Citometría de flujo multicolor para cuantificar EMR.
Dr. Elías Pérez Becerra Adscrito al departamento de Hematología y
responsable del área de Citometría de Flujo
En las últimas décadas, los avances en quimioterapia, radioterapia y en el trasplante de precursores hematopoyéticos han mejorado de forma considerable las posibilidades de supervivencia de los pacientes afectados de cáncer hematologico.
!Sin embargo, el riesgo de recurrencia continúa siendo,
en muchos casos, un obstáculo importante para su curación.
Introducción
Relevancia clínica de la medición de EMR
La detección de enfermedad mínima residual (EMR) constituye un procedimiento de gran i n t e r é s c on o b j e to d e a d e c u a r l o s requerimientos terapéuticos y además en algunos casos tiene una clara trascendencia pronostica.
!Brugiatelli M et al.
(Cancer 1989)
Robertson LE et al. (Blood 1992)
Leonormand B et al. (Leukemia 1994)
Cabezudo E et al. (Leukemia, 1997)
García-Vela A et al. (Leukemia, 1999)
Rawstron AC et al. (Blood 2001)
Maloum K et al. (Br J Haematol 2002)
Gupta R et al. (Am J Clin Pathol 2004)
Bottcher S et al. (Leukemia 2004)
Moreton P et al. (J Clin Oncol 2005)
Sensitivity
10-2 !
10-2 !
10-3 !
10-3 !
10-4 !
10-4 !
10-4 !
10-3
!10-4
!10-5
!
Aberrant criteria
sIgκ+/sIgλ+ ratio !
sIgκ+/sIgλ+ ratio !
CD19+/CD5+ !
CD19+/CD5+ !
CD19+/CD79b+d !
CD19+/CD20+d/CD5+/CD79b+d !
CD19+/CD20+d/CD5+/CD79b+d !
CD19+/CD5+ !
CD19+/CD5+/CD43+/CD20+d !
CD19+/CD20+d/CD5+/CD79b+d !
Prognostic value
Yes !
Yes !
Yes !
Yes !
Yes !
Yes !
Yes !
Not analyzed !
Not analyzed !
Yes !
Yes
Significancia clínica
Report Cases Aim Samples Time points (cut-off levels) Conclusion
Campana et al (Blood,1990)
28 Predict relapse
BM Positive vs negative Prognostic factor
Drach et al (Cytometry,1992)
8 Predict relapse
BM End of induction (0.5-4x10-2)
Prognostic factor
Griesinger et al (Blood,1997a)
48 Predict relapse
BM CR Prognostic factor
Ciudad et al. (J Clin Oncol,1998)
24 child 29 adult
Predict relapse
BM Sequential Prognostic factor
Coustan-Smith et al (Lancet,1998)
158 children
Predict relapse
BM End of induction/wk 6 (10-2) Continuation therapy/wk 14 (10-3), Wk
32 (10-4), Wk 56 (10-2)
Prognostic factor
Coustan-Smith et al (Blood,2000)
195 children
Predict relapse
BM End of induction/wk 6 (10-2) Continuation therapy/wk 14 (10-3), Wk
32 (10-4), Wk 56 (10-2)
Prognostic factor
Malec et al (Leukemia, 2001)
30 Predict relapse
BM End induction Prognostic factor
Coustan-Smith et al (Blood, 2002)
201 children
Predict relapse
PB End induction (10-4)
Prognostic factor
Vidriales et al (Blood, 2003)
Coustan-Smith et al (Blood, 2006)
102 adults 328
children
Predict relapse Predict relapse
BM !
BM
Day 14, end of induction (10-3- 10-4)
Day 19 (10-4)
Prognostic factor Prognostic factor
Significancia clínica
Campana&Coustan-Smith, Best Pract Res Clin Haematol, 2002
Detección por inmunoflourescencia EMR en un paciente con LLA-‐T
cCD3TdT
Celula LLA-T CD3+ TdT+
Linfocito T normal CD3+
Linfoblastos T normal TdT+
Métodos para la detección de EMR
Los métodos de estudio para detectar EMR deben cumplir requisitos previos para poder ser considerados útiles. Dichos requisitos incluyen una elevada sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y aplicabilidad de la técnica.
!Los procedimientos que actualmente cumplen
estos requisitos son la inmunofenotipificación por citometría de flujo y algunas técnicas de biología molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Métodos de biología molecular basados en PCR para valorar EMR
La PCR es una técnica molecular que permite amplificar secuencias específicas de ADN o ARN expresadas en las células tumorales.
!Con la RT-PCR, se puede analizar el ARN de transcripción expresado en
dichas células. Esto nos permite el estudio de los genes alterados por translocaciones primarias y de otros genes característicos asociados a determinados tipos de tumor.
