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Universidad Autónoma de Durango
MANUAL DE PRÁCTICAS
Bioquímica I
ASESOR EDUCATIVO: MC. MIGUEL ANGEL SANCHEZ RODRIGUEZ
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REGLAMENTO DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
1. PARA INGRESAR AL LABORATORIO:
a) Deberá portar bata blanca larga.
b) Manual de prácticas de bioquímica.
c) Presentación personal de acuerdo a los reglamentos de la
Universidad.
d) Solamente entrarán al laboratorio los alumnos que tengan
práctica (no se permiten visitas en horas de prácticas).
2. DENTRO DE LOS LABORATORIOS:
a) No se permite fumar ni tomar alimentos.
b) No sentarse en las mesas de trabajo.
c) Solamente se saldrá del laboratorio cuando todo el grupo
correspondiente termine su trabajo y tenga firmada su práctica.
RECOMENDACIONES:
1) Reporte inmediatamente a su profesor cualquier daño personal
por leve que sea.
2) Cuide de no contaminar los reactivos de trabajo.
3) No sacuda las pipetas.
4) Si utiliza ácido o álcalis fuertes, es mejor no pipetear
directamente.
5) Mantenga siempre limpio su material de trabajo.
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PRACTICA 1: RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE USO COMUN EN EL LABORATORIO
Introducción: PIPETAS.
Se le proporcionan en varias capacidades según el volumen
que va a medir, use la más apropiada (ejemplo: la pipeta de 1 ml
úsela preferentemente para medir volúmenes menores de 1mI).
Para pipetear, sostenga la pipeta con los dedos pulgar y medio,
absorba lentamente observando constantemente el nivel del líquido
tratando de que éste quede por arriba del nivel del volumen que va a
necesitar; tape el orificio superior con el dedo índice y regrese el
volumen necesario hasta que el menisco coincida con la división
(para el volumen que usted necesita).
Cuando necesite medir ácidos o bases fuertes no pipetee
directamente, use bulbo de hule.
Mantenga siempre limpias y secas las pipetas.
USO DEL FUEGO. Generalmente se utilizan mecheros de gas. Tenga precaución
al encenderlos y al apagarlos.
Tenga mucha precaución con las fugas posibles debido a las
uniones defectuosas.
En caso de tener un recipiente con material inflamable y éste
llegara a encenderse, utilice el extinguidor.
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CENTRIFUGACIÓN. En cualquier centrifugación los tubos a centrifugar deben estar
bien balanceados, de preferencia en base a peso (no a volumen).
Cada portatubos está provisto de un colchón de hule para
proteger el tubo de cristal durante la centrifugación. En caso de
rotura de un tubo dentro de la centrífuga, debe hacerse un aseo
completo antes de utilizada nuevamente.
Maneje con mucho cuidado la centrífuga, la velocidad debe
incrementarse lentamente para prevenir una sobrecarga eléctrica
que puede dañar el motor.
ESPECTROFOTOMETRÍA
La luz visible es una radiación electromagnética. El color
depende de la longitud de onda, ésta se determina en forma de:
Nanómetros (nm)=10 unidades Armstrong (Aº)
La luz blanca es la suma armónica de los colores del espectro.
Si una luz blanca atraviesa una solución o un filtro de color, el color
con el cual emerge se debe a que la solución o el filtro retiene todas
las otras longitudes de onda y sólo emerge la que ha podido pasar.
Así por ejemplo una solución que absorbe las longitudes de azul a
verde, aparece como color rojo.
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MEDICIÓN DE LA ABSORCIÓN. Si una solución absorbe una longitud de onda determinada, la
intensidad del rayo disminuye a medida que tropieza con las
moléculas de la sustancia absorbente. La absorción es proporcional
al número de las moléculas en la solución.
La absorción de una luz monocromática (una longitud de onda)
por una solución problema se utiliza para cuantificarla. Para realizar
esta determinación, es necesario que dicha absorción siga la ley de
Beer Bouger. Esta ley se expresa con la fórmula:
Log ___I°__ = a x C x e
I
Donde I° es la intensidad de la luz que llega a la solución, I es
la cantidad de luz que emerge de la solución, "a" es el coeficiente de
extinción característico a cada problema, "C" es la concentración del
problema y "e" es el espesor de la muestra.
