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1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Transferencia de
Métodos de HPLC
a UHPLC:
Estrategias y
Criterios de
Selección de
Columnas.
Isidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
UHPLC MasterClass Junio 2013
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
– Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de columnas
– Diámetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con información adicional.
Página: 2
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
– Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de columnas
– Diámetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con información adicional.
Página: 3
Introducción Métodos HPLC UHPLC
Página: 4
HPLC UHPLC:
• Columnas HPLC 5 y 3.5µm UHPLC: 1.8µm (TP) o 2.7µm (SP).
OBJETIVOS / Estrategias:
• Reducir Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.
• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.
Fundamentos:
• Poder trabajar a flujos elevados sin perder eficacia con rellenos TP<2µm ó SP 2.7µm.
• Aumento de la capacidad de separación en gradientes con flujos elevados.
* Trabajando con gradientes de concentración
Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC/RRLC
www.agilent.com/chem Instruments
Liquid Chromatography
Buscar: Method translator
Página: 5
http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
– Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de columnas
– Diámetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con información adicional.
Página: 6
Estrategias de Traspaso de Métodos HPLC a
UHPLC
• ¿Método ya validado? ¿Se quieren mantener condiciones
dentro del rango de cambios admitidos por USP?
• Admite 5µm 2.7µm (SP). Pero NO a < 2.5µm.
• 3.5µm 2.7µm (SP), 1.8µm (TP). Pero NO < 1.75 µm.
• Mantener validación USP Adicionalmente estar limitado a:
– Reducción Diámetro columna: : ≥ 0.50 x D p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)
– Subida Flujo: ≤1.50 x F
– Subida Temperatura: T+≤10ºC
• OBJETIVO:
• ¿Reducir tiempos de Análisis?
• ¿Aumentar Resolución?
• ¿Combinación de ambas?
Poroshell 120: 2.7µm
Superficialmente
porosas
Página: 7
¿Cuanto Puede Cambiarse en HPLC/UHPLC
un Método USP “Standard”?
• pH de la Fase Móvil: +/- 0.2 unidades
• Concentración de sales en tampón: +/- 10%
• Ratio de componentes in fase móvil para componentes minoritarios: < +/- 30% relativo. / <10% absoluto.
• Longitud Columna: +/- 70% p.e. 250mm75mm 150mm50mm
• Diámetro Interno Columna: +/- 50%. Adaptando el flujo para mantener la velocidad lineal constante. F2 = F1 x D2
2 / D12 p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)
• Tamaño Partícula: puede reducirse en un 50% p.e. 5µm 2.7µm (NO a 1.8µm)
• Flujo: +/-50%. Si se reduce d.i. columna se aplicará el +/-50% al resultante de F2 = F1 x (L2 D2
2) / (L1 D12).
• Long. Onda (UV-VIS): ninguno (error detector < +/- 3 nm)
• Temperatura Columna: +/- 10ºC.
• Volumen Inyección: cualquier volumen menor que cumpla requisitos.
Fuente: Pg. 6 USP 34 Physical Tests / <621> Chromatography 1
Poroshell 120: 2.7µm
Superficialmente
porosas
Página: 8
Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Métodos Reducción de Tiempo:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución :
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)
• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
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Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Métodos Reducción de Tiempo:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución :
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)
• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
Página: 10
min5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
5
10
15
20
25
30
Gradiente = 67min
Capacidad picos = 694 (10/min)
“Resolución GC”
Mapa péptidico de BSA digerida con tripsina con
Agilent 1200-RRLC (SL)
Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8µm
min2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Gradiente = 30min
Capacidad picos = 540 (18/min)
Cromatografía de Alta Resolución con el Agilent
1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8µm y 150mm
Capacidad de Separación de Picos: 700
Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8µm
(típica de columna GC de 10metros x 0.32mm)
8 Columnas x 5µm 200.000 platos/ 2 metros
Página 11
Página 12
Cromatografía de Alta Resolución por Acoplamiento
en Serie de Columnas de 5μm
0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80ºC
4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5μm
8 Columnas en serie 8 x 25cm x 4.6mm - 5μm
1 Columna 25cm x 4.6mm - 5μm
70bars
177bars
360bars
20.000 platos
100.000 platos
200.000 platos
105min
14min
Página 13
Cromatografía de Alta Resolución con 5μm y 80ºC
100.000 platos en 30min
380bars
4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5μm
1 y 2 ml/min H2O/CH3CN 60/40 30 y 80ºC 29min
Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Métodos Reducción de Tiempo:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución :
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo
• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
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Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.
Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)
Reducción del Tiempo de Análisis*
Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3
1.8µm x 50mm
(12.000 platos)
1/3
30min10min
1/6
30min5min
1/9
30min3.3 min
3.5µm x 75mm
(10.500 platos)
1/2
30min15min
1/4
30min7.5min
1/6
30min5 min
3.5µm x 100mm
(14.000 platos)
2/3
30min20min
1/3
30min10min
2/9
30min6.7 min
La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm *Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm
**Incremento presión: +2% para 7.5cm x 3.5µm +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η.u.L/ dp2))
• Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).
• Subir Flujo (hasta p.e. 80% presión máxima columna/ instrumento).
• Reducir volumen inyección (proporcionalmente a. reducción volumen columna).
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Ajuste de la Frecuencia de Adquisición de Datos: Compromiso entre Resolución Cromatográfica y Sensibilidad.
• Aumentar la frecuencia de adquisición de datos proporcionalmente a la reducción del tiempo de análisis.
– Ajustar “Peak width” adquisición al “width” de integración de los resultados del pico más fino de interés.
– Proporcionará unos 35-40 puntos de medición por pico para máxima resolución cromatográfica.
• El ruido se reduce con el aumento del nº de puntos promediados:
Ruido α ~ 1 / √ nº promedios
• Para máxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos (RSD% ≈ 10-15%).
• Para óptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos (RSD< 1%).
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Página 17
Parámetros Optimización Resolución Cromatográfica
Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.54 ( Tr / w50%)1/2
α = (T2 – T0)/(T1 – T0) K’ = (Tr – T0) / T0
* Para picos de tamaños muy distintos se recomienda Rs > 2
Parámetro
Modificado
% Mejora
Resolución Incremento
Tiempo Análisis
Long. x 2 40% x 2
K’: 0.5 2 100% x 2
K’: 5 10 10% x 2 El incrementar la retención por encima de K’=5
apenas mejorará la resolución.
