UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
“FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES CYP1A1 Y
CYP1B1 EN MUJERES CON CÁNCER DE MAMA, EN JALISCO”
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA:
Biol. Laura Janin Muñoz Islas
Asesor de Tesis:
Dr. en C. Ruth De Celis Carrillo
Investigador Asociado “C”
Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS
Asesor de Tesis:
Dr. En C. Elena Margarita Castro Rodríguez
Investigador Titular “A”
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Universidad de Colima
Colima, Colima, Julio 2010
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Instituciones donde se realizó el proyecto:
Laboratorio de Inmunología molecular de la División de Inmunología
Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO)
Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS)
Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE)
Centro Médico Nacional de Occidente (IMSS)
Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde
Instituto de Cirugía Reconstructiva
Secretaría de Salud.
Guadalajara, Jalisco
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE OCCIDENTE
ONCOLOGÍA AMBIENTAL Guadalajara, Jalisco a 28 de Julio del 2010 Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin mas por el momento, quedo de Usted Atentamente, Dra. Ruth De Celis Carrillo Mat. 8637954 Investigador Asociado “C” N52 Oncología Ambiental División de Inmunología Centro de Investigación Biomédica de Occidente CIBO IMSS Investigador Nacional Nivel I
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
UNIVERSIDAD DE COLIMA Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Colima, Colima 28 de Julio del 2010 Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin más por el momento, quedo de Usted
Atentamente,
____________________________________ Dra. Elena Margarita Castro Rodríguez
Investigador Titular “A”
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Universidad de Colima
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Agradezco de manera especial a: CONACYT por la beca No.252200 otorgada durante la Maestría en Ciencias Médicas, realizada en la Universidad de Colima. A la Universidad de Colima por abrirme sus puertas y brindarme la oportunidad de seguir con mi preparación académica y superación personal. Al Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO), por su apoyo incondicional durante mi formación
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
DEDICATORIAS A mis padres Felipe y Mary a quien amo y admiro, porque gracias a ellos hoy estoy aquí, por transmitirme la bondad, constancia y dedicación. Por su apoyo y confianza, sin ustedes no hubiera podido cumplir mis metas, esta tesis también es su premio. A Francisco Rico por ser mi fuerza y soporte, por su enorme comprensión y paciencia, pero sobre todo por quererme incondicionalmente. Gracias amor por impulsar mis sueños. A mis hermanos Edgar, Alejandra, Felipe y Héctor, por estar conmigo en todo momento y brindarme de su optimismo y entusiasmo, haciéndome ver siempre el lado positivo de las cosas. A mi cuñada y sobrinos con mucho cariño, porque me motivaron a seguir adelante.
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ruth De Celis Carrillo por todo lo que me ha enseñado y la confianza que ha depositado en mí; sus consejos, calidad humana, así como su dedicación han sido fundamentales para dar forma a este trabajo. A la Dra. Elena Margarita Castro por su disponibilidad y contribución a lo largo de la maestría. A mis asesores: Dra. Claudia Beltrán, Dr. Luis Felipe Jave, Dr. Alejandro Bravo y al Dr. Marco González gracias por su dedicación y apoyo a este proyecto. A Verónica Preciado Martínez por compartir conmigo no sólo conocimientos sino experiencias de vida, pero sobre todo por permitirme contar con su valiosa amistad todo este tiempo, muchas gracias por escucharme y estar siempre a mi lado. A Lupita, Elena y Paola por su oportuna participación y entusiasmo en este proyecto al hacer más ameno y agradable el trabajo diario. A mis profesores de la Maestría en Ciencias Médicas por sus conocimientos y experiencias brindadas.
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
ÍNDICE
Índice de cuadros y figuras Abreviaturas Resumen 1 Summary 2 Introducción 3 Antecedentes 5 Polimorfismo y mutación 5 Citocromo p450 6 Gen CYP1A1 8 Gen CYP1B1 8 Tóxicos 9 Cáncer de mama 11 Signos y síntomas del cáncer de mama 13 Epidemiología del cáncer de mama 13 Factores de riesgo para cáncer de mama 15 Justificación 19 Planteamiento del problema 19 Pregunta de investigación 19 Hipótesis 20 Objetivos 20 Objetivo general 20 Objetivos particulares 20 Material y Métodos 21 Diseño de estudio 21 Universo de trabajo 21 Tamaño de la muestra 21 Descripción de grupos de estudio 22 Criterios de selección 22 Criterios de inclusión 22 Criterios de exclusión 22 Variables 23 Operacionalización de variables 23 Descripción de las técnicas 24 Extracción de ADN 24 Integridad y pureza 28 Detección de polimorfismos 32 Amplificación por PCR 34 Descripción de enzimas de restricción 35 Análisis Estadísticos 36 Consideraciones Éticas 36 Resultados 37 Discusión 43 Conclusiones 47 Perspectivas 49 Anexos 51 Anexo I. Carta de consentimiento informado 53 Referencias Bibliográficas 55
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
FIGURAS
Figura 1. Citocromo p450 6
Figura 2. Modelo 3D del gen CYP1A1 7
Figura 3. Modelo 3D del gen CYP1B1 8
Figura 4. Mamografía 11
Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1
37
Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1
38
Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1
38
Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1
39
Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en grupo con cáncer de mama y de referencia
42
Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val
42
CUADROS
Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS 12
Cuadro 2. Principales causas de muerte en México 2005-2030 14
Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama 17
Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1 31
Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR
Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión conenzimas de restricción
32
Cuadro 7. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncerde mama y de referencia
40
Cuadro 8. Frecuencias alélicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncer de mama y de referencia
40
Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg 41
Cuadro 10. Determinación de Chi cuadrada y valor de P 41
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
ABREVIATURAS
º C Grados centígrados A Adenina ADN Ácido Desoxirribonucleico AHH Aryl hidrocarburos Art Artículo C Citosina CIBO Centro de Investigación Biomédica de Occidente CYP Citocromo p450 dNTPs Desoxinucleótidos trifosfatados EDTA Ácido etilendiaminotetraacético G Guanina GST Glutatión-S-transferasasgr Gramos H Horas Ile Isoleucina KCl Cloruro de Potasio Leu Leucina Lt Litros MgCl2 Cloruro de Magnesio mg Miligramo mL Mililitros µg Microgramo µL Microlitros min Minutos mM Milimolar M Molar ng Nanogramos nm Nabometros NAT N-acetiltransferasasNaCl Cloruro de sodio NH4Cl Cloruro de amonio NH4NCO3 Bicarbonato de amonio O2 Oxígeno Pb Pares de basesPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PAHs Hidrocarburos aromáticos policíclicos RH Sustrato orgánico RFLPs Fragmentos de restricción polimórficos en longitud rpm Revoluciones por minutoSDS Dodecilsulfato sódico seg Segundos T Timina Tris-HCl Tris-ácido clorhídrico TE Tris-EDTA U Unidades Val Valina
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
RESUMEN
Introducción. El citocromo p450 es responsable del metabolismo oxidativo de
los xenobióticos. Su expresión es regulada por variabilidad genética,
fisiopatológica y ambiental; y presenta variabilidad en la respuesta
farmacológica o diferente susceptibilidad a la acción de tóxicos o carcinógenos.
Los genes asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de
mama son CYP1A1: (Ile462Val) y CYP 1B1: (Val432Leu).
Objetivo. Estimar la frecuencia de los polimorfismos Ile462Val y Val432Leude
los genes CYP 1A1 y CYP 1B1, en mujeres con cáncer de mama.
Metodología. Estudio descriptivo transversal. Se analizaron muestras de
sangre periférica de mujeres con cáncer de mama, pacientes de varias
instituciones de salud en Guadalajara, Jalisco. Se obtuvo ADN de cada paciente,
se identificó el tipo de polimorfismo por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando enzimas de restricción específicas para los genes
CYP1A1 y CYP1B1, así como electroforesis en geles de agarosa.
Resultados: Se estudió un total de 151 muestras de sangre periférica (76
grupo con cáncer de mama; 75 grupo de referencia). Se utilizó Chi cuadrada
para el análisis estadístico. El polimorfismo que mayormente se presentó fue
Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 muestras del grupo con cáncer de mama
(67.1%) y en 44 muestras grupo de referencia (58.6%); a diferencia del
polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1, el cual sólo se presentó en 25
muestras del grupo con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de
referencia (41.3%). Aunque la frecuencia de las variantes de los genes
estudiados no fue significativamente diferente a la reportada, concluimos que
fue importante identificarlas debido a que podría ser factible considerarlo en la
estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la
información de toxicidad de ciertas sustancias.
Palabras Claves: Citocromo p450, CYP1A1, CYP1B1, cáncer de mama,
polimorfismos.
1
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
SUMMARY
Background: Cytochrome p450 is responsible for the oxidative metabolism of
xenobiotics. Its expression is regulated by genetic, pathophysiological and
environmental variability in the response showing pharmacological or different
susceptibility to toxic or carcinogenic action. The genes associated with
increased risk of developing breast cancer are CYP1A1 (Ile462Val) and CYP 1B1
(Val432Leu).
Objective. To estimate the frequency of polymorphisms Ile462Val and
Val432Leu gene CYP 1A1 and CYP 1B1 in women with breast cancer.
Methodology. Descriptive cross-sectional study. We analyzed peripheral blood samples of
survivors of breast cancer from different health institutions in Guadalajara, Jalisco. DNA was
obtained from each patient, type was identified through polymorphism chain
reaction (PCR) using specific restriction enzymes CYP1A1 and CYP1B1 genes
and agarose gel electrophoresis.