En la práctica I° se calibra a 100%, mientras que I es la lectura
del galvanómetro; "a" es consonante, como también lo es el valor de
"e", al despejar queda:
Log transmisión = concentración
Si trabajamos con un espectrofotómetro en condiciones
preestablecidas de técnica, reactivos y longitud de onda, la lectura de
la transmisión es proporcional a la concentración.
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El espectrofotómetro es un instrumento que consta de una
fuente de luz (policromática) y un sistema monocromador: prisma o
rejilla, la intensidad de la luz se regula con una abertura variable.
La luz que emerge de la muestra se dirige a una fotocelda, la
cual está conectada a un galvanómetro.
Ya en la práctica, primero se selecciona la longitud de onda
con la cual se va a trabajar y colocando una cubeta llena de agua
destilada o una solución de reactivos (blanco) se calibra el equipo a
100% de transmisión cambiando después a la solución problema con
lo cual se obtiene la lectura del problema.
Para obtener la concentración del desconocido la lectura que
se obtuvo del problema se compara con gráficas hechas previamente
o mediante un factor de conversión.
Objetivos
1. El alumno identificará y reconocerá el material y equipo de
laboratorio
2. El alumno aprenderá a usar los diferentes materiales de
medición.
Materiales
• Todo material existente en el laboratorio
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Procedimiento
El quipo que comúnmente se usa en los laboratorios son
balanzas, espectrofotómetro, centrífugas, hornos, microscopios,
pHmetro, etc. En tanto que el material usado es mucho mas diverso,
en los que podemos encontrar material volumétrico como pipetas,
matraces Erlenmeyer, matraces de aforación, vasos de precipitado,
etc. así como otros materiales como tela de asbesto, anillo metálico,
soporte universal, mechero, manguera de látex, papel filtro, tubos de
ensaye, papel indicador, agitador de vidrio, cápsulas de porcelana,
etc.
Observar detalladamente el material y equipo de laboratorio y dibujar cada uno de ellos.
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Cuestionario
1. ¿Qué es un material volumétrico?
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2. ¿Para que se utilizan los recipientes de aforación?
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3. ¿Para la medición de volúmenes pequeños (menores a 20 mL)
que material es mejor usar y porque?
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4. ¿Menciona que material o equipo hay para tu seguridad en el
laboratorio?
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Conclusiones:___________________________________________
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Bibliografia:____________________________________________
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PRACTICA 2: RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS
Introducción:___________________________________________
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Objetivos
1. Identificación de glúcidos.
2. Hidrólisis del enlace de un disacárido
Materiales
• Muestras de glúcidos al 1%:
o glucosa
o maltosa
o lactosa
o sacarosa
o almidón.
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• 7 Tubos de ensayo y 1 gradilla
• Baño maría (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).
• Mechero
• soporte universal, tela de asbesto y anillo metálico.
• 5 Pipetas de 2, 5 o 10 mL
• Reactivo de Fehling A
• Reactivo de Fehling B
• Lugol
• HCl diluido (10%)
• Bicarbonato de sodio
Procedimiento
1. Investigación de azucares reductores Reacción de Fehling:
• Tomar 3 ml de muestra de glúcidos en los tubos de ensayo.
• Añadir 1 mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B. El líquido del
tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul.
• Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero
de Laboratorio.
• La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-
ladrillo.
• La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a
un tono azul-verdoso.
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Observaciones:__________________________________________
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2. Investigación de azucares no reductores
• Tomar 3 ml de una muestra de sacarosa y añadir unas 10
gotas de ácido clorhídrico al 10%.
• Calentar a la llama del mechero durante un par de minutos.
• Dejar enfriar y realizar la Prueba de Fehling.
• Observa el resultado.
Nota: Se recomienda antes de aplicar la reacción de Fehling,
neutralizar con bicarbonato, Fehling sale mejor en un medio que
no sea ácido.)
Observaciones:__________________________________________
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3. Investigación de polisacáridos (almidón)
Reacción del Lugol:
Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en
contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y
yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico.
• Poner en un tubo de ensayo unos 3 mL de almidón
• Añadir 5 gotas de lugol.
• Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-
violeta, la reacción es positiva.
Observaciones:__________________________________________
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Cuestionario
1. ¿Qué es un azúcar reductor?