OBJETIVO Rs > 1.5 (2)*
1 < K'< 10 Rs= 0.25 N1/2 ((α- 1)/ α ) (K'/(K'+1))
RETENCIÓN Poder Eluotrópico Eluyente
% modificador Orgánico SELECTIVIDAD Fase Estacionaria y Soporte
pH Fase Móvil (si pH próximo a pK)
Modificador Orgánico y su %
Aditivos Fase Móvil
Temperatura
EFICACIA√
Tamaño Partícula del Relleno Longitud de la Columna Excesivos Volúmenes Muertos (-) Flujo:
ISOCRÁTICO:
k' k'/k'+1 T. análisis
0,2 0,17 1.2 x T 0
0,5 0,33 1.5 x T 0
1 0,50 2 x T 0
2 0,67 3 x T 0
3 0,75 4 x T 0
4 0,80 5 x T 0
5 0,83 6 x T 0
10 0,91 11 x T 0
20 0,95 21 x T 0
La mejora de Resolución
es muy importante al
incrementar la retención
hasta K’= 5
Rs = f ( K’/[K’+1] )
0,2
0,5
1
2
3 4
5 10
20
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
K'
k'/k
'+1
k'/k'+1
La mejora de Resolución
es muy importante al
incrementar la retención
hasta K’= 5
N= f(L/ 2dp)
Para mejorar resolución de picos con K’ > 5 mejor
aumentar long. columna. Para K’<2 reducir “poder
eluotropico” del eluyente
DISMINUCION 10% ORGANICO ===> K’2 = (2 ó 3) x K’1
Log K’ =aprox flineal(%orgánico)
Traspaso de Métodos con Gradientes
•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.
•Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula
2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)
•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.
K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Parámetro dependiente de:
• Analito
• Modificador Orgánico
Volumen muerto de la columna
% de incremento de Modificador Orgánico Tiempo del gradiente (min)
Flujo (ml/min)
“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F
Al mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
Tg = 3 min
3 min
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
Tg = 2 min
2 min
Si K’ se mantiene constante el poder de separación no variará
Página: 18
Comparación Estrategias Mejora de la Resolución
k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Columna: ZORBAX SB-C8
Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min
Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2
B: Acetonitrilo
Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: 35°C
Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine
5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor
Tg = 10 min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
15 min
1,2
3 4 5
6
7
8
0 5 10 15 Time (min)
• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican ) 1
Tg = 60 min a 1mL/min 4
2
0 25 50 Time (min)
3
5
8
6
7 40 min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
Tradicional
• Reducir V0 y Subir Flujo 4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml
N = 10,000
Tg = 15 min a 2mL/min
“Moderna”:
Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.
Página: 19
Time (min) 0 5 10
2
3
4 5
6 7
8
1
7 min
1x10/1.5= 6,7
2x15/0.75= 40
1x60/1.5= 40
¡¡¡Se reduce Tiempo análisis
a 1/6 pero se mantiene la
Separación !!!
¿Cómo mejorar?
Ejemplo de Reducciónde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5µm 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmáx. columna: 400bars) 40ºC
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
12min.
2mL/min 5 min Gradiente FxTg=10
6min.
3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10
4min.
4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10
3min.
Página: 20
Ejemplo de Reducciónde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5µm 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
Representación Normalizada en el Eje de Tiempo
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmáx. columna: 400bars) 40ºC
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10
12min.
2mL/min 5 min Gradiente FxTg=10
6min.
3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10
4min.
4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10
3min.
Página: 21
Ejemplo de Reducciónde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5µm 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
Representación Normalizada en el Eje de Tiempo
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmáx. columna: 400bars) 40ºC
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
1mL/min 10 min Gradiente AZUL FxTg=10
2mL/min 5 min Gradiente ROJO
3mL/min 3.33 min Gradiente VERDE
4mL/min 10 min Gradiente FUCSIA
50% altura pico 0.006min 0.08% 0.012min 0.16%
10% altura pico 0.015min 0.19% 0.024min 0.29%
8min. F=1ml/min
8min. F=1ml/min
14mL/min
Δancho pico
0.018min
26% pk wd
0.24% Tr
14mL/min
Δancho pico
0.0398min
30% pk wd
0.48% Tr
Página: 22
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Ecuación de Van Deemter
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula.
– Nuevos tipos de columnas para
poder hacer UHPLC en HPLC's
convencionales (Poroshell).
– Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 23
Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno “versus” Eficacia
Longitud
(mm)
Eficacia
N(5 µm)
Eficacia
N(3.5 µm)
Eficacia
N(1.8 µm)
150 12,500 21,000 36.000
100 8,500 14,000 24,000
75 6000 10,500 18.000
50 4,200 7,000 12,000
30 2.500 4,200 6,500
15 1.250 2,100 2,500
Tiempo
Análisis*
-
- 33%
- 50%
- 67%
- 80%
- 90%
• La Eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula ( N= f(L / 2dp) )
• El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )
• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo flujo y nº platos proporcionados por la
columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder Resolución.