Results. We studied a total of 151 peripheral blood samples (76 breast cancer
group, 75 control group). Chi square was used for statistical analysis. The
polymorphism Ile462Val presented was mainly the CYP1A1 gene in 51 samples
from breast cancer (67.1%) and 44 samples reference group (58.6%)
Leu432Val polymorphism unlike CYP1B1 gene, which was only present in 25
samples from breast cancer (32.9%) and 31 reference samples (41.3%).
Although the frequency of the variants of the genes studied was not
significantly different from that reported, we conclude that it was important to
identify because it may be feasible to consider in estimating the risk of
developing breast cancer and to contribute to the toxicity of certain information
substances.
Keywords: Cytochrome P450, CYP1A1, CYP1B1, breast cancer,
polymorphisms.
2
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el cáncer de mama es la neoplasia diagnosticada con mayor
frecuencia en las mujeres[3]. En México, de acuerdo al Registro Nacional de
Cáncer, se estima que cada día mueren diez mujeres por esta enfermedad. En
el 2005, se registraron 2,861 fallecimientos lo que representa el 21 por ciento,
en comparación con el 19 por ciento a causa del cáncer cérvico-uterino [4].
Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son
de tipo genético y ambiental. Estos últimos han despertado mayor interés [5] al
observar su trascendencia en la etiología de algunos tipos de cáncer como
próstata o mama [6].
Los efectos a la exposición a sustancias tóxicas son variados, por lo cual
las personas no lo perciben como perjudicial para su salud [7-9]; sin embargo,
para nuestra defensa disponemos de sistemas químicos como el citocromo
p450, el cual tiene como función actuar sobre sustancias exógenaspara
convertirlas en formas solubles de fácil excreción, evitando de esta forma que
se acumulen en el organismo y alcancen concentraciones tóxicas o letales[2].
Dicho sistema se encuentra compuesto por varias subfamilias
conformadas a su vez por genes, entre ellas:la Familia 1, constituida por:
a) el gen CYP1A1 que contribuye a la desintoxicación de sustancias como
los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)[10] y a metabolizar estrógenos,
su polimorfismo con mayor frecuencia es (Ile462Val) [11].
b) El gen CYP 1B1 que se encuentra involucrado en el metabolismo de
PAHs y arilamidas cuyo polimorfismo más frecuente es (Val432Leu); ambos
asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12].
3
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
ANTECEDENTES
Polimorfismo y mutación
Un polimorfismo genético es una variación en la secuencia de un sitio
específico del ácido desoxirribonucleico (ADN), debido a la coexistencia de
alelos múltiples en un locus entre los individuos de una población [13]. Cuando
se presentan en una secuencia codificante o reguladora, producen cambios
importantes en la estructura de alguna proteína o en el mecanismo de
regulación de su expresión, traduciéndose en diferentes fenotipos [14].
Consiste en la sustitución de una base nitrogenada o puede ser más complejo
como la repetición de una secuencia determinada de ADN, donde un porcentaje
de individuos tenga un número estipulado de copias de una secuencia
específica del ADN [15].
Cuando la variación se observa en por lo menos el 1% de la población,
se puede considerar como un polimorfismo [14]. Es importante destacar, que
sólo un número muy pequeño de polimorfismos son responsables de
enfermedades genéticas, la mayoría no tienen efecto sobre el fenotipo.
Se conocen como: mutaciones, cuando los cambios en la secuencia de
bases en el ADN son poco frecuentes, éstas son alteraciones en la información
genética, que producen un cambio en las características, se presentan de forma
súbita y espontánea, y pueden trasmitirse o heredarse a la descendencia [15].
La unidad genética capaz de mutar, es el gen, por poseer la información
hereditaria que forma parte del ADN.
Aunque la replicación del ADN es muy precisa, no es perfecta; algunas
veces se producen errores, y el ADN nuevo contiene uno o más nucleótidos
cambiados [14].
5
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Citocromo p450
En el curso de la evolución las especies se desarrollaron sistemas de
defensa endógena que les permitió adaptarse y sobrevivir en hábitats y dietas
diferentes. Para cumplir con este objetivo, el hombre y la mayoría de los seres
vivos, poseen el sistema citocromo p450 (Fig.1) cuya misión es actuar sobre
sustancias químicas exógenas, convirtiéndolas en formas solubles, fácilmente
excretables, evitando que se acumulen en los organismos alcanzando
concentraciones tóxicas o letales[2].Después de haber sido encontrado en
diferentes tipos de organismo, se cree que tiene su origen en un gen ancestral
que existió hace más de tres millones de años.
El citocromo p450 una hemoproteína con un pico de absorbancia de
450nm, capaz de transportar electrones [2],funciona como una monooxigenasa
que cataliza reacciones en las que solamente incorpora un átomo de oxígeno
(O²) en un sustrato orgánico (RH) y el otro se reduce a agua (H²O). [16].
En general, las enzimas se clasifican en dos categorías: Fase I, que
cumple la función de metabolizar; Fase II, que tiene la misión de conjugar los
sustratos con otros compuestos [17]. El citocromo p450, es una enzima
importante en el metabolismo de fase I, actúa dentro de las células en
6
Fig. 1. Citocromo p450
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
compañía de las enzimas fase II, entre las que se encuentran las glutation-S-
transferasas (GST) y las N-acetiltransferasas (NAT). La mayor o menor
actividad de unas y otras tiene como consecuencia que las sustancias exógenas
que llegan a las células, resulten inocuas o tengan un efecto tóxico [2].
Por lo tanto, el citocromo p450 es el responsable de catalizar la
hidroxilación de múltiples compuestos, así como del metabolismo de
xenobióticos entre los que se encuentran diversas drogas, alcaloides,
carcinógenos, pesticidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [2, 18,
19].
Éste sistema, participa activamente en el metabolismo oxidativo de una amplia
variedad de compuestos endógenos talescomo: esteroides, ácidos grasos y
prostaglandinas; asimismose encuentra implicado en la síntesis de sustratos [2,
18].
Las duplicaciones de genes repetidos han dado lugar a una de las
mayores familias de múltiples genes.Las enzimas que incluye esta superfamilia
CYP son: CYP1, CYP2, CYP3 y algunas enzimas de CYP4 [18]. La familia CYP1
está constituida por los genes CYP 1A1, CYP 1A2 y CYP 1B1. Los tres se
caracterizan porque pueden ser activados por hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAHs) [2, 20].
7
Fig. 2. Modelo 3D gen CYP1A1.
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
El gen CYP 1A1(Fig. 2) constituye la mayor fracción del citocromo p450
extrahepático. Se localiza en el cromosoma 15 q22-q24, posee siete exones y
seis intrones; esta conformado por 5,810 pares de bases, es una enzima
dominante en la bioactivación de la fase I de los xenobióticos. Contribuye a la
desintoxicación de numerosos compuestos, así como a la hidroxilación de los
aryl hidrocarburos, catalizando la primera etapa del metabolismo de una gran
variedad de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [10]. Se encuentra
implicado en el metabolismo del estrógeno, al catalizar la hidroxilación de 17ß-
estradiol en la posición C-2[10, 11, 21].
El gen CYP 1A1 codifica para una enzima con actividad aryl-hidrocarburo-
hidrolasa (AHH), que es inducible por ligandos de los receptores de aryl-
hidrocarburos en casi todos los tejidos estudiados, entre los que se encuentran:
linfocitos, tejido pulmonar, glándulas mamarias y placenta. Hasta la fecha han
sido identificados diecinueve polimorfismos de este gen; uno de los más
comunes es: CYP 1A1*2 el cual consiste en la sustitución de isoleucina en el
codón 462 por valina (Ile462Val); se asocia con el incremento del riesgo de
distintos tipos de cáncer: pulmón, mama, próstata y cérvico uterino [11].
Por otra parte, el gen CYP 1B1(Fig. 3) constituye también una fracción
importante del CYP extrahepático con expresión en casi todos los tejidos, como
son: riñón, próstata, glándulas mamarias y ovarios. Está localizado en el
8
Fig. 3. Modelo 3D gen CYP1B1
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
cromosoma 2p21-p22, constituido por tres exones y dos intrones; similar en
tamaño al gen CYP1A1 cuenta con 8.546 pares de bases de longitud.
Es una enzima que cataliza la formación de genotóxicos 4- hidroxi-
estradiol a catecol metabolito estrogénico por lo que posee una actividad
estrogénica significativa, este metabolito puede experimentar un ciclo redox
generando una mutación al producir radicales libres que pueden ocasionar
cambios significativos en el ADN y otras estructuras celulares. Esta enzima
también está involucrada en el metabolismo de hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAHs) y arilaminas y se ha sugerido su sobreexpresión en algunos
tumores [12].
El gen CYP 1B1 presenta varios alelos, en la actualidad se han reportado
42 variantes y aquéllos con actividad enzimática reducida han sido asociados
con glaucomas primarios congénitos[22].
El polimorfismo más común en CYP1B1 consiste en la sustitución de Valina en
el codón 432 por Leucina (Val432Leu), este cambio se asocia directamente con
el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12, 23].
Tóxicos
La mayoría de los tóxicos de uso frecuente son capaces de mutar al ADN
y transformar a las células hasta entidades totalmente extrañas para el
organismo, pueden ejercer efecto estrogénico sobre órganos o tejidos y pueden
causar inmunosupresión en los organismos [4].
Existe una larga lista de sustancias tóxicas, las cuales son consideradas
potencialmente peligrosas para la salud humana como son los hidrocarburos
aromáticos policíclicos (PAHs) un grupo de más de cien sustancias químicas
diferentes, formadas durante la combustión incompleta del carbón, el aceite, el
gas, la basura u otros compuestos orgánicos [24].
9
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Desde hace mas de cinco décadas los PAHs han sido el grupo de
compuestos que mayor interés ha despertado porque son empleados en
múltiples actividades y productos, por esa razón tienen una amplia distribución
en el planeta, algunos son extremadamente tóxicos y la mayoría son
químicamente muy estables por lo tanto persisten en el ambiente por largos
períodos de tiempo y son bioacumulables tanto en alimentos como en tejido
adiposo de humanos y animales, de ahí la importancia de su estudio [25,
26][4].
