57.2
Amortiguador mas dos aditivos
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM 60.2
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM 60.3
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM 60.4
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15% , BE-ME 1mM 58.2
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15% , BE-ME 1mM 58.6
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15% , BE-ME 1mM 59.1
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM 58.7
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM 55.9
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM 58.5
Tris pH 7.5 25mM, KCl 500mM, LiCl 25mM 54.2
MOPS pH 6.5 25mM, KCl 500mM, LiCl 25mM 56.8
HEPES pH 7.0 25mM, KCl 500mM, LiCl 25mM 55.1
Tris pH 7.5 25mM, KCl 500mM, BE-ME 1mM 52.9
MOPS pH 6.5 25mM, KCl 500mM, BE-ME 1mM 56.5
HEPES pH 7.0 25mM, KCl 500mM, BE-ME 1mM 56.1
Amortiguador mas tres aditivos
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM 62.0
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM 61.7
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM 60.6
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 57.7
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 58.3
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, LiCl 25mM y BE-ME 1mM 58.6
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM y BE-ME 1mM 60.9
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM y BE-ME 1mM 60.6
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM y BE-ME 1mM 56.9
Clp de X. axonopodis se incubó en presencia del fluoróforo SYPRO orange. La
prueba de desplazamiento térmico se hizo en un rango de 25° a 95°C y los datos
de fluorescencia emitida fueron procesados en Excel ajustándolos a la ecuación
de Boltzman usando el complemento Solver para obtener la Tm (melting
temperature).
23
Tabla III. Condiciones en las que crecieron cristales de Clp Xac y Clp-ADN
No. Tipo de proteína Características del precipitante [Proteína] Proporción Proteína :
Precipitante Matriz
Vol. Gota
1 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-26 2µL
2 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 2:1 Morpheus 1-26 2µL
3 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-27 2µL
4 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-30 2µL
5 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 2:1 Morpheus 1-30 2µL
6 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-31 2µL
7 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 2:1 Morpheus 1-31 2µL
8 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-34 2µL
9 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 2:1 Morpheus 1-34 2µL
10 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-35 2µL
11 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 2:1 Morpheus 1-35 2µL
12 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-36 2µL
13 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.4:1.6 Morpheus 1-31 3µL
14 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.6:1.4 Morpheus 1-31 3µL
15 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.8:1.2 Morpheus 1-31 3µL
16 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-31 3µL
17 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1.2:0.8 Morpheus 1-31 3µL
18 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1.4:0.6 Morpheus 1-31 3µL
19 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 0.4:1.6 Morpheus 1-34 3µL
20 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 0.6:1.4 Morpheus1 34 3µL
21 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 0.8:1.2 Morpheus 1-34 3µL
22 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-34 3µL
23 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1.2:0.8 Morpheus 1-34 3µL
24 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1.4:0.6 Morpheus 1-34 3µL
25 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1.6:0.4 Morpheus 1-34 3µL
26 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.4:1.6 Morpheus 1-35 3µL
24
27 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.6:1.4 Morpheus 1-35 3µL
28 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 0.8:1.2 Morpheus 1-35 3µL
29 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-35 3µL
30 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1.2:0.8 Morpheus 1-35 3µL
31 Clp X.axonopodis 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1.4:0.6 Morpheus 1-35 3µL
32 Clp X.axonopodis
0.1 M Carboxylic acids, 0.1M Buffer System1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 2-26 2µL