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2. ¿Qué azucares presentaron características de azúcar
reductor?
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3. ¿Que utilidad o aplicación a nivel industrial presentan los
azucares reductores?
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4. Debido a que el almidón en el experimento tres adquiere una
coloración violeta.
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Conclusiones:___________________________________________
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Bibliografia:____________________________________________
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PRÁCTICA 3: RECONOCIMIENTO DE LIPIDOS
Introducción:___________________________________________
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Objetivo Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lípidos, algunas de
las cuales pueden servirnos para su identificación.
Materiales
• Baño María (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).
• Mechero, tela de asbesto y anillo metálico.
• 2 Probetas
• Agitador de vidrio
• 3 tubos de ensaye
• 1 gradilla
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• 3 pipetas (5 o 10 mL)
• Aceite vegetal
• Sol. de Hidróxido sódico al 20%.
• Éter o cloroformo.
• Alcohol
• Agua destilada
Procedimiento
1. Saponificación
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico
descomponiéndose en los dos elementos que la forman: glicerina y
los ácidos grasos. Estos se combinan con los iones sodio o potasio
del hidróxido para dar jabones, que son en definitiva las sales
sódicas o potásicas de los ácidos grasos. La reacción es la siguiente:
Proceder de la siguiente forma:
• Colocar en un vaso de precipitado 50 mL de aceite vegetal y 50
mL de una solución de hidróxido sódico al 20%.
• Agitar enérgicamente y colocar el vaso a baño María de 20 a
30 minutos.
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• Transcurrido este tiempo, se puede observar en el vaso tres
capas: la inferior clara, que contiene la solución de sosa
sobrante junto con la glicerina formada; la superior amarilla de
aceite no utilizado, y la intermedia, de aspecto grumoso, que es
el jabón formado.
Observaciones:__________________________________________
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2. Solubilidad
Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en
ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una "emulsión" de
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aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por
reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor
densidad se sitúa sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son
solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, xilol,
benceno, cloroformo, etc.
Proceder de la siguiente manera:
• Tomar tres tubos de ensayo y poner en cada uno de ellos 3 mL
de agua, en el otro 3 mL de éter y en el tercero 3 mL de alcohol
u otro disolvente orgánico.
• Añadir a cada tubo 1 mL de aceite y agitar fuertemente.
Observar la formación de gotitas o micelas y dejar en reposo.
Se verá como el aceite se ha disuelto en el éter y en cambio no
lo hace en el agua, y el aceite subirá debido a su menor
densidad.
Observaciones:__________________________________________
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Cuestionario:
1. ¿Qué sustancias quedan en el residuo liquido una vez
separado el jabón?
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2. Otros jabones se fabrican utilizando diferentes grasos y álcalis.
Informe de las diferentes propiedades de estos jabones.
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3. ¿Qué otros ingredientes se pueden añadir a los jabones y con
que fines?
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4. ¿Como puedes probar si el residuo resultante de fabricar el
jabón tiene residuos álcalis?
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5. ¿Qué factores influyeron en que el jabón dejara de ser un
producto de lujo
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Conclusiones:___________________________________________
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Bibliografia:____________________________________________
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PRÁCTICA 4: RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS Introducción:___________________________________________
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Objetivos
1. Comparará las reacciones de los diferentes aminoácidos y los
identificará por grupos químicos característicos
2. Poner de manifiesto ciertas propiedades de las proteínas
Materiales
• Baño María (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).
• Mechero.
• Soporte universal, anillo metálico y tela de asbesto
• Gradilla
• 4 Tubos de ensayo
• Gotero
• 5 pipetas de 5 o 10 mL
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• Ácido acético
• Ácido nítrico
• Hidróxido de sodio al 20 y al 40%
• Hielo
• Solución de sulfato cúprico al 1%
• Acetato de plomo al 5%
• Clara de huevo
Procedimiento
Para ver la coagulación de las proteínas se puede utilizar clara de
huevo, para conseguir más volumen puede prepararse para toda la
clase una dilución de clara de huevo en agua, de forma que quede
una mezcla aún espesa.
1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara
de huevo.
2. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del
mechero.
Reacciones coloreadas
1. Reacción Xantoproteica
Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color
amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico
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concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas
con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente
en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza
con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.
