PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
(CURSO 2012–2013)
Distribución de las prácticas por días
Análisis de unamuestra de orina
Análisis de unamuestra de faringe
Antibiograma
LunesCuantitativo: siembra de Agar CLEDCualitativo: siembra de Agar Cromogénico y Agar de MacConkey
Siembra de Agar SangreSiembra de Agar Salino Manitol
Martes
Cuantitativo: lecturaCualitativo:Identificación presuntiva de coloniasTinción de GramPrueba de la oxidasaSiembra en Agar de MacConkey
Miércoles
Observación de la aparición de halos de hemólisisTinción de Gram a colonias aisladas en Agar Sangre y Agar Salino Manitol Identificación de cocos Gram positivosSiembra de Agar Sangre
JuevesSiembra de Agar KliglerInoculación de API20E
Prueba de la catalasaInoculación de API STAPHInoculación de API STREP
Siembra de Agar Müeller-HintonColocación de los discosE-test
ViernesLectura de Agar KliglerLectura de API20E
Lectura de API STAPHLectura de API STREP
Lectura y medida de halos en discosLectura del E-test
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013) Organigrama
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA CLÍNICA
LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2
Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en función de:
Virulencia
Dosis infectiva del microorganismo
Disponibilidad de tratamiento
Modo de transmisión en el laboratorio
Riesgo de difusión en la comunidad
Viabilidad del microorganismo en el entorno
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
GRUPO DE RIESGO PATOGENICIDAD EJEMPLOS
1No suelen causar enfermedad en personas sanas
Escherichia coliStaphylococcus epidermidis
2
Causan infecciones moderadas o gravesLas infecciones suelen tener buen pronósticoGeneralmente no se transmiten por vía aéreaSe suelen transmitir por contacto o ingestiónEs difícil su propagación en la comunidadExisten tratamiento y profilaxis eficaces
Bordetella pertussisClostridium tetaniHaemophilus influenzaeCandidaVirus del sarampiónEntamoeba histolytica
3Causan infecciones gravesAlgunos se transmiten por vía aéreaPueden propagarse en la comunidadLa terapia es de eficacia variable
Bacillus anthracisMycobacterium tuberculosisVirus de la hepatitis BLeishmania donovani
4Causan infecciones graves o muy gravesMuchos se propagan por vía aéreaSe propagan fácilmente en la comunidadLa terapia no es muy eficaz
Virus de la viruelaVirus de MarburgVirus Ébola
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
MICROORGANISMOS RIESGO PROVOCADO TIPO DE LABORATORIO
GRUPO DE RIESGO1
INDIVIDUAL → BAJO
COLECTIVO → BAJO
BÁSICO(Enseñanza)
GRUPO DE RIESGO2
INDIVIDUAL → MODERADO
COLECTIVO → MODERADO
SEGURIDAD(Hospital)
GRUPO DE RIESGO3
INDIVIDUAL → ELEVADO
COLECTIVO → ELEVADO
ALTA SEGURIDAD(Diagnóstico
especializado)
GRUPO DE RIESGO4
INDIVIDUAL → ELEVADO
COLECTIVO → ELEVADO
MÁXIMA SEGURIDAD
(Servicio estatal)
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
MEDIOS DE CONTENCIÓN
Describen los métodos que hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el laboratorio.
Objetivo: reducir al mínimo la exposición del personal y del entorno a agentes potencialmente patógenos.
Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son importantes tres elementos de contención:
A) Barreras primarias: primera línea de protección (bata, guantes, gafas, mascarillas, gorros, cabinas de seguridad biológica, etc.).
B) Barreras secundarias: normas que deben cumplirse para la construcción de un laboratorio de Microbiología Clínica (alicatado, paredes, grifos, interruptores, aparatos que generan ruido, aparatos que generan calor, etc.).
C) Procedimientos estándar: metodología de funcionamiento del laboratorio y de la manipulación de las muestras clínicas.
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
MUESTRA CLÍNICA SOSPECHOSA DE
CONTENER MICROORGANISMOS
TIPO DE LABORATORIO
RECOMENDADO PARASU ESTUDIO
NIVEL DE BIOSEGURIDAD
QUE DEBE TENER EL
LABORATORIO
GRUPO DE RIESGO 1 BÁSICO 1
GRUPO DE RIESGO 2 SEGURIDAD 2
GRUPO DE RIESGO 3 ALTA SEGURIDAD 3
GRUPO DE RIESGO 4 MÁXIMA SEGURIDAD 4
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS
Objetos punzantes y cortantes
• Agujas, pipetas Pasteur, portaobjetos, vidrio roto, etc.• Constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de microorganismos.• Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético.• Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser esterilizados en
autoclave o incinerados antes de desecharlos.
