UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICO AGROPECUARIAS
UNIVIASIOAOAUIONOMAOINAYARB
iii- .~
SISHMA Dr ~IBlIUJECAS
"IDENTIFICACION DEL GEN aoxB EN UNA COLECCION DEPROTEOBACTERIAS RESISTENTES A ARSENICO DEL Rio MOLOLOA"
•QFB ARMANDO QUINTERO CASTANEDA
Tesis presentada como requisito parcial para la obtenci6n del grado deMaestria en Ciencias en el Area de Ciencias Ambientales
Tepic,Nayarit,4dejunio2014
Dr. Diego Garcia ParedesCoordinadordelProgramadeMaestrfaenCienciasBiol6gicoAgropecuariasPresente
Los que suscribimos, integrantes del comite tutorial del QFB Armando QuinteroCastaneda, declaramos que hemos revisado la tesis titulada: "ldentificaci6n del genaoxB en una colecci6n de proteobactertas resistentes a arsenico del rio Mololoa"ydeterminamosquelatesispuedeserpresentadaporelestudiantede MaestrfaenCiencias Biol6gicoAgropecuarias, con opci6nterrninal en CienciasAmbientales.
ELeOMIT'TUTORIAL '~
Dkecto,. d.T~,D~.V....ok. AI.J.o.... Mood.....o ','m••~Co-Director de Tesis: Dra. LetiCIa M6nica Sanchez Herrera ~"'-"')
Asesor de Tesis: Dr, JesUs Bernardmo Velazquez Fernandez ~~~
CBAP/141/14
Xalisco, Nayarit; 10 dejunio de 2014
Ing. Alfredo Gonzalez JaureguiDirector de Administracion EscolarPre sen t e.
Con base al oficio de fecha 04 dejunio de 2014, enviado por los CC.Ora. Veronica Alejandra Mondragon Jaimes, Ora. LeticiaMonica Sanchez Herrera, y Dr. Jesus Bernardino VelaquezFernandez, donde se nos indica que el trabajo de tesis cumple con 10establecidoenformaycontenido,ydebidoaquehacumplidoconlosdemas requisitos que pide el Posgrado en Ciencias BiologicoAgropecuarias de la Universidad Autonoma de Nayarit, se autoriza alC. Armando Quintero Castaneda, continue con los tramitesnecesariosparalapresentaci6ndelexamendegradodemaestrfa.
Sin masporelmomento,recibauncordialsaludo.
C.c.p.-Expediente.
Unidad Academica de Agricultura Carretera Tepic-Compostela Km. 9C.P. 63780, XaliscoNayarit Tel. 311-2-1 1-24-78
EI presente trabajo de investigaci6n forma parte del proyecto "Resistencia a
metalespesadosyantibi6ticosen bacteriasambientalesdel rio Mololoa"quese
desarrollaenel Laboratoriode Resistencia Bacterianadela UnidadAcademicade
Ciencias Quimico Biol6gicas y Farmaceuticas de la UAN, bajo el Iiderazgo de la
Ora. Ver6nica Alejandra Mondrag6n Jaimes y cont6 con el apoyo econ6mico
PROMEP/103.5/07/2519 del mismo proyecto.
Parte de los experimentos se realizaron en ellaboratoriode An<ilisis Especiales
de Ja Unidad de Tecnologia de Alimentos de la UAN y en el Laboratorio de
Biologia Molecular del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierias
(CUCEI) de la Universidad de Guadalajara.
Paginaiv
ADios por permitirme lIegar a buen termino con mi maestria y ayudarme aentenderque caminarpor un senderosinuoso hacemas placenterala lIegadaaldestinofijado.
Ala doctora Veronica Mondragon por despertaren mi persona el interes por lainvestigacion, porpermitirmeformarpartedesu selecto equipo de trabajoyportodosuapoyoycompromisoduranteeldesarrollodemimaestria.
A la doctora Leticia Monica Sanchez por aceptarme como alumno de maeslria, porsuapoyoydedicacionenelproyectodeinvestigacionyporsureiterado interes enlaadopciondelosvaloresimprescindiblesenuninvestigador.
A los M. en C. Monica Elizabeth Martinez y Yolotzin Apatzingan Palomino por laayudayorientacion que me brindaron cuandomas 10 necesitaba.
AI doctor Jesus Bernardino Velazquez porsus enseiianzas en lasasignaturas.
A los compaiieros de generacion, con quienes comparto la felicidad por suslogros.
A la a.F.B. Guadalupe Pacheco y la Biologo Geovanny Melchor por sucomprensionyapoyoenlosmomentosmasdificiles.
Paginav
AI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla por el apoyo econ6mico brindado ami persona en la modalidad de becas estudiantiles para alumnos de maestrla (No.debeca335089;CVU448011).
AI Posgrado en Ciencias Biol6gico Agropecuarias y Pesqueras de la UniversidadAut6noma de Nayarit por las facilidades econ6micas y administrativas otorgadaspara mi desempeno como alumno de maestrla en ciencias. De igual manera,agradezco al personal administrativo de la dependencia citada por el apoyobrindadoduranteeldesarrollodemiempresa,queestaporconcluir.
A la direcci6n de la Unidad Academica de Ciencias Quimico Biol6gicas yFarrnaceuticas porperrnitirel uso de las instalacionesdel Laboratorio deResistencia Bacteriana para el desarrollo experimental de la presenteinvestigaci6n.
AI Laboratorio de Resistencia Bacteriana por permitir la realizaci6n de la mayorpartedelosexperimentos.
A la Unidad de Tecnologia de Alimentos por facilitar el uso de instalaciones yequipodel LaboratoriodeAnalisis Especiales.
AI Laboratorio de Biologia Molecular perteneciente al Departamento deFarrnacobiologia del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierias de laUniversidaddeGuadalajaraporpermitirmiaceptaci6nyfacilitarsusinstalacionespara la realizaci6n de una estancia de investigaci6n con la Ora. Maria EstherMacias Rodriguez.
Paginavi
Portu pacienciaycomprension; pocote importo sacrificartu tiempo para que yo
pudieracumplircon elmfo. Portu bondad ysacrificfo me inspirastea sermejor,
porlocualpuedodecirqueestatesislievamuchodeti.Graciasporestarsiempre
amilado,Chaparra.
Amispadresyhermanos
Porelapoyoycomprension que me brindaron durante estos aiios de estudio.Que
Diosrecompensesubondadymelosguardemuchosaiios.
Alamemoriadeunamigo
Quien se nos adelanto en elcaminoyno alcanzo a compartirmigusto poreste
logro. Decorazon lededicoestetriunfo, amigo Don Luis.
ABREVIATURAS Y SiMBOLOS
8itio de inserci6n de casettes de genes en un integr6n
Acr3p Protefnasdetransportetransmembranaldearsenito
Enzimaarsenatoreductasarespiratoria
Gencodificanteparalasubunidadmayordelaarsenitooxidasa
Oper6n de resistencia a arsenico; incluye una enzima arsenato
reductasacitoplasmaticayuncomplejodeexpulsi6ndearsenit0
Transferencia Genetica Horizontal (HGT, por sus siglas en ingles)
Genquecodificalaenzima~-galactosidasa
H20dde Aguadestiladadesionizadaesteril
Oper6n de resistencia a mercuric; incluye una enzima mercurico
reductasayproteinas de expulsi6n
pA Oligonucle6tido forward del par publicado por Hutson et al., 1993
para amplificaci6n de secuencias de rADN 168
pH" Oligonucle6tido reverse del par publicado por Hutson et al., 1993
paraamplificaci6n de secuencias de rADN 168
x2 Jicuadrado
Paginaviii
iNDICE TEMATICO
1. INTRODUCCION ..
1.1 GENERAUDADES DEL ARSENICO 1
1.2 CONTAMINAOON POR ARSENlCO .
1.3 REGULAOON ..
1.4 EXPOSIOON AL ARSENlCO ..
1.5 CLASIFICAOON Y NORMATNA .
1.6 INTERACOON CON MICROORGANISMOS..
1.9ELOPERONaox 13
3. JUSTIFlCACION ..
4.HIPOTESIS ..
5. OBJETIVO GENERAL .......
5.1 OBJETIVOS ESPEdFiCOS ..
6. MATERIALES YMETODOS .
6.1 MATERIAL BIOLOGlCO .....
6.3 ESTRATEGIA DE TRABAJO
6.3.1 PRUEBAS FENOTIPlCAS Y EXTRACOON DE ADN ....
a)pruebas de concentraci6n minima inhibitoria (CMI) 29
b)pruebadecapacidadarsenito-oxidante.... . 30
c) anl1/isisderesultados.... . 30
d)extracci6ndeADNbacteriano ....
6.3.2 REACo6N EN CADENA DE LA POUMERASA (PCR) 31
................................................................................................... 32
a) empleo de los Oligonlle/e6tidos diseiiadosporInskeep eta'., 2007
b)empleodelosOligonlle/e6tidosdiseiiadospor Qllemenellretal., 2008
a)bUsqlledadelgenaoxB en integrones e/aseI ....
b)selecci6ndecepasparaanalisisderADN16S .
c)analisisdeseCllenciasderADN 36
7. RESULTADOS YDISCUSION.
7.1 CONCENTRA06N MINIMA INHIBITORlA (CMI)
7.2 ACfIVIDAD ARSENITO-OXIDANTE .
7.3 IDENTIFICACI6N DEL GEN aoxB .
7.3.1 BUSQUEDA DEL GEN CON LOS OLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS PORINSKEEP etal., 2007.... . 41
7.3.2 BUSQUEDA DEL GEN CON UTILIZA06N DE LOSOLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS POR QuEMENEUR et al., 2008 42
7.4 BUSQUEDA DEL GEN aoxB INMERSO EN INTEGRONES CLASE 1 46
7.5 ANALISIS DE SECUENCIAS DE rADN 165 .
8. CONCLUSlONES .
9. PRODUCTOS DE LA INVESTIGACION ..
11. BIBLlOGRAFM..........
tNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Prineipa/es compuestos organieos e inorganieos que forma el arsenieo.2
Cuadro 2. Normas y regulaeiones para el arsfmieo inorg{mieo . . . .. . 5
Cuadro 3. Identifieaeion y sitios de aislamiento de las espeeies baeterianasutilizadasenesteestudio... . 28
Oligonueleotidos empleados en esta investigaeion, tamaiio delesperado (euando eorresponde) y
Cuadro 5. Resultados de las pruebas de CMI de arsenito y aetividad arsenito-oxidante... . 38
Tamaiios resultados de la seeueneiaeion de lospor PCR del
Paginaxi
fNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cicio biogeoquimico del arsenico 4
Figura 2. Estructura y cicio catalfticooxidasa ...
Figura 3. Estructura cristalina de la Arsenito
arsenito...... 11
Figura 4. Contextogenetico de 21 islasdearsenico 15
Figura 5. Filogenia de secuencias aoxB y rADN 16S.....
Figura 6. Comparacion de las regiones amplificadas por los oligonucleotidos deInskeep et al., 2007 y Quemeneur et al.,200B... . 20
Figura 7 Alineamiento de secuencias nucleotidicas de siete genes aoxBpublicados y tentativos que muestra las regiones usadas para el diseiio deoligonucleotidos.... . 21
Figura B. Ubicacion geog,,!Jfica del rio Mololoa ..
Figura 9. Sitios muestreados en la bUsqueda de bacteriasresistentes..
Figura 10. Esquema de la estrategia experimental utilizada en este estudio
Figura 11. Plantilla empleada en la tecnica de CMI ...
