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Metagenómica:Secuenciando lo desconocido
Lara Rodríguez Ribera
Genòmica i Proteòmica
2010 UAB
Obtención del genoma de un
microorganismo:
1- Aislamiento y cultivo
2- Extracción de DNA
3- Secuenciación
4- Ensamblaje
5- Anotación de genes i elementos reguladores.
La mayoría de
microorganismos:
1- no pueden ser cultivados
2- viven en comunidades
Metagenómica: estudio de ADN genómico obtenido de
microorganismos sin cultivar.
Estudios filogenèticos
PCR 16S rRNA
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Estudios de metagenómica
Papel de los
microorganismos en la
biosfera.
Como los ecosistemas
microbionos responden a
las perturbaciones
medioambientales.
Como los ecosistemas
microbianos contribuyen a
nuestra salud.
Diversidad ambiental,
evolución de las
poblaciones.
“En la Tierra no vivimos en la Era del Hombre o de los humanos, vivimos hoy,
y siempre, en la Era de la Bacterias”. Stephen Jay Gould (1941-2002).
Environmental shotgun sequencing (ESS)
respectivo tamaño de su
genoma.
Coverage normalmente
incompleto. Peligro de
ensamblar secuencias
de distintas OTUs.
Cobertura
determinada por
la variación en la
abundancia
relativa de cada
miembro de la
comunidad
microbiana y el
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“Targeted" sequencing approach
Screening de clones para detectar un gen
deseado (ex. PCR).
Gen 16S rDNA asignar ADN de un
filotipo específico.
Limitaciones de la PCR
Random sequencing approachResultado: contigs de diferentes tamaños y
fragmentos no ensamblados.
Genomas de “referencia”.
Asignación de contigs a “bins” basandose en
su contenido G+C, uso de codones, coverage
de las secuencias, presencia de pequeños n-
mers (frecuencia nucleotidica), etc. para
classificarlos en grupos que pueden ser vistos
como “especies” (OTUs).
Hay genes que no pueden ser clonados en E.coli (toxicidad).
Nuevos métodos de secuenciación como el 454 de Roche eliminan el paso de clonación (requerido en el método Sanger).
Desventajas: menor tamaño de los fragmentos y falta de paired-end sequencesmayor reto para el ensamblaje y la anotación.
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1.045Gb de secuencia no redundante.
Métodos basados en la similitud de la
secuencia y la búsqueda
computacional de genes Estimas
cualitativas i cuantitativas de la
diversidad genómica.
Criterios de binning:
grado de cobertura, frecuencias de
oligonucleótidos, similitud a genomas
previamente secuenciados.
Filtros de 0.1-3.0µm
Biblioteca genòmica (inserto
2-6Kb).
Pair-end reads
Whole-genome random shotgun.
1800 especies “genómicas” (148
filotipos bacterianos nuevos).
rDNA
(“genomic” species = clustering
of assemblies or unassembled
reads more than 94% identical
on the nucleotide level).
1.2 millones de genes
previamente desconocidos (782
nuevos rhodopsin-like
photoreceptors).
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Conclusiones
Se pueden aplicar whole-genome assambly algorithms a
muestras medioambientales.
Secuenciación shotgun proporciona marcadores
filogenéticos que pueden ser utilizados para evaluar la
diversidad filogenética en una muestra con mayor poder de
lo que permiten los estudios de rDNA basados en PCR.
También permite una mayor identificación de la
diversidad genética en familias génicas particulares.
10-100 trillones de microbios habitan el tracto
gastrointestinal. (100veces más genes que
nuestro genoma).
Sintetizan aminoácidos esenciales y
vitaminas.
Influencian a la maduración del sistema
inmune.
Modulan las respuestas al daño de células
epiteliales.
Afectan al balance energético y procesan
compuestos indigestibles como los
polisacáridos de plantas y los xenobióticos.
Secuenciación del genoma
y del microbioma humano
para entender la condicion
humana.
Revelar la diversidad
genómica y genética
microbiana y identificar
propiedades funcionales
de nuesto microbioma.
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78 millones bp de secuencia única secuenciados.
40% no ensamblado a contigs.
Diversidad entre la muestra:
Comparación shotgun reads y
secuencia del genoma completo.
B. longum 0’70 X coverage.
(80-100% identidad, 52% reads
<95%)
M. .smithii 3.5X coverage.
(99.65%-100% identidad,
89%>95%)
Identificación de filotipos
Análisis de secuencias de 16S rDNA de:
-Ensamblaje aleatorio shotgun de librerias de clones
-Amplificación de 16SrDNA por PCR (2062PCRs)
Shotgun
72 filotipos Bacteria i 1 Archaea
-22.2% nuevos
-83.3% no cultivados
Divisiones Firmicutes i Actinobacteria
No Bacteriodetes.
Metaboloma
Enzimas degradació
polisacaridos de plantas.
Genes centrales de la via
metanogénica.
