Métodos generales de aislamiento, cuantificación y caracterizaciónde metabolitos secundarios de
interés farmacognóstico
Métodos generales de aislamiento de metabolitos secundarios
• Métodos cromatográficos:
• No instrumentales: C. columna y C. capa fina• Instrumentales: HPLC y C. gases
Cromatografía en columna
• Para fines preparativos (aislar sustancias en una cantidad apreciable, generalmente mas de 10 mg puras)
• Para simplificar mezclas complejas antes de pasar a métodos instrumentales.
https://cellularphysiology.wikispaces.com/Column+Chromatography
Cromatografía en capa fina CCF
• Para fines analíticos (separar sustancias en una cantidad muy baja, generalmente menos de 1 mg)
• Para ayudar en la identificación, cuando se cuenta con sustancias de referencia (marcadores).
http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Chromatography/Thin_Layer
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
• Técnica instrumental que puede ser automatizada.• Para fines analíticos y preparativos.• Mayor capacidad de separación que CC y CCF• Más utilizada en laboratorios de control de calidad
de productos naturales• Sustancias de diferente polaridad y estabilidad
térmica.• Puede combinarse con otras técnicas de
identificación y caracterización como Espectrometría UV-vis, de masas y RMN.
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC.gif
HPLC-EM
http://www.atheris.ch/mass_sp.php
Cromatografía de Gases (CG)
• Técnica instrumental que puede ser automatizada, bases de datos.
• Para fines analíticos más que preparativos.• Mayor capacidad de separación que CC y CCF.• Sustancias térmicamente estables, p. ej.
Aceites esenciales, perfumes, aromas, etc.• Puede combinarse con técnicas de
identificación como Espectrometría de masas.
CG-EM
http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-standards/application-area-technique/standards-for-iso-188572.html
Métodos generales de cuantificación de metabolitos secundarios
• Gravimetría• Volumetría (valoraciones ácido-base, oxido-
reducción, formación de complejos coloreados, etc.
• Espectrometría UV-visible (curvas de calibración estándar, Ley de Beer)
• HPLC: áreas de los picos• CG: áreas de los picos
http://www.bmglabtech.com
http://en.wikipedia.org/wiki/Volumetric_flask
http://chemwiki.ucdavis.edu
http://www.phmethods.org
http://www.phmethods.org
Métodos generales de caracterización de metabolitos secundarios
• Espectroscopia UV-visible (UV-vis)• Espectroscopia Infrarrojo (IR)• Espectrometría de masas (EM)• Resonancia Magnética Nuclear (RMN)• Difracción de rayos-X
Espectroscopia UV-vis• Compuestos no conjugados: Incoloros• Compuestos poco conjugados: Amarillentos p.
ej.ergosterol • Compuestos muy conjugados: Amarillos (flavonoides
y carotenoides), Naranja (quinonas, flavonoides y carotenoides), Rojos (quinonas, carotenoides, antocianinas), violeta (antocianinas), azul (antocianinas).
• Todos los compuestos conjugados se pueden observar con una lámpara de luz UV 254 nm. Los más conjugados inclusive se observan a 360 nm.
Espectroscopia UV-vis
• E. Ultravioleta: 200-400 nm, solvente: metanol o etanol, celdas de cuarzo
• E. visible: 400-800 nm, celdas de vidrio
http://www.lpdlabservices.co.uk
Espectroscopia IR
• Celdas de NaCl, KBr, SeS, solución, etc.• Determinación de grupos funcionales, enlaces
C=C, =C-H, C-H, O-H, C-O, C=O, C-N, N-H, etc.• 4000 a 600 cm-1
http://www.chem.ucla.edu/
Espectrometría de masas
• Sustancias térmicamente estables: EM Impacto Electrónico (EM clásica), y EM Ionización Suave (FAB-MS, y otras)
• Sustancias térmicamente inestables: EM Ionización Suave (FAB-MS, y otras)
Glicósidos y agliconas
http://examine.com/supplements/Dioscorea+villosa/
Espectrometría de masas Glicósidos y agliconas aromáticas y no aromáticas• Glicósidos aromáticos y no-aromáticos: FAB-MS, ión
pseudomolecular y fragmentos debidos a pérdidas de una o varias unidades de monosacáridos.
• Agliconas aromáticas: EMIE (ión molecular intenso y fragmentación característica de comp. aromáticos).
• Agliconas no-aromáticas: EMIE (ión molecular poco intenso o no se observa, y fragmentación característica de comp. no-aromáticos).
Espectrometría RMN
• RMN una dimensión (RMN-1H, RMN-13C, etc.)• RMN dos dimensiones (Homonuclear y/o
heteronuclear: Cosy H-H, HMBC, HMQC, etc.)
2014-5-14
Protones aromáticos
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RMN-1H• Rango: 0-14 ppm • Protones alifáticos: Campo alto: 3-1 ppm • Protones olefínicos: 4-6 ppm. Acoplamientos: cis J 10, trans J 14 Hz.
Acoplamiento alílico. • Protones aromáticos: 6-8 ppm. Acoplamientos: orto J 8, meta J 2 Hz, para
es muy pequeño. Acoplamiento “W” • Protones de OH: no se observan en solventes próticos, OH peri 12-14 ppm
bs. • Protones de metoxilos: 4 ppm s, si señal integra para 3 protones es un
grupo metoxilo, si integra para 6 protones se trata de 2 grupos metoxilo y así sucesivamente.
• Protones vecinos a carbonos quirales: señal no es tan simple, no se aplica la regla de n+1 (n= número de protones a 3 enlaces)
• En sistemas alicíclicos los protones presentan otros acoplamientos debido a angulos diedros entre los protones vecinos (acopl. Axial-axial, acopl axial-ecuatorial, etc.)
2014-5-14
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• Nota: En equipos de baja resolución los dd J 8 y 2 pueden observarse como d J 8 Hz, ó como bs (debido a la superposición o solapamiento parcial de las señales).
• En equipos de muy alta resolución pueden observarse inclusive acoplamientos para.
2014-5-14
RMN CARBONO-13• Rango: 0-220 ppm • Carbonos alifáticos: Campo alto: 50-5 ppm • Carbonos olefínicos y aromáticos: > 90 ppm. • Carbonos carbonílicos: > 160 ppm • Nomenclatura: p, s, t, c (primario CH3, secundario CH2,
terciario CH, cuaternario C) • Nomenclatura: s, d, t, c (singlete C, doblete CH, triplete CH2,
cuartete CH3) • Exp. RMN C-13 PARCIALMENTE DESACOPLADO: señales s, d, t,
c • Exp. RMN C-13 DESACOPLADO: todas las señales son singlete.
Las señales de C con menos hidrógenos ligados son las más débiles. No aplica la integración como en RMN-1H.
2014-5-14
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RMN Bidimensional
• COSY H-H: Vecindad de protones a 3 enlaces• HMQC: Correlaciones entre carbonos y
protones directamente ligados a un enlace C-H
• HMBC: Correlaciones entre carbonos y protones a uno (C-H), dos (C-C-H) y tres enlaces (C-C-C-H).