La exposición a sustancias químicas se lleva a cabo por la actividad
laboral de las personas [27], por la utilización o desecho de algunos productos
tales como: combustibles, lacas, pinturas, plásticos, hules, conservadores,
fumigantes, insecticidas, productos de limpieza, cosméticos y alimentos, entre
otros [25, 28, 29], y son pocas las personas que tienden a percibir que esta
exposición a tóxicos es perjudicial para su salud [7-9]. Las principales formas
de ingreso al organismo es por inhalación del aire contaminado; por el consumo
de alimentos con pesticidas; por el uso de fármacos y cosméticos, por el agua
para beber o absorción dérmica [30-32].
Los efectos de la exposición a cualquier sustancia tóxica dependen de la dosis,
la duración, la manera en que las personas están expuestas, sus hábitos y
características genéticas, así como de la presencia de otras sustancias químicas
[33].
10
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Cáncer de mama
Es una enfermedad multifactorial dependiente de hormonas con una
clara relación positiva a las altas concentraciones endógenas de estrógeno[34].
Representa una proliferación maligna de células epiteliales que revisten los
conductos o lobulillos mamarios [35].
Las mamas, están formadas por tejido glandular (tejido conectivo) así
como por tejido graso; del 70 al 80 % del peso total de la mama corresponde al
tejido adiposo. En la mama se encuentran las glándulas productoras de
leche[36] (lobulillos); las cuáles se encuentran en el tejido de sostén donde
también se localizan los conductos, los vasos sanguíneos y los linfáticos. Estos
últimos, transportan el líquido linfático cuyo contenido principal son proteínas y
células del sistema inmunológico las cuales son llevadas a los ganglios linfáticos
11
Fig. 4. Mamografía
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
axilares ubicados sobre la clavícula y otros lo conducen a los ganglios mamarios
internos ubicados cerca del esternón[36].
Al igual que otras neoplasias malignas, el cáncer de mama se inicia
cuando una célula normal escapa a los controles habituales de replicación y se
multiplica sin control. Esta evasión requiere de una acumulación de mutaciones
en los genes que regulan la división celular y aseguran la síntesis y replicación
del ADN. Ciertas hormonas y algunas sustancias tóxicas pueden promover
también el crecimiento celular anómalo hasta lograr el crecimiento del tumor en
la mama [33].
Los tumores invasivos de mama son histológicamente heterogéneos. Los
tipos de cáncer de mama se clasifican histológicamente en carcinoma ductal in
situ, carcinoma ductal infiltrante (o invasivo), casi el 80% de los casos de
cáncer de mama son de este tipo; carcinoma lobular in situ; carcinoma lobular
infiltrante (o invasivo), este tipo de cáncer se presenta en el 15% de las
mujeres que desarrollan cáncer de mama; y carcinoma inflamatorio,se observa
en cerca del 3% de los casos; entre otros subtipos raros (cuadro 1)[37, 38].
Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS [37, 38]
Tipo de tumor Clasificación
No infiltrante Carcinoma lobulillar in situCarcinoma ductal in situ
Invasor
Carcinoma ductal invasor no específico (NST) Carcinoma ductal invasor con extenso componente intraductal Carcinoma ductal invasor con enfermedad de PagerCarcinoma lobulillar invasorCarcinoma medular Carcinoma muscinoso o coloide Carcinoma papilar Carcinoma tubular Carcinoma adenoide quístico Carcinoma secretor (juvenil) Carcinoma apócrifo Carcinoma con metaplasma Tipo escamoso Tipo células fusiformes Tipo cartilaginoso y óseo Tipo mixto Carcinoma inflamatorio
12
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
En general, el cáncer de mama se estratifica utilizando las directrices del Comité
Conjunto Americano del Cáncer (American Joint Committee on Cancer –AJCC-)
conocida como clasificación TNM [39-41].
La clasificación para los subgrupos se realiza con números que van del I
al IV [39-41]. Los índices de supervivencia relativa a cinco años, según el
estadio del cáncer son los siguientes: I-98%, IIA-88%, IIB-76%, IIIA-56%,
IIIB-49% y IV-16%[35].
Signos y síntomas del cáncer de mama
El indicio más común de cáncer de mama, es la presencia de una
protuberancia en el seno, dura y fija. En casi la mitad de todos los casos esas
protuberancias suelen crecer cerca de los ganglios de la axila, en la parte
superior y externa de la mama; las cuales pueden llegar a distorsionar la forma
del seno haciéndolo parecer más grande o elevado, dándole un aspecto
asimétrico con respecto al otro seno [42].
El pezón de la mama afectada puede verse escamoso o reseco, retraído
o incluso sumido. En ocasiones puede presentarse salida de líquido por el
pezón, de color amarillento semi traslúcido o con sangre [43].
La piel de la mama también puede verse afectada observándose
acartonada y con pequeños hoyitos, similar a la de una cáscara de naranja.
Otras señales que podemos observar es inflamación, enrojecimiento, irritación,
descamación o grietas en la piel de la mama o del pezón, dolor en el pezón o
en el brazo. Así mismo pueden presentarse punzadas o piquetes que llegan
desde los hombros hasta el pezón o que se inician en el pezón y se profundizan
dentro de la mama en los conductos lactíferos [43].
Epidemiología de cáncer de mama
Actualmente, el cáncer de mama es la neoplasia que con mayor
frecuencia se diagnostica en las mujeres, representa 15% de todos los tipos de
13
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
cáncer [3] es la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres a nivel
internacional (las 411,000 muertes anuales representan el 14 por ciento de
muertes femeninas por este tipo de cáncer) [44].
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el año 2005
murieron 58 millones de personas en todo el mundo, de las cuales casi ocho
millones murieron por cáncer, y se estima que en el año 2015 aumentará a
nueve millones y para el 2030 a más de once millones de fallecimientos por
cáncer.[45-47].
Cuadro 2.Principales causas de muerte en México 2005-2030. Fuente OMS
De acuerdo al Registro Nacional de Cáncer, se ha estimado que en
México cada día mueren diez mujeres por cáncer de mama y una de cada ocho
mujeres lo desarrolla; por tal razón, en algunos estados del país esta es la
principal causa de muerte de mujeres en edad reproductiva (entre 15 y 64
años), 47 por ciento del total de muertes ocurre en mujeres entre 45 y 64 años,
debido a que el riesgo aumenta con la edad, como sucede con cualquier tipo de
cáncer[48].
14
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Tan sólo en el 2005, a nivel nacional se registraron 2,861 fallecimientos
de mujeres por cáncer de mama, lo que representa el 21 por ciento de las
muertes de mujeres por cáncer, comparado con el 19 por ciento que murieron
por cáncer cérvico-uterino.
La incidencia de cáncer de mama se ha incrementado en México año tras
año. Según el Sistema Nacional de Información en Salud (SINAIS), en el año
2000 se registró una incidencia de 10,758 y se tiene una estimación de 19,811
para el año 2012; esto representa un incremento anual del 1 por ciento en
promedio[47].
La tasa de mortalidad por cáncer de mama en mujeres mexicanas se
estimó en 14.7 por 100 mil mujeres mayores de 25 años, con una sobre vida de
38 por ciento dentro de los primeros cinco años después de haberse establecido
el diagnóstico y de 22 por ciento en los diez años posteriores al diagnóstico[4].
Factores de riesgo para cáncer de mama
Cuando el organismo funciona adecuadamente, es capaz de reconocer
microorganismos, virus o células que están dañadas o células tumorales, y los
destruyen para controlar las infecciones o el crecimiento de tumores[43, 49].
Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son factores
de tipo genético, principalmente mutaciones en los genes p53, BRCA1, BRCA2,
Her2, Her2Neu, otros son de tipo reproductivo, una menarca temprana (antes
de los 12 años), menopausia tardía (después de los 52 años), uso de hormonas
exógenas (contraceptivos orales, terapia de hormona de reemplazo), edad del
primer embarazo a término (después de los 30 años), nuliparidad, ausencia de
lactancia materna, pero también existen otros factores como malos hábitos en
la alimentación como exceso de grasas de origen animal, pobre ingesta de
antioxidantes o vitaminas de origen vegetal, ciertas adicciones como
alcoholismo o tabaquismo y drogadicción, y otros factores de tipo ambiental
como exposición laboral a tóxicos o residencia en áreas altamente
contaminadas[50].
15
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Dos tipos de cambios en el genoma son la acumulación de mutaciones
somáticas y el desarrollo de inestabilidad genética. Muchos tipos de cáncer
tienen un mayor número de mutaciones comparado con las células normales.
Existe una correlación directa entre la progresión del tumor y el número
de mutaciones. La mutación de genes reparadores conduce a un aumento en el
daño del ADN y con esto también se incrementa la tasa en que las mutaciones
pueden ocurrir. La inestabilidad genética está reflejada en cambios en el
número de genes en células cancerosas. Esto puede ser el resultado de
pequeñas duplicaciones o deleciones, translocaciones de material de un
cromosoma a otro o incluso cambios que afectan a cromosomas completos. La
inestabilidad cromosómica puede ser causada por complejos o proteínas que
actúan en la partición (anafase) durante la mitosis (cuadro 2) [51].
Los factores genéticos, incluyendo los genes de mayor susceptibilidad,
pueden explicar hasta el 10% de los casos de cáncer de mama en países
desarrollados [22, 52], pero su prevalencia en la población es demasiado baja
para explicar el aumento del uno por ciento anual sostenido a lo largo de los
últimos 20 años a nivel internacional. Por lo que se cree, que la mayoría debe
ser por lo tanto, una consecuencia a diversas exposiciones ambientales [5], [8,
27, 53].
