Asma de cercaAsma de cerca
Nuevas aproximaciones
experimentales para el tratamiento
del asmaVictoria del Pozo
El asma se define como una enfermedad inflamatoria de las
vías respiratorias, que se caracteriza por inflamación,
hiperrespuesta bronquial y obstrucción variable al flujo
aéreo.
Es una enfermedad compleja: factores genéticos,
medioambientales y nutricionales
Se desarrolla tras exposiciones ambientales a sustancias
inocuas ajenas al organismo.
Enfermedad heterogénea: Fenotipos
.
- inducido por virus
- alérgico,
- no alérgico,
- intrínseco,
- extrínseco,
-ocupacional,
- persistente,
- estacional,
- inducido por ejercicio,
- nocturno,
- resistente a esteroides
8-10% 5%
PREVALENCIA
Asma es una de las enfermedades crónicas mas comunes en el mundo, especialmente en niños
Red >10.1%
Orange 7.6 – 10.0%
Yellow 5.1 – 7.5%
Green 2.5 – 5.0%
Blue 0 – 2.5%
White No standardized
data available
20%
300 MILLONES
Factores relacionados a la cultura y estilo de vida occidental
contribuyen al desarrollo de asma frente a tolerancia
Tratamiento del asma: objetivos
• Prevenir y tratar los síntomas crónicos
• Mantener la función pulmonar cerca de la normalidad
• Mantener un nivel de actividad normal.
• Prevenir las exacerbaciones, visitas a urgencias y hospitalizaciones
• Tener un control medico optimo sin efectos adversos
TRATAMIENTO FARMACOLOGICO
•Tratamientos sintomáticos:•Aliviadores/ corto plazo “alivian” las molestias al dilatar los bronquios, pero no influyen en la inflamación y, por tanto, no mejoran el asma.
Broncodilatadores de acción rápida: son los más utilizados. Su efecto se nota muy pronto (entre los 3 y los 5´), aunque a las pocas horas desaparece. Se usa cuando el asma es muy leve y produce síntomas ocasionales.
Broncodilatadores de efecto prolongado: su efecto dura más, hasta unas 12 horas.
•Antiinflamatorios: disminuyen la inflamación
“ Es el único tratamiento que puede afectar la evolución natural de las enfermedades alérgicas y también puede prevenir el desarrollo de asma en
pacientes con rinitis alérgica”
Tratamiento etiológico (específico e individualizado) de algunas enfermedades alérgicas, que consiste en la administración, generalmente subcutánea, de dosis progresivamente crecientes del material alergénico(extracto) al que el paciente está sensibilizado.
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?
• Identificar el alergeno cusante mediante HC, resultados de test de laboratorio
• Evitar o limitar la exposicion a:– Indoors: Tabaco; allergenos, acaros, cucarachas,
mascotas, etc.
– Outdoors: hongos y polenes
– Trabajo: agentes ocupacionales e.j. latex, harina de trigo, enzimas, animales de laboratorio
– Dieta: alergenos alimentarios
EDUCACION DEL PACIENTE
Antinflamatorios glucocorticoides inhalados,
Modificadores de leucotrienos
Broncodilatadores 2 agonistas
5-10% Asma grave de difícil control (resistentes a corticosteroides)
Sólo 2 nuevas dianas identificadas y llevadas a la practica clínica
aunque con restricciones en los últimos 20 años:
Anti-cisteinileucotrienos
Anti-IgE (Omalizumab)
NECESIDAD DE BÚSQUEDA DE NUEVAS TERAPIAS (SEGURAS Y
EFECTIVAS) QUE PROPORCIONEN ALIVIO SINTOMÁTICO A
PACIENTES ASMÁTICOS
La mayoría de los pacientes presentan un asma leve o moderado
Bien controlados
Estudio del Receptor responsable de la inhibición de la IL-5
Del Pozo, Rojo, et al.2002 Am. J. Respir Crit. Care Med.166:732
• Incubación de las células con gal-3 inhibe el ARNm de IL-5
Las funciones de la Galectina-3 apuntaban a un posible papel en las reacciones alérgicas.Por ello estudiamos el efecto de la Galectina-3 en diferentes tipos celulares:
Cortegano, del Pozo et al . 1998. J. Immunol. 161:385.