Proceder de la siguiente manera:
• Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 mL de solución problema
(clara de huevo ).
• Añadir 1 mL de HNO3 concentrado.
• Calentar al baño maría a 100º C.
• Enfriar en agua fría
• Añadir gota a gota una disolución de sosa (NaOH) al 40%.
Observaciones:__________________________________________
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2. Reacción del biuret
La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos,
ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -)que
se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se
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pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia
compleja denominada biuret, de fórmula:
que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una
coloración violeta característica.
Proceder de la siguiente manera:
• Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 mL de albúmina de
huevo.
• Añadir 2 mL de solución de hidróxido sódico al 20%.
• A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico
diluida al 1%.
• Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica.
Observaciones:__________________________________________
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3. Reacción de los aminoácidos azufrados
Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco
de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación
mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al
reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de
plomo.
Proceder de la siguiente manera:
• Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 mL de albúmina de huevo
(clara de huevo).
• Añadir 2 mL de solución de hidróxido sódico al 20%.
• Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.
• Calentar el tubo hasta ebullición.
• Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se
ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los
aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que
tienen en su composición aminoácidos con azufre.
Observaciones:__________________________________________
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Cuestionario
1. ¿Explique a que se debe la precipitación de la albúmina?
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2. Mencione en que líquidos del organismo humano se puede
encontrar las albúminas.
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3. Que efectos químicos se presento en cada una de las pruebas
(represente las reacciones químicas).
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4. ¿Que compuestos, elementos o sustancias, además de la
albúmina se encuentran en la clara de huevo?
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5. ¿Que porcentaje de albúmina se encuentran en la clara de
huevo?
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Conclusiones:___________________________________________
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Bibliografia:____________________________________________
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PRÁCTICA 5: RECONOCIMIENTO DE ENZIMAS Introducción:___________________________________________
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Objetivos
1. Poner de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en
tejidos animales y vegetales.
2. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de
las enzimas.
3. Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa.
Materiales
• Gradilla
• 6 tubos de ensayo
• Mechero
• 2 pipetas de 5 mL y 3 de 1 mL
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• Baño María (vaso de precipitado de 250 mL o 125 mL)
• Soporte universal, anillo metálico y tela de asbesto
• Solución de lugol
• Soluciones de Fehling
• Agua oxigenada
• Almidón
• Trocitos de hígado
• Trocitos de tomate
Procedimiento
1. Reconocimiento de la catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los
tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos
es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una
molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua
oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y
oxígeno, por lo que se soluciona el problema.
Proceder de la siguiente manera:
• Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado.
• Añadir 5 mililitros de agua oxigenada
• Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento
de oxígeno.
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Observaciones:__________________________________________
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2. Desnaturalización de la catalasa
Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental
de proteínas, que es la desnaturalización.
Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos
desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la
estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia
su función catalítica.
Proceder de la siguiente manera:
• Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado
• Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos
minutos.
• Después de este tiempo, retirar el agua sobrante.
• Añadir el agua oxigenada.
Observaciones:__________________________________________
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3. Hidrólisis del Almidón
Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima,
la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima actúa sobre
el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace O-glicosídico, por lo
que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa.
Proceder de la siguiente manera:
• Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1
al 4.
• Añadir en cada tubo 5 mililitros de una solución diluida de
almidón.
• A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva.
• En el tubo 1, haz la Reacción de Fehling.
• En el tubo 2, realiza la Reacción de Lugol.
• Los tubos 3 y 4 que contienen el almidón, al que le hemos
echado la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al baño
María, controlando la temperatura del agua para que no hierva,
ya que lo que intentamos, es que la enzima de la saliva trabaje
a unos 37ºC. Dejarlo unos 15 minutos.
• A continuación realizar las siguientes reacciones: En el tubo
número 3, realizar la Reacción de Fehling y en el tubo número
4, realizar la Prueba del Lugol.
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Observaciones:__________________________________________
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Cuestionario
1. ¿Explique a que se debe el burbujeo en el experimento 1?
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2. ¿Explique a que se debe que no hubo burbujeo en el
experimento 2?
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3. Explique a que se debe los resultados de los tubos 3 y 4 del
experimento 3.
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4. ¿A que se debe que la saliva tenga un efecto sobre el almidón?
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Conclusiones:___________________________________________
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Bibliografia:____________________________________________
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