Post on 30-Aug-2019
transcript
Fonaments de la imatge digital
Marta Valeri Sala, MSc, Biòloga
Responsable de la Unitat de Microscòpia
UAT - VHIR
Imatge Digital
La imatge digital és una matriu numèrica de punts d’una determinada
mida anomenats píxels.
Es tracta d’una funció discontínua on cada punt tindrà un valor numèric
que dependrà de la intensitat de llum captada en aquell punt.
Ángel Martínez Nistal
Servicio de Proceso de Imágenes
Universidad de Oviedo
128 x 128 256 x 256
512 x 512 1024 x 1024
Imatge Digital Resolució espacial
A més píxels les imatges:
Són més contínues, amb més informació.
El temps d’exposició de la mostra serà més gran.
L’arxiu ocuparà més espai.
La resolució temporal disminuirà.
Imatge Digital
128 x 128
256 x 256
512 x 512
1024 x 1024
Resolució espacial
Criteri de Nyquist
Per poder diferenciar bé entre dues estructures, la
mida del píxel/vòxel ha de ser almenys la meitat
(1/2.3) de la distància entre aquestes.
No podem diferenciar entre les dues estructures.
Adquisició Microscòpia
Microscòpia
Per obtenir la mida del píxel desitjada podem:
Canviar a un objectiu d’un altre augment.
Fer un zoom òptic de la imatge: el zoom òptim és aquell que compleix el criteri de Nyquist
Variar el format d’adquisició ( 256 x 256, 1024 x 1024...).
Fer binning (càmeres CCD).
Oversampling o zoom buit
undersampling
mida correcta
Imatges amb els límits de les estructures
menys definits.
Sobreexposició de la mostra a la llum.
Arxius amb molt més pes.
Disminució de la resolució espacial
Menys degradació del fluorocrom
Aparició d’artefactes, pèrdua
d’estructures.
Resolució espacial
Imatge Digital Càmeres CCD i PMT
Binning 2 x 2 Binning 3 x 3
Pèrdua de resolució.
Millora de la relació senyal/soroll de fons.
Millora de la velocitat d’adquisició.
Disminució de la fotodestrucció.
Imatge Digital
Rang Dinàmic: nivells de gris
Resolució cromàtica
Profunditat
A cada nivell de gris se li assignarà un valor numèric.
El valor numèric de cada píxel és una mesura indirecta de la quantitat de biomolècula
marcada existent.
És molt important treballar amb la imatge de base o una còpia d’aquesta sense modificar.
Cal ser molt rigorós en la preparació, el manteniment dels paràmetres d’adquisició i la
modificació de les imatges a avaluar.
Ángel Martínez Nistal
Servicio de Proceso de Imágenes
Universidad de Oviedo
Imatge Digital
Color blanc/gris
Color RGB
Resolució cromàtica
Color CMYK
Imatge Digital
Color indexat
Les impresores fan servir aquest mode.
Admet imatges de 8 bits (fins a 256 colors).
L’ avantatge és que obtenim imatges de color que ocupen
molt menys espai.
Resolució cromàtica
Imatge Digital Paletes de colors
Imatge Digital Resolució cromàtica
Artefactes i pèrdua d’informació en l’adquisició de la imatge:
Imatge amb les
estructures que tenen
forma de xinxeta
sobresaturades
Imatge sense saturació; es pot
quantificar de forma relativa
la quantitat de biomolècula
existent.
Imatge digitalitzada
Microscòpia
Es tracta d’un objecte matemàtic, d’una matriu de números on el valor numèric m(x,y)
es tradueix en el valor d’intensitat de gris de la imatge al punt (x,y).
60 70 115
65 80 123
69 110 125
39
82
83
103
88
59
112
96
67
35
73
72
60
120
40
218
229
169
228
236
194
229
237
197
231
241
200
Imatge Digital
Imatge Digital
Canals Bits/Píxel Valors
3 24 (8 x3) (0...255) RGB (16 millons)
3 36 (0...4095) RGB (19 millons)
3 42 (0...16383) RGB (4 billons)
Imatge en nivells de gris
Imatge en color RGB
Canals Bits/Píxel Valors
1 1 0...1
1 8 0...255
1 12 0...4095
1 14 0...16383
1 16 0...65535
Resolució cromàtica, espacial i pes
Imatge Digital
Mida 8 bits 24 bits
512 x 512 256 Kb 768 K
1024 x 1024 1M 3 M
1 Bit = 0,1
1Byte = 8 bits = (2)8 = 256
1KB = 1024 bits
1 MB = 1024 KB
Resolució cromàtica, espacial i pes
Formats amb compressió :
. tiff : algoritme LZW (loss-less file compression )
Suporta un ample rang de profunditats de bits.