Genes involucrados en la
sintesis de aá esenciales i
vitaminas.
Diferencias entre individuos
(producción energía,
carbohidratos aá, etc) : bajo
coverage o dieta, genotipo i
estilo de vida.
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Conclusiones
Son necesarios estudios futuros para proporcionar un microbioma con un
mayor grado de cobertura y para evaluar los efectos de la edad, la dieta y
estados patológicos (ej. Enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer…) en
el microbioma del colon humano.
El muestreo periódico del microbioma del colon puede proporcionar
conocimientos sobre como los efectos medioambientales cambian nuestra
“microevolución”.
Los resultados pueden proporcionar nuevos biomarcadores para definir
nuestra salud, nuevas maneras de optimizar nuestra nutrición personal, de
predecir la biodisponibilidad de drogas administradas oralmente y de
pronosticar nuestra predisposición a desordenes como infecciones con
patógenos, obesidad, etc.
Aplicaciones
Correlaciones entre datos medioambientales y metadata.
Fertilidad del suelo y seguridad alimentaria
Entender la simbiosis.
Metagenómica y virologia medioambiental (transducción)
Enriquecer familias génicas (ej. Fotoreceptores Mar
Sargasso)
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AplicacionesCorrelaciones entre datos medioambientales y metadata.
Antoni van Leeuwenhoek
Temperatura viabilidad
Distribución de las especies
microbianas
Patogenicidad
Virulencia
Colonización …
Propiedades del hábitat
Temperatura
pH
Salinidad
Contenido de nutrientes…
Metagenómica nos permite estudiar el potencial genómico de una comunidad
y como es afectado por los cambios en el hábitat.
Microbioma ind. Obesos
Enriquecido en genes de enzimas que metabolizan
polisacaridos “indigestibles”.
Firmicutes
AplicacionesCorrelaciones entre datos medioambientales y metadata.
Microbioma ind. delgados
Bacteroidetes
Microbioma ind. Obesos
Enriquecido en genes de enzimas que metabolizan
polisacaridos “indigestibles”
Firmicutes
Perdida de peso en humanos
Firmicutes Bacteroidetes
Las Bacterias juegan un papel directo en
la obesidad humana.
Nueva diana en la lucha contra la
obesidad
Vol 444|21/28 December 2006| doi:10.1038/nature05414
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AplicacionesFertilidad del suelo y seguridad alimentaria
Algunos suelos son mas favorables que otros para el crecimiento de plantas
saludables.
Las comunidades microbianas del suelo favorecen la productividad agrícola
ya que están implicadas en la supresión de patógenos de las plantas y la
descomposición de contaminantes.
La metagenómica del suelo puede ofrecer un diagnóstico de las
comunidades microbianas para una óptima producción agrícola. Se podrían
estimular los procesos microbianos que impulsan el crecimiento de las plantas
añadiendo a los suelos degradados nutrientes para favorecer a los
microorganismos beneficiosos.
La fertilización de suelos con estiércol animal pueden facilitar el
establecimiento de comunidades microbianas en el suelo que son una amenaza
para la seguridad alimentaria ya que sirven de reservorio de patógenos y
facilitan el intercambio de genes de resistencia entre los microorganismos.
AplicacionesEntender la endosimbiosis
Homalodisca coagulata
Baumannia cicadellinicola Sulcia muelleri.
Biosíntesis de
vitaminas y
cofactores
Síntesi de
aminoácidos
esenciales
Codependencia metabólica entre
bacterias no relacionadas y su
insecto huésped.
Modelo simple de coevolución
genómica y la reducción del
genoma.
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AplicacionesVirologia medioambiental i transducción
En ambientes marinos los virus constituyen 94% de todo el ácidonucleico. (5% Biomasa).
Dificultades de la metagenómica de virus.
Profagos
No marcador filogenético
No homologos.
La mayoría de ORFans de la biosfera son debidos a la transferenciagénica lateral de origen vírico.
La transducción es un gran contribuyente a la diversidad genética delos procariotas.
Cassettes fotosintèticos en cianófagos pueden aumentar lafitness de su huésped suplementando y mejorando losfotosistemas existentes de las cianobacterias.
Futuro
Secuenciadores de tercera generación permitiránsecuenciar un cromosoma en un solo paso conningún o pocos fragmentos. Algoritmos deensamblaje. El control de cualidad, la búsqueda degenes y la anotación aún serán necesarios.
Diferenciar citosina y citosina metilada durante lasecuenciación. (metilación = sistema inmunitarioprimitivo en bacterias y control de expresióngénica en eucariotas).
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Conclusions
Els microorganismes tenen una gran influencia sobre lesaltres formes de vida de la terra.
Metagenómica “nova” disciplina que permet l’estudigenòmic de microorganismes mediambientals.
Proporciona informació sobre la diversitat genètica igenòmica de les espècies microbianes, la seva evolució i laseva adaptació a ambients diversos.
Aplicacions diverses.
Bibliografía
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FIN!