ANTECEDENTES
Cortegano, del Pozo et al. 2000. Glicobiology 10:237
La administración local de Galectina-3 en un plásmido con un promotor de expresión fuerte y constitutiva, inhibia la síntesis de IL-5 y por lo tanto el reclutamiento de los eosinófilos en el foco inflamatorio, así como su activación en una modelo de asma agudoGalectina-3 como terapia para el asma crónico
Tipos de lectinas animales
GALECTINAS
-Tipo-C (dependientes de Ca2+): Selectinas -Tipo-S (soluble): GALECTINA-3
Chromosome 14 (14q21-q22)
Gen LGALS3 (17 kb)
• Familia de proteínas que contienen un dominio lectina con afinidad por beta-galactósidos
MODELO CRONICO: RATONES A/J CON INFLAMACIÓN ALÉRGICA INDUCIDA POR ANTÍGENO (OVA)
Instilación pEGFP-Gal-3
pEGFPFunciones pulmonaresLBAsExtracción de sangreExtracción de pulmones
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Instilación intranasal OVAGrupo OVA (n=26)Grupo pEGFP-Gal-3 (n=30)Grupo pEGFP
SEMANAS DEL ENSAYO
Puntos de Estudio
2 6 8 124
Grupo salinoInstilación intranasal salino
(3 veces por semana)
RATONES A/J
MCS
pCMV IEGen de Gal-3
pEGFPEGFP
SV40 poly AAntibioti
co r
P SV40 e
SANGRE PERIFERICA LBA
EOS/ mm3 % EOS
CEL TOT (X106) % EOS
pEGFP-Gal-3 386 150 5.58 1.8 0.420.1 4.38 1.05
OVA 1584 600 13.6 3.7 3.341.1 11.09 2.4
pEGFP 1624 408 11.2 1.5 2.81.8 9.80 2.6
SS 287 100 2.5 0.5 0.40.1 1.88 0.6
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Re
lati
ve
mR
NA
ex
pre
ss
ion
of
IL-4
0
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0,8
1
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mR
NA
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pre
ss
ion
of
IL-1
0
0
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0,6
0,8
1
Rela
tive
mR
NA
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pre
ss
ion
of
IL-5
*p<0.05
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Re
lati
ve
mR
NA
ex
pre
ss
ion
of
IL-1
3
** p< 0.01
** p< 0.01
*p<0.05
A B
C D
ESTUDIO DE LA FUNCIÓN PULMONAR(Pletismografía Corporal Total)
Sistema de pletismografía
Registro flujos respiratorios
Cámara de inhalación
CONCLUSION
La terapia génica con Gal-3 inhibe las características patognomónicas del asma crónica en un modelo de ratón.
•E. López, V. del Pozo, T. Miguel, B. Sastre, C. Seoane, E. Civantos, E. Llanes, M.L. Baeza, P. Palomino, B. Cárdaba, S.
Gallardo, F. Manzarbeitia, J.M. Zubeldia and C. Lahoz -Inhibition of chronic airway inflammation and remodeling by gal-3
gene therapy in a murine model. J. Immunol 2006. 176:1943-1950.¿Cómo?
TECNOLOGÍA MICROARRAY
Análisis Microarrays
Mouse Genome 430 2.0 Microarrays (Affymetrix)
ARN total
pulmones
ADNc
Transcripción
reversa
Transcripción
in vitro
ARNc
biotinilado
Fragmentación
Hibridación
Chip génico
de array de
expresión
ARNc biotinilado
y fragmentado
Lavar y
teñir
UNDER-represented
OVER-representedUNDER-represented
OVER-representedOVA GROUP
pEGFP- GAL-3 GROUP
% of annotated genes
1000 20 40 60 80ID NAME PERCENTAGE
ADJUSTED
P-VALUE
GO: 0006954 Inflammatory Response 66.58 2.67E-7
GO: 0002889Regulation of Immunoglobulin
mediated Immune Response78.18 4.02E-4
GO: 0050728Negative Regulation of
Inflammatory Response92.9 6.15E-4
GO: 0042089 Cytokine Biosynthetic Process 65.3 5.37E-3