De hecho recientemente se ha sugerido que el residir cerca de una zona
industrial y estar expuesto a las sustancias contaminantes del ambiente que
derivan de los procesos industriales puede ser la causa potencial del aumento
en las tasas de incidencia de cáncer de mama y de la posible variación en las
tasas alrededor del mundo [6]. Investigaciones recientes han demostrado que
los factores ambientales pueden desempeñar un papel importante en la
etiología de algunos tipos de canceres tales como tumores malignos en mama
o próstata[4, 29, 49, 54].
16
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Factores de riesgo de cáncer de mama Magnitud de riesgo
Factores confirmados
Edad incrementada ++ Región geográfica (EU y países del Oeste) ++Historia familiar de cáncer de mama ++Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 ++Mutaciones en otros genes de alta penetrancia (p53, ATM, NBS1,LKB1) ++
Exposición a radiación ionizante (en la niñez) ++Historia de enfermedad de mama benigna ++Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) ++ Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) ++ Edad temprana de menarca (menos de 12 años) ++ Nuliparidad y edad avanzada en el primer embarazo a término ++
Alta densidad en tejido mamario ++ Terapia de remplazo hormonal ++Uso prolongado de anticonceptivos orales ++ Obesidad en mujeres post-menopáusicas + Consumo de alcohol (una copa por día) + Estatura alta +
Factores probables
Altos niveles de factor de crecimiento parecido a insulina 1 (IGF1) ++
Altos niveles de prolactina + Consumo de grasas altamente saturadas + Polimorfismos en genes de baja penetrancia + Alto status socioeconómico +
Factores de riesgo de cáncer de mama Magnitud de riesgo
Factores confirmados
Región geográfica (Asia y África) ++ Edad temprana en el primer embarazo a término ++Alta paridad ++Lactancia (entre cuatro y seis meses de duración) ++Obesidad en mujeres premenopáusicas ++Consumo de frutos y vegetales ++Actividad Física ++Agentes quimiopreventivos ++
Factores probables Drogas anti-inflamatorias no esteroideas ++ Polimorfismos en genes de baja penetrancia +
Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama[50]
17
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
JUSTIFICACIÓN
Debido a que la mayoría de las personas están expuestas a una mezcla de
tóxicos presentes en el ambiente, resulta de gran importancia conocer la
frecuencia de los polimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 en
mujeres con cáncer de mama y que han estado expuestas a tóxicos en forma
más prolongada o por más tiempo. Si se encontrara que alguno de los
polimorfismos es más frecuente que otros, podría ser factible considerarlo en la
estimación de riesgo para desarrollar este tipo de cáncer en mujeres,
posteriormente está información sirva de base para realizar estudios ulteriores
que permitan contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Si se considera que de los genes en p450 CYP 1A1 y CYP 1B1, codifican para
las enzimas involucradas en el metabolismo de ciertos tóxicos [2], resulta
importante conocer las frecuencias de los polimorfismos de estos genes en
mujeres con cáncer de mama.
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál de lospolimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 será más
frecuente en mujeres que han desarrollado cáncer de mama?
19
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
HIPÓTESIS DE TRABAJO
Algunos de los polimorfismos que se presentan en los genes CYP 1A1 y 1B1,
entre ellos Ile462Val y Val432Leurespectivamente, están asociados al cáncer de
mama.
OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN
OBJETIVO GENERAL
Identificar y estimar la frecuencia de los polimorfismosde los genes CYP
1A1 y CYP 1B1 (Ile462Val y Val432Leu, respectivamente) en mujeres
que han desarrollado cáncer de mama y en un grupo de referencia,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
OBJETIVO PARTICULAR
Identificar y describir las frecuencias genotípicas y alélicas para los
polimorfismos Ile462Val y Val432Leu, en los genes CYP 1A1 y CYP 1B1.
20
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño del estudio. Transversal.
Universo de trabajo
Mujeres con Cáncer de Mama, que fueron pacientes de diferentes Hospitales o
Institutos, tales como la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE);
Hospital de Especialidades; del Centro Médico Nacional de Occidente del IMSS,
así como del Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde en Guadalajara, Jalisco y del
Instituto de Cirugía Reconstructiva; ambos de la Secretaría de Salud.
Tamaño de Muestra
Se considero todas las muestras de sangre periférica de pacientes con
diagnóstico de cáncer de mama reciente o que tuvieron cáncer,
correspondientes al período del 1 de enero del 2009 al 31 de diciembre del
2009, de acuerdo a los criterios de inclusión. El número total de muestras
seleccionadas fueron 151.
De las cuales 76 pertenece a muestras de sangre periférica de pacientes con
cáncer de mama, y 75 a muestras referencia de sangre periférica de individuos
del banco de sangre de Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO).
21
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Descripción de grupos de estudio
Casos con cáncer de mama. Pacientes que mediante ecosonograma de
mamas o mamografía presenten cáncer de mama con diagnóstico confirmado
mediante biopsia.
Referencia. Individuos pertenecientes a población en general de los cuales se
desconozcan sus datos clínicos, antecedentes personales y familiares. Este
grupo se consideró para establecer parámetros poblacionales de los
polimorfismos que se seleccionaron en el presente proyecto.
CRITERIOS DE SELECCIÓN
Criterios de inclusión (pacientes)
Mujeres con diagnóstico reciente o que tuvieron cáncer de mama.
Derechohabientes de la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145
(UMAE); Hospital de Gineco-obstetricia; Instituto de Cirugía
reconstructiva y; Hospital Civil; Guadalajara, Jal.
Referencia:
Individuos que acudieron al Banco de sangre del CMNO, como
donadores, de quienes se desconocen sus datos clínicos, antecedentes
personales y familiares.
Criterio de exclusión
Muestra de sangre insuficiente, sea perdida involuntariamente, se degrade o
contamine, antes o durante todos los procedimientos del análisis molecular.
22
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
VARIABLES
Variable dependiente
Polimorfismos encontrados de los genes CYP1A1 Y CYP1B1.
Polimorfismo: variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre
los individuos de una población.
Polimorfismos Gen CYP1A1: Ile462Val
Polimorfismos Gen CYP1B1: Val432Leu
Variable independiente
Como variable independiente se considerará el diagnóstico de cáncer de mama.
Cáncer de mama: Proliferación acelerada, desordenada y no controlada de
células con genes mutados, los cuales suprimen o estimulan la continuidad del
ciclo celular pertenecientes a distintos tejidos de una glándula mamaria.
Cuadro de Operacionalización de variables Variable Interrelación Naturaleza Medición Análisis
Polimorfismos
CYP1A1 (Ile462Val) y
CYP1B1 (Val432Leu)
Dependiente Cualitativa
Nominal
Dicotómica
(ausente/presente)
Chi
cuadrada
Cáncer de mama
Independiente
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
(ausente/presente)
Chi
cuadrada
23
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Descripción de las Técnicas
Extracción de ADN.
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama.
Se llevó a cabo la extracción de ADN de cada muestra mediante protocolos
previamente descritos. La sangre periférica (5 mL) se colectó en tubos con
EDTA como anticoagulante y la extracción de ADN se realizó por el método
Miller. La integridad y pureza se determinó mediante espectrofotometría y
electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Todas
las muestras una vez cuantificadas se ajustaron a 100 µg/mL para utilizarlas en
los procedimientos moleculares.
MMaaccrroommééttooddoo ddee MMiilllleerr
Tipo de muestra: Sangre periférica.
Reactivos Necesarios:
Solución buffer de lisis
Solución B
SDS
Proteinasa K
NaCl 6M
Etanol 100%
Etanol 70%
TE
24
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Preparación de reactivos
Solución buffer de lisis
Pesar 15.4 gr. de cloruro de amonio (NH4Cl) 0.44M y aforar en 2 Lt de agua
destilada.
Pesar 0.158 gr. de bicarbonato de amono NH4NCO3 0.01M.e hidratar en 200 mL
de la solución de NH4Cl 144 M mezclar y agregar al matraz de la primera
solución aforar a 2 Lt.
Solución B Miller.
Sustancias. Mili
moles
pH Gramos
Tris base 10 mM 7.5 0.6055
NaCl 40 mM 11.688
EDTA 2 mM 8.0 0.3722
En un Vaso 1000 mL colocar un agitado magnético
Vaciar 350 mL de agua bidestilada
Agregar el tris base ya que esté disuelto agregar en NaCl y al final el
EDTA
Ajustar pH a 8.2 (con HCl diluido)
Vaciar a un matraz de 1000 mL llevar a esterilizar
Posteriormente vaciarlo a un matraz volumétrico de 500 mL y aforar con
agua destilada estéril, mezclar y almacenar.
SDS al 20%.
Pesar 5 gr. de SDS y disolver en 25mL de agua destilada.
25
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Proteinasa K
Reactivo Gramos
Proteinasa K 0.050
SDS 0.5
EDTA 0.0372
Aforar a 50 mL para 100 muestras.
Colocar un agitador magnético limpio poner 35 mL de agua des-ionizada estéril
colocar el vaso en un plato con agitador agregar primero el EDTA, ya que esté
disuelto, vaciar el SDS (agitar suavemente cuidando que no se forme espuma),
agregar la proteinasa K hasta que se disuelva, vaciar a un tubo de 50 mL y
aforar.
*Cubrir de la luz con papel aluminio.
NaCl 6M
Pesar 35.1gr. de cloruro de sodio (NaCl) en 100 mL de agua destilada.
Etanol al 70%
Tomar 35 mL de etanol al 100% y aforar con 15 mL de agua destilada estéril.