33 Clp X.axonopodis
0.1 M Carboxylic acids, 0.1M Buffer System1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 2-27 2µL
34 Clp X.axonopodis
0.1 M Carboxylic acids, 0.1M Buffer System2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 2-31 2µL
35 Clp X.axonopodis
0.1 M Amino acids, 0.1M Buffer System2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 10mg/ml 1:1 Morpheus 2-43 2µL
36 Complejo Clp-ADN
0.2 M sulfato monohidratado de lítio, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5, 30%w/v PEG 4000 10mg/ml 1:1
Crystal Screen 1-17 2µL
37 Complejo Clp-ADN
0.2 M Acetato de sodio trihidrato, 0.1 M Cacodilato de sodio pH 6.5, 30%w/vPEG 8000 10mg/ml 1:1
Crystal Screen 1-28 2µL
38 Complejo Clp-ADN 2.0 M Sulfato de amonio 10mg/ml 1:1
Crystal Screen 1-32 2µL
39 Complejo Clp-ADN
0.2 M Sulfato de amonio, 0.1 M MES pH 6.5, 30% w/v PEG monoetileter 5000 10mg/ml 1:1
Crystal Screen 2-26 2µL
40 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 1 pH 6.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-28 2µL
41 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 1 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-29 2µL
42 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-30 2µL
43 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 3 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-31 2µL
44 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 2 pH 7.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-32 2µL
45 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 1 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-33 2µL
46 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-34 2µL
47 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 10mg/ml 1:1 Morpheus 1-36 2µL
48 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 1 20mg/ml 1:1 Morpheus 1-33 2µL
25
Tabla que contiene el listado de los ensayos de cristalización, en los cuales se observó el crecimiento de cristales. Para el
caso de la proteína recombinante Clp de Xanthomonas axonopodis se colocaron 374 condiciones, de las cuales 35
mostraron crecimiento de cristales. Para el complejo Clp-ADN se hicieron un total de 550 condiciones de las cuales sólo
16 mostraron desarrollo de cristales. Dentro de estos ensayos se hicieron cambios de proporción proteína: precipitante,
así como la reproducción de las soluciones precipitantes, con reactivos del laboratorio. .
49 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 20mg/ml 1:1 Morpheus 1-34 2µL
50 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 4 20mg/ml 1:1 Morpheus 1-36 2µL
51 Complejo Clp-ADN 2.0 M Sulfato de amonio 20mg/ml 2:1 reactivos Lab-9 2µL
52 Complejo Clp-ADN 2.0 M Sulfato de amonio, aditivo F11 (Hampton Research) 15mg/ml 1:1 reactivos Lab-9 2µL
53 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 1 15mg/ml 1:1 reactivos Lab-9 2µL
54 Complejo Clp-ADN 0.09 M NPS, 0.1 M Buffer System 3 pH 8.5, 50% v/v Precipitant Mix 2 15mg/ml 1:1 reactivos Lab-9 2µL
26
Tabla IV. Aditivos usados para optimizar las condiciones de cristalización.
ID Hampton Research
Concentración stock
Aditivo Concentración
en la gota
A3 0.1 M Cloruro de Calcio dihidratado 0.01 M
A6 0.1 M Cloruro de Magnesio hexahidratado 0.01 M
A12 0.1 M Sulfato de Níquel (en lugar de cloruro de Níquel)
0.01 M
B3 1.0 M Sulfato de Amonio 0.1 M
B5 0.1 M Cloruro de Litio 0.01 M
B10 1.0 M Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
0.1 M
B11 1.0 M Citrato de sodio tribásico dihidratado 0.1 M
C2 0.1 M L-Prolina 0.01 M
C4 30% v/v Dimetil sulfóxido 3.0%
C10 1.0 M Glicina 0.1 M
D2 0.1 M Spermidine 0.01 M
D7 1.0 M Hidrocloruro de guanidinio 0.1 M
D8 0.1 M Urea 0.01 M
E1 0.1 M EDTA 0.01 M
E5 10%v/v PEG 3350 1.0%
E7 30% v/v Sucrosa 3.0%
F2 30% v/v Glicerol 3.0%
F11 5% w/v n-octyl-β-D-glucoside 0.5%
G4 50% v/v PEG 400 5.0%
G8 40% v/v PEG 400 4.0%
G10 30% v/v Etanol 3.0%
G11 30% v/v 2-propanol 3.0%
G12 30% v/v Metanol 3.0%
H4 40% v/v acetonitrilo 4.0%
H8 40% v/v Acetona 4.0%
H10 7% v/v 1-butanol 0.7%
NA 0.1 M L-Prolina, L-ac. glutámico, L-arginina 0.01M
NA 0.1 M L-ac. glutámico 0.01M
NA 0.1 M L-arginina 0.01M
*NA= No aplica Listado de aditivos usados con la intención de obtener cristales de mayor tamaño
o mejor definición. Se tomaron del listado de aditivos que proporciona Hampton
Research en su Additive Screen. Todas las soluciones fueron preparadas con
agua desionizada y filtradas a través de una membrana de 0.2 micras.
