Date post: | 28-Oct-2015 |
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¿Para qué aislar microorganismos?
¿Para qué identificar un microorganismo ?
Caracterización vs. Identificación
1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva
2. Pruebas Moleculares Identificación final
Aislamiento e identificación de microorganismos
Procedencia
Características
Expectativas
Métodos convencionales
Métodos moleculares
Tratamiento inicial
Siembra
Aislamiento
Identificación
Tratamiento inicial
Siembra
Enriquecimiento (selectivo o no)
Calentamiento
Filtración
Homogeneización, etc
Selección de medios de cultivo
Inóculo
Observación microscópica
Agotamiento por estrías, diluciones seriadas, etc
Subcultivo
Aislamiento
Criterios de pureza
Cultivo puro
Identificación
Macroscópicos
Microscópicos
Muestras
Microorganismos indicadores
Coliformes
P. aeruginosa
Detección de B. cereus en leche en polvo,miel, arroz
Detección de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda
Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados
Agua
Alimentos
Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Selección de esporas
Calentamiento
Enriquecimiento
Agotamiento por estrías Mossel
Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))
Repique
Tinciones
Cultivo puro
Morfología de las colonias
Forma y tamaño de las colonias: Irregular, puntiforme
Bordes: liso, rugoso.
Elevación: Convexo, elevado, umbonado, liso.
Color: pigmento, opaca, translucida, brillante.
Textura: Mojada, mucosa, seca.
Bacillus subtilis
Forma de la colonia y tamaño: irregular
Bordes: ondulado
Elevación: umbonada
Color: Blanca crema
Textura : seca
Proteus vulgaris
Típico aspecto sobre la caja de petri
Klebsiella pneumoniae
I M Vi C*
Indol
Rojo de Metilo
Vohes Proskauer
Citrato
Identificación de bacilos entéricos
Bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas y fermentadores de
glucosa.
Miembros
Patógenos: Salmonella y Shigella
Patógenos ocasionales: Proteus y Klebsiella
Flora normal: Escherichia y Enterobacter
Test de producción de Indol
Determina la capacidad de un microorganismo de degradar triptófano
Triptofanasa
Triptofano Indol + Acido Piruvico + amoniaco
Butanol
Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tubo
HCl
Reactivo Kovac
positivo negativo
E.coli
Acción de la triptofanasa
El triptofano se adiciona al medio en una
Concentración 1%. Es una peptona derivada de
la caseína. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.
Rojo de Metilo
Para identificar bacterias que metabolizan glucosa con producción de altas concentraciones de ácidos.
Sirve para diferenciar E.coli de Enterobacter
El medio tiene glucosa al 10% y Rojo Fenol
E. coli : estabiliza el pH bajo producto de la acidificación del medio
Enterobacter: Convierte los ácidos en productos finales neutros como 2,3 butanediol y acetoina lo que
resulta en una elevación del pH en in valor de 6.
Positive positive negative control.
pH 4 vira al rojo (test positivo)
pH 6 sigue indicando presencia de
acido pero a una concentración
insuficiente para producir el viraje
Left: uninoculated control
Right: negative (copper color)
Left: uninoculated control
Right: positive (red color) Left is Barritt's A (alpha-napthol) and right is
Barritt's B (KOH--potassium hydroxide).
Voges-Proskauer (VP)
Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3butanediol como
resultado de la degradación de glucosa. Positivo para Enterobacter aerogenes
Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo
y se agita ligeramente. Rojo positivo
Glucosa + O2 piruvato a-acetolactato acetoina 2,3 butanodiol
40% KOH
Acetoina + a-naftol Complejo rosado (creatina + diactetilo)
Etanol Absoluto
Para determinar la capacidad de un m.o. de utilizar la enzima citrato permeasa para usar
como fuente de carbono el citrato únicamente.
Simmon's citrate agar: Es un medio definido que contiene citrato de sodio como fuente carbonada.
Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul
de bromotimol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.
Citrato
Enterobacter cloacae: positive
Escherichia coli: negative
Klebsiella pneumoniae: positive
Citrato permeasa
Glucosa + O2 Ac. piruvico + Ac. Oxalacetico + CO2
Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3
(producto alcalino que eleva pH
vira de verde a azul)
Catalasa* Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. Micrococcaceae
como Staphylococcus catalasa positivos, Streptococcaceae, Streptococcus
Enterococcus catalasa negativo.
H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no
enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática de radicales
superóxido. H2O2 puede dañar las bacterias, la enzima catalasa presente en algunas
bacterias lo transforma en agua y oxígeno.
Se adiciona peróxido de hidrogeno sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta
objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.
2H2O2 2H2O+ O2
Catalasa
Oxidasa*
Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiración).
Oxidase negativa Enterobacteriacae y Pseudomonadaceae, Neisseria oxidasa positiva.
La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el
aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor de electrones artificial
(phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo Oxidasa.
Si la enzima esta presente se observará una coloración purpura.