!En la monitorización de la EMR es importante la cuantificación de ésta
mediante la PCR en tiempo real, de manera que la comparación de su nivel de amplificación con los estándares adecuados, proporciona una medida cuantitativa del grado de afectación.
!Posee una sensibilidad que se sitúa entre 1 x 104 y 1 x 105
Citometría de flujo en la valoración de EMR
Tecnología utilizada para analizar y definir el perfil inmunofenotípico de las células neoplásicas y establecer así la presencia de IAL.
!Se basa en la utilización de anticuerpos monoclonales
específicos, dirigidos contra proteínas de membrana o intracitoplasmáticas, que llevan apareado un fluorocromo para su detección y visualización mediante un citometro de flujo
!Posee una sensibilidad superior a 1 x 104 (1 x 105)
* Increased through the usage of additional molecular markers (e.g.: WT1, NMP1 & FLT3 mutations
MRD. Applicability
FCM immunophenotyping PCR/RT-PCR analyses (sensitivity) (sensitivity) Disease category LAIP sIgκ/sIgλ Junctional Reg Chromosomal or TCRVβ Ig/TCR genes aberrations (10-3-10-4) (10-2-10-3) (10-3-10-6) (10-4-10-6) ! Precursor B-ALL Children >90% NA 95% 40-50% Adults >95% NA 90% 35-45% T-ALL Children >95% 30-35% >95% 10-25% Adults >95% ? 90% 5-10% ! Chronic B-cell leukemias >95% >95% >95% 10-25% Chronic T-cell leukemias 70-80% 60-65% 95% <5% B-cell lymphomas 90% >95% 70-80% 25-30% T-cell lymphomas 75-90% 50-60% 95% 10-15% Multiple myeloma >97% >97% 70-80% NT !
Citómetro de Flujo
Suspensión celular teñida
Laser
FSC
FL1
FL2
FL3
SSC
o
o
o
o
o
Fluído
Filtr
os
Fluo
rocr
omos
Programas •adquisición •análisis
PMT
Celda de flujo
Punto de interrogación
Sistema óptico Sistema electrónico Sistema de fluido líquido Sistema de computación
Fundamentos de la Citometría de Flujo
C
Emisiónmáxima
La emisión fluorescente cubre un rango amplio de longitudes de onda
Longitud de o
nda
mas la
rga con
menor e
nergía
Fluore
scenciaLongitud de onda
corta con alta
energía
Excitación
LáseresAzul
(488 nm) Rojo
(635nm)Violeta (405nm)
Ultravioleta Infrarojos
(Máxima exitación)
Espectro luminoso
bloquea
bloquea
bloqueabloquea
BP !!LP !!!SP !!D
FILTROS
Max Em 519 578 615 694 785 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5
525BP 575BP 620BP/30 695BP/30 755LP
488 nm
D
B
A
FILTROS
Absorcion de energia
Emisio
n de ener
gia
E
“Bright” = good resolution sensitivity
W2
W1
D
WD(SI)Index Stain =
Where D = difference between positive and negative peak medians, and W = 2 x rSD (robust standard deviation)
Holden Maecker, Ph.D.
Visión General de los Fluorocromos
Características Intrínsicas Coeficiente de Extinción El rendimiento cuántíco Solapamiento de la emisión
espectral
Optica del Instrumento Selección de filtros Sensibilidad de los PMT Potencia del Láser
Comparación de la intensidad de conjugados del anti-‐CD8
FITC PE ECD PC5 PECy5.5 PC7
APC Alexa 700 APCAlexa 700 APC-‐H7 APCAlexa 750
Pacific Blue
Excitación
Blue
Red
Violet
+Qdot NanocrystalsKrome Orange
Ag expresión altaAg expresión baja
(http://www.mcg.edu/cancer/shared/flow/fluorophores.html)
INDICE DE COLOR
Comparaciones de fluorocromos
Comparación de los conjugados anti-CD8 en diferentes instrumentos
Flurochrome Sensitivity Across Multiple Platforms
0
100
200
300
400
500
600
700
800
FC500 Gallios Inst X Inst Y
Sign
al to
Noi
se
FITCPEECDPECY5PECY5.5PECY7APCAlexa Fluor 700APCA700APCA750Pacific BluePacific Orange
Optima relación Señal/Ruido Saturación
!– Optima S/R para cada combinación
– Evaluación de interacciones
– Cuando sea posible, evaluar varias dosis • 2 variables – matriz simple • >2 variables – Utilizar matriz compleja
