REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Lic. en BioquímicaLic. en Biotecnología
Microbiología de los Alimentos 2016
• Desarrollada por Kary Mullis en 1986
• Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente unaregión determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueadapor 2 secuencias de ADN conocidas
• Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: ElADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario,duplicándose y volviéndose a enrollar.
Pasos para realizar una PCR
1) Extracción del ADN deseado
2) Preparación de la mezcla de reacción (Master mix)
3) Separación de master mix en alícuotas y agregado delADN de interés
4) Amplificación en Termociclador
5) Electroforesis en gel de agarosa
6) Observación en transiluminador UV
Extracción de ADNExisten distintos métodos para extracción de ADN.
Técnica A:
Enriquecimiento debacteria en mediode cultivo Ansada
Resuspender en 150µlde Triton X-100 enbuffer TE
Hervir a baño de agua a100°C 15 minutos
Centrifugar a12000 rpm 5minutos
Tomar 50 µl delsobrenadante ycolocar en tubonuevo
ADN listo para PCR
Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp
Componentes de la Master Mix
H2O ultrapura
Buffer
Mg+2
dNTPs
Primer forward
Primer reverse
ADN polimerasa
+ ADN de interés
Termociclador
Preparación de Master mix
Reactivos Solución stock Solución de
trabajo
Volumen en la
mezcla (ml)
Buffer 10 x 1x
dNTPs 2,5 mM 0,1 mM
MgCl2 25 mM 1,5 mM
Iniciador a 100 pmol/ml 2 pmol/ml
Iniciador b 100 pmol/ml 2 pmol/ml
Taq pol 5 U/ml 0,02 U/ml
ADN templado 2
H2O ultrapura
Volumen final 50
Pasos durante la amplificación1) Desnaturalización inicial
2) Ciclos: - Desnaturalización
- Unión o annealing
- Extensión
3) Extensión final
Importancia de los controles
Control Positivo: ADN diana que se sabe amplifica el gen buscado. Permite verificar queeste correcto el procedimiento.
Control Negativo: Componentes de Master mix sin ADN. Permite ver que no hayacontaminación.
92 - 94°C
92 – 94°C
55 – 61°C
72 – 74°C
72 – 74°C
Cuidados a tener en cuentaTrazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de unfragmento incorrecto (FALSOS POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental:
• Trabajar en condiciones de asepsia
• Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes
• Material que se utiliza debe estar esterilizado
• Preferible si es material nuevo
• Evitar corrientes de aire
Zonas de trabajo
Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado.
• Zona de preparación de la muestra: Extracción y purificación del material genético.
• Zona de PCR: preparación de master mix y muestras.
• Zona post-PCR: donde se realiza la amplificación de ADN.
ReveladoLos fragmentos de PCR se revelan mediante electroforesis en gel deagarosa.
Gel de agarosa y bufferde corrida TAE o TBE
Siembra 5 µl de muestra+ 2 µl de azul debromofenol
Visualización
Conceptos básicos
En Microbiología:
• Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr uotros genes específicos de especie
• Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc.
• Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos
En otras áreas:
• Identificación de genes para diagnostico y medicina legal
• Investigación de modelos de expresión
• Especificidad: Generación de un único producto de amplificación.• Eficiencia: Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos.• Fidelidad: Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor
número de errores, mayor fidelidad).• Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran
cantidad de copias
Aplicaciones
Ventajas• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad
considerable
• Rapidez en el diagnostico
• Mayor sensibilidad que los cultivos
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, vivo o muerto
• El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar
Desventajas
• Se pueden reproducir partes del genoma cuya secuencia se conoce y consta de 20 a 40pb de longitud
• Se necesitan “PRIMERS” específicos
• La enzima ADN polimerasa puede tener errores al sintetizar
• Puede contaminarse con otro ADN
• Reactivos costosos
Tipos de PCR
Nested PCR
Técnica muy sensible de PCR en laque el producto de amplificaciónes utilizado como molde pararealizar una segunda amplificacióncon cebadores que se ubicandentro de la primera secuenciaamplificada.
Ventajas: brinda alta sensibilidad yespecificidad
Desventajas: no permitecuantificar la muestra
PCR multiplex
PCR en la cual se amplificasimultáneamente dos o mássecuencias. Para lo cual secombinan dos o más paresde cebadores en el tubo dela mezcla junto con losdemás reactivos.
RT- PCR
Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc) usando la enzima retrotranscriptasa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.
Aplicaciones en el laboratorio de Microbiología
Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos por nested-PCR cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a)ADN extraido mediante el protocolo desarrollado por Kapperud y modificado en el presente trabajo, (b) ADN extraído mediante el reactivo PrepMan Ultra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control negativo.
Sensibilidad de la técnica nested-PCR para el gen
yadA
PCR múltiplex para la
determinación de la
presencia de genes de virulencia
Electroforesis en gel de agarosa para ver los fragmentos de PCR multiplex de Yersinia enterocolitica para los genes Inv y yst.
1: Cepa 51, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb
2: Cepa 52, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb
3: Cepa 53, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb
4: Cepa 64, B4/O:3: Inv: 558pb
5: Marcador de peso molecular
6: Cepa 68, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb
7: Cepa de referencia, W1024, B2/O:9:Inv: 558pb ; yst: 192pb
8: Cepa de referencia, MCH700, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb
9: Control negativo
10: Marcador de peso molecular
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10
Resistencia a ATM de Helicobacter pylori
El mecanismo de resistencia a Cla esta asociado a mutaciones puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una guanina o citocina reemplazan una adenina.
ACGGAAAGACC WT S CLAACGGGAAGACC A2142G R CLAACGGAGAGACC A2143G R CLA
Corte con enzima
BsaI
Corte con
enzima MboII
Amplificación fragmento 450 pb
Bibliografía, dónde buscar?
• US National Library of Medicine. National Institute of Health
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
• Science Direct
http://www.sciencedirect.com/
• Biblioteca electrónica de Ciencia y Tecnología. Argentina
http://www.biblioteca.mincyt.gob.ar/