27
Tabla V. Datos cristalográficos y estadísticos de la recolección de datos y
refinamiento.
Datos estadísticos del estudio de difracción de rayos X de los cristales de Clp. Los
cuales están formados por celdas de unidad triclínica, cada una de ellas contiene
4 moléculas. Los valores que se encuentran en paréntesis corresponden a la
mayor resolución.
Clp Xanthomonas axonopodis
X-ray source LANEM (UNAM)
Wavelength (Å) 1.8
Resolution range (Å) 33.71 - 2.571 (2.663 - 2.571)
Space group P 1 21 1
Unit cell (Å) a = 67.613, b = 67.888, c = 108.817, α = 90, β = 103.649, γ = 90
Matthews coefficient (Å3 Da-1) 2.57
Solvent content 48.6
Unique reflections 30017 (2461)
Completeness (%) 97.55 (80.65)
Mean I/sigma(I) 20.8 (5.3)
Wilson B-factor 32.98
Clp protomers per asymmetric unit 4
Reflections used in refinement 30010 (2459)
Reflections used for R-free 1992 (154)
R-work 0.2175 (0.2756)
R-free 0.2750 (0.3748)
Number of non-hydrogen atoms 5994
macromolecules 5994
Protein residues 842
RMS(bonds) 0.009
RMS(angles) 1.36
Ramachandran favored (%) 97.84
Ramachandran allowed (%) 2.16
Ramachandran outliers (%) 0.00
Rotamer outliers (%) 0.36
Clashscore 8.35
Average B-factor 36.45
macromolecules 36.45
28
Tabla VI. Datos estadísticos de validación por MolProbity.
All-Atom Contacts
Clashscore, all atoms:
8.35 99th percentile* (N=226, 2.571Å ± 0.25Å)
Clashscore is the number of serious steric overlaps (> 0.4 Å) per 1000 atoms.
Protein Geometry
Poor rotamers 2 0.36% Goal: <0.3%
Favored rotamers
474 86.18% Goal: >98%
Ramachandran outliers
0 0.00% Goal: <0.05%
Ramachandran favored
816 97.84% Goal: >98%
MolProbity score^
1.49 100th percentile* (N=6188, 2.571Å ± 0.25Å)
Cβ deviations >0.25Å
0 0.00% Goal: 0
Bad bonds: 0 / 6081 0.00% Goal: 0%
Bad angles: 5 / 8280 0.06% Goal: <0.1%
Peptide Omegas
Cis Prolines: 0 / 29 0.00% Expected: ≤1 per chain, or ≤5%
Low-resolution
Criteria
CaBLAM outliers
8 0.97% Goal: <1.0%
CA Geometry outliers
0 0.00% Goal: <0.5%
29
A) Clp Xax. 1 MSPGNTTVVTTTVRNATPSLALDAGTIERFLAHSHRRRYPTRTDVFRPGDPAGTLYYVISGSVSI 65 Clp Xca. 1 MSLGNTTVVTTTVRNATPSLTLDAGTIERFLAHSHRRRYPTRTDVFRPGDPAGTLYYVISGSVSI 65 Clp Xax. 66 IAEEDDDRELVLGYFGSGEFVGEMGLFIESDTREVILRTRTQCELAEISYERLQQLFQTSLSPDA 130 Clp Xca. 66 IAEEDDDRELVLGYFGSGEFVGEMGLFIESDTREVILRTRTQCELAEISYERLQQLFQTSLSPDA 130 Clp Xax. 131 PKILYAIGVQLSKRLLDTTRKASRLAFLDVTDRIVRTLHDLAKEPEAMSHPQGTQLRVSRQELAR 195 Clp Xca. 131 PRILYAIGVQLSKRLLDTTRKASRLAFLDVTDRIVRTLHDLSKEPEAMSHPQGTQLRVSRQELAR 195
Clp Xax. 196 LVGCSREMAGRVLKKLQADGLLHARGKTVVLYGTR 230 Clp Xca. 196 LVGCSREMAGRVLKKLQADGLLHARGKTVVLYGTR 230 B)
C)
Fig. 1 Alineamiento de las secuencias de Clp tanto de X. campestris cómo de X. axonópodis.