Figura 12. Planteamiento de las pruebas de PCR con oligonucleotidos dirigidos alas secuencias conseNadas Int/1 y qacED del Integron Clase I en combinacionconlosoligonucleotidosparaelgenaoxB... . ... 35
Figura 13. Pruebas de CMI de arsenito realizadas a las 15 cepas de estudio ......39
Figura 14. Resultados de pruebas de actividad arsenito-oxidante en medio~ ~
Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCRcon los oligonucleotidos de Inskeep et al.,2007. .. .......42
Paginaxii
Figura 16. Corrimien/o e/ec/rofore/ico en ge/es de agarosa a11% en TAE de lasbandas amplificadas con losoligonucle6/idos de Quemeneure/al., 2008 43
Figura 17. Resul/ado del BLA5Tpfll entre la secuencia de aminoacidos obtenida dela secuencia de 640 pb Y las secuencias reportadas en la base de datos Non-redundan/pro/einsequences, del NCBlfIl 43
Figura 18. Elec/roforesis de los produc/os de PCR para la amplificaci6n de rADN165...... . . .. 49
Paginaxiii
RESUMEN
Elarsenicoenallasconcenlracionesrepresenlaunriesgoparalasaludhumanay
el ambienle. EI rro Mololoa, que alraviesa la ciudad de Tepic, Nayaril, presenla
concenlraciones eJevadas de arsemico. Ademas es afeclado por descargas
induslriales, agropecuarias, domeslicas, de servicios y Iixiviados del liradero
municipal a cielo abierto "Ellxtele", 10 que causa un serio problema de salud
publica. En estudios previos lIevados a cabo en este sitio, se han aislado e
identificadounaseriedemicroorganismosconcapacidadderesislenciaaarsenico
y metales pesados como mercurio, cromo, cadmio y a antibi6ticos como
kanamicina, cipro!1oxacino, gentamicina y beta-Iactamicos. Eslos hallazgos
sugieren laexistencia de una constante presi6n de selecci6n en la zona.Ello
implicaques61olasbacleriasencuyogenomaseencuenlrengenesderesistencia
aagentesseJectivoslograransobrevivir.
Enestetrabajo, seencontr6 que8 de las 15cepasestudiadastienenlacapacidad
deconvertirarsenitoenarsenatoporreacci6ndeoxidaci6n,loqueexplicael
fenotipoarsenilo resislenle, con valores de concentraci6n minimainhibiloria (CMI)
de arsenilo de sodio (NaAs02) enlre 2 y 15 mM, correspondienle a las cepas C4:
E. cloacae, C5: Enterobacter sp., C10: Enterobacter sp., C12: K. pneumoniae,
C16: E. aerogenes, C20: K. pneumoniae, C81: K. pneumoniae y C95: K.
pneumoniae. La idenlificaci6n del gen aoxB como responsable del fenolipo
arsenito-resislenleconutilizaci6ndelosoligonucle6lidosreportadosparaeslegen
no fueposible. Probablemenle,seaconsecuenciadelaocurrenciadeunproceso
exaplativo donde los microorganismos empleen un mecanisme enzlmalico dislinto
delsistemaaoxparalaoxidaci6ndearsenilo.
Paginaxiv
SUMMARY
The presence of high concentrations of arsenic in a certain site represents a
constant risk to populations living there. In Mololoa River, which flows across the
city of Tepic, Nayarit, concentrations of arsenic above the average content of
continental crust haves been found. Along with this, pollution by sewage and
landfill leachate "Ellxtete"constitutesa serious public health problem. In previous
studies, arsenic-resistant microorganisms have been isolated from samples of
sewage and leachate. Those organisms are also resistant to heavy metals such as
mercury, chromium, cadmium and antibiotics such as kanamycin, ciprofloxacin,
gentamicin and beta-Iactams.
In this work, it was found that 8 of 14 studied strains have the ability to convert
arsenite to arsenate by oxidation. This explains the phenotype resistant arsenite,
with values of minimum concentration inhibitory (CMI) are between 2 and 15 mM
(NaAsOz) sodium arsenite, corresponding to the strains C4: E. cloacae, C5:
Enferobacfersp., C10: Enferobacfersp., C12: K. pneumoniae, C16: E. aerogenes,
C20: K. pneumoniae, C81: K. pneumoniae y C95: K. pneumoniae. It was not
possible to identify the aoxB genotype. This could be probably caused by
occurrence of an exaptative process arisingfromdifferentenzymaticmechanisms
other than "aox".
Paginaxv
Pilginaxvi
1. INTRODUCCION
1.1 GENERALIDADES DEL ARSENICO
EI arsenico (As) es un metaloide ubicuo en el ambiente (Brown y Ross, 2002) que
pertenece al grupo Vde la tabla peri6dica de los elementos yes, por 10 tanto,
clasificado como un metal pesado. Se encuentra en la naturaleza en cuatro
estadosdeoxidaci6n(+5,+3,0,y-3),conarsenatopentavalente[+5,AsMl.Y
arsenito trivalente [+3, As (111)] como las formas mas comunes. EI arsenico
elementalmuyraramenteseencuentraen lanaturaleza, perosepuedeencontrar
en forma de masas microcristalinas en Siberia, Alemania, Francia, Italia, Rumania,
ylos EE.UU. La mayor parte seencuentraen conjunci6n con azufreen minerales
tales como arsenopirita (FeAsS), rejalgar (AsS), oropimente (As2S3) y enargita
(CuJAsS.) (Mateos etal., 2006).
Dado que se encuentra en cuatro estados de oxidaci6n, este elemento puede
formar una serie de compuestos quimicos, de los cuales se resumen los
principalesenelcuadr01.
Los compuestos arsenicales tienen una larga historia como agentesmedicinalesy
venenosos. Se sabe que las sociedades humanas ya conocian el arsenico en el
ana 3000 a. de C. y que posiblemente fue descubierto por su presencia como
subproducto en las actividades mineras. Su usc medicinal fue descrito desde el
an0400 a. de C. porHip6crates, quien recomend61a aplicaci6n de una pasta de
rejalgar (AsS) para tratar ulceras cutaneas. Historias de muertes por
envenenamientoconarsenicohanabundadoenloscirculosdelapolitica. Durante
el Renacimiento en !talia, los Borgias usaron arsenico para asesinar oponentes
politicos (Sambu yWi!son, 2008).
Paginal
Cuadro 1. Prlncipales compuestos organlcos e Inorganlcos que forma elarsenico.
Nombre(Sin6nimo) IArsenlcolnorganlco, As (III)
F6rmulaqufmica
6xidodearsenico(1I1),tri6xidode arsenico
acidoortoarsenioso,acidoarsenioso
(Orto)arsen~os, salesdelacido. ortoarsenioso
clorurodearsenico(III),triciorurodearsenico
su~urode arsenico (III), trisu~urode arsenico
HzAsO,', HAsO,", AsO,"
AsCI>
Arsenicoinorganico, As (V)
6xidodearsenicoM,pent6xidodearsenico
acidoortoarsenico,acidoarsenico
(Orto)arseniatos,salesdelacidoarsenico
A,senicoorganico
acidop-aminobenceno-ars6nico
acido4-nitrofenilars6nico,
acidop-nitrofenilarsonico
arsenobetalna
dialquilcloroarslna
alquildicloroarsina
Tomadode. Carbonell etal., 1995.
HzAsO.
HAsO,
HzAsO,', HAsO,", AsO,"
CHzAsO(OH)2
(CH,)zAsO
CHzAsH,
(CH,)zAsH
(CH,)zAs
H,N-C,H,'AsO(OH)2
(CH,)zAs'CH,COOH-
(CH,)zAs'CH,CH,OH
RzAsCI
Pagina2
Durantela Edad Media, laspropiedadest6xicasdelarsenicofueronmuyutilizadas
yelarsenicoblanco(tri6xidodearsenico)fueelvenenodeelecci6n,porsualla
toxicidad. Durante la Primera Guerra Mundial, se desarrollaron y utilizaron como
armas qulmicas los gases arsenicales, entre ellos el gas Lewisita (c1orovinil
dicloroarsina), que es un potente agentevesicante, irritante localytoxico
sistemico.Aprincipiosdeestesiglo, losarsenicalesorganicosseemplearonpara
combatirenfermedadescomolatripanosomiasisylaslfilisy,algunos compuestos
de arsenico inorganico, para el tratamiento de enfermedades cutaneascronicas,
anemia, leucemia y enfermedades pulmonares (Sambu y Wilson, 2008).
Actualmente, alrededor del 90% de todos los compuestos de arsemico producidos
porel humane se utilizan como conservantes de la madera, donde el arsenato
cromado de cobre es el mas utilizado. E110% restante se usa en insecticidas,
fertilizantes, herbicidas, fungicidas, producci6n de vidrio, semiconductores y
produccion de aleaciones de metales; tambien se utiliza como ingrediente en
medicamentos para el tratamiento de algunas enfermedades (por ejemplo,
enfermedad del sueno y leucemia cronica mieloide) (Mateos etal. ,2006).
1.2 CONTAMINACION paR ARSENICO
Lasfuentes naturales del arsenico presente en elartlbiente incluyenelvulcanismo,
la actividad hidrotermica y la erosion de las rocas sedimentarias e igneas que
contienen minerales de arsenico en su composicion (Figura 1). Las actividades
antropogenicas, tales como la fundicion de minerales, quema de combustibles
fosiles yel usc de agroquimicos tambien representan unafuente importante de
arsenicoenelambiente (Oremland y Stolz, 2003).
Este metaloide se encuentra ampliamente distribuido de forma desigual en la
atmosferaterrestre, hidrosfera, suelos, sedimentos,yorganismosvivos(Culieny
Pagina3
Reimer, 1989). Su contenidoen lacortezaterrestreoscilaentre 1.5y2mg/kgyes
el numero 20 en la lista de los elementos mas abundantes (N. A. S., 1977). Se
encuentranaltasconcentracionesdearsenicoenlasareasdondese presenta una
actividadgeotermicanotable,aslcomoensuelosprocedentesde roca madre de
origenvolcanico (Carbonell etal., 1995).
Figura 1. Cicio biogeoquimico del arsenico. Se muestra la implicaci6n de los
microorganismos en laformaci6n de las especies qufmicasdel arsenico. Traducidode
Jones,2007.
Suciclobiogeoquimicoesaltamentedependientedelatransformaci6nbacteriana,
la que consiste en metilar, reducir y/o oxidar el metaloide. Dichas
biotransformacionestienen un rolfundamentalen lamovilidadyladistribuci6nde
arsenicoenelambiente (Silvery Phung, 2005).
Pagina4
1.3 REGULACI6N
La regulaci6n del arsenicoesta a cargo de diversas dependencias (Cuadro 2). EI
valor limite actual de arsenico en agua potable establecido poria OMS esde 10
flg As/L (WHO, 2004). Esla concentraci6n tambien fue adoptada en Mexico como
Ilmile maximo penmisible en agua de loma domiciliaria, segun 10 eslipula la NOM
127-SSAl-1994, que eslablece los Iimiles maximos permisibles en agua para uso
yconsumohumano.
La dosis de referencia LOAEL (nivel masbajo de efeclos adversos observables)
calculada para elarsenico a partir del valor de 0.17 mg/L dearsenicoen elagua
conunaestimaci6ndelaingesli6ndearsenicoatravesdelosalimentos de 0.002
mg/dra, unconsumode4.5lilrosdeaguaaldiayun pesocorporalpromediode
55 kg en las personas expueslas, es de 0.014 mg/kg-dia (ATSDR, 2009).
Cuadro2. Normasyregulaciones paraelarsenicoinorganico.
Organismo I
Aire-Iugarde trabajo 10 "g/m3
NIOSH Aire-Iugardetrabajo 2 ug/m3
OSHA Aire - lugar de trabajo 10 "g/m3
Aire-ambiente No Aplica
EPA Agua-aguade bebida 10 partes porbill6n
FDA Alimentos 0.5-2partesporbiIl6n
ACGIH: Conferencia Americana de Higienistas Industriales Gubernamentales
EPA AgenciadeProtecci6nAmbientaide EE. UU
FDAAdministraci6ndeAlimentosyFarmacosdeEE.UU
NIOSH:lnstitutoNacionalparalaSeguridadylaSaludOcupacionai
OSHA:Administraci6ndeSeguridadySaludOcupacionaldeEE.UU
Tomado de. ATSDR, 2009.
PaginaS
1.4 EXPOSICI6N AL ARStNICO
EI arsEmico, al igual que otros metales pesados, no puede ser destruido en el
ambiente,porlocualpuedepropagarseycausarefectosperjudicialesenlosseres
humanos,animalesyotrosorganismos(Mateosetal.,2006).
Lasprincipales rutasde exposicion al arsenicoson la ingesta de alimentosyde
agua de bebida, asf como la inhalacion de particulas. EI nivel de absorcion esta
influido poria ruta de exposicion y la especie quimica de arsenico. Las plantas
puedenabsorberarsenicodelsueloodelamateriadepositadasobre sus hojas.