* Reducción con respecto a una columna de 150 mm
+ Eficacia
(N)
+
Presión
- Tiempo
Análisis
- Volumen Pico
- Consumo Solvente
Página: 24
Recomendación: Columnas 5cm para gradientes ≤ 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min
Viscosidad “versus” Composición Orgánico/Agua. En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo
Gradiente 10100%
Metanol
Tener en cuenta:
La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (máximo a 40/60)
3 3
η
0 20 40 60 80
1
2
1
2
Vis
cosid
ad
[cP]
a 20º C
100%
n-Propanol
Etanol
Metanol
Acetonitrilo
Perfiles de Presión con Gradientes Concentraciónº
Perfil de Concentración
Presión CH3-CN / H2O
Presión CH3OH / H2O
Este gráfico es útil para poder calcular relaciones
aproximadas de viscosidad entre distintas
composiciones de eluyentes y poder calcular
presiones equivalentes: p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a 100 x
(1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30
η ~ 0.6
η ~ 1.3
70/30 org. /agua
CH3OH
CH3CN
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
Bar 25 o C (355b)
80ºC (140bars)
% Orgánico[w/w]
50ºC (220bars)
ºC Posible Δ flujo con
respecto a 25ºC
50ºC x 1.6
80ºC x 2.5
Página: 25 + info en Anexo final
Traspaso de Métodos de H20/CH30H a H20/CH3CN. Composiciones Fase Móvil con Fuerza Eluotrópica
Equivalente
Acetonitrilo / Agua (da menor presión)
Metanol / Agua
Tetrahidrofurano / Agua
%MeOH %ACN %THF
20 15 10
40 30 25
60 50 38
80 72 53
100 98 72
%ACN %MeOH %THF
20 30 18
40 50 30
60 72 45
80 85 58
100 >100 72
%THF %MeOH %ACN
20 35 28
40 65 55
60 88 82
80 >100 >100
100 >100 >100
72%
53%
80%
En RRLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas
Página: 26
Página 27
Reducción del Tiempo de Análisis mediante Incremento de la Temperatura Ejemplo a Flujo Constante
Trabajar a temperaturas elevadas permitirá reducir considerablemente los tiempos de análisis y
en ocasiones cambiar la selectividad de la separación. la alta estabilidad térmica de las columnas
StableBond a pH’s ácidos: hasta 80ºC (90 para las SB-C18) amplían esta posibilidad.
Optimización
Método
Alta
Temperatura
Baja
Temperatura Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 μm Eluyente: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y
0.07% ácido fosfórico
26% MeOH
Flujo: 1 mL/min (constante)
Detección: UV 280 nm
Muestras: Vitaminas B
min.
Acorta a 1/3 el
tiempo análisis
Cuando se trabaja a altas temperaturas se
recomienda enfriar el eluyente a la salida de la
columna antes de entrar en el detector (no hace
falta con MS). En los Agilent Series 1100 / 1200
utilizar el 2º intercambiador (el de 3µl) de los
T.C.C, o el específico del 1200-SL (1.5µl).
Cte Dieléctrica Agua: 20ºC=80 / 60ºC=67 / 90ºC=58
Metanol a 25ºC=33 Hexano a 20ºC=2
+ info en Anexo final
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Ecuación de Van Deemter
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de
columnas.
– Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 28
Selección Fase Estacionaria (Relleno)
• Si es posible, mantener el mismo relleno que en
HPLC simplemente cambiando tamaño partícula
(p.e. Zorbax XX).
• Si NO se quiere revalidar de nuevo los métodos al
transferir HPLCUHPLC, la limitación en la reducción
de tamaño de partícula en métodos validados obliga a
pasar de rellenos 5µm (TP) a 2.7µm (SP) cambio
fase.
• Con HPLC convencionales (400 bars) utilizar rellenos
SP de 2.7µm
Página: 29
• Para 1.8μm utilice las Zorbax de 600-1200bars. Además reducen la
presión de trabajo en >20%, gracias a la distribución del tamaño de
partícula ingeniada por Agilent.
• Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fácil
escalabilidad debido a la idéntica selectividad
de Zorbax - independiente del tamaño de
partícula (5, 3.5,1.8µm) y dimensiones de la columna.
• Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a pH’s intermedios y
traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pH’s extremos).
• Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy ácidos (hasta pH
0.8) y/o a Alta Temperatura hasta 90° C (100ºC).
• Zorbax Extended para separaciones a pH básicos (hasta pH 11.5)
• Excelente tiempo de vida y resistentes a las más altas presiones
gracias a la alta resistencia mecánica de las partículas ZORBAX (+1300 b) .
Selección del Tipo de Fase Estacionaria con
Columnas ZORBAX 1.8µm
Página: 30 + info en Anexo final
Tabla de Similitud* de Fases Recomendadas para el
Traspaso de métodos a RRLC con Zorbax 1.8µm ó 2.7µm.
Ace C18, Develosil-ODS-HG,Develosil-ODS-MG, Develosil-
ODS-UG, Hichrom C18, Hichrom RPB, Hypersil HyPURITY
C18, Inertsil ODS, Inertsil ODS2, Luna 5 C18(2), Nucleosil
C18 HD, Prodigy ODS2, Symmetry C18, Xterra MS C18,
YMC ODS A, YMC ODS AM, YMC Pro C18
ECLIPSE PLUS o XDB
(C18 o C8 según el caso)
Poroshell 120 EC (C18 o C8)
Cosmosil C18-AR, Exsil ODS, Hypersil BDS C18,
LiChrosorb RP-18, Novapak C18, Nucleosil C18AB, Partisil
ODS3, Resolve C18, Synchropak CR101, TSK ODS-120T,
TSK ODS-80TM, u-Bondapak C18, Ultrasphere ODS,
Vydac 218MS, Vydac 218TP,Vydac Selectapore 300M,
Vydac Selectapore 300P, Vydac Selectapore 90M, Waters
Spherisorb ODS1, Waters Spherisorb ODS2, Waters
Spherisorb ODSB, YMC J'Sphere ODS M80
STABLEBOND (SB)
(SB-C18 o C8 según el caso)
Poroshell 120 SB C18
Genesis C18, Inertsil ODS3, Kromasil C18, Prodigy ODS3,
Purospher RP18-e
EXTENDED o XDB
(C18 o C8 según el caso)
*Sugerencia de columna a probar en primer lugar, por su mayor similitud. Obviamente pueden
haber diferencias de selectividad. La mejor dependerá de los analitos a separar.
Página: 31 + info en Anexo final
Página 32
Ejemplo Comparativo
min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
mAU
-2
0
2
4
6
8
10
DAD1 B, Sig=275,8 Ref=400,80 (ACECLO070918\004-0301.D)
0.0
07
0.9
10 0
.964
1.0
33
1.4
29
1.5
16
1.6
73
1.67 min
20.2 min
Symmetry C18 5 μm 250 x 4.6 mm;
Gradiente 1ml/min
Zorbax Eclipse Plus C18 1.8 μm 50 x 4.6 mm;
Gradiente 3.4 ml/min
500bars- 50ºC
Agilent 1200 RRLC
1.67 2.4min a 25ºC y
2.4ml/min -500 bars
¿Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?