Líquidos infecciosos
• Deben recogerse en recipientes herméticos y esterilizados, sangre incluida, en autoclave.• Esta práctica es también obligatoria cuando los residuos proceden de áreas de
micobacteriología y virología.
Residuos sólidos
• Muestras clínicas, medios de cultivo, depresores, tubos de plástico, tiras API, etc.• Deben ser esterilizados en autoclave o incinerados antes de ser desechados.
Líquido sobrante de tinciones
• Debe ser recogido en garrafas de plástico (nunca tirar al fregadero).
IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
PRÁCTICAS A REALIZAR
ANÁLISIS CUANTITATIVO
ORINAL-1
Siembra de la muestra de orina(bote nº 2) Agar CLED
ANÁLISIS CUALITATIVO
ORINAL-2
Siembra de la muestra de orina(bote nº 1)
Agar Cromogénico Agar de MacConkey
ANÁLISIS CUALITATIVO
MUCOSA FARÍNGEA
L-3 Toma de muestraMucosa faríngea
L-4 SiembraDos placas de Agar Sangre
L-5 SiembraUna placa de Agar Salino Manitol
OrganigramaPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE ORINA
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Conocer el número de microorganismos presentes en la muestra.
Se toma una cantidad conocida de orina y se siembra en un medio de cultivo específico. Se incuba 24horas y se cuenta el número de colonias.
ANÁLISIS CUALITATIVO
Conocer qué microorganismos están presentes en la muestra.
Se siembran muestras de orina en diferentes medios de cultivo, tratando de obtener colonias aisladas.Tras su estudio, se elegirá una colonia correspondiente a una enterobacteria.
La enterobacteria se identificará utilizando un sistema comercial: API 20E.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
ANÁLISIS CUANTITATIVO
FUNDAMENTO
En función del número de microorganismos presentes por mililitro de orina se establecerán conclusiones acerca de posibles infecciones existentes enel tracto urinario.
METODOLOGÍA
Sembrar una placa de agar CLED (agar cistina, lactosa,deficiente en electrolitos).
La placa se siembra con asa estéril de plástico calibradas(1 microlitro).
El asa se introduce verticalmente en la muestra (Bote nº 2)correspondiente a la orina procedente del “chorro medio”.
Se hace una única estría diametral. Seguidamente, se realizan estrías en zig-zag perpendiculares a la primera estría, tal como se esquematiza en la siguiente imagen.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
El asa se introduce y se sacaverticalmente del bote con orina
Sin agregar más orina, con la misma asase hacen estrías sobre la placa cruzandovarias veces la línea del inóculo inicial
El asa toca el centro de la placa a partir del cualel inóculo se extiende en forma de una línea
a lo largo del diámetro de la placa
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
AGAR CLED (CISTINA, LACTOSA, DEFICIENTE EN ELECTROLITOS)
Digerido pancreático de gelatina 4 g/LDigerido pancreático de caseína 4 g/LExtracto de carne 3 g/LLactosa 10 g/LL-cistina 0,128 g/LAzul de Bromotimol 0,02 g/LAgar en polvo 15 g/LAgua destilada 1 L
pH: 7,3
Es un medio diferencial que favorece el crecimiento de todos los microorganismos existentes en la orina. Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.
La lactosa es el único carbohidrato presente. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes dependientes de ella.
El azul de bromotimol permite distinguir las colonias de bacterias fermentadoras de las que no lo son. Los microorganismos fermentadores dan lugar a colonias de color amarilllo. Los no fermentadoresdan lugar a colonias de color claro o traslúcidas. La alcalinización del medio provoca la aparición de un color azul intenso.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
ANÁLISIS CUALITATIVO
FUNDAMENTO
Sembrar una muestra de orina (Bote nº 1) en medios diferenciales. El tipo de colonia y su pigmentación servirán para presuponer qué microorganismos pueden estar presentes.
METODOLOGÍA
Sembrar una placa de agar Cromogénico.
Sembrar una placa de agar de MacConkey.