GO: 0002456 T cell mediated Immunity 78.55 4.46E-3
GO: 0019221Cytokine and Chemokine
mediated Signalling Pathway71.45 5.92E-3
GO :0043299 Leukocyte Degranulation 98 4.48E-2
GO: 00042692 Muscle Cell Differentiation 20.29 2.7E-7
GO: 0030329 Lung Development 30.58 1.58E-2
GO: 0051128Regulation of Biological
Process 40 3.85E-2
PROCESOS BIOLÓGICOS
GENES
Respuesta inflamatoria IDO1, IL17A, IL17B, IL17F, IL25, TGFB1, IL6, IL4, FOXP3, JAK2, SATA5A,
TLR4
Regulación de la
respuesta immune
mediada por
inmunoglobulinas
BCL6, FOXP3, FCG2B, IGH7, TNF, TGFB1, IL4, STAT6, IGH1A, IGH3, IGH7, C3, IL27RA
Regulación negativa de la
respuesta inflamatoria
IL10, FOXP3, TGFB, SOCS3, IL2, TNF1B, AD, FOXF1A, IL2RA, ZFP36
Procesos de biosíntesis
de citocinas
ADAM3, GATA3, IGF2BP1, IL12b, ,AP2K3, IL6, FOXP3, IL10, NFKB1, BCL3,
IFNG, IL1B, TNF, WNT5A, IL21, IL1A, STAT5, IL17F
Inmunidad mediada por
células T
IL4RA, BCL6, TGFB, IL20RB, IL2RA, IDO, FOXP3, CD27, CD74, LAG3,
CASP3
Vias de señalización
mediadas por citocinas y
quimiocinas
ILR1, IL23R, IL2RB, IL3, IL5, JAK1, JAK3, SOCS1, SOCS3, SOCS5, STAT1,
STAT3, STAT5A,
STAT5B, IL6. IL6RA, TNF
Degranulación de
leucocitos
PAK2A, RAB27A, IGH7, HMOX1, FOXF1A, FCER1G, PRAM1
BÚSQUEDA DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES EN RUTAS
BIOLÓGICAS ENTRE EL GRUPO OVA vs pEGFP – GAL-3
Rela
tive
mR
NA
ex
pre
ss
ion
of
SO
CS
1
0
1
2 OVA
pEGFP
pEFGP-GAL-3
SS
Rela
tive
mR
NA
ex
pre
ss
ion
of
SO
CS
3
Rela
tive
mR
NA
ex
pre
ss
ion
of
SO
CS
5
A B
C
** P < 0.01*** P < 0.001
** P < 0.01
Rela
tive
in
ten
sit
y r
ati
o
SO
CS
3/
-ac
tin
0
0.2.
0.4
0.6
0.8
1pEGFP-Gal-3
SSOVA
SOCS3(38 kDa)
Actin(43 kDa)
OVA Gal-3 SS C+
La expresión de SOCS-3, tanto a nivel génico como a nivel proteico,
está más elevada en los ratones asmáticos no tratados frente a los
tratados con el pEGFP-Gal-3.
CONCLUSIONES
Estos datos sugieren que la Galectina-3 está ejerciendo algún efecto
directo o indirecto sobre la transcripción de SOCS-3.
ESTUDIO DE SOCS EN HUMANOS
•López E, Zafra MP, Sastre B, Gámez C, Lahoz C, del Pozo V. Gene expression profiling in lungs of chronic
asthmatic mice treated with galectin-3: down-regulation of inflammatory and regulatory genes . Mediators of
Inflammation. 2011;2011:823279.
SOCS3 “Supressor Of Cytokine Signaling”
La expresión constitutiva de
SOCS-3 en las células T
incrementa la hiperreactividad
bronquial como resultado de un
incremento en la respuesta Th2.
Es posible que la expresión
específica en las células Th2 de
SOCS-3, tenga un papel
importante en la patofisiología de
las enfermedades alérgicas
mediadas por Th2.
SOCS-1, SOCS-3 y SOCS-5 están implicados en la diferenciación Th1/Th2.
Análisis de la expresión de las proteínas
SOCS : PACIENTES RED RESPIRA
*p<0.05
*p<0.05
*p<0.05
CLASIFICACIÓN DE LA SEVERIDAD DEL ASMA
N
CONTROLES 24
INTERMITENTE 15
PERSISTENTE LEVE 17
PERSISTENTE MODERADO 26
PERSISTENTE GRAVE 60
Análisis de la expresión de las proteínas
SOCS : PACIENTES RED RESPIRA
*p<0.05
*p<0.05
CLASIFICACIÓN DE LA SEVERIDAD DEL ASMA
N
CONTROLES 24
INTERMITENTE 15
PERSISTENTE LEVE 17
PERSISTENTE MODERADO 26
PERSISTENTE GRAVE 60
La principal célula que participa en el daño que se produce en la mucosa bronquial son los eosinofilos.