Superficial Totalmente Porosa
Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución
2.7µm (capa porosa: 0,5µm)
1.8µm
Ventajas Poroshell 120:
• Reducir la presión para aumentar el flujo.
Importante con HPLC de 400 bars
• Mejorar la resolución en Métodos USP
con 5µm (2.7µm <50% en disminución
del tamaño de partícula).
• Robustez: fritas 2µm (en lugar de 0.5µm de las de 1.8µm)
Ventajas 1.8µm Totalmente Porosas:
• Mayor surtido de fases.
• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica
selectividad.
• 10-20% más eficacia/cm.
Página: 33
Poroshell -120
+ info en Anexo final
Comparación Eficacia Partículas Superficial
“versus” Totalmente Porosas (SP vs TP)
Poroshell 120 proporciona:
• Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partículas 1.8µm totalmente porosas.
• Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.
• Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos más elevados.
* También su capacidad de carga
Poroshell -120
Mínimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.) ↓P↑F
Página: 34 + info en Anexo final
Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 °C
0.095sec PW
0.140secPW
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de
separación con todo tipo y marcas de columnas
Columnas Superficialmente Porosas:
permiten muy elevadas velocidades lineales
con elevada resolución y menor presión
0.5 s
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7µm
Página: 35 + info en Anexo final
1.8µm Eclipse Plus C18 vs. Poroshell 120 EC-C18
Análisis de 17 Aminoácidos con 1290 Infinity
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
Poroshell 120 EC-C18
3.0 x 100mm, 2.7um
Pmax=331 bar
F=0.86 mL/min
RRHT Eclipse Plus C18
3.0 x 100mm, 1.8um
Pmax=474 bar (Porosh.+43%)
F=0.86 mL/min
RRHD Eclipse Plus C18
3.0 x 100mm, 1.8um
Pmax=528 bar (HT+11%)
F=0.86 mL/min
Rs6,5=1.98
Rs6,5=2.28
Rs6,5=2.90
Rs14,13=1.81
Rs14,13=2.34
Rs14,13=1.81
W½ 9 =0.043 min.
W½ 9 =0.036 min.
W½ 9 =0.045 min.
Selectividad Poroshell 120 EC-C18 ~ Eclipse Plus C18 (o Eclipse XDB)
Pmáx.=1200bars
Pmáx.=600bars
Pmáx.=600bars
Página: 36 + info en Anexo final
Tipos Instrumentos y Columnas UHPLC
Tipos Instrumentos UHPLC
• Presión máx.≈ 1000-1200 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min. (Fluj. elev.todo tipo columnas)
• Presión máx.≈ 1000-1200 bars y Flujo máx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. columnas 2-3mm d.i.)
• Presión máx.≈ 600 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min (Fluj. elev. Columnas SP)
Tipos Columnas UHPLC
• Totalmente porosas <2µm (1.7, 1.8, 1.9µm). USP 50% 5µm = 1.75µm
- Zorbax ofrece distribución asimétrica del tamaño de partícula reduce la presión en un 20-30%
- Zorbax ofrece la misma selectividad independientemente del tamaño de partícula: 1,8, 3.5 y 5µm.
• Superficialmente porosas 2.7µm (efectivo 0.5µm). reduce presión en un 40-50%
• Diámetros: 2.1 a 4.6 mm. 0,6mL/min en d.i. 2.1 3mL/min en d.i. 4.6mm
UHPLC’s que permitan llegar a 5 mL/min permitirán obtener todo el rendimiento
de las columnas Superficialmente Porosas y de columnas con 4.6mm d.i.
Con Columnas UHPLC el trabajar a flujos elevados permitirá mejorar
la capacidad de separación en gradientes
El flujo máximo es un parámetro clave en un UHPLC
Superficialmente
porosas
Página: 37
NO es imprescindible un cromatógrafo de Alta
Presión (600-1200bars) para trabajar en UHPLC
Tipo
Cromatógrafo
(Presión Máxima)
“Máxima” Longitud Columna*
1.8µm (TP)** Poroshell-120 2.7µm (SP)**
400 (“HPLC”) 5 (10) cm 10 (15) cm
600 (“UHPLC”) 10 (15) cm 15 (20) cm
1200 (“UHPLC”) 25 (30) cm 35 (40) cm
* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo; el utilizar metanol reducirá los flujos máximos de trabajo (especialmente con
contenidos de agua alrededor del 60% ).
** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y
60% más largas que las TP (o trabajar a flujos mayores).
Equivalencia Eficacia columnas UHPLC
(1.8µm TP/ 2.7µm SP)
Columnas HPLC
5µm
5 cm 15 cm
10 cm 30 cm
25 cm 75 cm
+ info en Anexo final Página: 38
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Ecuación de Van Deemter
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Nuevos tipos de columnas para
poder hacer UHPLC en HPLC's
convencionales (Poroshell).
– Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 39
¿Qué Diámetro de Columna Utilizar?: ¿d.i. (mm): 2.1, 3, 4.6?: Mantener la del método validado.
• Recomendación LC/MS: 2.1mm con Electrospray (óptimo 0.5-0.8mL/min) //
3-4.6mm con APCI (/APPI con dopante): óptimo ~ 1.5mL/min (actúa como detector que
responde a la cantidad absoluta de analito mejor inyectar cantidades lo mayores posible).
• Recomendación LC/DAD/UV/FLD/…. : 2.1- 3 - 4.6mm.
• El flujo debe ser proporcional a la sección de la columna utilizada.
• Al reducirse el diámetro se reducirá el flujo de trabajo (para mantener la misma
velocidad lineal dentro de la columna).
• 3mL/min en 4.6mm d.i. ~ 1.26mL/min en 3.0mm ~ 0.6mL/min en 2.1mm
• Reducir el diámetro permite reducir consumo de disolvente y si se inyecta la misma cantidad
absoluta de muestra, ganar sensibilidad pero:
• Se debe de inyectar menor volumen/cantidad de muestra para:
• NO sobrecargar la columna de analito (pérdida de resolución por saturación
columna).