TE
Reactivo Gramos
Tris base 0.0605
EDTA 0.0186
Pesar todo en ese orden, disolver y aforar a 50 mL con H2O destilada estéril.
26
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Equipo
Centrífuga refrigerada
Incubadora
Micro centrifuga
Congelador
Procedimiento
1.- Para obtener el botón se depositarán 10 mL de sangre periférica con EDTA
más solución buffer de lisis hasta aforar los tubos a 35 mL.
2.-Refrigerar por 10 minutos.
3.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. 4C.
4.-Decantar y lavar el botón con un poco de solución de lisis con movimiento
circular, retirar el sobrenadante y desbaratar el botón, .después agregar
solución de lisis hasta alcanzar un volumen de 25 mL.
5.-Centrifugar nuevamente a 3900 rpm 15 min. a 4C.
6.-Decantar y guardar el botón a -20C (opcional).
7.-Se re suspenderá el botón en 3 mL de solución B (búffer de lisis de Miller).
8.-Agregar 200 L de SDS al 10% + 500L de solución de proteinasa K,
agitar suavemente, 15 seg. en un vórtex.
.9.-Incubar 24-48 h. a 37C.
10.-Después de incubar se adicionará 1mL NaCl 6M
11.-Agitar en el vórtex durante 15 seg.
12.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. a -4C.
13.-Se tendrá preparados 10 mL de etanol frió al 100% en un tubo de 15 mL,
posteriormente se agrega el sobrenadante y se agita suavemente hasta
precipitar.
14.- Transferir el ADN precipitado en un tubo de 1.5 mL con una pipeta y se
agrega 750L de etanol al 70%.
15.-Centrifugar a 10,000 rpm de 3-5min.
1.6-Decantar el etanol
27
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
17.-Realizar un segundo lavado con 750L de etanol a 70%, centrifugando a
10,000 rpm durante 3min.
18.-Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente.
19.-Agregar búffer TE para re suspender el ADN.
IInntteeggrriiddaadd yy ppuurreezzaa
Método Electroforesis en geles de Agarosa
Equipo y Materiales
Cámara para electroforesis horizontal
Cama o soporte para hacer geles
Plancha de calentamiento
Balanza Analítica
Fuente de poder
Peine para hanchura de pozos de 8 dientes
Matraz Erlenmeyer de 100 mL
Guantes
Reactivos
Agarosa
Búffer TBE 1X
Agua Bidestilada
Nota: El gel debe prepararse en el mismo búffer de corrimiento, para
proporcionar las mismas condiciones en el soporte (gel) y en la fase líquida. El
corrimiento se realiza a un voltaje moderado que puede ser de 65 V durante 30
min. (hasta que se separen los colorantes del búffer cargador o jugo azul) y 80
V durante 30 min, dependiendo también del tamaño del fragmento y de la
cámara de electroforesis.
28
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Procedimiento
1. Pesar 0.75 gr. de agarosa y agregar cuidadosamente a un matraz
Erlenmeyer de 150 mL con 50 mL de TBE 1X, a pH de 8.0. Se coloca
sobre la placa para calentar (o en el microondas), se espera a que
comience a hervir.
2. Se agita suavemente el matraz para diluir todos los residuos de
agarosa, hasta que la solución quede cristalina.
3. Revisar el volumen de la agarosa disuelta y completar (aforar) a 100
mL con TBE 1X, mezclando suavemente por agitación.
4. Lavar previamente el molde en que se vaciará el gel y la cámara de
electroforesis. Poner el molde en una tabla o mesa nivelada.
5. Esperar a que la temperatura llegue aproximadamente a 55 ºC para
así aplicar la agarosa en el molde, cuidando que no queden burbujas
en la matriz del gel.
6. Poner el peine y esperar a que gelifique completamente, para
después remover el peine cuidando de no romper los bordes de los
pozos.
7. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y adicionar TBE 1X a un
pH de 8.0 observando que el nivel del búffer este aproximadamente
0.5 – 1cm por encima de la superficie del gel.
8. Colocar las muestras de ADN (previamente mezcladas sobre un
parafilm con jugo azul) en los pozos del gel. La cantidad dependerá
del tamaño de los pozos.
9. Conectar los cables de la fuente de poder. El voltaje debe estar en un
rango de 60 a 80 V. Recordar que el ADN tiene una migración
anódica: tiene carga negativa (-) y migrará hacia el cátodo (+) o polo
positivo.
Anotar condiciones de corrimiento para cada experimento particular.
29
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Rango de separación de ADN en geles de agarosa
Cantidad de Agarosa en el gen
(% [peso/volumen])
Rango de separación efectivo de ADN en
geles de agarosa
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
Método de tinción con bromuro de etidio
Equipo y material
Lámpara de luz ultravioleta o transiluminador
Máscaras protectora de luz ultravioleta
Charola para colocar el gel
Gasas
Guantes
Reactivos
Solución de bromuro de etidio
Agua bidestilada
Procedimiento
1. Colocar el gel en un envase plano (preferiblemente de vidrio) con 300
mL de solución de bromuro de etidio en 300 mL de agua destilada por 5-
15 min.
30
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
2. Pasar el gel a una charola con agua bidestilada por 1 ó 2 min. Según se
requiera.
3. Observar el gel con el ADN en el transiluminador de luz UV utilizando la
protección adecuada.
Método para cuantificación de ADN
Para cuantificar la cantidad de ADN o ARN, deben tomarse las lecturas de la
densidad óptica (DO) o absorbancia a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm
permite calcular la concentración de ácido nucleico en la muestra. Una DO de 1
corresponde a aproximadamente 50 µg/mL de ADN de doble cadena, 40 µg/ml
de ADN de cadena sencilla y ARN, y alrededor de 20 µg/mL de oligonucléotidos
de cadena sencilla. La tasa entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (DO260/ DO280)
proporciona un estimado de la pureza del ácido nucleico.
Las preparaciones puras de ADN o ARN tienen valores de DO260/DO280 de
1.8 y 2, respectivamente. Si hay una confirmación con proteínas o fenol, este
valor será significativamente menor y no será posible la cuantificación exacta
del ácido nucleico.
Procedimiento
1. Las muestras perfectamente homogéneas se bajan en la
microcentrífuga.
2. Encender en el espectro la lámpara de luz UV, si es computarizada
utilizar el programa para ácidos nucleicos.
3. Ajustar con el blanco el espectro, midiendo 1000 µL de agua bidestilada
o inyectable en la celdilla de cuarzo para el espectrofotómetro.
4. Rotular un tubo de 1.5 mL por cada muestra.
5. Colocar 995 µL de agua MilliQ en cada tubo.
6. Adicionar 5 µL de ADN a su tubo correspondiente.
7. Para cuantificar se coloca el contenido de cada tubo en la celdilla de
cuarzo, agitar perfectamente la solución y leer la muestra.
31
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
8. Se repiten los pasos 3 al 7 para cada muestra.
9. Registrar las lecturas de densidad óptica (DO) a 260 nm y 280 nm, para
calcular la cantidad de pureza del ADN.
Fórmula para calcular la concentración del ADN
Considerando que:
50 µg/mL de ADN de doble hebra absorben 1 DO a 260 nm.
La relación de lecturas de DO 260 nm/DO 280 nm nos proporciona
una estimación de la pureza de los ácidos nucleicos. Las
preparaciones puras de ADN presentan valores aproximados de 1.7 a
2.0.
CONCENTRACIÓN DE ADN (µg/mL) = (DO 260nm) (Factor de dilución) (50)
El factor de dilución en este caso es el volumen total de la celdilla entre el
volumen de la muestra (en este caso 200/1 0 200).
DDeetteecccciióónn ddee ppoolliimmoorrffiissmmooss
Para la detección de los polimorfismos se diseñaron protocolos de PCR/RFLP, la
descripción de cada uno se muestra en el cuadro 3.
Gen
Polimorfismo
Iniciadores
Tº de
alineamiento
(ºC)
Producto
amplificado
(pb)
Enzima de
restricción
Corte de
Enzima
CYP1A1
(Ile462Val)
F:5´GGC CCC AAC TAC TCA GAG GCT
3´
R:5´ GC TGA GCA ATC TGA CCC TA 3´
56
147
MspI
C CGG
CYP1B1
(Val432Leu)
F:5´ AAT TTC AGC TTG CCT CTT G 3´
R:5´ TCA CTT GCT TTT CTC TCT CC 3´
55
113
AcuI
CTGAAG_N(16)
Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1. Iniciadores y
enzima de restricción correspondiente para la genotipificación de cada polimorfismo.
32
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Para la selección de los polimorfismos de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se
consultó la base de datos SNP del NCBI. Se diseñaron iniciadores específicos a
partir de la secuencia obtenida del
GenBankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank para la amplificación de
fragmentos de ADN que contiene a los polimorfismos seleccionados de los
genes CYP1A1 Y CYP1B1 mediante el programa OligoTM v6.0.
Se llevó a cabo la estandarización a partir de las condiciones de reacción
mostradas en el cuadro 4 tanto para amplificación por PCR como para la
reacción de digestión con enzimas de restricción mostradas en el cuadro 5 para
la detección de los polimorfismos del cuadro 3.
Reactivos Concentración µL por reacción Muestra DNA 500ng/μL 1 Iniciador 1 (foward) 15 pmol/µL 1.5 Iniciador 2 (reverse) 15 pmol/µL 1.5 dNTP´s 100nM 2 Búffer 10 x (Mg+) 1 X 2.5 H²O cbp 25 µL 16.5 Taq pol 0.5 U 0.2 Volumen total por tubo
- 25
Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR.
*Mg+, mercurio *Taq pol
Reactivos Concentración µL por reacción
Búffer (depende de cada enzima) 1 X 2
Enzima de restricción 1 U 0.2
Agua cbp 20 µL 2.8
Producto amplificado - 15
Volumen final 20
Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión con enzimas de restricción.