Generalmente, la absorcion de las formas organicas de arsenicoesmuysuperior
alaabsorciondelasinorganicas, aunquenormalmente las concentracionesenlas
plantas son bajas (Moreno-Grau, 2003). EI arsenato y arsenito, al entraral agua
deconsumo humanodesdefuentes naturales, han causado envenenamientos en
paises de America y Asia (Nordstrom, 2002; Ravenscroft et al., 2009). Ademas, en
otros paises se ha reportado contaminacion por arsenico debida a actividades
antropogenicas como la mineria (Smedley y Kinniburgh, 2002)
EI principal aportedeAs a la dieta son losalimentosdeorigen marino, pues los
crustaceosypecesmarinoscomestiblestienenlasconcentracionesmasaltas(0.1
a 90 ~g/g). Sin embargo, el As presente en este tipo de alimentos es organico, el
cualesmenostoxico.La ingestion en elaguade bebida(principaImentearsenico
inorganico) es una importantefuente deexposicion, que puede lIegara ser un
problema grave de saIud pliblica. Esteproblemahasidodescritoenvariospaises,
donde las concentraciones rebasan varias veces el limite maximo permitido
establecido por la OMS para agua de consumo humano. EI ingreso al organismo a
traves del aireysuelo es mucho menor, perc puede lIegara serimportante en
poblacionesaledariasalasfuentesdeemision(PimparkeryBhave,2010).
Pagina6
EI arsenico resulla 16xico para la mayorla de formas de vida (Cullen y Reimer,
1989). Debido a su simililud eslruclural con el fosfalo, el arsenalo ejerce su
loxicidadpordesacoplamienlodelafosforilaci6n oxidaliva, con 10 que inlerrumpe
la slnlesis de ATP. Por su parte, el arsenilo forma fuertes enlaces con grupos
funcionalescomo losgruposliol de los residuosdecislelnae imidazolderesiduos
dehislidinadeprolelnascelulares, molivoporelcualejerceunafuerte inhibicion
enzimalica (Oremland ySlolz, 2003).
Eliodalugaraprocesosdeloxicidadagudaycronica;laingesliondedosis
grandes provoca problemas gaslrointestinales, lraslornos en funciones de
sislemas cardiovascular, nervioso y finalmenle, muerte. Tambien depresion de
medulaosea,hemolisis, hepalomegalia, melanosis,polineuropalfayencefalopalfa
(Boll,2013).
La exposicion cronica se ha relacionado con una variedad de slnlomas de
afeclacionesdermicas como dermalilis exfolialiva, queralosis, vilfligo y cancer de
piel, as! como con neuropalfa periferica, encefalopalfa, bronquilis, fibrosis
pulmonar, hepaloesplenomegalia, hipertension portal, enfermedad vascular
perifericaf'enfermedad del pie negro", aterosclerosis, cancer y diabeles mellilus
(Boll,2013).
Segun informes de la OMS, la exposici6n prolongada al arsenico en el agua
polable esla causalmenle relacionada con un mayor riesgo de cancer en piel,
pulmones, vejiga y rinones, asi como con cambios de la piel (hiperqueralosis y
cambios en la pigmenlacion). A partir de concenlraciones 2: 50 ~g As/L de agua
polablese han observado relacionesde exposici6n-respueslapara U'riavariedad
depalologias, con un riesgo mayordecancerdepulm6nyvejigaydelesionesen
lapiel(Boll,2013).
Pagina7
1.5 CLASIFlCACI6N Y NORMATIVA
En el 2002, el arsenico fue c1asificado por la Agencia Inlernacional para la
Invesligaci6n del Cancer (IARC, por sus siglas en ingles) dEmlro del grupo 1 de
carcinogenicidad. Esla misma descripci6n Ie alribuy6 el programa nacional de
toxicologia de Estados Unidos (NTP, por sus siglas en ingles), y la Agencia de
Protecci6n al Ambiente (EPA, por sus siglas en ingles) 10 c1asific6 en el grupo A,
que corresponde a la clasificaci6n de carcin6geno humane conocido. Ademas,
bajolaautorizaci6ndela Ley del Aire Limpio, la EPAclasificaalarsenicocomoun
contaminanteaereopeligroso, y 10 define como una sustancia quepuedeprovocar
una mortalidad creciente 0 enfermedades serias en seres humanos que hayan
estadoexpuestosa niveles significativos de estecontaminante. En 1986, la EPA
promulg6 las Normas Nacionales para la Emisi6n de Contaminanles Peligrosos en
el Aire, las cuales aplican en 3 cate90rias de fuentes eslacionarias: fabricas de
arsenico, fundidorasprimarias de cobre, yfabricas de manufaclura de vidrio. Sin
embargo, no exisle un eslandar de aire ambiental para el arsenico (ATSDR, 2009)
Elnivel perrnisibledearsenicoen el aguade bebida eslablecidoporla EPAes 10
ppb (nivel maximo conlaminante), valor que igualmente la Organizaci6n Mundial
de la Salud recomienda como crilerio provisional para el agua de bebida. La
Administraci6n de Drogas y Alimentos (FDA) ha eslablecido los niveles de
lolerancia de arsenico presenle en los sUbproduclos de animales que fueron
tratados con medicamentosveterinarios. Estos niveles oscilanenlre las 0.5 ppm
en huevosyen lostejidos comestibles crudosde pollosypavosylas2 ppm en
ciertossubproductoscrudosdecerdos, Losmariscos(especialmenlelgsmoluscos
Y los crustaceos) tienden a concentrarel arsenico disuelloen el aguade mar. Sin
embargo, este esta presente en la forma organica, la cual no produce efectos
adversosenlosconsumidoreshumanos, ademas de que se excrela rapidamente
del cuerpo (ATSDR, 2009).
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1.6 INTERACCI6N CON MICROORGANISMOS
Las bacterias desempeiian un rolfundamentalen laespeciaci6nymovilizaci6ndel
arsenico en el ambiente (Oremland y Stolz, 2005). Esta funci6n resulta favorecida
porsuversatilidadparacrecerendistintoshabitats,puedenocuparnichos
ecol6gicos mes6filosoterm6filos (Inskeep etal., 2007; Quemeneuretal., 2008;
Quemeneur et al., 2010; Rhine et al., 2005), as! como subterraneos subarticos
(donde la temperatura fluctua entre4y 10·C) (Osborne etal., 2010)
Los microorganismosse involucran en elciclodel arsEmico mediante reacciones
de reducci6n, oxidaci6n y metilaci6n (Bhattacha~ee y Rosen, 2007;
Mukhopadhyay et al., 2002; Oremland y Stolz, 2003). Para ello se valen de la
expresi6n de genes especificos que les confieren capacidad de resistir
concentracioneselevadasdelmetaloide,locualsuponeunaventajacon respecto
aaqueliasquecarecendelosmismos(Ehrlich,1997).
Los mecanismos de resistencia hasla hoy descritos estan codificados
geneticamente en micrcorganismos de distintos generos. La reducci6n del
arsenatosehadescritocomoun mecanismo de resistencia bacterianaalarsenico
mediado por la presencia del oper6n arsCBAR, que implica la entrada del As(V) a
la celula poria via del fosfato. Unavezenelcitoplasmaes reducidoaAs(III)porla
arsenito reductasa codificada porel gen arsC, y luego es bombeado fuera de la
celula por proteinas codificadas por los genes arsAB, que se ubican en la
membrana citoplasmatica. Finalmente, el gen arsR cumple una funci6n reguladora
aunque se ha descrito que puede estar ausente en algunas bacteria~reductoras
(XuyRosen,1997).
Otro mecanismo involucra los miembros de la familia de transportadores tipo
Acr3p, que realizan una funci6n similar a arsB, perc no presentan una similitud
significativa en su secuencia por 10 que ha side reportado en especies
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filogeneticamente mas distantes que ArsB. Acr3p puede agruparse en dos
subfamilias en base a sus disimilitudes filogeneticas: Acr3pl y Acr3pll. Ambas
subfamilias han sido descritas en bacteriasdesuelo, perc nose haestablecido
unacorrelaci6nentreelgenotipoyla resistencia a arsenito (Caietal.,2009a).
Por otra parte, se ha descrito la oxidaci6n de arsenito principalmente como un
mecanismo de detoxificaci6n, ya quetransforma elAs (III) ubicado en elexterior
de la membrana celular, a una especie quimica menos t6xica, As (V). Sin
embargo, en losultimosanossehandescritobacteriasquimiolitotr6ficascapaces
deoxidararsenitomediante un mecanismoquepermite laobtenci6n deenergia.
Ensayos in vitro indican que en el proceso se transfieren electrones obtenidos
desdelaoxidaci6ndelarsenitoalacadenatransportadoradeelectrones,donde
se utiliza el oxigeno como aceptorfinal y di6xido de carbono como fuente de
carbono(Salmassi etal., 2005).
Laarsenitooxidasaesunaproteinaperiplasmicaqueseencuentraacopladaala
superficie externa de la membrana interna, esta asociada funcionalmente a la
cadena respiratoria (Ellis etal., 2001) y ha sido descrita en una seria de aislados
pertenecientestantoa Bacteria como Archaea (Cai etal.,2009b).
La oxidaci6n del arsenito a arsenato ocurre a nivel del periplasma bacteriano,
dondeescatalizadaporuna enzimadenominadaarsenito oxidasa, Ia cualexhibe
actividadarsenitooxidanteen presencia de oxigeno, azurinaocitocromo ccomo
aceptores de electrones (Anderson etal., 1992; Ahmann, 1994; Mukhgpadhyay et
al., 2002; Ellisetal., 2001).
Esta enzima es heterodimerica con una subunidad mayor de 88 kDa (-825
aminoacidos) (AoxB) que contiene una Mo-pterina y un grupo 3Fe-4S, y una
subunidad menor de 14 kDa (-135 aminoacidos) (AoxA) que contiene el dominio
PaginalO
Rieske 2Fe-2S (Figura 2). AoxA posee un peptide TAT (Twin-Arginine Transporter)
en el extreme amino terminal como senal para que la proteina heterodimerica
plegada sea transportada del citoplasma al espacio periplasmico (Muller etal.,
2003). ElcofactorMo-pterinacontienedospterinasorientadasuna hacia arriba y
otraabajo, de manerasimilara 10quesehaencontradoenotroscofactoresMo
pterina de la familia de enzimas dimetilslJlf6xido (DMSO) reductasas (Ellis et al.,
2001; Mukhopadhyayetal., 2002).
Figura 2. Estructurayciclocataliticopropuesto para laenzima arsenitooxidasa.Los
pasosson (i) uni6n del arsenito, H,AsO,a laenzima, (ii)transferenciadedoselectrones
al cofactormolibdeno (Mo),(iii) salidadearsenato(H,AsO'),(iv)transferenciadelosdos
electrones del Mo{lV) algrupo 3Fe-4S, (v)transferencia de los doselectrones del grupo
3Fe-4S de 1a subunidad mayor al Rieske 2Fe-2S de la subunidad pequena, y (vi)
transferencia de los electrones del Rieskedela arsenitooxidasa al oxlgeno en la cadena
respiratoria.Traducidode:Mukhopadhyayetal.,2002.
ElciciocataJiticopropuestodelaarsenitooxidasainvolucraelingresodelarsenito
alinteriordelaprotelnaatravesdeunorificioc6nicoenlasuperficiedl!laenzima
(posiblemente coordinado por los residuos His-195, Glu-203, Arg-419 y His-423).
Despues, el arsenito entra en contacto directo por ataque nucleofilico con el
molibdeno (VI) del cofactor Mo-pterina oxidado, 10 queorigina iatransferencia de
doselectrones. Elarsenatoes Iiberadoatravesdelmismoorificiodeentradayel
Paginall
molibdeno es reducido a Mo (IV). Despues, los electrones se transfieren primero al
grupo [3Fe-4S] situadoa unos 1.5 nm dedistancia del MO,dentrodelasubunidad
grande Mo-pterina de la proteina, y despues a un grupo [2Fe-2S] situado en la
subunidad pequena. A partir de ese sitio, los electrones se transfierenalacadena
respiratoria de la membrana interna, posiblemente primero a una azurina 0 un
citocromo y eventualmente al oxigeno, el aceptor terminal de electrones
(Mukhopadhyayetal., 2002; Anderson etal., 1992, Ellis etal., 2001 y Hoke etal.,
2004 citados en: Silvery Phung, 2005).
EIanalisisde lasubunidadmayordelaenzimaarsenitooxidasaporcristalografia
yde lasecuenciaaminoacidica han determinadoque secomponede una seriede
hojas beta y helices alfa que en conjuntodan lugara laexistenciadecuatro
dominios (Figura 3) (Ellis et al., 2001; Quem{meur et al., 2008). Los alineamientos
multiples entre secuencias obtenidas de diferentes especies bacterianas han
mostrado la existencia del motivo C-X2-C-X3-C-X70-S que corresponde al inicio de
dosdeloscuatrodominiosconservados.