• NO deformar el perfil del pico por un exceso de poder de elución del volumne (p.e.
en fase reversa disolver la muestra en solvente orgánico)
• Se debe reducir los volúmenes del sistema: bombas, capilares, celdas de detección,…. (a 1/5 al pasar de d.i. 4.6mm a 2.1 mm)
Página: 40
Influencia Volumen de Dispersión en la Eficacia
Flujos ajustados al d.i. de la columna:
4.6 mm columna 1 mL/min
3 mm columna 0.43 mL/min
2.1 mm columna 0.21 mL/min
Ejemplo para compuesto con K’=4
Columna:
50 mm long.
1.8 µm tam. part.
Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V0 columna <0.1x V pico
d.i. mm capilar V0 µL/cm.
0.17 mm 0.227 µL/cm
0.12 mm ** 0.113 µL/cm
0.05 (sílice fundida) 0.020 µL/cm
0.025 (sílice fundida) 0.00467 µL/cm
*
* Volumen dispersivo: el que recorre la muestra fuera de la columna ** 0.12mm recomendado para columnas de 2-3mm d.i.
Página: 41
Típico 60 cm capilar 0.12mm = 7µL + X µL celda + Y µL vol. Inyectado total > 10µL
Requerirá
HP
LC
’s
adecuados
Selección D.I. de Columna según Sistema de Bombeo Mejora de la Sensibilidad y Consumo Disolvente con la Reducción del D.I.
MS con Nano-Electrospray o
HPLC-Chip Cube
Nano LC 100 µm
75 µm
50 µm
500 nl/min
250 nl/min
100 nl/min
Micro LC 1 mm
800 µm
40 µl/min
20 µl/min
LC Capilar 300 µm
180 µm
4 µl/min
2 µl/min
LC Estándar 4.6 mm
2.1 mm
1000 µl/min
200 µl/min
Flujo típico
D.I. Columna Ganancia Teórica
en Sensibilidad UV
~ 1
~ 5
~ 20
~ 30
~ 200
~ 600
~ 2000
~ 3500
~ 8500
• Celdas DAD / MWD:
x10
x200
Muy utilizadas en ESI
LC Estándar 4.6 mm
2.1 mm
1000 µl/min
200 µl/min
CUATERNARIA*
Mezcla a baja presión
Na
no-1
200
1
20
0 C
ap
ilar
UV
/ VIS
• Standard: 13µl y 10mm, 120bar típica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm
• Semi-Micro: 5µl y 6mm, 120bar para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm
• Micro - Alta Presión: 1.7µl y 6mm columnas D.I ≥ 1 mm
• Semi-Nano: 500nl y 1cm para columnas DI > 1mm
• Nano: 80nl y 6mm para columnas DI >= 180-300µm.
Con columnas cortas de 1.8µm y flujos elevados
se deberá reducir el volumen de la celda
BINARIA
Mezcla alta presión
LC
/MS
D.I. Diámetro de referencia (D.I.): 4.6mm
Sensibilidad Consumo Disolvente Vo columna
2.1 mm x 5 1/5 (-80%) 1/5 (-80%)
3 mm x 2.35 1/2.35.(-57%) 1/2.35.(-57%)
↓ d.i. columna ↓ Vmuertos que recorre la muestra (d.i. capilares,
volumen de la celda de detección,…)
Página: 42
*1290 cuaternario permite
también 2.1mm d.i.
???
Aumento Tiempo de Retardo del Gradiente
0 min 0 min
Reducir flujo (/d.i. columna) gradiente tardará más en llegar a la columna:
• se deberá reducir volumen barrido por el gradiente
en inyector y bomba.
Página: 43
d.i.: 4.6mm d.i.: 2.1mm
Configuración del Volumen de Retardo del Gradiente de Concentración
• El volumen de retardo se recomienda no sea superior al Vo de la columna
utilizada (como valor orientativo).
• Con columnas de D.I. 2.1mm (usuales en LC/MS con ESI) o columnas cortas de
1.8µm se recomienda utilizar un sistema con mezclado en alta presión (bombas
binarias) o 1290 cuaternarias.
• Con columnas largas de 1.8µm o flujos muy elevados se requerirá sistemas de
bombeo de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL), 1220, 1260 y 1290 infinity.
Gradientes con Mezclado a Alta
Presión
Menor volumen de retardo – Configurable
120-800µL (1100,1200,1260) // 10-45µL (1290)
Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290
Gradientes con Mezclado a Baja Presión
(en válvula proporcional)
Válvula proporcional
Mayor volumen de retardo – NO configurable 600-900µL / (<350 1290 cuaternario)
Bombas cuaternarias 1100,1200, 1220, 1260 y 1290
Página: 44
sólo 1220/1260
*Ambos 1290 NO llevan “Damper” Amortiguador /Damper (sólo 1260)
Bomba Binaria Serie 1200-RRLC: Muy Fácil Cambio
de Configuración
Configuración 1:
Volumen de retardo
estándar (mixer 400µL)
Retardo: 600-800µl
Retardo con “Mixer”
200µL*: 400-600µl
B A
600bar Amortiguador
200 o 400µl
Mezclador
600 bars Sensor
Presión
Válvula Purga
Configs. 1 2: ¡Desconectar sólo estos punto!
Configuración 2: Bajo volumen de retardo
Retardo: 120µl
¡Conectar sólo este punto!
B A
Sensor
Presión
Válvula Purga
600bar Damper
400µl Mixer
Sensor Presión
Válvula Purga
Inicio Mezcla: T
Recorrido del Flujo
T
T
Incorpora “amortiguador electrónico” de pulsaciones
Sensor Presión
Válvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
Mezclador 400 o 200µl
*Solvent mixer, 200 µl (600bars) ref.: 5067-1565
Página: 45
Reducción Volumen de Retardo del Gradiente con
Bombas Binarias*: 1100/1200/ 1220/1260 “versus” 1290
Infinity
1220/60 Series
Channel A
Passive Damper
0 - 300 µl
Passive Mixer
400 µl (opcional 200)
1220/60 Series
Channel B
1290 Inifinity
Chanel A
1290 Inifinity
Chanel B
Very Low Noise
~ 600-800 µl
+ = Active Damping
10µl
Jet Weaver Mixer
35µl
Delay Volume
• 10µl / 45µl
• 80x / 20x lower
1290 Infinity
Página: 46
* En bombas con mezclado en baja presión sin mezclador (cuaternarias) el volumen de retardo NO se puede reducir.