33
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
TTééccnniiccaa RReeaacccciióónn eenn CCaaddeennaa ddee llaa PPoolliimmeerraassaa ((PPCCRR))
La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés
Polymerase Chain Reaction) es un método que permite la amplificación
selectiva in vitro de secuencias específicas del ADN blanco a partir de una
fuente heterogénea y grande como el ADN genómico.
Condiciones
95 °C/4min
95 °C/10seg
60 °C/30seg
72 °C/1 1/2min
72 °C/5min
Ciclos: 35
Paso 1.-Se preparará Mix1, en un tubo estéril de 0.2 µL (en hielo) de la
siguiente manera:
MIX1 Volúmenes
cDNA 1.0 µL
Primer 1 1.5 µL
Primer 2 1.5 µL
H2O 1.5 µL
Σ= 5.5 µL
Paso 2.-Se preparará Mix2 cbp todas las relaciones del paso anterior en un tubo
de 2 ml estéril (en hielo).
Paso 3.- Agregar 15.0 µl de la Mix2 a cada tubo del paso 1 (trabajar en hielo)
Paso 4.-Homogenizar cada tubo y colocar en el termociclador.
34
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
DDeessccrriippcciióónn ddee eennzziimmaass ddee rreessttrriicccciióónn
MspI
Sitio de reconocimiento: C CGG
GCC G
Temperatura de reacción: 37 ºC
Concentración: 5 U/µL46
AcuI
Sitio de reconocimiento: CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN ... ...
GACTTCNNNNNNNNNNNNNNNNN ... ...
Temperatura de reacción: 37 º C
Concentración: 10 U/µL
35
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Análisis Estadístico
Se realizó conteo génico para establecer frecuencias génicas y
genotípicas y mediante la prueba de Χ2 de bondad de ajuste se calculó el
equilibrio Hardy-Weinberg. Las frecuencias de los genotipos fueron
determinadas por conteo genotípico y la prueba estadística fue Χ2.
Se calculó un Intervalo de Confianza de 95 % para las mediciones
obtenidas y un valor de p < 0.05 se considero significativo.
Consideraciones éticas
El protocolo de estudio fue elaborado de acuerdo con la Norma Oficial
Mexicana en materia de investigación en humanos y de acuerdo con las normas
de bioética que establece al respecto en la Ley General de Salud de la
República Mexicana haciendo hincapié en los artículos estipulados en el titulo
segundo capítulo I (Art.13, 14, 15, 16). Conforme al artículo 17 el presente
proyecto se encuentra en la categoría de investigación con riesgo mínimo [55].
Durante todo el estudio, se observaran los lineamientos definidos en el tratado
de Helsinki y en las enmiendas realizadas a éste, en Tokio, en relación con la
realización de investigación en humanos [56].
36
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
RESULTADOS
Población estudiada
Se captaron un total de 151 muestras de sangre periférica que se
clasificaron en 76 casos (con cáncer de mama) y 75 individuos de referencia
(población general) para establecer parámetros poblacionales de los
polimorfismos.
Análisis Molecular
Las figuras 4 y 5 muestran la amplificación y digestión del polimorfismo
Ile462Val del gen CYP1A1. El fragmento amplificado tiene un tamaño de 147
pb. En la digestión con la enzima MspI se observaron dos bandas de 90 y 61
pb.
Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de
agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los
carriles es de 147 pb, M: escalera de 100 pb.
37
147 pb
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de agarosa al 1.5%
teñido con bromuro de etidio. Se observan dos bandas de 90 y 61 pb. Genotipos en números negros:
genotipo 1, Ile/Ile (carriles 1,3,5,6,7), genotipo 2, Ile/Val (carriles 2,4,8,9,10,11,13) y genotipo 3, Val/Val
(carril 12).
Se detectó el polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 al amplificar un producto
de 113 pb y digestión de este con la enzima AcuI donde se observaron dos
bandas de 95 y 75 pb lo que se muestra en las figuras 6 y 7.
Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al
1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los carriles es de 113 pb,
M: escalera de 100 pb.
38
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al 1.5%
teñido con bromuro de etidio. Genotipos en números negros: genotipo 1, Leu/Leu (carril 1), genotipo 2,
Leu/Val (carriles 4,5) y genotipo 3, Val/Val (carril 3).
Análisis estadístico
Mediante conteo génico se realizó la determinación de la frecuencia de
los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 en
mujeres con cáncer de mama. Se determinó la frecuencia de los polimorfismos
mencionados en población en general (referencia) para determinar si los
genotipos se encontraban en equilibrio Hardy-Weinberg, ya que los
polimorfismos no han sido analizados en población Mexicana por lo que se
desconocen sus frecuencias en ésta.
El polimorfismo que mayormente se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en
51 casos de mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la
población de referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del
gen CYP1B1 que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama
(32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%). La frecuencia de los
polimorfismos analizados en los grupos cáncer de mama y en la población de
referencia se muestra en el cuadro 6 y 7.
39
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Polimorfismo Genotipos Ca mama
Casos (porcentaje)
Referencia
Casos (porcentaje)
Ile462Val
AA 10 (19.60) 13 (29.54)
AG 18 (35.29) 11 (25)
GG 23 (45.09) 20 (45.45)
Total 51 44
Leu432Val
GG 7 (28) 10 (32.25)
GC 10 (40) 12 (38.70)
CC 8 (32) 9 (29.03)
Total 25 31
Cuadro 7. Frecuencia genotípica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes
CYP1A1 y CYP1B1, en grupo con cáncer mama y de referencia.
Polimorfismo Alelos Ca mama
Casos (porcentaje)
Referencia
Casos (porcentaje)
Ile462Val
A 37 (36.27) 29 (32.95)
G 65 (63.72) 59 (67.04)
Total 102 88
Leu432Val
G 17 (34) 42 (67.74)
C 33 (66) 20(32.25)
Total 50 62
Cuadro 8. Frecuencia alélica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1
y CYP1B1, en grupo con cáncer de mama y de referencia.
Los genotipos de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1
Y CYP1B1, se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg. Las consideraciones
estadísticas entre los grupos se describen en el cuadro 8.
40
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Polimorfismo Ca mama Referencia
Ile462Val
Χ2=2.5851
P= 0.0582
Χ2= 0.4084
P=0.4152
Leu432Val Χ2=1.1918
P=0.5494
Χ2=1.8476
P=0.3970
Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg de la distribución de los genotipos de los
polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en los grupos de estudio.
La determinación de la prueba de chi cuadrada y el valor de p de los
polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 se
describen en el cuadro 9.
Polimorfismo Ca mama %
Referencia %
Ile462Val
67.10
58.66
Leu432Val
32.89
41.33
Χ2 = 0.47870634
P = 0.7921
Χ2 = 0.67709214
P = 0.2785
Cuadro 10. Determinación de chi cuadrada y valor de p en los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val
de los genes CYP1A1 y CYP1B1.
41
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Las frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos Ile462Val y
Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se muestran en la figura 8 y 9
respectivamente.
Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en
grupo con cáncer de mama y de referencia
Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 en
el grupo con cáncer de mama y grupo de referencia
42
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
DISCUSIÓN
En mujeres, el cáncer de mama es una de las principales causas de muerte. La
complicación más frecuente es la invasión, la cual puede presentarse por un
gran número de factores entre los cuales están un diagnóstico tardío o erróneo,
antecedentes familiares y la susceptibilidad personal hacia la metástasis. En la
bibliografía internacional numerosos estudios describen y clasifican los genes
que intervienen o participan en el cáncer de mama. El presente estudio analiza
los genes que se asocian al incremento del riesgo de cáncer de mama mediante
la identificación de genotipos particulares. Los polimorfismos Ile462Val y
Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 respectivamente, no han sido
analizados en población Mexicana, únicamente se han estudiado en población
Caucásica y China pero con asociación a otro tipo de cáncer como el de
pulmón.
Existen varios factores que pueden alterar no sólo la producción, sino también
la exposición a las hormonas endógenas, como la edad de la menarquía, edad
del primer embarazo a término, número de embarazos y la edad de la
menopausia, y muchos de estos factores tienen un efecto adicional en el riesgo
de desarrollar cáncer de mama[5, 34, 57]. Por lo tanto, los genes implicados
en el metabolismo de las hormonas sexuales son candidatos a genes de
susceptibilidad para desarrollar cáncer de mama.
Los genes que están en la ruta de biosíntesis de hormonas sexuales pueden
afectar la síntesis y el periodo de exposición del estrógeno más activo, el
estradiol. Los genes que se encuentran en esta vía son los de la familia de
CYP.[45, 46]
En este estudio nosotros consideramos importante estudiar estos genes debido
a que muchos tóxicos ambientales tienen la capacidad de ingresar al organismo
y competir por el sitio activo del receptor a estrógeno con lo cual sin tener una
naturaleza de hormona, se comportan como tal y pueden ejercer algunas de las
43
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
funciones que se han descrito para las hormonas, en particular, para los
estrógenos, como son la capacidad de incrementar el índice mitótico en muchos
tipos de células, pero algunos tóxicos adicionalmente también pueden inducir
mutaciones e inmunosupresión[4, 58]. Por esta razón muchos hidrocarburos
han sido llamados xenoestrógenos y han sido asociados al incremento del
riesgo para desarrollar algunos tipos de tumores malignos, en especial aquellos
que son de tipo hormono-dependiente como es el cáncer de mama o el de
próstata [29, 49, 58].
En particular la CYP1A1 es una enzima extrahepática. Su expresión
constitutiva es muy baja, pero es muy inducible por ligandos del receptor Ah
(hidrocarburos aromáticos policíclicos, dioxinas, humo del tabaco y otros
xenoestrógenos) por lo que la exposición a estos compuestos aumenta de
forma significativa sus niveles en tejidos como el pulmón, la placenta, la
glándula mamaria o los linfocitos [10, 11, 59].