CD127-APC
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Dose (ug/test)
Fluo
resc
ence
nce
S/NPositive MFINegative MFI
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Dose (ug/test)
Fluo
resc
ence
nce
S/NPositive MFINegative MFI
CD x
2X 1x ½ x
CD y
2X 2,2 2,1 2, ½
1x 1,2 1,1 1,½
½ X ½, 2 ½, 1 ½, ½
Titulación de conjugados independientes
Combinación de matriz para finalizar dosis
Para ajustar la compensación es necesario considerar los diferentes reactivos de tándems como fluorocoromos diferentes
BCI OtroBCI
Otro
Sub
Sobre
Compensación
0
50
100
150
200
250
300
350
400
550 650 750 850
PECy7 ConjugadosMultiples Vendedores, Multiples Conjugados
Algunas consideraciones para obtener un resultados confiables
• Seleccion de Fluorocromos / Conjugados • Maximizar separacion espectral • PE / APC: Ag’s baja expresion y con expresion
continua • Colores en secuencia (“Tandem”):
Mediana-densidad → Antigenos brillantes
• Curvas de titulacion para cada conjugado • Determinar proporcion señal/ ruido • Escoger dosis optima
• Curva de area de saturacion • La mas alta S/N
• Siempre utilice controles: • Controles negativos:
• Poblacion negativa interna • FMO • Controles de isotipo • Control de autofluorescencia
Estrategia Optimización
Verificación
• Controles positivos: • Cada color independiente en un tubo • Muestra positiva conocida
• Evaluar las interferencias mayores • Interferencias • Uniones no especificas
Análisis de los resultados
Instrumento
Las cuatro reglas de los antígenosCD en cuanto a su utilidad para tipificar neoplasiashematológicas:
1. No existe un solo antígeno CD que sea específico de una enfermedad.
!2. Todos los antígenos CD que se emplean para
definir l inaje y estadío de las neoplasias hematológicas se expresan también en células normales.
Las cuatro reglas de los antígenosCD en cuanto a su utilidad para tipificar neoplasiashematológicas:
3. Las neoplasias hematológicas se distinguen de las célulasnormales solamente por aberraciones en la expresión de antígenos por lo demás normales.
Cuantitativas. Infidelidad o promiscuidad de linaje. Cronológicas. Anatómicas. Numéricas.
Las cuatro reglas de los antígenosCD en cuanto a su utilidad para tipificar neoplasiashematológicas:
4. En algunas ocasiones las células neoplásicas no presentan aberraciones en la expresión de los antígenos CD que permitan distinguirlas de las células normales.
ANÁLISIS CELULAR MUTIPARAMÉTRICO
Conocer la hematopoyesis normal. Reconocer cambios anormales. Contar con la instrumentación necesaria. Utilizar reactivos de excelente calidad. Utilizar técnicas adecuadas para el proceso de la
muestra. Interpretar los resultados en el contexto de la
enfermedad.
IDENTIFICACION DE POBLACIONES CELULARES
NORMALES: ❖ Valorando los patrones de diferenciación y maduración celular.
!!ANORMALES:
❖ > < Expresión antigénica. ❖ Asincronismo en la expresión de antígenos de maduración. ❖ Infidelidad de linaje celular. ❖ Expresión de antigenos producto de mutaciones moleculares.
Citometría de flujo multiparamétricaComprender la biología.
❖ Reconocer las distintas poblaciones celulares. ❖ Ontogenia de los antígenos de diferenciación leucocitaria.
Comprender la metodología. ❖ Clonas de anticuerpos monoclonales.
• Calidad. Titulación. ❖ Plataformas de los equipos.
• Láseres, PMTs, Filtros • Estandarización.
❖ Opciones de flourocromos • Características intrínsecas. • Tecnología de tandem. • Compensación.
Manejar la tecnologia. ❖ Diseño de protocolos de análisis. ❖ Software.
Conocer la patologia. ❖ Selección de los paneles de AcMo.