. jpeg: aplica 1/30 de taxa de compressió.
Provoca canvis tant de resolució espacial com
d’intensitat dels nivells de gris.
Obrir i salvar una imatge jpeg repetides vegades
implica també l’aplicació acumulativa del mateix
algoritme , la qual cosa provoca una degradació
de la imatge.
Format sense compressió: . Raw
. Específic de cada equip ( FV1000 és .oib )
tiff
jpeg
Transformacions de la imatge
adquirida
Imatge Digital Esquema
Imatge Real
Imatge digitalitzada
Captura de la imatge (digitalització)
Processament de la imatge
Imatge Binària
Soroll de fons
Errors d’il·luminació
Redistribució de l’histograma
Aplicació de filtres matricials
Segmentació
Imatge avaluable
Conclusions i decisions
Identificació d’estructures
Mesures de diferents
paràmetres: àrea,
perímetre...
3D
Dilatació
Erosió...
Calibració
(metadata)
Imatge Digital Anàlisi de la imatge
Calibració
IntDen Mean StdDev Median Min Max
1 89505 255 0 255 255 255
2 125460 255 0 255 255 255
3 85170 255 0 255 255 255
4 64770 255 0 255 255 255
5 193035 255 0 255 255 255
Imatge Digital
Calibració de la imatge (mida real del píxel o vòxel)
Resolució espacial
. Problemes en la identificació d’objectes.
. Obtenció de mesures errònies com ara l’àrea, el perímetre, la longitud, les distàncies,
la mobilitat cel·lular…
. Disminuir o engrandir la mida d’una imatge condueix a pèrdues de resolució espacial i
del valor numèric dels píxels. Si es fa aquest procés repetides vegades, es van
acumulant les errades en la imatge final.
. En reconstruccions 3D, s’obtindran proporcions de la imatge distorsionades (aplanamet,
estirament…).
Imatge Digital Processament de la imatge
Operacions punt a punt
+ operació =
Tots els píxels de la imatge es modifiquen proporcionalment
Operacions aritmètiques
Histograma: normalització, escalat,
linearització
Operacions de processament per grups de píxels veïns
(Filtres matricials)
Quantificar una imatge modificada mitjançant l’aplicació
d’un filtre matricial no és recomanable.
El valor final de cada píxel
de la imatge dependrà dels
píxels que l’envolten.
Operacions punt a punt
Histograma:
Normalització: reescalat entre els nivells de grisos. Reasignació d’aquests repartint-se per
igual.
Escalat: Variar el rang de detecció.
Linearització: Reforça els grisos mitjos.
Inversió o positivat (gels).
Operacions aritmètiques:
Suma
Divisió
Resta
Multiplicació
Imatge Digital Processament de la imatge
Modificacions en la brillantor, el contrast, la redistribució de l’histograma, la correcció
gamma etc… per millorar la imatge són acceptables, sempre i quan s’apliquin de la
mateixa manera en totes les imatges a comparar.
Imatge Digital Processament de la imatge
Histograma: Informa de la representació de cada nivell de gris en la imatge.
Dr. José Pertusa
Departament de Biologia Funcional
Universitat de València
Imatge Digital Processament de la imatge
Operacions aritmètiques
Resultat de la resta entre dues imatges:
Les imatges A, B i C s’han restat de dos en dos obtenint les
imatges AB, BC i AC
Dr. José Pertusa
Departament de Biologia Funcional
Universitat de València
Imatge Digital Processament de la imatge
Operacions aritmètiques
+ 50
- 50
x 2
/ 2
Dr. José Pertusa
Departament de Biologia Funcional
Universitat de València
Categories de filtres:
Imatge Digital Processament de la imatge
De suavitzat o de pas baix:
D’emfatització:
Detecció de marges:
Mitja
Mitjana
Gaussians
Efecte: Difuminar
Desenfocar
Reduir el soroll
Efecte: Augment del contrast per
ressaltar estructures
Els valors intermitjos es consideren positius mentre que a la resta se’ls dóna un
valor negatiu o zero
Laplacians
Sobel
Roberts
Sharpen 1
Sharpen 2
Operacions de processament per grups de píxels veïns (Filtres matricials)
Imatge Digital Processament de la imatge
1 2 1
2 4 2
1 2 1
Gauss
25 50 25
50 100 50
25 50 25
6 25 6
25 100 25
6 25 6
6 18 25 18 6
18 50 71 50 18
25 71 100 71 25
18 50 71 50 18
6 18 25 18 6 Gauss 1 Gauss 2 Gauss 3
Gauss 4 L’efecte del degradat o desenfocament serà diferent
Segons la matriu aplicada, el pes de cada píxel i la mida.