En otras poblaciones estudiadas anteriormente algunas de las variantes
polimórficas, se han relacionado con una mayor incidencia del cáncer de
pulmón en algunos grupos de población, sin embargo no había evidencia de un
riesgo mayor de desarrollar cáncer de mama entre las mujeres que
presentaban alguna de las variantes polimórficas de los genes CYP1A1 o
CYP1B1. [12, 20, 60]
Ningún reporte anterior demostró un aumento de riesgo de cáncer de
mama asociado con algún polimorfismo en particular de estos genes. Sin
embargo, se publicó recientemente un meta-análisis que informó de un OR de
0.91 (IC 95% 0.79, 1.04) asociado con la condición de ser heterocigoto Asn/Ser
y un OR de 0.85 (95% IC 0,54, 1,34) asociado con la condición de ser
homocigoto Ser/Ser para estos genes y un riesgo mayor para desarrollar cáncer
de mama[23]. Esto es importante debido a algunas variantes polimórficas de
los genes CYP1A1 y CYP1B1 han mostrado ser funcionalmente más eficientes
en su actividad catalítica para la conversión de estrógeno a 4-hidroxi-estrógeno
44
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
y de algunos tóxicos en compuestos menos agresivos, por medio de procesos
de metilación, así como diferentes respuestas ante la exposición a tóxicos y
niveles de daño al ADN, este mecanismo puede ser el más relevante en la
presentación de una enfermedad benigna del tejido mamario y su progresión
hasta cáncer de mama, incluso con la formación de metástasis[61-63].
Nuestros resultados mostraron que el polimorfismo que mayormente
se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de mujeres con cáncer
de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de referencia (58.6%) con
un valor de p=0.7921; a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1
que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y
en 31 de las muestras de referencia (41.3%) con un valor de p=0.2785.
Consideramos que pese a que nuestra muestra fue pequeña, la
diferencia que encontramos puede sugerir que debido a que las enzimas
CYP1A1 y CYP1A2 juegan un papel importante en la activación de algunos pro-
carcinógenos, convirtiéndolos en metabolitos intermediarios que pueden unirse
al ADN originando mutaciones[1],y que la CYP1A1 activa el beno(a)pireno y
otros hidrocarburos aromáticos policíclicos, y participa fundamentalmente en la
activación de nitrosaminas, aflatoxina B1 y aminas aromáticas[59, 64], con las
cuales muchas personas tienen exposición no sólo por actividad laboral o por
lugar de residencia, sino también por tóxicos que son ingeridos en los
productos para la alimentación o para uso domestico, y es muy posible que la
variante polimórfica que nosotros encontramos como más frecuente, no sea la
más apta para el adecuado metabolismo de los tóxicos y que muchas de las
mujeres que desarrollaron este tipo de tumor hubieran sido susceptibles por
esta deficiencia en esta enzima.
En el caso del CYP1B1 que también se expresa de forma constitutiva en el
riñón, próstata, glándula mamaria o el ovario, pero no en el hígado [12, 61]. Y
que en general su expresión basal (en situaciones de no inducción) es mayor
que la del CYP1A1 y que participa tanto en el metabolismo de estrógenos como
45
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
de hidrocarburos aromáticos policíclicos y de aminas heterocíclicas [19, 22, 61,
62]. Para este gen del CYPlB1 se han descrito diferentes variaciones alélicas
algunas de las cuales se traducen en una alteración funcional [22, 63]. Se ha
sugerido un posible papel del enzima como modulador de ciertos procesos de
crecimiento y diferenciación, así como una sobreexpresión del mismo en
algunos tumores[12, 62]. Sin embargo, en este estudio nosotros observamos
que esta variante Leu432Val del gen CYP1B1 (32.9%) que fue encontrada para
esta población estudiada no fue significativamente diferente a la reportada para
la variante Ile462Val del gen CYP1A1(67.1%), lo cual podría tener explicación
en el tipo de agentes tóxicos a los que estuvieron expuestas estas pacientes o
sus factores de exposición a estrógenos endógenos que pudieron jugar un
papel importante como ya lo hemos mencionado.
Es importante señalar que las limitantes principales de este estudio fue el
de encontrar personas que de acuerdo a los criterios de inclusión desearan
participar en el estudio, lo cual redujo nuestro universo de trabajo. Sin
embargo, aun cuando nuestra población de estudio fue pequeña la posibilidad
de identificar la frecuencia de los polimorfismos de los genes de la familia CYP1
fue importante debido a que podría ser factible considerarlo en la estimación
de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la información de
toxicidad de ciertas sustancias.
46
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio indican una clara diferencia en la
frecuencia de los polimorfismos Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de
mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de
referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1
que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y
en 31 de las muestras de referencia (41.3%). Siendo el polimorfismos del gen
CYP1A1 el que con mayor frecuencia se observó en el grupo con cáncer de
mama, a diferencia del grupo tomado como referencia.
47
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
PERSPECTIVAS
La identificación y estimación de la frecuencia de los polimorfismos de los
genes de la familia CYP1, es importante debido a que podría ser factible
considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para
contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.
Es necesario hacer un estudio con un mayor tamaño de muestra, ya que
el análisis estadístico puede encontrarse en el límite de la diferencia
significativa, por el reducido número de individuos analizados debido a las
dificultades técnicas para conseguir muestras.
El cáncer de mama es una enfermedad heterógenea debido a sus
múltiples formas de presentación, es por esto que es importante realizar otros
estudios que permitan determinar la distribución de los polimorfismos en todo
el país, así como su interacción con otros factores tanto genéticos como
ambientales
Es el primer estudio en nuestro conocimiento que realiza una estimación de la
frecuencia de los polimorfismos presentados asociados con el incremento del
riesgo para cáncer de mama en población Mexicana. Es necesario incrementar
el número de polimorfismos de los genes estudiados para poder analizar de qué
manera contribuyen al desarrollo de este tipo de tumor y de esta forma poder
considerarlo, en un futuro, en la estimación de riesgo.
49
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
ANEXOS
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Anexo I. Carta Consentimiento Informado
Guadalajara, Jalisco a _____de_____del 200_
A quien corresponda:
Por este medio comunico que se me ha informado con detalle, los objetivos, alcances y
beneficios del proyecto de investigación “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1
y CYP1B1 en mujeres con Cáncer de Mama”, en el cual deseo participar libre y voluntariamente.
Se me ha explicado claramente que mi participación consiste, en permitir que el personal
responsable del proyecto, me realice preguntas para la elaboración de mi historia clínica, que
me tomen muestras de sangre, en las fechas que se me indique. Asimismo estoy informada que
voy a recibir los resultados de mis estudios y que puedo solicitar mas información si tuviera
alguna duda en cuanto a ellos.
Se me ha indicado también, que puedo dejar de participar en el proyecto en el momento en
que yo así lo desee y que esta decisión no tendrá ninguna consecuencia negativa para mí, ni
para recibir la atención médica que requiera.
____________________________________
Nombre y firma del participante
Domicilio ____________________________
Teléfono ____________________________
____________________________ _________________________
Nombre del Testigo Firma del Testigo
____________________________ ______________________________
Investigador Responsable
Dra. Ruth De Celis Carrillo Biol. Laura Janin Muñoz Islas
Lab. de Oncología Ambiental Lab. Oncología Ambiental
División de Inmunología, CIBO, IMSS División de Inmunología, CIBO, IMSS
53
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Santiago, C.F.B.y.F.G.G., Citocromo P450: Papel como marcador
biológico. Medicina del Trabajo, 2002: p. 130-140.
2. Santiago, F.B.y.F.G.-G., CITOCROMO P450: PAPEL COMO MARCADOR
BIOLÓGICO. Medicina del Trabajo, 2002: p. 130-140.
3. Parkin, D.M., et al., Global cancer statistics, 2002.CA Cancer J Clin, 2005.
55(2): p. 74-108.
4. De Celis, R.Morgan G., et. al. , Breast cancer and exposure to aromatic
hydrocarbon. e-Gnosis online 2006. 02-09 DOI: .
5. Boffetta, P. and F. Nyberg, Contribution of environmental factors to
cancer risk. Br Med Bull, 2003. 68: p. 71-94.
6. Laden, F., et al., 1,1-Dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene and
polychlorinated biphenyls and breast cancer: combined analysis of five
U.S. studies. J Natl Cancer Inst, 2001. 93(10): p. 768-76.
7. Kroenke, C.H., et al., Caregiving stress, endogenous sex steroid hormone
levels, and breast cancer incidence. Am J Epidemiol, 2004. 159(11): p.
1019-27.
8. Rushton, L., How much does the environment contribute to cancer?
Occup Environ Med, 2003. 60(2): p. 150-6; quiz 156, 80.
9. Tse, L.A. and I.T. Yu, Re: 'Occupational exposures and risks of liver
cancer among Shanghai female textile workers--a case-cohort study'. Int
J Epidemiol, 2006. 35(5): p. 1359.
55
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
10. Masson, L.F., et al., Cytochrome P-450 1A1 gene polymorphisms and risk
of breast cancer: a HuGE review. Am J Epidemiol, 2005. 161(10): p.
901-15.
11. Kisselev, P., et al., Association of CYP1A1 polymorphisms with differential
metabolic activation of 17beta-estradiol and estrone. Cancer Res, 2005.
65(7): p. 2972-8.
12. De Vivo, I., et al., Association of CYP1B1 polymorphisms and breast
cancer risk.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002. 11(5): p. 489-92.