Figura 3. Estructuracristalina de la arsenito oxidasa de A. faecalis. Dominios I-IV de
lasubunidadmayorsemuestranencolorazuJ,verde.amarilloynaranjarespectivamente
Lasubunidadmenordecolorrojo.Tomadode:Ellisetaf.. 2001.
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En cepas de Ochrobactrum tritici al igual que en cepas de Herminiimonas
arsenicoxydans, se report61a presencia de todos los genes anteriores dentro del
oper6n aox(Branco eta/., 2009). Ensayos de mutagenesis con el transpos6n Tn5
endichacepa,revelaronqueexistenotrasprotefnasqueparticipan en el control
de la oxidaci6n del arsenito, como son RpoN y DnaJ. RpoN es un factor 0 54
alternativo de la ARN poJimerasa y DnaJ interacciona con la chaperona DNA-K
(Hsp-70-like) y regulan tanto la transcripci6n como la estabilidad del mRNA de aox
o en la conformaci6n de AoxR respectivamente (Koechler et al., 2010). Por ultimo,
rio abajo detodos losgenesanteriores, seencuentra elgen denominado aoxX,el
cual codifica para una protefnaperiplasmicade union a oxianiones. Su expresi6n
esta determinada por arsenito, regula la expresi6n de los genes aoxAB y, por
consecuencia,laactividad arsenito-oxidante(Cai etal., 2009b; Liuetal.,2012).
Laregulaci6ndelaexpresiondeloper6naoxrespondeaseiialesquorumsensing
cuyas particularidadessedesconocen (Kashyap etal., 2006; Lietal., 2013), pero
podrfanconsistirencambiosconformacionalesinducidosporarsenito,comoenel
casodeAgrobacteriumtumefaciens(Zhangetal., 2002).
Se ha demostrado que los genes de este oper6n selocalizanen una sola copia en
los genomas bacterianos, a menudo como parte de islas geneticas con otros
genes de resistencia a arsenico (ars y ACR3 tipos I y II), transporte de fosfato
(operones Pst1) y transporte de fosfonato (operones phn1). Asi mismo se ha
determinadoquelosgenesseencuentranencontexlosgeneticosvariables
(Figura4),yconfrecuenciaformanpartedeplasmidos(Lietal.,2013).
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Las islas de arsenico transferidas por plasmidos son frecuentes en 0
proteobacterias, a menudo en arreglos geneticos conservados, 10 que habla de
procesos de transferencia genetica horizontal de genes (HGT, por sus siglas en
ingles) (Li eta/" 2013). Dentro de estas islas un elemento genetico que pod ria
desemperiar un papel importante en la distribuci6n de genes de resistencia a
compuestosdearsenicoeselintegr6n.
Los integrones son elementos m6viles de ADN que conlienen un gen de inlegrasa
(una recombinasaespecializada) que les pemniteadquiriro inlercambiargenesde
resistenciaatravesdeeventosderecombinaci6nespecificadesitio(intQyunsitio
deintegraci6ndecaseltes(attl)enelqueseintegranlosgenesderesistencia
(principalmenteaantibi6ticos,aunquela resistenciaa arsenicoesunaposibilidad
fehaciente). Un caselte de genescontiene un gen de resistencia, unelemenlode
59pbyunelementocortoinvertidorepetidoconunsitionucleoderecombinaci6n.
Se han descrilo al menos cinco c1ases de integrones cromos6micos y Iigados a
plasmidosenbacteriasGram-negativas.Los Inlegronesclase1 seconsideranlos
mascomunesenlosaisladosclinicosycontienenlosgenesderesistencia a sales
cuaternarias de amenia qacED1 y resislencia a sulfonamida sul1 en la regi6n
conservada3'(Bassetal., 1999; Lietal., 2006).
De todos los genes que integran al oper6n aox, el gen aoxB ha side el mas
estudiado, dado queen su secuencia selocaliza el sitio catalilicode laenzima.
Este gen consta de alrededor de 2,475 nucle6tidos (Ellis et al., 2001). Varias
invesligacionesconcuerdanenqueselraladeungencuyasecuencianucleolidica
esmuyvariable.Lassecuenciasqueconformanelsitiocataliticode la enzima son
las unicas queguardan relaci6n entre distinlas especies, locual ha side
aprovechadoparalabusquedadelgengraciasalavenlajaquelaconslanciade
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estaregi6n otorga (Inskeepatal., 2007; Branco atal., 2009; Escalanteatal.,2009;
Hamamura at a/., 2009; Quemenaur et al., 2006; van Lis at al., 2012). Con base en
los resultados de dichosestudios, se sabe que el gen aoxB: (a) se encuentra en
numerosos microorganismos filogeneticamente dislantes (b) se presenta en
bacterias que provienen de diversos sitios geogn3ficamente aisJados con amplio
rangoen..elniveJdelacontaminaci6nporarsenicoy(c)sepresentayexpresaen
bacteriascon actividadarsenitooxidante (Inskeep atal., 2007).
Eigen aoxBtienelasprincipalescaracteristicasde un marcadormolecular: (i)8e
haencontrado en todas las bacterias aer6bicasarsenito-oxidantesestudiadas
hasta ahora (Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Thiomonas spp.,
Rhizobiumspp., Agrobactarium spp., etc.), (ii) Las regiones conservadas de este
gen,quecorrespondenalsiliocatalfticodelaenzima, hanpermitidoeldiseiiode
cebadores,y(iii) Laregi6n amplificada con dichoscebadoresessuficientemente
grande y cubre las variaciones geneticas dentro del gen, 10 que permite la
discriminaci6nentregruposfilogeneticos.Eslosdatossonalenladoresparaeluso
del gen aoxB como un marcador de resistencia especifico funcional de los
microorganismos arsenito-oxidantes aer6bicos en estudios de diversldad
ambiental (Quemeneuretal., 2006).
Asimismo,se ha demostrado que Josanalisisderelaci6n filogeneticabasadosen
elgen aoxBmuestran de manera generaJ resultados similares a 10soblenidostras
los an<3lisis de secuencias de rADN 168. Esto indica un origen comun de la
enzima arsenito oxidasa presente en microorganismos desde etapas evolutivas
iniciales, aunque es claro tambian que los eventos de HGT han desempeiiado un
papelimportanteenestos procesos(Figura 5) (Quemeneuretal., 2006).
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Las regiones conservadas del gen hicieron posible flanquear fragmentos
especlficosydisenaroligonucle6tidosparaelestudiodelaenzima(Quememeuret
a/., 2008).
Los 0ligonucle6tidos utilizados por Quemeneur eta/., 2008 son: aoxBMl-2F: 5'
CCACTICTGCATCGTGGGNTGYGGNTA y aoxBM3-2R:
TGTCGTIGCCCCAGATGAONCCYTTYTC. Estos se disenaron a partir de nueve
secuencias de protefnas AoxB de las bacterias A. faecalis (No. de acceso
AY297781), H. arsenicoxydans (No. de acceso AF509588), Thiomonas
arsenivorans (No. de acceso EU304260), Agrobacterium tumefaciens (No. de
acceso OQ151549), Rhizobium sp. cepa NT26 (No. de acceso AY345225),
Chloroflexus auran/iacus (No. de acceso NZ_AAAH01000321), Thermus
therrnophilus (No. de acceso NC_000854), las Archaea Aeropyrum pemix (No. de
acceso NC_000854) y Sulfolobus /okodaii (No. de acceso NC_0031 06). Oichos
0ligonucle6tidos f1anquean una region de 1,100 pb en la primera mitad de la
secuencia del gen aoxB. Ello corresponde a la secuencia desde la primera parte
(aminoacidos 22 al 32 en AoxB de H. arsenicoxydans) del motivo CX2CX3CX70S
(CHFCIVGCGYH) necesario para unir el grupo [3Fe-4Sj y el motivo consenso
YEKGIIWGN (aminoacidos 383 al 391) (figura 6) (Quemeneur e/ al., 2008)
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Inskeepycolaboradoresenel2007,reportaronun pardeoligonucleotidos
(AoxBF: GTSGGBTGYGGMTAYCABGYCTA y aoxBR' 5'
TIGTASGCBGGNCGRTIRTGRAT) (Figura 7) que flanquean un fragmento de
500 pbenelprimercuartodelgen aoxBquecodifica lasubunidad Mo-pterinade
laenzimaarsenitooxidasa. Lassecuencias usadasfueron lascepas: Rhizobium
sp. Cepa NT26 (AAR05656), Thermus thermophiJus cepa HB8 (BAD71923),
ChlorofJexus aurantiacus (ZP_00356732), Herminiimonas arsenicoxydans
(ULPAs1) (AAN05581), Alcalligenes faecalis (AAQ19838), Thiomonas sp. Cepa
VB-2002 (CAD53341) YAgrobacterium tumefaciens cepa 5A (ABB51928).
Fi9ura7.AlineamlentodesecuenclasnucleotidicasdesletegenesaoxB,quemuelllra las regiones usadas porlnskeepetal., 2007 paraeldiseiiodeoligonucle6tidos
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2. ANTECEDENTES
EI rio Mololoa se localiza en la region hidrologica No.12 (Lerma-Santiago), cuenca
F,subcuencaCyeselcuerpodeaguamasimportantequepasaporlaciudadde
Tepic, capital del Estadode Nayarit (Figura 8). Nace en lavertientesuryoestedel
volcan Sanganguey a una altitud aproximada de 2,200 metros sobre el nivel del
mar (msnm) y desemboca en el rio Grande Santiago a una elevacion de 265
msnm. Tiene un desarrollo de 70 km aproximadamente, ubicado entre las
coordenadasgeograficas21°33'y21°44'delatitudnortey104°54'y104°58'de
longitud oeste (SEMARNAT, 2002).
Figura 8. Ublcaclon geogrMica del rio Mololoa. Tornado de: SEMARNAT, 2002
ElaguaenlasubcuencadelrioMololoapresentaundeteriorogeneralproductode
laactividadantropogEmicaenestazona. La Regi6n Centro de Nayarit (7.4% de la
superficie total del estado) concentra eI37.26% del total de la poblaci6n en
Nayarit,locualocasionaunfuerteimpactoenelindicedecalidaddel agua del rio
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tras su paso por la ciudad de Tepic. Esto, sumado a la insuficiencia de los
sistemas de tratamiento de aguas residuales, derivan en un marcado deterioro
ecol6gico (Jauregui etal., 2007).
A su paso por la ciudad de Tepic, el rio Mololoa recibe descargas de aguas
residualesprovenientesdelaactividadmunicipal,descargasdetipoindustrial,asi
como provenientesde laactividad pecuaria(Rodriguez etal., 2008). Aunadoa 10
anterior, el rio recibe las aguas de retorno agricola de su cuenca, asi como
lixiviadosdelbasureromunicipal"Ellxtete"(Mondragonetal.,2009),porloquese
considera que potencialmente podria ser afectado en sus aguas y sedimentos
(Rodriguezeta/., 2008).
En la cuenca del rio Mololoa se ha determinado la existencia de arsenico. Esto
puede atribuirse a un aporte natural del entorno, principalmente de origen
volcanico (Gonzalez, 2005; Vivanco eta/., 2010) en concentraciones promediode
10.81 ppm, superioresal contenido promedio de la corteza continental (1.8 ppm)
(Gonzalez, 2005). En consideraci6n a 10 anterior, las aportaciones de arsenico de
origenantropogenicoen lazonadeestudioseriandespreciablesen comparaci6n
a las de origen natural.
Esta problematicageneral hadado lugara que investigacionesefectuadasenel
sitio hayan determinado la presencia de bacterias de importancia medica y
veterinaria como Enterococcus faecalis, E. faecium. E. ga/linarum, E. durans,
Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Pseudomonas
aeruginosa, P. stutzeri, entre otras especies (Mondragon eta/., 2011). En estos
aislados se ha detectado resistencia a arsenico y MP como mercurio, cromo,
cadmio y a antibioticos como kanamicina, ciprofioxacino, gentamicj[1a y beta
lactamicos.
La contaminacion ambiental generada por metales pesados (MP), antibi6ticos y
otros contaminantes contribuye a la permanencia y extension de genes de
resistencia (Gorii-Urriza et a/., 2000). Esto ultimo puede ocurrir mediante
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transferenciahorizonlal(comoeselintercambiodeplasmidos) entre bacterias no
relacionadas en ambientes naturales (Kruse y Sorum, 1994). Ello da lugar ala
existenciade procesos deco-selecci6n, tales como co-resistencia (un organismo
con resistencia a elementos diferentes) y resistencia cruzada (el mismo
determinantegeneticoesresponsabletantodelaresistenciaaantibi6ticoscomoa
metales). Por 10 anterior, este tipo de contaminaci6n representa un proceso de
presi6n selectiva persistente y generalizado que potencialmente contribuye a
mantener y expandir los factores de resistencia (Baker-Austin et al., 2006;
Mondrag6netal., 2011).
