INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS
DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
(N.A.T.)
BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI
FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN
Patógenos transmisibles por transfusión
Virus Virus de la Hepatitis B (HBV)
Virus de la Hepatitis C (HCV)
Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2)
Virus Linfotrópico Humano I/II (HTLV I/II)
otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus
Parásitos Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza)
otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum
Bacterias Treponema pallidum (Sífilis) Brucella abortus (Brucelosis)
otros
Agentes no convencionales-Priones2
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIÓN EN ARGENTINA
(LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )
HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total
HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV
HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2
HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II
Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinación indirecta, ambos anti-
Tripanosoma cruzi
Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum
Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-Brucella abortus
3
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIÓN
Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o
plasma) del donante de la presencia de una respuesta
inmune contra un patógeno dado Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio
Ej: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del
donante (EIA anti-HIV 0/1/2)
Métodos directos: detección directa de la presencia
del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del
donante Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag
Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral
4
FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIÓN DE
INFECCIONES A TRAVÉS DE LAS TRANSFUSIÓN
Errores humanos o de laboratorio
Problemas en los sistemas de análisis/equipos
Insuficiencias en la calidad de los análisis
Entrenamiento deficitario
Seroconversiones atípicas
Variantes o genotipos del patógeno no detectadas
Cambios epidemiológicos
Periodo de “ventana” serológico
5
TiempoInfección
Reacción inmune
Reactivo Serológico
PERÍODO VENTANA
TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIÓN Y EL
DESARROLLO DE MARCADORES SEROLÓGICOS
6
Período
Ventana: NAT
Eclipse
Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al.
Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003
Año
1/1000
1/10,000
1/100,000
1/1000,000
Rie
sg
o d
e i
nfe
cció
n p
or
un
ida
d tr
an
sfu
nd
ida
1985 1990 1996 1999 2001
HCV
HBV
HIV1/180,000
1/1.600,000
1/1.900,000
1/100
Ac Anti-HIV Ac Anti-HCV NATp24
EVOLUCIÓN DEL RIESGO EN LA PROVISIÓN DE SANGRE
7
NUCLEIC ACID TESTING
Ventajas de NAT
Importante avance teconológico en screening de sangre
Altamente sensible & específico
dirigido especificamente a las secuencias nucléicas virales
Detección directa del RNA or DNA viral
Ayuda a la prevención de enfermedades transmisibles por
transfusión
Provee una etapa adicional de seguridad a la provisión de sangre
segura
Reduce el Período Ventana desde la infección hasta la detección8
Tiempo
Infección
Reactividad Serológica
Virus
Detección más temprana
NAT positivo
OBJETIVO DE NAT O DGV:
DISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA
Reacción inmune
9
Eclipse
Período
Ventana
EJ: EVOLUCIÓN CLÍNICA DE HIV: DÓNDE ACTÚA NAT?
10
EVOLUCIÓN EN LA IMPLEMENTACIÓN DE LAS TÉCNICAS NAT EN LOS BANCOS DE SANGRE
1993 se considera formalmente la utilización de NAT para el tamizaje en bancos de
sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos
de infección por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa
manufacturada.
1995 Comité Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se
adhirió a este lineamiento, haciéndolo extensivo a todos los productos medicinales
derivados del plasma.
1997 Organización Mundial de la Salud (OMS) se establecen estándares para el
ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.
2000-2001 diferentes países incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el
tamizaje de donaciones.
2009 OMS en su documento “Recommendations: Screening Donated Blood for
Transfusion-Transmisibles Infection” sugiere que junto a los ensayos de tamizaje
serológicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serológicos de
antígenos y/o anticuerpos, se realice la búsqueda de ácidos nucléicos virales para
estos patógenos.11
PERÍODO VENTANAMODEL TESTING DATA
Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.
Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .
12
VENTAJAS NAT
13
VIRUS Pruebas
serológicas
NAT MP
(Minipool)
NAT ID
(Individual)
VIH
(incluye p24)16 días 10 días 7 días
VHC 70 días 9 días 7 días
VHB 59 días 49 días 38 días
Acortamiento del período de ventana inmunológico
Disminución del riesgo residual
TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR
Involucran tres etapas:
1. Extracción o captura del genoma viral
2. Amplificación
3. Detección
Ejemplos:
PCR(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR (Real Time PCR)
NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)
TMA (Transcriptional Mediated Amplification) 14
15
EasyQ Instrument &
Reagents
Desktop computer
Strip centrifuge
NucliSens
EasyQ
IncubatorNucliSens
EasyQ
Analyzer
Nuclisens Easy Q system TMA: pasos principales del ensayo
Detección
Captura del blanco
o diana (target)
Amplificación
PCR Real
Time
PCR
TMANASBA
MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS
TÉCNICAS NAT
Técnicas “in house”
Técnicas comerciales
Técnicas Cualitativas
Técnicas Cuantitativas
Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)
16
POOL
48
POOL
24
UNIDADES
POOL
24
UNIDADES
POOL
8
POOL
8POOL
8
POOL
8
POOL
8
POOL
8
NAT DETECTA INFECCIÓN HCV MÁS TEMPRANO QUE EL
TEST DE ANTICUERPOS
17
0
1,000
10,000
100,000
10,000,00
10,000,000
0
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40 50
NAT pool
HCV Ac
HCV GEq/mL S/CO
Días
28 días7 días
Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999
NAT ID test
HCV GEq/mL
PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN
CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR:
Sensibilidad
Especificidad
Detección de variantes/subtipos
Reproducibilidad
Trazabilidad de reactivos y resultados
Software adecuado
Control Interno
Control de Contaminación
Ensayos discriminatorios/confirmatorios
Identificación de su uso: RUO o IVD
Marca CE, FDA, ANMAT18
PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA
SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS
EN SUS DIFERENTES ETAPAS:
Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de
ADN/ARN foráneo o productos de amplificaciones
precedentes.