Agilent 1200 Series HP Autosampler SL
Delay Volume Reduction and Overlapped Injections
Main Pass Bypass
Simultaneous Speed and Carry Over optimization by
• Simple “one-valve“ flow-through design
• Automatic delay volume reduction (6ul)
• Overlapped injection
• Programmable sample flush-out time
• External needle wash
• Minimized Carry Over by additional valve
switches
Permitirá reducir el volumen de retardo del gradiente, al
colocar la válvula en posición de “Bypass” cuando la
muestra ha salido del inyector (“Sample Flush-Out Factor”)
Página: 47
Problema: Reproducción de Analisis en Gradiente con
diferentes HPLC´s: - Impacto del volumen muerto y de la calidad de
la mezcla. Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell
min 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Rs= 1.90 1100 Series Binary LC
1290 Infinity LC - El gradiente llega antes
Rs= 1.15
Me
tam
itro
n
Chlo
rid
azo
ne
Sim
azin
e
Chlo
rtolu
ron
Diu
ron
Pro
pa
zin
e
Te
rbu
tyla
zin
e
Pro
me
tryn
Cya
niz
ine
1290 Infinity LC
with iSET
Rs= 1.87
Página: 48
June 26, 2013
Confidentiality Label 49
Emulación de “cualquier” HPLC/UHPLC con el
1290 y la nueva tecnología ISET.
ISET: Tecnología de Emulación Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)
Programa de gradiente
1290 gradiente
1200 gradiente
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyecctión
Mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y
emulando el perfil del gradiente a
clonar
+ info en Anexo final Página: 50
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
– Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de columnas
– Diámetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con información adicional.
Página: 51
Resumen Traspaso de Métodos a UHPLC/RRLC
• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:
– Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº platos columna (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).
– Las columnas TP de 1.8µm o SP de 2.7µm permiten trabajar a flujos elevados para reducir tiempo de análisis y mejorar resolución en gradientes.
• Maximizar la Resolución:
– Sin aumentar tiempo de análisis: Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8µm).
– Aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm requieren un equipo de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL).
• Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):
– Le permiten trabajar en UHPLC con HPLC’s convencionales.
– Poder trabajar a mayores flujos para:
• reducir sus tiempos de análisis.
• incrementar la capacidad de separación y resolución en gradiente.
Página: 52
Capacidad de separación en gradientes proporcional a F x Tg / V0 Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separación en gradientes de concentración
1200 Infinity Method Translator http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe
para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).
Página: 53
Agilent 1290 Infinity LC
Muchas
Gracias
por su
Atención
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890 isidre_masana@agilent.com
customercare_spain@agilent.com www.agilent.com/chem
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¿Preguntas?
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC
a UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
– Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
– Longitud y Tamaño Partícula
– Fase estacionaria y tipo de columnas
– Diámetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con información adicional.
Página: 56
Columnas Poroshell-120 (600bars) 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11), SB-
CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC. 3 Diámetros y 6 Longitudes
Info 2013
Página 57
Especificaciones Columnas Poroshell-120 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11),
SB-CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC.
Info 2013
Página 58
13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Extend-
C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11), SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL
(USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)
Página 59
La Mayor Flexibilidad: Especificaciones 17 Fases Diferentes RRHD de 1.8 μm y 1200bars para Cualquier Aplicación
Página 60
La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 μ y 600bars para Cualquier Aplicación
1.0
2.1
3.0
4.6
ID’s
Longitudes: 20,30, 50, 100 y 150mm nº Fases: 10
Con igual selectividad que los rellenos de 3.5 y 5µm
Página 61
La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 μ y 600bars para Cualquier Aplicación
13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8
(USP L7), Extend-C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11),
SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL (USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)
Designaciones USP
Página 62
Designaciones USP
Página 63
Designaciones USP
Página 64
Designaciones USP
Página 65
“Workshop” 1200-RRLC: Conversión de
Métodos de HPLC Convencional a
Cromatografía de Resolución Rápida
Página 66
Flujo (mL/min)
Reducción de la Presión de Trabajo mediante la Optimización de la Distribución del Tamaño de Partícula con Nuevos Rellenos Zorbax de 1.8m
0
50
100
150
200
250
300
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Pre
sión (B
ars
)
+25% MÁS de
Presión a (2.0
mL/min)
Rellenos 1.8m standard
Nuevos Rellenos 1.8m
Distribución Optimizada
Columnas: ZORBAX SB-C18
Dimensiones: 4.6 x 30mm, 1.8 m
Eluyenty: 85:15 ACN:Agua
Flujos: 0.05 – 5.0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1.0L Octanofenona en Eluyente
Detección: UV 245nm
Presión Sistema (1100 sin Columna)
Manteniendo la eficacia, las nuevas columnas Zorbax de 1.8µm
reducen la presión en + 20% y permiten trabajar hasta 600bares
“Workshop” 1200-RRLC: Conversión de
Métodos de HPLC Convencional a
Cromatografía de Resolución Rápida
Página 67
600 bar
5μm 3.5μm
2.3 2.1
1.8μm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
400 bar
Presión “versus”: Diámetro Partícula y Longitud de Columna
Presión 1/(dp)2
700-800
600-700
500-600
400-500
300-400
200-300
100-200
0-100
Presión (bars)
Longitud Columna (mm) Diámetro Partícula (µm)
1 mL/min H2O/CH3CN 50/50* Temp.: 25°C
Calculado en base Agilent 1100 y columnas
Zorbax 4.6mmx1.8μm con tecnología de
400bars
15cm 3.5μm
10cm
5cm
1.8μm
400bars
600bars
200bars
25cm
5μm
* Viscosidad 10-15% inferior a la del agua J
-35%
-55%
-65%
Reducción viscosidad
Página 68
Efecto del Incremento de la Temperatura en la
Viscosidad del Eluyente y Presión de Trabajo
• La viscosidad se reduce con
respecto a 25ºC:
• a 80ºC: entre un 35 y
65%.
• a 60ºC: entre un 25-
50%.