Se utilizarán también las placas de agar CLEDempleadas en el análisis cuantitativo.
Dada la posible escasez de microorganismos presentes en orina, debe utilizarse un método de siembra que pueda descargar un inóculo denso.
Con un asa de 10 µL se realizarán tres descargas (30 µL en total) en estrías paralelas en el sector 1. Los sectores 2 al 7 se sembrarán arrastrando inóculo del sector anterior tal como se esquematiza en la siguiente imagen.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Técnica de siembra en placa por estrías cada 45º
1
2
3
4
5
7
6
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
AGAR CROMOGÉNICO
El agar Cromogénico es un mediodiferencial, pero no selectivo.
El carácter diferencial se traduceen que las colonias crecidas presentandiferentes colores en función de sucapacidad para utilizar ciertos sustratos presentes en elmedio.
La presencia en las bacterias de enzimas específicas(por ejemplo, β–galactosidasa, β-glucosidasa o triptófano desaminasa) capaces de descomponer esos sustratos, provoca la aparición de un color determinado (rosa, azul turquesa, azul oscuro, verde, blanco, crema, etc.) unicamente en la colonia a la que pertenece dicha bacteria.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Técnica de siembra en placa por estrías continuas
Dirección de la siembraDirección de la siembra
Alumno A Alumno B
AGAR DE MACCONKEY
Peptona 20 g/LLactosa 10 g/LSales biliares 1,5 g/LCloruro sódico 5 g/LRojo neutro 0,030 g/LCristal violeta 0,001 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1L
pH: 7,1
El agar de MacConkey es un medio moderadamente selectivo y diferencial utilizado para la recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes. La lactosa es el único carbohidrato. Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH menor de 6,8) por la producción de ácidos mixtos. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes.
No fermentador
Fermentadorde lactosa
Fermentadorfuerte de lactosa
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE FARINGE
FUNDAMENTO
En el tracto respiratorio existe una abundante microbiota que se establece, normalmente, sin causar daños al hospedador.
El objetivo de la práctica consiste en tomar una muestra del tracto respiratorio superior (faringe) para tratar de identificar cocos Gram positivos.
METODOLOGÍA
Tomar una muestra de faringe con un hisopo estéril y la ayuda de un depresor también estéril.Sembrar la muestra en dos placas (nº1 y nº2) de agar sangre y en una de agar salino manitol:
Placa nº 1 de Agar Sangre: se descarga el hisopo en una zona próxima al borde (zona densa) y se siembra el resto de la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC.
Placa nº 2 de Agar Sangre: con un asa estéril se toma un inóculo de la zona densa de la placa nº 1 y se siembra la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC.
Placa de Agar Salino Manitol: sembrar por estrías continuas con el mismo hisopo que se ha sembrado la placa nº 1. Incubar 48 horas a 37º C.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Siembra por estrías continuas
Placa nº 1 con hisopo
Placa nº 2 con asa
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
AGAR SANGRE
Es una combinación de agar base, generalmente agar nutritivo, y sangre. Se puede utilizar sangre de oveja, de otros animales e incluso humana.
Es un medio rico que aporta muchos factores de crecimiento para microorganismos exigentes.
Se utiliza también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos, por lo que se considera un medio diferencial. Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que poseen: alfa, beta o gamma.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
AGAR SANGRE (AGAR BASE DE COLUMBIA + 5% SANGRE OVEJA)
Agar base de Columbia
Peptona 5 g/LTripteína 12 g/LExtracto de levadura 3 g/LExtracto de corazón (buey) 3 g/LAlmidón soluble 1 g/LCloruro sódico 5 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1 L
pH: 7,3
El agar base de Columbia es uno de los muchos medios de cultivo a los que se les puede adicionar sangre para preparar agar sangre o agar chocolate.
La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.
Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
AGAR SALINO MANITOL (MEDIO DE CHAPMAN)
Extracto de levadura 2,5 g/LTriptona 10 g/LGelatina 30 g/LLactosa 2 g/LManitol 10 g/LCloruro sódico 75 g/LFosfato dipotásico 5 g/LRojo fenol 0,025 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1 L
pH: 7,0
Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos.
La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos patógenos sí lo hacen.
La presencia de manitol permite detectar a los estafilococos fermentadores del mismo que producen colonias amarillas debido al viraje de color del rojo fenol. Los estafilococos no patógenos no lo fermentan y producen colonias de color rosa.
LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)