En los microorganismos aislados de la zona contaminada del rio Mololoa se
demostr6 ademas la presencia de los genes arsA, B y C (Mondrag6n et al., 2012),
que cuando se expresan en un microorganismo Ie confieren la capacidad de
sobrevivir y proliferar aun en concentraciones elevadas de arsenico (Cai et al.,
2009a). Algunos de ellos resultaron capaces de transferir la caracteristica de
resistenciaalarsenicoacepassensiblespormediodeconjugaci6n (Mondrag6n el
al., 2010; Mondrag6n elal., 2011; Mondrag6n etal.,2012),locualconcuerdacon
estudios previos en cepas de Corynebacterium flaccumfaciens (Hendrick etal.,
1984). Con el conocimiento de este fen6meno, se explica el hecho de que se
encuentren cepas bacterianas con capacidad de resistencia a metales y
antibi6ticos en ambientes nunca antes expuestos de manera directa a estos
contaminantes(Morozzielal.,1986).lnciusosehademostradoquesu presencia
puedeestarcondicionadaporlosgradientesdeconcentraci6nenlas zonas
contaminadas(Quemeneuretal., 2010).
En este estudio, se trabaj6 con 15 cepas obtenidas en investigaciones previas
realizadasenellaboratoriode ResistenciaBacterianade la UnidadAcademica de
Ciencias Quimico Biol6gicas y Farmaceuticas de la Universidad Aut6noma de
Nayarit (Mondrag6n atal., 2009, Mondrag6n etal., 2010, Mondrag6n etal., 2011,
Mondrag6n at al., 2012). Dichas cepas pertenecen a una colecci6n de 300
aislados que fueronobtenidos de tres puntos distintos en la periferiadelrio
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Mololoa. Lasfuentesde colecta fueron las aguas del rfo (R) en las coordenadas
21°32'47.13" latitud norte y 104°53'36.35" longitud oeste, aguas negras (AN)
(21°32'48.23"latitudnortey104°53'43.04"longitudoeste)ylixiviados del basurero
municipal"Ellxtete"de laciudad de Tepic, Nayarit (Lx) (21°33'05.33" latitud norte
Y 104°53'30.65" longitud oeste) (Figura 9).
.P:.A.R...~i.Ei.t.:.. '.~..~.:>....'. ~~. r. 1r /
Rio' .
.\101010' I .1."
~. )
4~.l"Figura 9, Sitios demuestreo. Se muestra el cauce del rio Mololoa (flecha vertical). Se
seJialan los sitios muestreados de donde seaislaron las bacterias arsenito resistentes:
AN: sitio de colecta de las aguas negras, Lx: zona de escurrimiento de lixiviados
provenientesdelconfinamientodebasuraalrlo,R:puntodecolectadeaguasdelcauce
Pagina25
3. JUSTIFICACI6N
Lapresenciadearslmicoenelambienteafectanegativamentelasaludhumanay
alosorganismosqueallfseencuentren.Laexistenciadebacteriasconresistencia
aarsenitoyarsenatoen'elrioMololoasugierelaocurrenciadeun grave problema
decontaminaci6n. Con base en esta situaci6n, se debe visualizar la zonaentera
como un sistema dinamico con alta movilidad de elementos en el cual todos los
organismos vivos son susceptibles de padecer los efectos adversos de estes
contaminantes, 10 que representa un serio problema de salud pubIicayambiental.
Por ello, resulta pertinente la generaci6n de conocimiento acerca de los
mecanismosbiol6gicos porloscuales lasbacterias han adquiridoydesarrollado
capacidad de resistencia, dado que poseen potencial para ser aplicados como
biorremediadoresentareasqueconsiderenelsaneamientoyrescatedel cauce.
Enestesentido, lapresenteinvestigaci6n buscolaidentificacionyan<\lisisdelgen
aoxB en bacterias aisladas del lugar bajo la premisa de que dicho gen es
responsabledelfenotipoarsenito-resistente.
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4. HIPOTESIS
Lasproteobacterias resistentes a arsElnicoaisladas del rio Mololoa poseenelgen
aoxB, hom6logoalasseeueneiasyareportadas.
5. OBJETIVO GENERAL
Identificar y analizar las seeuencias del gen aoxB en una eoleeei6n de
proteobaeteriasresistentesaarsenieo.
5.1 OBJETIVOS ESPECfFICOS
~ Identifiear la presencia del gen aoxBen proteobaeterias arsenito-resistentes
~ Seeueneiar losproduetos amplifieados porlos eebadores para el gen aoxB
~ Analizar las secueneias obtenidas con las reportadas en las bases de datos
paradetermlnarelgradodesimilitud
6. MATERIALES YMETODOS
6.1 MATERIAL BIOL6GICO
En esta investigaci6nseestudiaron 14 eepas de las reportadas con earaeterlstieas
fenotlpieas y genotlpicas de resisteneia tanto a arsenato como -<i arsenito
(Mondrag6netal., 2012). Laidentificaei6nbaeterianadeestosaisladosserealiz6
por el sistema automatizado MieroSeanGll (Cuadro 3) (Mondragon et al., 2009;
Rodriguez, 2010).
P~gina 27
Cuadro 3. IdentlflcacI6n y sltlos de alslamlento de las especles bacterlanasutlllzadasenesteestudio.
Cepa I Especie I ai~~:i:~IO I Cepa
IEspecie I ai~::i:~to
~ Enl&robacI&rclo8c88 R C20 KJebsielfapneumonia AN
C5 Enl&rob8cl&rsp R C2l Actinobacillusurese Lx
C8 Achromobactersp R C23 Escherichia coli AN
Cl0 Ent8rob8cl&rsp R C8l KJebsiellapneumonise AN
C12 Klebsieflapneumonis9 R C95 KJebsiellapneumonlse R
C14 KI8bsi8118oxyloc8 R C97 Klebsiallspneumonise AN
C16 EntsfObacf8rssrogenes R C123 K/ebsiallaoxytoca AN
C19 KJebsiaJlapneUtnonise AN
EI numero de cepa es el aSlgnado en la colecclon de respaldo del Laboralorlo de
Resistencia Bacteriana (AN: Aguas Negras, Lx: Lixiviados del basurero municipal "EI
lx1ete'yR: Agua corrienle del rio).
Para el crecimiento y mantenimiento de las cepas se tomaron muestras a partir del
stockcongeladocon puntilla esteril, secrecieron en 3.0 mL de caldo Luria Bertani
(LB, marca DifcolP) a37'C con agitaci6n constante por18 horasyse inocularon
en agar nutritivo con NaAS02 3 mM para corroborar que se tratara de cultivos
axenicos. Para su conservaci6n se tomaron colonias aisladas, se crecieron y
mantuvieronencaldoLBcon20%glicerola-20·Chastasuuso.
6.3 ESTRATEGIA DE TRABAJO
5e realizaron pruebas fenotipicas consistentes en la evaluaci6n de la
Concentraci6n Minima Inhibitoria (CMI) en placas de agar nutritivo, Y"capacidad
arsenito-oxidante conel metodo de AgN03 (Figura 10) (Brancoetal., 2009).
Pagina28
P",ebasfeno!fpicas
~:iJ
~~~~.~
+
~
Ensayos de blologia molecular
[lapauno Etapados
Figura 10. Esquema de la estrategia experimental utilizadaenesteestudlo.
6.3.1 PRUEBAS FENOTiPICAS Y EXTRACCI6N DE ADN
a) PRUEBAS DE CONCENTRACI6N MiNIMA INHIBlTORIA (CMI)
La concentraci6n minima inhibitoria (CMI) es la concentraci6n mas baja de un
compuestoque inhibeelcrecimientovisiblede un microorganismo despuesde su
incubaci6n (Madigan ef al., 2004). Mediante esta prueba se evalu6 el fenotipo
arsenito-resistentedelas 15 cepas en estudioentenminoscuantitativos.
Cada una de las cepas fue cultivada en caldo Luria Bertani (LB) adicionado con
NaAs023 mM a 37·C por 18 h de incubaci6n con agitaci6n constante a 125 rpm
(Incubator Digital Microprocessor Model 10-140E QuincyLab~. Se prepararon
cajas de agar nutritivo adicionadas con arsenito de sodio (NaAs02) a las
siguientes concentraciones: 0 (control), 2, 6,10,11,12,13,14 Y 15 mM. Cada
cajafue inoculada can 10 ~L del cultivo en caldo previamente descrito-{crecido a
una densidad 6ptica de 0.7) de cada una de las 15cepas (dilucionesprevias1:100
en LB esteril) con la ayuda de plantillas (Figura 11) y se incubaron a 37·C
durante24horas.
PaginaZ9
~:4
5 I; 7
8
Flgura11.PlanllllaempleadaenlalecnicadeCMI.Secolocadebajodelacajadeagar
nutritivocomoreferenciaalinocular, para 10 cual se aprovecha latransparenciadel medio
b) PRUEBA DE CAPACIDADARSENITO-OXIDANTE
Esta prueba se realizo con lafinalidad de evaluar la capacidadde Iascepasde
estudio para oxidar el arsenito a arsenato. Para ello, se empleo el metodo de
AgN03 descrito por Branco et a/., 2009, el cual se detalla a continuacion: se
sembraron las cepas en caldo nutritivo esteril con NaAs02 3 mM y se crecieron
hasta una DOdeO.7a 37·C a 125 rpmyse inocularon 10 ilL de cada cultivoen
piacas de agar nutritivo con NaAs02 3 mM. se incubaron 24 horas a 37 ·C Y se
embebieron de forma homogenea con 1 mL de solucion 0.1 M de AgN03, se
incubaron porotras24 horas a 37 ·Cyse retiraron de la estufa paravisualizarel
resultado. Un colormarron revelo la presencia de arsenato, mientras un colorpaja
indico que el arsenito no se oxido. Como controles se prepararon cajas con
NaAs023 mM y AgN030.1 M sin inoculo bacteriano y cajas con NaAs02 3 mM sin
AgN03coninoculo.
c) ANALISIS DE RESULTADOS
Losresultadosdelaspruebasfenotlpicasfueronanalizadosmediantelaspruebas
de Kruskal-WallisYX2, para locualse utilizoel programastata!>version 8.1 yel
analizador de datos PSPP version 0.7.8 B20110902 de IBM!>, respectivamente. Se
evaluaron las variables: sitiodeaislamientoyactividad arsenito-oxidante, sitiode
Pagina30
aislamientoyCMI, sitio de aislamientoyespecie yactividad arsenito-oxidantey
grade de resistencia, respectivamente. Para las evaluaciones se fij6 un nivel de
significanciaP(a)deO.05.
d) EXTRACCION DE ADN BACTERIANO
Serealiz61aextracci6ndeADNtotaibacterianodetodasiascepasporelmetodo
dechoquetermico, descritoacontinuaci6n. En un tubo eppendorfde 1.5mL,se
colocaron 50 ~L de agua inyectable, se agreg6 una asada de tres colonias
aisladasyse agit6en v6rtex. Lamuestrasemantuvoa96·Cpordiezminutos,
seguido de cinco minutos a -20·C (se repitieron ambos pasos dos veces).
Posteriormente, se centritug6durantetresminutos a 12,000 rpm yserecuper6el
sobrenadante. Se hizo una diluci6n 1:10, y se almacen6 a -20·C hasta su uso.
Para la realizaci6n de las pruebas de PCR se trabaj6 con grupos de ADN de 3
cepasalavez.
6.3.2 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Las cepas que mostraron tenotipo de oxidaci6n del arsenito, se usaron en la
busqueda del gen aoxB como respuesta genotipica del comportamiento. Con base
en 10 anterior,selIevaron a cabo losensayosde biologia molecularconsistentes
especificamenteen pruebasde PCR, con unaestrategia planteadaen dosetapas
(Figura 10). Elcuadro4muestra los oligonucle6tidosempleados para tal efectoy
eltamanodelosfragmentosesperados.
Pagina31
Cuadro4.Caracterlstlcas de los ollgonucle6tldos empleados enestalnvestigacl6n.
Ollgonucle6tldo I
,ADN16SpH'
I
-1.5kpb
I Refe,encl.