• Flujo ↑ x 1.5-3)
• ∆P = f (η . u . L / dp2)
Subir temperatura permite trabajar a mayores flujos
Página: 69
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Modelo
UHPLC
Pres. Máx
bars
“Máxima” Longitud
Columna UHPLC cm Rango d.i.
Columna mm
“Delay
Volume”
Bomba
µL
Flujo
máx. mL/min
1.8µm (TP)** Poroshell-120 2.7µm (SP)**
1220 binario
1260 cuaternario 600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10
1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5
1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16) <350 10
1290 binario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (8) 10 / 45 5
¿Qué UHPLC Agilent se Adapta Mejor a Sus
Necesidades/ Presupuesto?
+
-
Coste
• La selección del cromatógrafo depende del
diámetro y longitud de las columnas de UHPLC
que se quieran utilizar. • Algunos UHPLC’s del mercado están limitados a un flujo
máximo de 1-2mL/min NO permitirá trabajar con
columnas de d.i. 4.6mm a velocidades lineales/flujos
elevados.
Bomba Binaria Series 1200/1100*- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL
Configuración 1: Volumen de retardo estándar
Retardo: 600-900µl
Sensor Presión
Válvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
400µl Mezclador
Configs. 1 2: Desconectar sólo estos puntos!
Recorrido del Flujo
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presión
400µl
Mezclador
Sensor
Presión
Válvula Purga
T
Sensor Presión
Válvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
80µl filtro
Configs. 2 3: Desconectar sólo estos puntos!
Recorrido del Flujo
B A
Configuración 2: Volumen de retardo medio**
Retardo: 300-600µl**
400bar Amortiguador
+Sensor Presión
80µl
Filtro en
Línea (400 bars) Sensor
Presión
Válvula Purga
T
** Al eliminarse el mezclador el ruido
de mezcla puede aumentar
Página: 70
Bomba Binaria Series 1200/1100- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL
Configuración 3: Volumen de retardo medio*
Retardo: 200-500µl
** Al eliminarse el mezclador el ruido
de mezcla puede aumentar
Inicio Mezcla: T
Válvula Purga
Amortiguador +
Sensor Presión
Configuración 4: Volumen de retardo muy bajo**
Retardo: < 200µl
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presión Sensor
Presión
Válvula Purga
400µl
Mezclador
T
Amortiguador +
Sensor Presión
Válvula Purga
Inicio Mezcla: T
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presión Sensor
Presión
Válvula Purga
400µl
Mezclador
T
Recorrido del Flujo
Página: 71
Soluciones 1290 Infinity LC - 2000 muestras/día usando ACR (Reg. Aut. de Columna)
• Análisis y Regeneración de columna
simultáneos con válvula de 2
posiciones / 10 puertos
• Tiempos de ciclo más cortos y mayor
capacidad de análisis de muestras para
laboratorios de HT y desarrollo de
métodos
• Respuestas más rápidas en los
controles de calidad durante la fase de
producción o de liberación de producto
acabado
Página 73
Adaptación HPLC: Mínimizar los Volúmenes Extra-
Columna en Función su Tamaño: Capilares de Conexión
Columna Vol. Col. Flujo tip. Vol. pico
d.i. mm L, mm V0 µl µl/min µl @k'=3
4.6
2.1
1
0.5
0.3
0.075
150 1329 1400 667
150 417 292 139
150 94 66 31
150 23.6 17 7.9
150 8.5 6.0 2.8
150 0.53 0.37 0.18
Capilar de 0,17 mm de d.i. x 150 mm = 3,4 µl de vol. interno
Capilar de 0,12 mm de d.i. x 150 mm = 1,7 µl de vol. interno
Capilar de 0,05 mm de d.i. x sílice fundida 150 mm = 0,3 µl vol
Capilar de 0,025 mm de d.i. x sílice fundida 150 mm = 0,07 µl vol
Re
qu
iere
n in
str
um
en
tos
es
pe
cíf
icam
en
te d
ise
ña
do
s
máx. D.I. cap. 0.17
0.12
0.075 0.05
0.025
(0.025)
Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 X V0 columna <0.1 x V pico
Página 74
Reducción Volúmenes Extra-Columna: Celdas Detección
y Volumen de Retardo con Gradientes de Concentración
Celdas de Detección DAD & MWD: (opciones parecidas con VWD)
Standard: 13µl, 10mm, 120bar típica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm
Semi-Micro: 5µl, 6mm, 120bar típica para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm
Micro: 2µl, 3mm, 120bar típica para columnas D.I.: 1 – 2.1 mm
Alta Presión 1.7µl, 6mm, 400bar típica para MS y columnas D.I ≥ 1 mm
Semi-Nano: 500nl, 10mm, 50bar típica para columnas D.I.: 0.5 –1 mm
Nano: 80nl, 6mm, 50bar típica para columnas D.I.: 0.18 –0.5mm
Preparativas: 3mm, 120bar / 0.3mm, 20bar / 0.06mm, 20bar
Con columnas cortas de 1.8µm y flujos elevados
se deberá reducir el volumen de la celda
Página 75
Adaptación HPLC: Cromatogramas < 1min pueden
Requerir Frecuencias de Adquisición Superiores a 20Hz: Detectores DAD-SL y MWD-SL pueden adquirir hasta a 80Hz para picos de
tan sólo 0.15 segundos de ancho
Para picos con PW (peakwidth al 50% de su altura)
> 0.01min (0.6seg) el DAD standard a 20Hz es suficiente
min 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0
80Hz
PW=0.30sec
40Hz
PW=0.33sec
20Hz
PW=0.42sec
10Hz
PW=0.67sec
5Hz PW=1.24sec
DAD standard
20Hz
Agilent SL Fast DAD
RSD%<1% 15 ptos./pico
1<RSD%<3% 12 ptos./pico
RSD% 10-12% 8 ptos./pico
Muestra: Mezcla de Fenonas
Columna: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um Gradiente: 50-100% ACN en 0.3min
Celda det.: 5ul
24pts.
80 pts.
12pts.
40 pts.
6pts.
20 pts.
Frec.
Adq..