A) Alineamiento de las secuencias de Clp de X. axonopodis (Clp Xax.) con X. campestris se puede observar que los
residuos L3, T21, R132 y S172 de X. campestris corresponden a los residuos P3, A21, K132, A172 en X. axonopodis.
B) Comparación de las estructuras de Clp correspondientes a X. axonopodis (tonalidad azul) y X.campestris (tonalidad
lila) con un RMSD de 0.681Å.
C) Comparación de las estructuras de Clp de X. axonopodis (tonalidad azul) con CAP de E. Coli (tonalidad café) con un
RMSD de 1.109
30
A)
.
B)
Fig. 2 Evaluación del tiempo de incubación y concentración de IPTG para la expresión de Clp en BL21 (DE3) Star
A) Gel SDS page al 12% de poliacrilamida en el cual se muestra la evaluación del tiempo y temperatura de incubación,
con 0.2mM de IPTG para la expresión de Clp de Xanthomonas axonopodis. En el carril uno se encuentra el marcador de
peso molecular, en el dos la muestra antes de la adición de IPTG. Del carril tres al seis se mantiene constante la
temperatura a 37°C y se va variando el tiempo de incubación (2, 5, 8 y 16 horas); del carril siete al diez se usó una
temperatura constante de 28°C y se variaron los tiempos de incubación (2, 5, 8 y 16 horas).
B) Gel SDS page al 12% de poliacrilamida de la evaluación de diferentes concentraciones de IPTG, para inducir la
expresión de Clp de Xanthomonas axonopodis. En el carril uno se encuentra el marcador de peso molecular, en el dos la
muestra antes de inducir con IPTG; del carril tres al siete se varia la concentración de IPTG adicionada, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8
y 1.0 mM respectivamente. Para después ser incubado a 28°C por 16 horas.
Clp
31
Fig. 3 Ensayo de estabilidad térmica.
Evaluación de la estabilidad térmica de Clp de Xanthomonas axonopodis. El eje de las ordenadas corresponde a la
fluorescencia y el eje de las abscisas a la temperatura en grados Centígrados. La condición optimizada que presenta una
mejor Tm y ajuste a la ecuación de Bolztman fue la siguiente: Tris 25mM pH 7.5, glicerol 15%, KCl 500mm, LiCl 25mM y
BME 1mM muestra una sigmoidea que se ajusta mejor a la ecuación de Boltzman y una Tm de 60.8±0.15.
Condición Tm
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15% 58.7 ± 0.02
MOPS pH 6.5 25mM, glicerol 15% 59.0 ± 0.01
HEPES pH 7.0 25mM, glicerol 15% 59.5 ± 0.21
Tris pH 7.5 25mM, KCl 500mM, 55.7 ± 0.20
MOPS pH 6.5 25mM, KCl 500mM, 55.7 ± 0.07
HEPES pH 7.0 25mM, KCl 500mM, 55.9 ± 0.06
Tris pH 7.5 25mM, LiCl 25mM 55.4 ± 0.51
MOPS pH 6.5 25mM, LiCl 25mM 56.1 ± 0.63
HEPES pH 7.0 25mM, LiCl 25mM 56.6 ± 0.08
Tris pH 7.5 25mM, BE-ME 1mM 55.9 ± 0.04
MOPS pH 6.5 25mM, BE-ME 1mM 56.5 ± 0.16
HEPES pH 7.0 25mM, BE-ME 1mM 57.2 ± 0.09
Tris pH 7.5 25mM, glicerol 15%, KCl 500mM, LiCl 25mM y BME 1mM 60.8 ± 0.15
32
A)
B)
Fig. 4 Purificación de la proteína recombinante por afinidad a Níquel
A) Gel SDS page al 12% de poliacrilamida evaluando la purificación por afinidad a níquel, en una columna Ni-NTA de 5
ml. Carril 1: marcador de peso molecular. Carril 2: sonicado. Carril 3: centrifugado. Carril 4: frente. Carril 5y 6: últimos
lavados con 50mM de Imidazol. Carril 7, 8, 9 y 10: correspondientes a los lavados con 500mM de imidazol. La proteína
recombinante eluye prácticamente en su totalidad en el primer lavado con 500mM de imidazol.