Maturing
Neutrophils Eosinophils
Monocytic cells
Mature Lymphocytes
CD34+ B-‐cell precursors
HPC
NRBC
UNGATED EVENTS
Basophils pDC
!!CD34-‐ B-‐cell precursors CD45-PerCP
Tra
nsfo
rme
d S
SC
Normal bone marrow: multilineage differentiation
CANCER RESEARCH CENTER
Monocytic-‐ DC
Modified from Matarraz S et al. Clin Cytometry 2010
Maturing
Neutrophils Eosinophils
Monocytic cells
Mature Lymphocytes
CD34+ B-‐cell precursors
HPC
NRBC
UNGATED EVENTS
Basophils pDC
!!CD34-‐ B-‐cell precursors CD45-PerCP
Tra
nsfo
rme
d S
SC
Normal bone marrow: multilineage differentiation
CANCER RESEARCH CENTER
Monocytic-‐ DC
Modified from Matarraz S et al. Clin Cytometry 2010
LMA LLA B LLA T
Mieloblasto
Promielócito/
MielócitoMetamielócito
Neutrófilo Banda/
segmentado
CD11b
CD
13
Phenotypic patterns of neutrophil maturation
Identificación de células hematopoyéticas en maduración
ESTADIO I
ESTADIO II
ESTADIO III
ESTADIO IV
Línea de granulocito neutrófilo
Monocitos
Precursores Monociticos
Serie eritroide
Líneas monocítica y eritroide
Granulocito basófilo
CDp
Granulocito basófilo y CD plasmocitoideLínea linfoide B
CD19+
CyCD79a+
Modified from Matarraz S et al. Clin Cytometry 2010
MONOCYTIC LINEAGE
Monoblast. Irregular shaped nuclei
Visible nucleoli
Basophil cytoplasm. N/C lower than myeloblast
Non-specific sterese stain for identification
cMPO+d/+/+d HLADR+/++ CD45+d/+ CD117+/- CD33+d/++ CD64+d/++ CD13+/-/+ CD11b-/+ CD15-/+++/+ CD16- CD10- CD66c CD300e
CD14
SERIE ERITROIDEMieloblasto
Eritrocito
Proeritroblasto Eritroblasto basófilo
Eritroblasto policromático
Eritroblasto ortocromático
Reticulocito
Multipotent hematopoietic precursor (“Stem cell”)
Common myeloid precursor
Megakaryoblast
Promegakaryocyte
Megakaryocyte
Platelets
cMPO- HLADR+/- CD45+d/- CD117+/- CD105+d/+/- CD71+dim/- CD36-/+++ CD33+d/- CD13+d/- CD11b- CD61-/++ CD41-/++ CD42a-/++
MEGAKARYOCYTIC LINEAGE
PRECURSORES NORMALES DE CELULAS B EN MO
CD34
TdT
CD38
CD45
CD10
CD19CD22 CD20
Pro-‐B Pre-‐B B-‐Tempranos B-‐Tardíos
Análisis del IAL para valorar EMR
Interpretar los cambios antigénicos de las poblaciones celulares en el contexto: ❖Población celular de estudio.
• Contar AcMo. Que la identifiquen. • Considerar la infidelidad de línea.
❖ Intensidad de la expresión antigénica. • Estadio de maduración • Expresión coordinada de antígenos.
❖ Intensidad de la expresión antigénica de otras poblaciones celulares
• Control interno de calidad de los reactivos. • Referencia interna.
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
Importancia de la selección de marcadores a utilizar.
PANELES PARA LA BUSQUEDA DE INMUNOFENOTIPOS ASOSIADOS A LEUCEMIAS
LINAGEMARCADORES UTILIZADOS USANDO 8 FLOUROCROMOS
FITC PE ECD PC5 PC7 APC APC-‐AF700 APC-‐AF750
LINFOIDE BCD10 CD49f CD45 CD34 CD15 CD58 CD19 CD20
CD10 7.1 (NG1) CD45 CD2 CD33 CD13 CD19 CD7
LINFOIDE TTdT CD7 CD45 CD4 cCD3 CD2 CD8 CD3
CD10 CD34 CD45 CD2 CD33 CD13 CD19 CD7
MIELOIDE
CD10 CD33 CD45 CD34 HLA-‐DR CD13 CD19 CD20
CD15 7.1 (NG1) CD45 CD34 CD33 CD13 CD56 CD117
CD15 CD2 CD45 CD34 CD33 CD13 CD7 CD11b
Diferencias inmunofenotipicas de los blastos en distintos pacientes con leucemia aguda.
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
Valoración EMR en pacientes con LLA
Valoración EMR durante las distintas etapas del tratamiento LLA-B
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
Podemos ver la complejidad al analizar solamente 3 marcadores y 1 dotplot en tres pacientes con LLA-‐B
Selección en células CD19+
N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM VS AML
CD15 26.6CD117 19.4SSC 19.2FSC 19.0CD11b 6.0
Maturation stage of AML blasts
Aberrant phenotype of AML blasts
Aberrant markers
Enfermedad mínima residual en LLASangre periférica vs Medula ósea
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
Enfermedad mínima residual en LLA-‐TSangre periférica vs Medula ósea
DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith
Solicitud de EMR
Demograficos completos del paciente. Tipo de muestra. Fecha y hora de la toma de muestra. Diagnostico. (Clínico) Inmunofenotipo al diagnostico.