Té més pes el píxel central i el pes dels altres és proporcional
a la distància amb el centre.
Imatge Digital Processament de la imatge
Mitjana Original
De pas baix
Elena Abad
Cardiologia experimental
IUHVH
Imatge Digital Processament de la imatge
0 -1 0
-1 5 -1
0 -1 0
-1 -1 -1
-1 9 -1
-1 -1 -1
Sharpen
Sharpen 1 sharpen 2
Sharpen Original
Imatge Digital Processament de la imatge
Sobel Original
De detecció de marges
Average
Sharpen Sobel
Projecció Màx.
Imatge Digital Processament de la imatge
0 -1 0
-1 5 -1
0 -1 0
0 -1 0
-1 5 -1
0 -1 0
Imatge Digital Processament de la imatge
Segmentació
Eritròcits de pollastre en extensió de sang tenyida
Histograma de nivells de gris
Dr. José Pertusa
Departament de Biologia Funcional
Universitat de València
Imatge Digital Processament de la imatge
Segmentació
Selecció de llindars i aplicació de la màscara sobre els nivells de grisos.
Representacions de màscares binàries: blanc = 1 i negre = 0 o a la inversa.
Dr. José Pertusa
Departament de
Biologia Funcional
Universitat de València
Imatge Digital Anàlisi de la imatge
IntDen Mean StdDev Median Min Max
1 89505 255 0 255 255 255
2 125460 255 0 255 255 255
3 85170 255 0 255 255 255
4 64770 255 0 255 255 255
5 193035 255 0 255 255 255
Assaig de migració
Autofluoresc.
del filtre
Merge
Substracció
Binarització
watershed
Cèl. GFP +
Cel. Object Counter (Fiji , ImageJ)
Imatge Digital Anàlisi de la imatge
IntDen Mean StdDev Median Min Max
1 89505 255 0 255 255 255
2 125460 255 0 255 255 255
3 85170 255 0 255 255 255
4 64770 255 0 255 255 255
5 193035 255 0 255 255 255
Mesures d’intensitat de fluorescència
Nuclis
Redirecció
Substracció
Prot. X
Cel. Object Counter (Fiji , ImageJ)
Imatge Digital Anàlisi de la imatge
Calibració
Segmentació
IntDen Mean StdDev Median Min Max
1 89505 255 0 255 255 255
2 125460 255 0 255 255 255
3 85170 255 0 255 255 255
4 64770 255 0 255 255 255
5 193035 255 0 255 255 255
Imatge Digital
Màscara Binària
Anàlisi de la imatge
Imatge Digital
Anàlisi de partícules
Anàlisi de la imatge
Imatge Digital
MIA
B6_S3_1
B6_S3_2 B6_S3_4
B6_S3_3
MLC
20X
1024 x 1024
Anàlisi de la imatge
Imatge Digital
MIA
Anàlisi de la imatge
Imatge Digital Cal recordar
Millora de la imatge
Espacial:
Identificació d’objectes i obtenció de mesures com ara àrea, perímetre,
amplada, longitud...
Espectral:
El valor numèric de cada píxel és una mesura indirecta de la quantitat de
biomolècula marcada existent. Per tant, en aquest cas és molt important
treballar amb la imatge de base o millor una còpia d’aquesta sense cap
modificació. Cal ser molt rigorós tant en la preparació com en el
manteniment dels paràmetres d’adquisicó en totes les imatges a avaluar.
Cal recordar Imatge Digital
S’han de conèixer les limitacions i aberracions de l’equip que es fa
servir en l’adquisició de la imatge.
La manipulació s’hauria de fer sobre una còpia de la imatge original.
S’accepten modificacions lineals com petites modificacions de la
brillantor i del contrast.
Tallar la imatge (crop) també s’accepta si és per millorar la composició
de la figura i no per amagar detalls que estan en desacord amb la
nostra hipòtesi.
Les imatges que s’han de comparar, s’han d’adquirir i processar en les
mateixes condicions.
Es poden qüestionar manipulacions en àrees concretes de la imatge.
Cal recordar Imatge Digital
S’haurien d’indicar al peu de la figura les modificacions que s’hagin fet
amb l’aplicació de filtres, ja que canvien el valor numèric dels píxels.
És més que qüestionable copiar i clonar objectes.
S’accepten modificacions lineals com petites modificacions de la
brillantor i del contrast.
Les mesures d’intensitat s’haurien de fer en imatges no modificades o
modificades uniformement i el menys possible.
Evitar la compressió que porti pèrdues d’informació.
Posar sempre la barra d’escala.
Moltes Gràcies