B) Gel SDS page al 12% de poliacrilamida en donde se observa el corte de la cola de histidinas, realizada por la adición
de PPS a la proteína purificada previamente por afinidad a Níquel.
Clp Clp
33
Fig. 5 Cromatografía de afinidad a Heparina
A) Cromatograma de la proteína Clp purificada en el equipo AKTA GE Healthcare, por afinidad a heparina en una
columna Hi Trap Heparin HP 5ml, con el amortiguador A: Tris 25mM pH 7.5, Glicerol 15%, LiCl 25mM, Beta
mercaptoetanol 1mM, el amortiguador B: Tris 25mM pH 7.5, Glicerol 15%, LiCl 25mM, Beta mercaptoetanol 1mM, KCl
1M. Se hace un gradiente de 50% de KCL a 100% de KCl. Las ordenadas corresponden a la absorbancia a 280nm y en
las abscisas corresponden al volumen de elución. La corrida se hizo con un flujo de 2.0 ml/min, el volumen de inyección
fue de 7.0 ml. La proteína eluye aproximadamente con 65% de KCL.
B) Gel SDS-PAGE al 12% de poliacrilamida de la purificación por afinidad a heparina de la proteína Clp. Carril 1:
Marcador de peso molecular. Carril 2: Proteína que se cambió al amortiguador con 300 mM de KCl. Carril 3: Proteína
filtrada a través de una membrana de 0.22 µm. Carril 4 al 8: Fracciones colectadas que contienen a la proteína Clp de
Xanthomonas axonopodis las cuales eluyeron en un rango de 600mM a 700mM de KCL. .
Clp
A) B)
34
A)
B)
C)
D)
Fig. 6 Cristales de Clp de Xanthomonas axonopodis.
A) Cristales obtenidos en la condición 31 del kit de Morpheus 1 el cual tiene la siguiente composición: 0.09M de una
mezcla de nitrato de sodio, fosfato dibásico de sodio y sulfato de amonio. Amortiguador: 0.1M de una mezcla de HEPES
sódico y MOPS pH 7.5. Precipitante: 50% v/v de Glicerol y PEG 4000
B) Cristal colectado de la condición 31 del kit de Morpheus 1 y montado en el crioloop para la difracción de rayos X
C) Cristales del complejo Clp-ADN de la condición 31 del Kit de Morpheus con la siguiente composición: 0.09M de una
mezcla de nitrato de sodio, fosfato dibásico de sodio y sulfato de amonio. Amortiguador: 0.1M de una mezcla de HEPES
sódico y MOPS pH 7.5. Precipitante: 50% v/v de Glicerol y PEG 4000
D) Cristales del complejo Clp-ADN de la condición 34 del Kit de Morpheus con la siguiente composición: 0.09M de una
mezcla de nitrato de sodio, fosfato dibásico de sodio y sulfato de amonio. Amortiguador: 0.1M de una mezcla de Tris
(base) y BICINE pH 8.5. Precipitante: 50% v/v de Etilenglicol y PEG 8000.
35
A) .
B)
C)
36
Fig. 7 Densidad electrónica en la estructura de Clp de Xanthomonas axonopodis
A) Zona de poca densidad ubicada entre los residuos del 178 al 183 (mapa 2 fobs-fcalc, contorno 1.5 veces por arriba de
la desviación estándar).
B) Residuos E99 y R15 de cadena larga que ocupan el sitio de unión a AMPc observado en CAP eliminando la cavidad
para que el ligando de Clp, c-di-GMP, interactúe en esta zona.
C) En la imagen de la izquierda se muestra el mapa de densidad electrónica (mapa 2 fobs-fcalc, contorno 1.5 veces por
arriba de la desviación estándar) que muestra los dos puentes de hidrógeno entre los residuos D159 y D162, residuos
importantes en la interacción con ADN. En la imagen de la derecha en tono gris se muestran los residuos D159 y D162,
con los dos puentes de hidrógeno en líneas azules; esto provoca que el residuo V165 tenga interacciones hidrofóbicas
(línea café) con el residuo L211 empujando de esta forma la hélice αF para su interacción con ADN.
37
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