ASMA Bronquitis eosinofílica
no-asmática (BENA)
Tos, disnea, sibilancias Tos aislada
Obstrucción variable
al flujo aéreo
AUSENTE
Hiperrespuesta
bronquial
AUSENTE
EN COMÚN:
Infiltración eosinofílica en biopsia bronquial
Eosinofilia en el lavado broncoalveolar
Infiltración de los
mastocitos en el
músculo liso
AUSENTE O MUY
ESCASA
Healthy controls Eosinophilic bronchitis Asthma
N 9 8 6
Age 23 (20-30) 40 (31-55) 37(21-61)
Male 4 (44.4 %) 4 (50 %) 3 (50 %)
Atopy 0 5 (62.5%) 3 (50%)
Total IgE (IU/ml) 21.150 (4.52-144) 163 (34.50-605) * 65.2 (57.60-360) *
Eosinophil count 0.14 (0-3.32) 4.40 (1.5-8.39)** 2.66 (1.34-7.92) *
PGE2 (pg/ml) 2.89 (0.78-5.28) 15.582 (3.81-1336) * 33.83 (12.98-54.72)
Results were expressed as median (range)* p<0.05 (versus healthy control; Kruskal Wallis test; post test Dunn’s Multiple comparison Test).** p<0.01(versus healthy control; Kruskal Wallis test; post test Dunn’s Multiple comparison Test).
Table . Clinical characteristics of study subjects
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5R
ela
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mR
NA
ex
pre
ss
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of
SO
CS
3
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d C
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T c
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s
A* P < 0.05
HEALTHY C0NTROLS
ASTHMATICS
0
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1
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2
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ed
eo
sin
op
hil
s
D
EOSINOPHILIC BRONCHITIS
† P < 0.01
2 3
ISOCS3
(38 kDa)
1 2 3 4
J
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
SO
CS
-3 (
AR
BIT
RA
RY
UN
ITS
)
*P < 0.05
ACTIN
(45 kDa)
C
E
A D
G H
B
F
Estos datos indican que SOCS-3 puede ser un posible marcador de
patología respiratoria.
•López E, Zafra MP, Sastre B, Gámez C, Fernández-Nieto M, Sastre J, Lahoz C, Quirce S, del Pozo V.
Suppressors of cytokine signaling 3 (SOCS3) expression in eosinophils: regulation by PGE2 and Th2
cytokines Clinl Dev Immunol. 2011; 2011:917015
Terapia Silenciamiento SOCS3 siRNA
44 % INHIBICIÓN EXPRESIÓN SOCS3
NIVEL GÉNICO: RT-PCR CUANTITATIVA
N=50
20
40
60
80
100
120
C-ARNsi SOCS3 ARNsi
Exp
resio
nre
lativa
A
RN
mS
OC
S3
(%
)
SOCS3
Actina
C-ARNsi
SOCS3
ARNsi
+IL-5/GM-CSF 48h
NIVEL PROTEICO: WESTERN BLOT
N=4
26 VECES MENOS DE EXPRESION PROTEICA DE SOCS3
EFECTO DEL SILENCIAMIENTO GÉNICO DE SOCS3 EN EOSINÓFILOS
+IL-5/GM-CSF 48h
Terapia Silenciamiento SOCS3 siSOCS (4 siSOCS3)
Modelo elegido: Modelo II
ARNsi C- ó ARNsi SOCS3 (+4) cc. 20uM (12 dosis)
ESTUDIO “IN VIVO”: CONTINUACIÓN
GRUPO 1: SS
GRUPO 2: OVA
GRUPO 3: OVA + ARNsi C-
GRUPO 4: OVA + ARNsi SOCS3
N=20 (5/grupo)
•Silenciamiento es una buena aproximación terapéutica
para enfermedades respiratorias
•El silenciamiento de SOCS3 mejora las función pulmonar
en un modelo animal de asma crónica
CONCLUSIONES
“Progress in understanding asthma and its underlying mechanisms is slow;
treatment can be difficult and response unpredictable; and prevention or cure
is still a pipedream. Asthma, one of the most important chronic diseases,
remains a genuine mystery”
Lancet 2008
Grupo del IIS-FJD
Dra. Carla Mazzeo. Postdoctoral
Cristina Gámez. I. Predoctoral.
Mª Paz Zafra. I. Predoctoral
Verónica Sanz. TEL.
Ana de Zuloaga. TEL
Dr. Santiago Quirce •Jefe de Alergia•Hospital La Paz
Dr. Joaquin Sastre •Jefe de Alergia •Fundación Jiménez Díaz- CAPIO
AGRADECIMIENTOS