Inskeep at
a/., 2007
Comprendi6 las pruebas de PCR enfocadas a la identificaci6n directa del gen
aoxBmedianteelusodedosdistintosparesdeoligonucle6tidos:
a) Empleo de los Oligonucleotidos disenados por Inskeep et al., 2007 "
Se evalu6 la presencia del gen aoxB por PCR, para 10 cual se emplearon los
oligonucleotidos disenados por Inskeep et a/., 2007. Cada reaccion de PCR
conten!a en un volumen final de 25 ).lL: 3).lL de ADN de 3 cepas distintas (1ul
P~gina 32
Icepa), 2.5 J.Ll de buffer 10X (Tris-HCI10 mM pH 8 Y KCI50 mM), 2 III de MgCI2
25 mM, 2 III de dNTP's 2.5 mM, 0.1 III de Taq polimerasa Invitrogen~ (5UI Ill) Y
2.5 fLLde cada iniciadoren unaconcentraci6n de 10pM, ajustadosa25 fLLcon
aguadestiladadesionizadaesteril(H20dde).
Las condiciones en que estas pruebas se realizaron comprendieron a) un cicio
inicial de desnaturalizaci6n de 4 min a 95·C b) 9 ciclos de: 45 segundos de
desnaturalizaci6n a95·C,45segundosdehibridaci6na50·C,y50segundosde
extensi6n a 72 ·C,seguidosde c) 25 cicloscon 45segundos dedesnaturalizaci6n
a95·C,45segundosdehibridaci6n a46·Cy50segundosdeextensi6n a 72·C,
conunpasofinalded)extensi6nde5minutosa72·Cquedisminuy6a4·Chasta
quelostubostueronretiradosdeltermociclador(eppendorfll'AG22331 Hamburg).
b) Empleo de los Oligonucle6tidos disenados par Quemeneur et al., 2008
Se realizaron ensayosde PCR con empleode losoligonucle6tidos disenados por
Quemeneureta/., 2008. Elvolumenfinaldecadareacci6n (preparadasentubos
eppendorfll' de 0.2 ml) tue de 25 fLL: 3 III de ADN de 3 cepas (1 fLUcepa), 2.5 J.1l
de buffer 10X de la Taq polimerasa (Tri~-HCI10 mM pH 8 Y KCI50 mM), 2 III de
MgCI2 25 mM, 2 III de dNTP's (Invitrogen~) 2.5 mM, 0.1 III de Taq polimerasa
Invitrogen~(5 Ullll)y2.5 IlLdecada iniciador10 pM, ajustadosa 25 ilL con agua
destilada desionizadaesteril (H20dde).
las condiciones de temperatura en que se lIevaron a cabo las pruebas de PCR
constaron de4minutosa95 ·C, seguidosde 35ciclos de45segundos a 95 ·C,
45 segundos a 52·C Y 1 minuto y diez segundos a 72 ·C, seguidgl> de una
extensi6n final de 72 ·C por5 minutos, parafinalmente bajara4·C hasta retirar
lostubosdeltermociclador.
Los productos de amplificaci6n se corrie ron en geles de agarosa al1 % en TAE a
100 V durante 90 min en camara de electrotoresis Thermo Scientific 240616~ con
Pagina33
utilizaci6n de TAE 1X como buffer y el marcador de peso molecular de 1 Kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen~). Las muestras se corrieron en volumenes de 15 ~L
mezclados can 1.5 ~L de Nucleic Acid Sample Loading Buffer4!l 5X de BioRada!> y
visualizadas en un transiluminador de luz UV BENCHTOP UV 011810-001a!> can
previa tinci6n can bromuro de etidio (0.5 ~g/mL). Tras su visualizaci6n la imagen
delgelfuedigitalizadaparaefectosdearchivoconelequipofotograficopropiodel
transiluminador. Como control de las pruebas de PCR se amplific6 el gen arsC en
el ADN de la cepa E. coli C23, que form6 parte del grupo de prueba de este
estudioycuya posesi6n de genes arssedetermin6 enestudios previos
(Mondrag6netal.,2012).
Losampliconesgeneradostraslaamplificaci6nfueroncortadosdeIgeldeagarosa
can ayuda de una espatula. EI amplic6n se purific6de acuerdoal procedimiento
del High Pure PCR Product Purification Kita!> de Rochea!> en base a las instrucciones
delfabricante. Laconcentraci6n de los amplicones purificados sedetermin6 en el
analizadorBioteka!>enlamodalidadTake3a!>paraposteriormentesersecuenciados
en la unidad UBIPRO de la Escuela de Estudios Superiores de Iztacala (UNAM)
a) BUSQUEDA DEL GEN aoxB EN INTEGRONES CLASE I
Estaspruebassellevaron a cabo can base en elsiguiente razonamiento:sielgen
aoxBsesitua dentrode una secuencia integr6nica, suamplificaci6nseriaposible
can los 0ligonucle6tidos dirigidos a dicho gen en combinaci6n can los que se
aparean can regiones constantes conservadas del integr6n. La hip6te~~s anterior
se esquematiza en la Figura 12:
Pagina34
Figura 12. Planteamlento de las pruebas de PCR reallzadas con
ollgonucle6tldosdirlgidosalassecuenciasconservadas/nt/1 yqacEDdelintegr6n
Claselencombinacl6nconlosoligonucle6tldosparaelgenaoxB.
Deacuerdoalplanteamiento referidoseutilizaron los 0ligonucle6tidos de Inskeep
et al., 2007 y Quemeneur at al., 2008 en combinaci6n con los dirigidos a la
integrasatipolylaregi6nderesistenciaacompuestoscuaternariosdeamoniode
secuencias integronicas (Liata/., 2006; Bassetal., 1999). Loanteriorserealizo
con el fin de determinar la presencia del gen como parte de la estructura de
Integronesclase1,demanerasimilaraloquesehareportadoconlos genes del
operon mar (Bass at al., 1999), los cuales se pueden encontrar en regiones
geneticasinmediatasalntegronesdentrodeuntransposon,como Tn21 (Liebert at
al., 1999).
Se utilizo el oligonucleotido Intl1 Fw (Li at al., 2006) y el oligonucleotido qacED1 R
descritosporBassatal., 1999 en combinacion con losoligonucleotidosdirigidosal
genaoxB. Esto con elfin de obtenerfragmentosque brindaran infomnacion acerca
de la presencia del gen aoxB, as! como de su contexte genetico dentro del
Integron Clasel.
Seevaluarondistintascondicionesdetemperaturadealineamientoconobjetode
ampliarlasprobabilidadesdeexitoenlaamplificaciondealgunfragmento:a) las
condiciones iniciales constaron de 4 minutos de desnaturalizacion a 94 'C,
seguidos de b) 35 ciclos de 40 segundos de desnaturalizacion a 94 'C, 40
Pagina35
segundos de alineamiento a 57·C Y 3 minutos de extensi6n a 72 ·C, can una
extensi6n final de c) 5 minutos a 72 ·C, hasta descender a 4 'C hasta que los
tubosseretirarondeltermociclador. Otras condiciones constaron de un gradiente
detemperaturadealineamientodesde55a62 ·C, ademasdequese realizaron
pruebas can rampa, las cuales consistieron.en a) una temperatura inicial de
desnaturalizaci6n a 94·C par 4 minutos, seguidos de b) 5 ciclosde 1 minutode
desnaturalizaci6n a 94 ·C, 1 minuto de alineamiento a 56 ·C Y 2 minutos de
extensi6na72·C,quedeahlpas6ac)35ciclosde 1 minutodedesnaturalizaci6n
a 94 ·C, 1 minuta de alineamiento a 58 ·C Y 2 minutos de extensi6n a 72 ·C (a
pesarde desconocerse el tamaiio de fragmento, se fijaron 2 minutos, uno par
cada mil pb), can extensi6n final de d) 4 minutos a 72 ·C que finalmente disminuy6
a4·Chastaretirarlostubosdeltermociclador.
b) SELECCI6N DE CEPAS PARA ANALISIS DE rADN 16S
Seseleccionaroncuatrocepasparadeterminarsuespeciemedianteelanalisisde
sus secuencias de rADN 16S. Las cepas seleccionadas se habian identificado
previamente par MicroScan<'ll como E. cloacae C4, K. pneumoniae C12, E.
aerogenes C16, y K. pneumoniae C81. Estas presentaron actividad arsenito
oxidante y los valores mas elevados de CMI de AslIl, par 10 cual se aislaron en
media s61ido y se les extrajo ADN total mediante el empleo del kit ZR
FungaI/BacteriaIDNAMiniprep<'ll.
c) ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN RIBOSOMAL 16S
Se utilizaron los 0ligonucle6tidos pAy pH*publicados par Hutson etal., 1993. La
concentraci6n final de cada reactivofue: buffer de laTaq polimerasa (Invitrogen<'ll)
1X, MgC121.5 mM, dNTP's mix 0.2 mM, oligo pA 0.5 mM, oligo pH 0.5 mM, Taq
polimerasa (Invitrogen<'ll) 0.03 U/~L, templado de ADN 1 ng/~L y el resto fue
completadoconaguainyectableparaunvolumenfinalde25~L.
Pagina36
Las condiciones en que se lIevaron a cabo las reacciones constaron de a) 95·C
porcuatrominutosseguidosde b) 35 ciclosde94·C por45 segundos, 56·C por
45 segundos y 72·C por un minuto con una extensi6n final de c) 72·C por5
minutos, para finalmente disminuir a 4 ·C hasta que los tubos fueron retin~dos. EI
fragmentoesperadoeradealrededorde1.6kb,yunavezobtenidoslospraductos
amplificados se enviaron a la empresa Macrogen en Seul, Corea del Sur para su
secuenciaci6n.
Unavezrecibidoslos resultados de lasecuenciaci6n,fueronanalizadosytratados
coneiprogramaChromasversi6n 2.4.1 GI> para ladepuraci6ndeexlremoserr6neos
con base en los ferogramas recibidos. Las secuencias anotadas fueron
comparadas de acuerdo al BlastN de la base de datos del NCBI en los seis
marcosabiertosdelectura(hllp:llblasl.ncbi.nlm.nih.gov/Blasl.cgi).
7. RESULTADOS YDISCUSION
Enesta investigaci6n setrabaj6 un total de 14 proteobacterias confenotipo
resistentea arsenito. Estacaracteristicatambien hasido reportadaen cepasdel
genero Pseudomonas, elcual pertenecea lasproteobacterias, perose ubicaen
una unidad taxon6micamente distinta a las enterobacterias, la familia
Pseudomonadaceae (Quemeneur et al., 2008; Cai et al., 2009b; Heinrich
Salmeron etal., 2011). Loanteriorsecorrespondeconelhechodequelainmensa
mayoria de las bacterias arsenito oxidantes aisladas de sitios"mes6filos
pertenecen al phylum Proteobacteria (Quemeneuretal., 2008).
7.1 eONCENTRACI6N MfNIMA INillBITORIA (eMI)
Pagina37
Los resultados de esta prueba mostraron que losvalores de CMI de arsenito de
sodio (NaAs02) en las cepas de estudio se encuentran entre 2 y 15 mM (Cuadro
5); las 15 cepas crecieron en As(lIl) 2mM, mientras que de las mismas 15 s610
doce crecieron en As(lIl) 6mM, de las cuales nueve en As(llI) 10mM y seis en
As(llI) 12mM, tres en As(lIl) 14 mM y de estas tres, unicamente dos en As(lIl) 15
mM. Las cepas E. coli C23 y. K. pneumoniae C81 resultaron ser las mas
resistentesaarsenitodesodioentodoelgrupodeprueba(Figura13).
Cuadro6.ResultadosdelaspruebasdeCMldearsenitoyactividadarsenlto-oxidante.
ISlllOdol CMldolalslamlento arsenlto
C4
C5
C8
Cl0
C12
C14
C19 KJebsiellapneumoniae
C20 KJebsieJ/apneumoniae
C21 Lx
C23 AN
C95
C97 KI.bsl.lI.pn.umonl••
C123 KJ.bsl.llaoxytoca AN
arsenlto
oxidants
(AN. Aguas Negras, Lx. Llxlvlados del basurero mUnicipal "Ellxtete",R: Aguacorrientedel rfo). EI numerodecepaeselasignadoen lacolecci6n.
Pagina38
B cFigura 13. PruebasdeCMI dearsenito realizadas a las 15cepasdeestudio.Circulos
en amarillo senalan los in6culos que dejaronde presentarcrecimientoconformeaument6
la concentraci6n de arsenito. A) 2 mM, B) 6 Mm y C) 10mM. Los ensayos se efecluaron
portriplicado
Las cepas con actividad arsenito-oxidante (Figura 14) fueron: E. cloacae C4,
Enterobacter sp. C5, Enterobacter sp. C10, K. pneumoniae C12, E. aerogenes
C16, K. pneumoniae C20, K. pneumoniae C81 y K. pneumoniae C95 (Cuadra 5).