Ancho pico Resolución Capacidad
sep. picos
80 Hz 0.300 2.25 60
40 Hz 0.329 2.05 55
20 Hz 0.416 1.71 45
10 Hz 0.666 1.17 29
5 Hz 1.236 0.67 16
Página 76
Configuración para Inyección “Grandes
Volúmenes”
Bomba Gradientes Detector
Columna Inyector
Configuración con Inyección Directa*: según las condiciones
utilizadas el volumen de inyección está limitado por las dimensiones de la columna*
Válvulas controladas por Agilent LC-1200/1100
Configuración con Columna Concentradora
Bomba de
Carga Isocrática
Pre-Columna
Concen-
tradora en válvula 2
posiciones
Desecho
Bomba
Gradientes
Inyector
Columna Separadora Detector
Carga (p.e. 2 min)
Análisis
Requiere 2 bombas
Concentración
Permitirá la inyección de grandes
volúmenes. La elución de la columna
concentradora se realiza en sentido contrario
a su sentido de carga
* Volumen típico de inyección 1-2 (5) % del V0 de la columna utilizada. V0(col. 100 x 4.6mm) =1.0ml
Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario Prestaciones UHPLC para TODOS LOS LABORATORIOS:
Resolución optimizada
3x100mm, 1.8µm
Resolución pico 5 = 7.16
Tiempo análisis: 7 min
Velocidad y Resolución optimizadas
3x50mm, 1.8µm
Resolución pico 5 = 4.79
Tiempo análisis: 1.1min
Convencional
4.6x150, 5µm
Resolución pico 5 = 4.20
Tiempo análisis: 11 min
min 0 2 4 6 8 10
min 0 2 4 6 8 10
min 0 2 4 6 8 10
10 x PRODUCTIVIDAD mayor nº de datos y de mejor calidad!
Página: 77
600 bars
Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario 100% Compatibilidad con Métodos HPLC
Reemplazo Sin Riesgo
1260/1220 Infinity LC
Sistema Cuaternario
1100/1200 Series
Sistema Cuaternario
Columna: 4.6 x 150mm, 5µm
Gradiente: 0 min 20 % B
10min 95 %
Flujo: 1 mL/min
min 0 2 4 6 8 10
Ejecute sus actuales métodos de HPLC y obtenga los mismos resultados
Página: 78
1100/1200 Binarios serían remplazados por 1260 Binario o 1290+ISET
600 bars
Problema: Reproducción de Analisis en
Gradiente con diferentes HPLC´s: - Impacto del
volumen muerto y de la calidad de la mezcla
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 B, Sig=275,4 Ref=400,40 (B:\RIC\AGI...RIC DATA\1 PHARMA METOCLOPRAMIDE\WAD PHARMA\XBRIDGE-2000004.D) 2
.747
3.0
49
8.1
21
8.3
23
8.7
47 8
.930
9.5
45
9.9
75
12.
005
12.
215
12.
393
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000001.D)
2.7
44 2
.884
6.0
88
6.3
28
6.6
73
6.8
72
7.4
80
7.9
23 9.9
37
10.
249
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000003.D)
2.8
87
3.3
20
8.5
38
8.7
44
9.1
59 9
.325
9.9
51
10.
379
12.
395
12.
630
12.
763
1200 Series LC Bomba Cuaternaria
1290 Infinity bomba Binaria
Sample: 0.5% impurities in formulation
(metoclopramide)
Xbridge C18, 150x3 mm, 3.5 µm dp,
0.45 ml/min, Eluent: A =0 .25 % AmAc, B = ACN,
Gradient: 0-15 min; 5-57 % B
El resultado:
• Diferencias en los RT y resolución
• ¡Se juntan 2 picos!
Página: 79
June 26, 2013
Confidentiality Label 80
Emulación de “cualquier” HPLC/UHPLC con el
1290 y la nueva tecnología ISET.
Pesticidas: Ejemplo Emulación 1100 con ISET Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell
min 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Rs= 1.90 1100 Series Binary LC
1290 Infinity LC - El gradiente llega antes
Rs= 1.15
Me
tam
itro
n
Chlo
rid
azo
ne
Sim
azin
e
Chlo
rtolu
ron
Diu
ron
Pro
pa
zin
e
Te
rbu
tyla
zin
e
Pro
me
tryn
Cya
niz
ine
1290 Infinity LC
with iSET
Rs= 1.87
Intelligent System Emulation Technology
ISET: - Cómo programarlo?
Select pump
Select autosampler
• Agilent 1100
• Agilent 1200
• Agilent 1220
• Agilent 1260
• Agilent 1290
• Waters Alliance
• …
Tecnología de Emulación Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)
Programa de gradiente
1290 gradiente
1200 gradiente
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyecctión
Mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y
emulando el perfil del gradiente a
clonar
Página 84
Resumen Conclusiones Adicionales • Posibilidades Adicionales para Reducir Tiempo Análisis :
– Trabajar a temperaturas elevadas permitirá reducir el tiempo de análisis, trabajar a flujos más elevados y reducir la resistencia a la transferencia de masa (útil con rellenos de 5μm).
– Aumentar el flujo con gradientes de concentración permitirá reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo la separación.
– Reducir el Vo de la columna permitirá reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo el poder de separación (si FxTg/ V0 = cte).
• Requisitos de la Cromatografía Ultra-rápida:
– Requerirá reducir el volumen de los capilares de conexión y de las celdas de detección, y aumentar la frecuencia de adquisición de datos.
– Requerirá adecuar el volumen de retardo al flujo y dimensiones de la columna utilizada.
– Columnas de 2.1mm de D.I. requerirán un equipo con mezcla a alta presión y mínimo volumen de retardo (como las bombas 1290, 1260, 1200, 1100 binarias o 1290 cuaternaria)
• Requisitos de la Cromatografía de Alta-Resolución:
– Requerirá un equipo de alta presión como el Agilent 1220, 1260 o 1290 y columnas 150mm x 1.8µm, o acoplar varias columnas en serie de 250mm x 5µm.
La flexibilidad de la Serie Agilent 12X0-Infinity le permite trabajar en
óptimas condiciones con todo tipo de cromatografía
Agilent 1290 Infinity LC
Muchas
Gracias
por su
Atención
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890 isidre_masana@agilent.com
customercare_spain@agilent.com www.agilent.com/chem