Control Negativo: para evaluar los riesgos de
contaminación (en la organización del espacio físico, en
los métodos de trabajo, posible aerozolización durante
el alicuotado de reactivos)
Control Positivo: para controlar la presencia de
inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas.
Control Interno: para verificar la idoneidad de la
amplificación y/o la presencia de inhibidores de la
misma. 19
Marca (s) Formato Muestra Uso habilitado Fabricante Fecha de
Aprobación
COBAS
Ampliscreen HIV-1
Test
PCR Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc12/20/2002
Procleix HIV-1/HCV Nucleic
Acid Test (TMA)Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, living
organ donors and
cadaveric samples
Gen-Probe
San Diego, CA
9212102/08/2002
UltraQual HIV-1
RT-PCR Assay PCR Plasma
Donor Screen National Genetics
Institute
Los Angeles, CA 9212109/18/2001
UltraQual HCV RT-
PCR Assay PCR Plasma
Donor Screen National Genetics
Institute
Los Angeles, CA
92121
09/18/2001
COBAS
AmpliScreen HCV
Test
PCR
Plasma
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc 12/3/2002
COBAS
AmpliScreen HBV
Test PCRPlasma
Donor Screen
Indications For Use:
Source Plasma donors,
other living donors,
and organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc 04/21/2005
Procleix WNV Assay
Nucleic Acid Test
(TMA)
ID
Plasma
Qualitative detection of
West Nile Virus
(WNV) RNA from
volunteer donors
Gen-Probe
San Diego, CA
9212112/01/2005
20
COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA
DE LOS TEST NAT
95% Límite de Detección (95% CI)
Ensayo HIV
(IU/ml)
HCV
(IU/ml)
HBV
(IU/ml)
WNV**
(Copies/ml)
Procleix TMA* 19.62
(17.15-23.16)
2.78
(2.44-3.37)
7.46
(6.43-8.97)
3.4
AmpliScreen*
Std
preparation
323.4
(284.9-387.3)
41.9
(28.0-111.8)
15.99
(13.78-20.06)
Taq
Screen
15AmpliScreen*
Multiprep
78.4
(68.4-94.4)
28.8
(20.5-85.8)
4.41
(3.56-6.13)
* Roche’s COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499
21
DISEÑO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA
DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Metas principales para la instalación:
Proporcionar el espacio suficiente para el flujo
de trabajo y mantenimiento de equipos
Evitar la contaminación
Mantener la correcta temperatura , humedad y
presión del ambiente
22
CONDICIONES GENERALES
Nivel de seguridad 2 : BSL2
Paredes con pintura resistente a la descontaminación (ácidos o álcalis)
Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo.
Presión relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa en área de post-amplificación
Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con bordes sanitarios y puertas corredizas
Mesadas: resistentes a agentes químicos
Iluminación: compartimiento estanco
Electricidad: UPS de soporte / grupo electrógeno
23
ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Área de preparación de reactivos y muestras
Área de pre-amplificación
Área de post-amplificación y detección
Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o
protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra.
Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo
diferentes24
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Principal objetivo: minimizar la contaminación a través de…
Diseño del ensayo
Disposición del laboratorio
Control del flujo de trabajo
25
ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
26
Pre-Amplificación
Post-Amplificación
GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA
MOLECULAR
Manuales de Gestión de la Calidad
Manuales de procedimientos
Manual de Bioseguridad
Estándares y normativas: Norma ISO 9001:2000
Norma ISO /IEC17025 /1999
Estándar Paul Erlich Institute
Organismos internacionales: OMS “Collaborative Study
Group” (provee CCE y establece la unidad de medida:
UI/ml)
Acreditación27
CONCLUSIONES (1)
Disminución del período ventana
Otras aplicaciones: tests que permiten unadetección directa de otros virus. Ej: WNV, otrosvirus emergentes
Progresar desde analizar mini-pooles a analizarmuestras individuales.
Lograr la implementación de automatización totalde las técnicas de NAT:
-disminución de los errores del operador.
-mejor estandarización operativa.
-optimización de los tiempos de reacción.
-trazabilidad de los productos liberados. 28
CONCLUSIONES (2)
Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas
puntuales referentes a la implementación de NAT en
Argentina:
la obligatoriedad de las técnicas NAT en Medicina Transfusional,
creación de comités de expertos que evalúen la necesidad de
legislar el tema
definición de la logística de centralización de muestras para lograr
un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable
evaluación de resultados obtenidos hasta el momento mediante las
técnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de
definir si la sensibilidad de dichas técnicas y su ejecución son
útiles en nuestro sistema de salud
consolidación en la formación de los recursos humanos dedicados
a la aplicación de NAT. 29