Se realiz6 un an<llisis de Kruskal-Wallis para establecersi haydiferencia en la
capacidad de resistencia entre las bacterias arsenito-oxidantesylasque no 10 son.
Seencontr6quehaydiferenciaestadisticamentesignificativa (p=O.0177) entre los
grupos.Estosugierequepudierahaberunarelaci6nfenotipicaenlacualla
actividadarsenito-oxidanteestaimplicadaenlacapacidadderesistenciaaIAs(III).
Figura 14. Cultivos con NaAsO, y AgNO, para evaluar actividad arsenito-oxidante.
Lacoloraci6n cafe de los in6culos indica laconversi6ndearsenitoaarsenato
Pagina39
Por otro lado, las cepas que alcanzaron un nivel de resistencia ~ 10 mM (E.
cloacae C4, E. sp. C5, E. sp. C10, K. pneumoniae C12, E. aerogenes C16, K.
pneumoniae C20, E. coli C23, K. pneumoniae C81 y K. pneumoniae C95)
presentarontambilm actividadarsenito-oxidante, conexcepci6ndelacepaE. coli
C23.
La implicaci6n de la actividad arsenito-oxidanteen elfenotipo arsenito-resistente
observado en este estudio concuerda con los resultados descritos en H.
arsenieoxydans cepa ULPAs1 ....80X8, la cual disminuye su capacidad de resistencia
al arsenito de 5 mM a 2.66 mM debido al silenciamiento de aoxB con un
transposonreporterobasadoenlaeZ(Mulieretal.,2003).
Lacapacidaddeoxidarelarsenitoaarsenatonoescondici6nesencialparaque
sepresenteresistenciaaelevadasconcentracionesdearsenico,dadoqueexisten
cepasque no oxidan nireducen alarsenito, ni loconvierten en arsenicales
organicos (PhillipsyTaylor, 1976). Estoscomportamientostienen lugargraciasa
sistemas transmembranales expulsores de arsenito que no involucran cambio
algunodel estado de oxidaci6n, tales como los productosde laexpresi6n de los
genes A y B del oper6n ars (Dey y Rosen, 1995; Saltikov y Olson, 2002; Ord6nez
etal.,2005),aslcomolostransportadoresAcr3ptipo Iyll (Rosen, 1999; Caieta/.,
2009a).
En el caso particular de la cepa E. coli C23, que al igual que la cepa K.
pneumoniae C81 present6 el maximo valor de resistencia al arsenito (15 mM) perc
no mostr6 actividad de arsenito-oxidasa, la resistencia puede atribuirse a la
presencia previamente determinada de los genes arsABC (Mondrag6n et al.,
2012). Sin embargo, estevalormaximoseencuentrapordebajoalreportadopor
Butt y Rehman, 2011, para la cepa K. pneumoniae y K. variieola resistentes a
concentraciones26y24mM de arsenito respectivamentecon resultadopositivoa
lapruebadedeterminaci6ndeactividadarsenitooxidantedeAgN03.
Pagina40
Tras realizar las pruebas de x2, no se encontr6 evidencia estadistica significativa
de que la actividad arsenito oxidante.los valores de CMI 0 la predominancia de
alguna especie en particular tengan alguna variaci6n conforme al sitio de
aislamiento (X2C8IcuI8d8= 3,62 < X2'8b18= 5,99, X2colcul8d8= 12,50 < X2'8b18= 18,31 Y
X2COICUI8d8=21,98<X2'8bI8=23,68.respectivamente),
7.3 IDENTIFICACI6N DEL GEN noxB
7,3,1 BUSQUEDA DEL GEN CON LOS OLIGONUCLE6TIDOSDESCRITOS POR INSKEEP et aI" 2007
Las pruebas de PCR lIevadas a cabo con este par de 0ligonucle6tidos en las
condicionesdescritas por Inskeep etal.. 2007 no resultaron en Iaamplificaci6nde
algunfragmento.PorelioserealizQunaseriedemodificacionesconlafinalidadde
favorecer la amplificaci6n. Dichos cambios consistieron en la realizaci6n de
pruebas con gradiente de MgCI2 y uso de DMSO al 0,5 %. variaci6n de las
temperaturasdealineamiento(48,50. y52'C). ademasde que seIIev6acaboun
gradiente de temperatura de alineamiento desde48 hasta62 °C,
Estas modificaciones dieron lugar a la amplificaci6n de un fragmento de
aproximadamente1.900pbquesegener6contemperaturasdealineamientoque
fueron desde los 52 'c hasta los 65 'c (Figura 15) y que fue persistente aun
cuando se utilizaron templados distintos de ADN, Sin embargo. cuando se someti6
a reamplificaci6nya nose obtuvo, Esta consideraci6n aunada a ladiferenciade
tamano con el fragmento esperado. el resultado se consider6 un art~cio de la
peR,
Pagina41
Figura 16. Electroforesls en gel de agarosa de los productosamplificadosporPCR
con ADN de la cepa 16. Carril 1: marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA
Ladder. Carril2: Banda de 1.9 kbgenerada a60"C. Carril3: Banda de 1.9 kb generada a
62"C.Carril4:Bandadel.9kbgeneradaa6S"C
7.3.2 BUSQUEDA DEL GEN CON UTILlZACI6N DE LOSOLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS POR QutMtNEUR et al., 2008.
las condiciones de PCR descritas en la metodologia para este par de
oligonucleotidos nodieron lugara la amplificacion de fragmentoalguno. Porello,
al igual que con el paranteriordeoligonucle6tidos, se realizaron modificaciones
en las pruebas con elfin depropiciarelalineamiento. loscambios consistieronen
la realizacion de curvas de MgCI2 (1, 1.25, 1.5,2 Y2.5 mM), uso de Taq Platinuml!>
y uso del kit Platinuml!> Blue PCR Super Mix, con las temperaturas de
alineamiento:48,52,54,56,58y62 "C.
En las pruebas de PCR donde se empleo el kit Platinuml!> Blue PCR Super Mix no
seobtuvobandeoalguno. En las realizadas de manera convencional a58 "C con
aumento en la cantidad de Taq Platinuml!> de 1 U a 2 U por cada 50 III de
reaccion en el grupo de ADN de las cepas E. cloacae C4, E. sp. C5 Y A. sp. C8
comotemplado, seobtuvieron productos con tamaliosde menosde 100, 470y
670 pb aproximadamente (Figura 16A). Estas bandas fueron eldraidas y
purificadas del gel de agarosa mediante el empleo del kit High Pure PCR Product
Purification Kit~de Roche~(Figura 16B) y posteriormente reamplificadas por PCR
en las mismas condiciones, donde resulto amplificada solo Ja banda de
aproximadamente 670 pb (Figura 16C).
Pagina42
~...•Figura 16: Corrlmlento electroforetlco en geles de agarosa al 1% en TAE. A: Carril 1:marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA Ladder. Carril 2: Bandas de 100, 470Y 670 pb aproximadamente amplificadas con los 0ligonucle6tidos de Quememeur et al.,2008; B: Carril 1: marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA Ladder. Carril 2Purificaci6n del ADN de la banda de 470 pb. Carril 3: Purificaci6n del ADN de la banda de
670 pb; C: Carril unico: Reamplificaci6n por PCR de la banda de 670 pb.
Como resultado de la secuenciaci6n del producto amplificado por PCR de
aproximadamente670pbse obtuvo una secuenciade 640 pb. Dicha secuenciase
convirti6 a secuencia de aminoacidos con el programa ClustalW y se compar6 con
las reportadas en la base de datos Non-redundant protein sequences del NeSII!>.
EI porcentaje maximo de identidad fue de 80 % con un e-value de 2·1Q-27 y un
coverage de 30 % para un dominic de corte/metHaci6n N-terminal de una proteina
tipo prepilina de Enterobacter cloacae subespecie NCTC 9394 Y en menor grado
conotrassecuenciasafines(Figura17).
Figura 17. Resultado del BLASTpl!> entre la secuencla de amlnoacldos obtenlda de lasecuenclade640 pby las secuenclas reportadasen la base de datos Non·redundant protein sequences del NCBI. Analisis realizado con la secuencia ORF-1. EIanalisisdelasecuenciaORF-2indicarelaci6nconlamismaproteina.
Pagina43
Estasecuencia(640pb)sealine6medianteelusodelprogramaClustalW2conia
secuencia reportadaporCaietal.• 2009b para elgen aoxB(subunidadMo-pterina,
827 aa) de 2484 nucle6tidos en Achromobacter sp. Cepa SY8 (Numero de acceso
NCBI: ABP63660.1. GI: 145321)85) y mostr6 escasas regiones cortas con un
minimogrado de conseIVaci6n a 10 largo de los 2484 nucle6tidosde lasecuencia
con lacualsecompar6. Lasecuenciaempleadacomo referenciafueelegidapor
suhomologiaconlamayorladesecuenciasreportadasparaaoxB.
Dada la escasa identidad entre fa secuencia obtenida y la secuencia aoxB usada
comoreferenciaparaelalineamiento, la fa Ita de relaci6n estructuralymetab6lica
de la proteina tipo prepilina con la enzima arsenito oxidasa y fa diferencia de
tamano entre el fragmento obtenido (640 pb) Y el esperado al emplear los
0ligonucle6tidos descritos por Quememeur etal., 2008 (1,100 Pb),sepudoafirmar
queelbandeoobtenidoen la PCRcareciaderelaci6n consecuenciastipo aoxBo
relacionadas.
Aun cuando las evidencias fenotipicas de resistencia a arsenito, arsenato y
actividad arsenito-oxidante en las cepas de estudio sugieren Iaexistenciadela
enzima arsenito oxidasa, no se identific6 el gen aoxB con los 0ligonucle6tidos
reportados para tal prop6sito. Sin embargo, existen reportes de cepas arsenito
oxidantes en cuyo genoma no se encontraron los genes aoxB, como las cepas
arsenito oxidantes Alkalilimnico/a ehrlichii-MLHE-1 y Azoarcus sp. DA01 (Rhine et
aI., 2007). En base a ello, se sugiri6 que la capacidad arsenito oxidante de A.
ehrlichiise debra probablemente a la presencia de una proteina semejante a la
arsenato reductasa respiratoria (ArrA) (Hoeft et aI., 2007). Se propon:. que ArrA
presentacapacidadoxidadoraatravesdeunflujodeelectronesreverso,cualidad
opuestaa la forma conocida. Posteriormenle, Kulpetal., 2008 report6 unaislado
con capacidad arsenito-oxidante en ausencia del gen aoxB y atribuye la funci6n
oxidadora a ArrA, ya que obtuvo un amplic6n con un -68 % de identidad a fa
secuenciadesugencorrespondientedescritoenA.ehrlichii.
Pagina44
Otraevidenciade mecanismosdeoxidaci6n ajenosa la presencia del gen aoxB
esla reportadaenA. ehrlichiicepa MLHE·1 porZargaretal., 2010, quien identific6
un"nuevo"tipodearsenitooxidasaconmayorrelaci6nfilogeneticaalasenzimas
arsenato reductasas respiratorias ArrAB que a las arsenito oxidasas AoxAB, cuyos
genes inicialmente denomin6 mlg_0216 y posleriormente JJf)cA. La identificaci6n
deestosgenescomounaarsenitooxidasaalternalivaabri6nuevasposibilidades
para reexaminarporqueciertascepasarsenilooxidanles han eludidoladetecci6n
porPCRdearsenitooxidasastipoaoxB(Zargaretal.,2010).
Los analisisfilogenelicos de lassecuencias nucleotidicasdedichooper6n
confirman que pertenecen a un grupo de arsenito oxidasas dislinto de AoxAB y
ArrAB dentro de la misma familia de enzimas DMSO reductasas, y se cree que
podrianhaberestadosujetasaprocesosdetransferenciagenelicahorizontal
(Zargaretal., 2012).
Parala oxidaci6n del arsenito en condicionesan6xicas las bacleriashanacoplado
tanto la reducci6n como oxidaci6n de compuestos de arsenico para su
supervivenciayla conservaci6n de energiaycrecimiento'(Zargar etal., 2010). No
obstante, el desarrollo de tales mecanismos podria estar Iimitado a condiciones
especificas como una medida adaptaliva en ese grupo de microorganismos en
particular.