13. Tamarín., H.R., Principios de Genética. Reverté ed. 1996. 250-51.
14. Stanfield, W.D., Genética. Mc Graw Hill ed. 1992. 340-343.
15. Lewin, B., Genes VII. Oxford University Press ed. Vol. I. 2000. 41-4.
16. Lai, J., et al., CYP gene polymorphisms and early menarche. Mol Genet
Metab, 2001. 74(4): p. 449-57.
17. Orellana, M. and V. Guajardo, [Cytochrome P450 activity and its
alteration in different diseases]. Rev Med Chil, 2004. 132(1): p. 85-94.
18. McFadyen, M.C., W.T. Melvin, and G.I. Murray, Cytochrome P450
enzymes: novel options for cancer therapeutics. Mol Cancer Ther, 2004.
3(3): p. 363-71.
19. Green, R.M., et al., Reactive oxygen species from the uncoupling of
human cytochrome P450 1B1 may contribute to the carcinogenicity of
dioxin-like polychlorinated biphenyls. Mutagenesis, 2008. 23(6): p. 457-
63.
56
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
20. Mense, S.M., J. Chhabra, and H.K. Bhat, Preferential induction of
cytochrome P450 1A1 over cytochrome P450 1B1 in human breast epithelial
cells following exposure to quercetin. J Steroid Biochem Mol Biol, 2008.
110(1-2): p. 157-62.
21. Taylor, R.T., et al., Roles of coactivator proteins in dioxin induction of
CYP1A1 and CYP1B1 in human breast cancer cells. Toxicol Sci, 2009.
107(1): p. 1-8.
22. Dong, L.M., et al., Genetic susceptibility to cancer: the role of
polymorphisms in candidate genes. Jama, 2008. 299(20): p. 2423-36.
23. Paracchini, V., et al., Meta- and pooled analyses of the cytochrome P-450
1B1 Val432Leu polymorphism and breast cancer: a HuGE-GSEC review.
Am J Epidemiol, 2007. 165(2): p. 115-25.
24. ATSDR and A.f.t.s.a.d. registry, Toxicological profile for polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs). in Polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAHs). 2002: Atlanta, G.A.
25. Bonner, M.R., et al., Breast cancer risk and exposure in early life to
polycyclic aromatic hydrocarbons using total suspended particulates as a
proxy measure. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005. 14(1): p. 53-
60.
26. Burns, C., et al., A cancer incidence and mortality study of Dow Chemical
Canada Inc. manufacturing sites. Occup Med (Lond), 2005. 55(8): p.
618-24.
57
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
27. Gunier, R.B., et al., Estimating exposure to polycyclic aromatic
hydrocarbons: a comparison of survey, biological monitoring, and
geographic information system-based methods. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev, 2006. 15(7): p. 1376-81.
28. Roberts, R.J., J. Steward, and G. John, Cement, cancers and clusters: an
investigation of a claim of a local excess cancer risk related to a cement
works. J Public Health Med, 2003. 25(4): p. 351-7.
29. Engel, L.S., et al., Pesticide use and breast cancer risk among farmers'
wives in the agricultural health study. Am J Epidemiol, 2005. 161(2): p.
121-35.
30. McElroy, J.A., et al., Potential exposure to PCBs, DDT, and PBDEs from
sport-caught fish consumption in relation to breast cancer risk in
Wisconsin. Environ Health Perspect, 2004. 112(2): p. 156-62.
31. Fawell, J. and M.J. Nieuwenhuijsen, Contaminants in drinking water. Br
Med Bull, 2003. 68: p. 199-208.
32. Rusiecki, J.A., et al., Cancer incidence among pesticide applicators
exposed to atrazine in the Agricultural Health Study. J Natl Cancer Inst,
2004. 96(18): p. 1375-82.
33. Hoyer, A.P., et al., Organochlorine exposure and risk of breast cancer.
Lancet, 1998. 352(9143): p. 1816-20.
34. Hankinson, S. and D. Hunter, Breast cancer. Textbook of cancer
epidemiology. 2002, New York. 301-39.
58
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
35. PD, S. Cuadro clínico del cáncer de mama. Exámenes de laboratorio.
[cited 2007; Available from:
http://escuela.med.puc.cl/paginas/alumnos/Quinto/temas
Quinto/medicina/28spring.htm. .
36. Dickson, R. and M. Lippman, Molecular Biology of Breast Cancer, in
Cancer, Principles & Practice of Oncology, H.S. DeVita VT, Rosenberg
SA., Editor. 2001, Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA 19106
USA. p. 1633-1651.
37. Ahearne PM, L.S., Feig BW, Cáncer de mama invasivo. Segunda edición
ed. En MD Adreason Oncología. 2000, Marban España. 13-37.
38. Detección y atención integral del cáncer de mama. Ed. Martínez
Montañez OG, Mainero Ratchelous F. ed. Guía técnica. 2004.
39. Woodward, W.A., et al., Changes in the 2003 American Joint Committee
on Cancer staging for breast cancer dramatically affect stage-specific
survival. J Clin Oncol, 2003. 21(17): p. 3244-8.
40. Singletary, S.E., et al., Revision of the American Joint Committee on
Cancer staging system for breast cancer. J Clin Oncol, 2002. 20(17): p.
3628-36.
41. Singletary, S.E. and J.L. Connolly, Breast cancer staging: working with
the sixth edition of the AJCC Cancer Staging Manual. CA Cancer J Clin,
2006. 56(1): p. 37-47; quiz 50-1.
59
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
42. Cancer, C.G.o.H.F.i.B., Breast cancer and hormone replacement therapy:
collaborative reanalysis of data from 51 epidemiological studies of 52,
705 women with breast cancer and 108, 411 women without breast
cancer. Lancet, 1997. 350: p. 1047-1050.
43. El Hanchi, Z., et al., [Bilateral breast cancer. Incidence and risk factors].
Gynecol Obstet Fertil, 2004. 32(2): p. 128-34.
44. Parkin, D.M., F.I. Bray, and S.S. Devesa, Cancer burden in the year
2000. The global picture. Eur J Cancer, 2001. 37 Suppl 8: p. S4-66.
45. Bakken, K., [Is estrogen therapy of significance for the incidence of
breast cancer?]. Tidsskr Nor Laegeforen, 2004. 124(21): p. 2801; author
reply 2801.
46. Bajdik, C.D., et al., Do work-related breast cancer risks in pre-
menopausal women depend on family history?Chronic Dis Can, 2004.
25(3-4): p. 147-51.
47. Epidemiología, D.G.d., Registro Nacional de Cáncer. 2003, Secretaría de
Salud: México.
48. Bray, F., P. McCarron, and D.M. Parkin, The changing global patterns of
female breast cancer incidence and mortality. Breast Cancer Res, 2004.
6(6): p. 229-39.
49. Gapstur, S.M., et al., Associations of breast cancer risk factors with
breast density in Hispanic women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,
2003. 12(10): p. 1074-80.
60
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
50. Dumitrescu, R.G. and I. Cotarla, Understanding breast cancer risk --
where do we stand in 2005? J Cell Mol Med, 2005. 9(1): p. 208-21.
51. Lewin, Genes VIII. Pearson Pretince Hall ed. Vol. Oncogenes and cancer.
2004, Upper Saddle River. 889-938.
52. McPherson, K., C.M. Steel, and J.M. Dixon, ABC of breast diseases.
Breast cancer-epidemiology, risk factors, and genetics. Bmj, 2000.
321(7261): p. 624-8.
53. Guo, S., et al., Green tea polyphenol epigallocatechin-3 gallate (EGCG)
affects gene expression of breast cancer cells transformed by the
carcinogen 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. J Nutr, 2005. 135(12
Suppl): p. 2978S-2986S.
54. De Celis, R., A. Feria-Velasco, et al, "Expression of NK cells activation
receptors after occupational exposure to toxics A preliminary
study".Immunology Letters, 2008. 118: p. 125–131.
55. Salud, S.N.d., Ley General de Salud, in Diario Oficial del Gobierno del
México. 2001: México, D.F.
56. Association, W.M., Declaration of Helsinki. Ethical principles for medical
research involving human subjects. Note of Clarification on Paragraph 30
added by the WMA General Assembly, Tokyo. 2004.
57. Kelsey, J.L., M.D. Gammon, and E.M. John, Reproductive factors and
breast cancer.Epidemiol Rev, 1993. 15(1): p. 36-47.
61
Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama
58. De Celis, R.a.A.F.-V., Efecto de la contaminación ambiental por
hidrocarburos sobre la respuesta inmune.Inmunidad y Ambiente, 2004:
p. 218.
59. Whitlock, J.P., Jr., Induction of cytochrome P4501A1. Annu Rev
Pharmacol Toxicol, 1999. 39: p. 103-25.
60. McFadyen, M.C., W.T. Melvin, and G.I. Murray, Cytochrome P450
CYP1B1 activity in renal cell carcinoma. Br J Cancer, 2004. 91(5): p.
966-71.
61. Wen, W., et al., Cytochrome P450 1B1 and catechol-O-methyltransferase
genetic polymorphisms and breast cancer risk in Chinese women: results
from the shanghai breast cancer study and a meta-analysis. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev, 2005. 14(2): p. 329-35.
62. Hanna, I.H., et al., Cytochrome P450 1B1 (CYP1B1) pharmacogenetics:
association of polymorphisms with functional differences in estrogen
hydroxylation activity. Cancer Res, 2000. 60(13): p. 3440-4.
63. Shimada, T., et al., Catalytic properties of polymorphic human
cytochrome P450 1B1 variants. Carcinogenesis, 1999. 20(8): p. 1607-13.
64. Schwarz, D., P. Kisselev, and I. Roots, CYP1A1 genotype-selective
inhibition of benzo[a]pyrene activation by quercetin.Eur J Cancer, 2005.
41(1): p. 151-8.
62