Resulta improbable que la falta de amplificaci6n en las pruebas de PCR sea
consecuencia de variaciones en lasecuenciagenelicadel gen aoxB. Aun cuando
lassecuencias codificantes han estado sujetas a variacionescomounarespuesla
a las condiciones del entorno,existeun gradovariablede conservaci6nentre
diferentesespecies(38.4a96.8%deidentidadsegunresulladosdeQoemEmeur
at al., 2008; resultados de: Santini y Vanden Hoven, 2004, Inskeep el al., 2007,
Branco elal., 2009, Cai elal., 2009b, Clingenpeel etal., 2009y Osborne elal.,
2013manejanporcentajesdeidentidaddenlrodeesterango).
Polgina45
La aseveraci6n de que la falla de amplificaci6n no obedece avariaciones en la
secuencia de aoxB se robuslece si ademas del grade de conservaci6n se
considera queel primerselde oligonucleotidos empleadoen esta investigaci6n
(publicadoporlnskeepatal.,2007)fuediseiiadodadalaconservaci6nde
secuenciasespeclficasde aoxBcon diferenciaci6n de losdemas miembrosde la
familia DMSO reduclasas, y que el segundo sel utilizado (publicados por
Quemeneur at al., 2008) fue probado en el mismo esludio en ensayos de PCR con
ADN de 10 cepas no arsenilo-oxidantes, de las cuales 6 poseian una
molibdoenzima de la familia DMSO.
7.4 BUSQUEDA DEL GEN aoxB INMERSO EN INTEGRONES CLASE I
Los pruebas de identificaci6n del gen aoxB dentro del contexte genetico de un
Integr6n Clase I cuando se utilizaron los 0ligonucle6tidos Intl1 Fw + AoxBRv no
dieron lugar a la amplificaci6n de algun fragmento de ADN relacionado a aoxB.
Las pruebas realizadas con el 0ligonucle6tido qacEDRv (Bass et al., 1999) en
combinaci6n con aoxBFwnoamplificaronfragmentoalguno,porlo cualserealiz6
ungradientedelemperaluradealineamienlode55,58,60y62'Casicomouna
rampa de temperatura con los mismos reaclivos y templados de ADN y no se tuvo
exito en la amplificaci6n de algun fragmento de ADN en las cepas de estudio.
Enestesentido,elunicoestudioenelcualsehadeterminadounmarcoabiertode
leclura parcial para inlegrasa en el mismocontexto genetico que el gen aoxB 10
comprende los lrabajosde Osborne etal., 2013,quienesencontraronsecuencias
que comparten homologla con inlegrasas de fago putalivas -de varias
betaproteobacterias, aunque es poco probable que fueran funcionales (Osborne et
al., 2013).
Pagina46
Los resultados obtenidos en esta investigaci6n sugieren que en el ADN de las
cepasenestudioelgenaoxBnoseencuentra inmersoen un integr6n, 10 cual no
implicaqueelgennoestepresenteensugenoma.
La ausencia de amplificaci6n podria deberse a que estos microorganismos
empleen un mecanisme enzimatico distinto del sistema aox para la oxidaci6n de
arsenito. Estudios recientes de expresi6n de genes en concentraciones elevadas
de arsenico demuestran la posibilidad de que se lIeven a cabo procesos
exaptativos que involucren diferentes mecanismos con proteinas propias para
lograr la resistencia bacteriana a arsenico. Ejemplos de estos procesos son:
transporte (miembros de la familia de transportadores MFS), biogenesis de
membrana (diacyl-gligerol-kinasa (DAGK) y fosfolipido fosfatasa (PAP)),
maduraci6n post-transcripcional de tRNAs (Queuosina), respuesta al estres
(chaperona ClpB) y reparaci6n de ADN (ADN glucosilasa) (Morgante y Gonzalez,
2013).
7.5 ANALI515 DE 5ECUENCIA5 DE rADN 165
Como ya se mencion6, de las 15 cepas utilizadas en este estudio (las cuales
presentan grados variables de resistencia a Aslil yAsV), 8 mostraron capacidad
arsenitooxidante.Apesardeesto, en las pruebasde PCR nose identific6elgen
soxB como responsable de dicha actividad. Es preciso conocer el sistema
biol6gico porel cual se observa este comportamiento. Una opci6n metodol6gica
poria cualse podrfaabordaresta cuesti6n seria la secuenciaci6n de genomay
posteriorcomparaci6nconlasbasesdedatosdegenomascompletosreportados.
Para ello, es necesario la determinaci6n especifica de la especie cuyo genoma
sera secuenciado, para, de esta forma, asegurar que el genoma anotado
corresponda a especiesreportadaspreviamente. Loanteriorparatenerun punto
decomparaci6n yencontrarla 0 las secuenciasque pudieran serresponsablesde
laoxidaci6ndearsenito.
Pagina47
Poresta raz6n, se seleccionaron las cepas C4, C12, C16y C81, por ser las que
presentaron actividad arsenito-oxidante y los valores mas altos de CMI de
arsenito. Se analizaron sus secuencias de rADN 16S con la finalidad de lIevar a
cabo en investigacionesposteriores lasecuenciaci6ndelgenomacompletodeuna
de elias y buscarsecuencias relacionadasalgen aoxBoa proteinas conocidas 0
nuevas con facultad de lIevara cabo laoxidaci6n delarsenito.
El corrimiento electroforetico de los productos de las pruebas de PCR con los
0ligonucle6tidos dirigidos a secuencias de ADN ribosomal 16S se muestran en la
figura18.Lassecuenciasresultadasdelasecuenciaci6nde738y693pb
correspondientes a las cepas C4 y C16 respectivamente presentaron un
porcentajede identidad del 99 % con EnterobactercioacaecepaZ9 No. deacceso
KF429496.1 y 97 % con Enterobacter hormaechei cepa PS53C No. de acceso
JX294308.1. Esto es, ambas cepas corresponden al genero Enterobacter (cuadro
6).
Los analisisde lassecuencias para C12 yC81, mostraron una identidad del99y
92% respectivamente con K. pneumoniae (Cepas SW, No. de acceso
AB641122.1) y NW115, (No. de acceso JF915362.1) (cuadro 6). Esto se logr6
mediante comparaci6n con las secuencias reportadas en las bases de datos:
Nucleotide collection, NCBI Genomes (Chromosome), Reference genomic
sequences (refse<Lgenomic), 16S Ribosomal RNA sequences (Bacteria and
Archea) y Reference RNA sequences (refseq_rna) del National Center for
Biotechnology Information (NCBIQIl).
Pagina48
1 2 3 4 5 6 7
t.JMlOo.- c::;> cx,) QIC) ••
t'l
."',.~
Flgura1B.Electroforeslsen gel deagarosaal1 %delosproductosdePCR.CarriI1·marcador de peso molecular (MPM) 100 pb. Carril 2: ADN cepa 4. Carril 3: ADN cepa 12.Carril4: ADN cepa 16. Carril 5: ADN cepa 61. Carril 6: control negativo (-ADN). Carril 7:ccntrolpositivo.
Cuadro 6. Tamaflo y porcentaje de los fragmentos rADN 165 secuenclados. 5emuestran los porcentajes de los fragmentos anotados, respectoa la longltud delampllc6n(1,500pb).
Cepa ITama~o resultado de la I% respeetc al tama~o1
secuenclacI6n esperado
Poreentajede
identidad
EcfoacaeC4
K.pnaumonfaeC12
EaerogenesC16
K.pneumoniaeC81
738
976
693
1015
49.2
65.0
46.2
67.6
99
99
97
92
Laconfirmaci6n de especie de las cuatro cepas seleccionadasresultademucha
utilidad para decidir el genoma a secuenciar en investigaciones posteriores. Sin
embargo, el hecho de que los porcentajes de recuperaci6n con respecto al
amplic6n hayan sido tan bajoses un inconveniente. Estoporquesiseconsidera
quelaestrategiadeamplificaci6nprodujofragmentosde1,500pb(querepresenta
un 97 % aproximadamente del total de la secuencia primaria de rARN 16S (Hutson
elal., 1993)) yde los mismos se recuperaron porcentajes de entre 4ll y67 %,
pudieron haberse perdido fragmentos determinantes en la diferenciaci6n de
especies.
Loanteriorpodria representarun importante sesgo de los resultados, por10 cual
sera necesario efectuar otras pruebas de amplificaci6n de rADN 16S para tener
Pagina49
porcentajes de recuperaci6n mas elevados. Otra posibilidad serla utilizar los
0ligonucle6tidos complementarios descritos por el mismo Hutson et al., 1993, los
cuales flanquean dos regiones traslapadas de aproximadamente 1,000 pb cada
una,loquedisminuirialaposibilidadderesultadoserroneos.
8. CONCLUSIONES
EI60 % de las 15 cepas de estudio mostraron valores de CMI entre 10 y 15
mM de arsenito de sodio.
Hay diferencia en cuanto a la resistencia a arsenito entre las bacterias
arsenito-oxidantesylasquenoloson.eIBB.B%delascepascuyosvalores
de CMI fueron ~ 10 Mm mostraron actividad arsenito-oxidante en las
pruebasdenitratodeplataO.1 M.
Probablemente las cepas en estudio presentan un mecanisme de
resistencia a arsenito alterno al sistema ars.
EnlascepasutilizadasenesteestudionoseidentificoelgenaoxB,por!o
queelfenotipoobservadopuedeserresultadodeunmecanismodistintoa
aoxB.
No se identifico el gen aoxB como parte de Integrones Clas!!' J con la .
metodoJogiautilizadaparaestefin.
Se confirm6 la especie de las cuatro cepas evaluadas por analisis de
secuenciaderADN 16S
Pagina50
9. PRODUCTOS DE LA INVESTIGACI6N
- Capitulo titulado "Microbial arsenite biotransformation and its potential
applications in bioremediation" en: Velazquez-FernandezJBycols., 2013.
"Bioremediation: Processes, Challenges and Future Prospects". ISBN: 978
1-62948-513-3.
- Presentaci6n de resultados del proyecto en el Tercer Congreso
Internacional de la Rama de Bioqufmica y Biologfa Molecular de Bacterias
del3al7deoctubredel2013en CuatroCiemegas, Coahuila.
10. PROSPECTIVAS
• Cuantificaci6n de la conversi6n de arsenito Para tener informaci6n de la
medida en la que las cepas objetode estudio realizan la conversi6n de
arsenitoaarsenato,resultarfaconvenientedeterminardelavelocidaddel
proceso, en un mediocontrolado, dado que el objetivo a largo plazo serfa
aprovechar estas caracterlsticas en un dispositivo que asegure la mayor
eficienciayeficaciaposibles.
• Purificaci6n de la enzima. Otra acci6n importante a considerar seria la
purificaci6ndelaenzimaarsenitooxidasaapartirdecultivospurosconel
fin de evaluarsu usoen la descontaminaci6n de aguasen lugardeemplear
microorganismos completos. Ademas, esta purificaci6n permitiria su
cristalizaci6nycaracterizaci6n.
Pagina51
• Caracterizar moleculannente la enzima. Ir de proteina al DNA para obtener
lasecuenciadelgendelaarsenitooxidasa.
11. BIBLIOGRAFiA
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ANEXO 1 SOLUCIONES Y REACTIVOS EMPLEADOS
- Agarosa al1 % en TAEfTBE
Pesarlacantidad necesaria de agarosa en una proporci6n p/vdel 1% respectoal
volumen final deseado. Disolver en el buffer TAE 0 TBE (uno u otro, depende del
tamalio del fragmento), calentar hasta su completa disoluci6n. Vaciar en el molde,
previa colocaci6n del peine para pocillos yesperarhasta la polimerizaci6n para
montarelcorrimientoelectrofonilico.
- Arsenito de sodio (NaAs02) 0.1 M
Pesar1.2991grsdeNaAs02yaforaren100mLdeaguadestiiadaesteril.
- Nitrato de plata (AgN03) 1M
PesarO.849grsyaforaren5mLdeaguadestiladaesterii.
- TAE 1X
Realizar la diluci6n de 20 mL de TAE (Tris + Acido Acetico + EDTA) 50X de BIO
RAD® en 980 mL de agua destilada esteril y homogenizar.
- TBE1X
_ Disolver 108 grs de Tris Base, 55 grs de Acido Borico y 40 mL de EDTA
disodico (pH 8.0) en 800mLdeaguadestiiadaesterilyaforara un Iitropara
obtener el buffer TBE 10X. De este, tomar 100 mL y diluir a un Iitro con
aguadestiladaesterilparaliegarasialbufferTBE 1X.
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