El test se debe leer a los 15 segundos pues el reactivo puede cambiar de color con el paso
del tiempo.
oxidasa (+)
Pseudomonas
oxidasa (-)
E. coli
Neisseria
Reducción de nitrato*
Muestra la capacidad de un m.o. de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2), nitrógeno
molecular (N2) o amoniaco, usando la enzima nitrato reductasa.
Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiración
anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como
sustrato.
Determinación de Nitrito NO2-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY
1. Solución A: acido sulfanico
2. Solución B: a-naftilamina
Determinación de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER
REACCION POSITIVA: aparición instantánea de una coloración rojo cereza
Que no se produzca color puede indicar dos cosas: (1) el nitrito no se redujo (2) se redujo
a otros compuestos. Para distinguir esta situación se adiciona Zinc. Si hay nitrato en el
medio se va a reducir a nitrito y el medio se tornará rojo mostrando una reacción negativa.
Si al adicionar Zn no sucede nada, se redujo a otros compuestos.
Pseudomonas aeruginosa: no hay cambio de
color, negativo
Escherichia coli: cambio de color a rojo, positivo
Corynebacterium xerosis: no hay cambio de color,
negativo
Test del nitrato
Reagent A: Sulfanilic Acid
Reagent B: alpha-naphthylamine
Triple Sugar Iron Agar (TSI)*
Enterobacterias y otros bacilos intestinales Gram negativos
Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o
sucrosa.
TSI contiene tiosulfato de hierro, sustrato para la producción de sulfuro de hidrogeno y
sulfato ferroso.
Rojo fenol. Fermentación de carbohidratos vira de rojo a naranja a amarillo en presencia
de ácidos.
Se siembra en profundidad con una aguja y luego se estría el pico de flauta.
Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)
Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)
Fermentación (medio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)
SH2 + iones férricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)
Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie
recta acida (amarilla) con o sin producción
de gas (ruptura o no del agar)
Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie
recta alcalina (rojo) o sin cambios
Agar inclinado acido (amarillo) y
superficie recta acida (amarilla) con y sin
producción de gas (ruptura o no del agar)
Únicamente
fermenta glucosa
No ocurre
fermentación de
carbohidratos
Puede ocurrir
fermentación de
lactosa o sacarosa
o ambos
Test de la Descarboxilasa
Muestra la capacidad de un m.o. para descarboxilar un aminoácido.
En esta reacción se remueve el grupo carboxilo (COOH) de un aminoácido produciendo
amina y dióxido de carbono.
El indicador de pH (purpura de bromocresol) es adicionado con unas gotas de aceite
mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentación.
Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. pH
alcalino el indicador cambia a purpura (positivo).
Prueba de fenilalanina-desaminasa
Para identificar acción de la enzima phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir
Morganella, Providencia, y Proteus (phenilalanina-deaminasa positiva) géneros de otros
miembros de Enterobacteriaceae (phenylalanine deaminase negativa).
El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y
libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la
adición de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%).
Un cambio de color al verde indica una reacción positiva.
Negativo Positivo
Prueba de ureasa Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos
moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa
Indicador de pH: rojo fenol. Presencia de amoniaco aumenta el pH y vira a rosa oscuro
Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3
1. No inoculado
2. Proteus vulgaris: Positivo
3. Escherichia coli: Negativo
Prueba de hidrólisis de caseina
Determinar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla caseína
Agar leche. Contiene caseina la cual le da el color blanco. Algunas bacterias secretan
caseasa, la cual rompe la molécula de caseína en pequeños polipentidos los cuales
atraviesan la membrana celular. Esta reaccion de hidrólisis, aclara el area alrededor de la
colonia.
Bacillus subtilis es positivo para la enzima
caseasa.
Prueba de licuefacción de Gelatina*
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preotelítico
(gelatinasas) que licuan gelatina
Proteína + H2O Polipéptidos
Polipéptidos + H2O Aminoácidos individuales
Escherichia coli: negativa (gelatina como solido)
Pseudomonas aeruginosa: positiva (gelatina degradada)
Prueba de hidrólisis de Almidón
Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón mediante
enzimas del tipo amilasas
α-amilasa
Almidón dextrinas + maltosa + glucosa
H2O polisacáridos disacárido monosacárido
El almidón en presencia de Iodo imparte coloración azul indicando ausencia de amilasa
(Resultado Negativo)
Si el almidon fue hidrolizado, se vera una zona clara alrededor de las colonias (Resultado
Positivo)
lugol
Fermentación de carbohidratos (rojo fenol) Se adiciona un azúcar al medio: Lactosa, sacarosa o glucosa
Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares y producción de gases.
Se usa para identificar bacterias entéricas Gram negativas.
Durante el proceso de fermentación el aceptor final de electrones es una molécula orgánica.
Un tubo (Durham) es colocado dentro del medio invertido con el propósito de capturar gases
liberados durante la fermentación.
El indicador cambia al amarillo por debajo de pH 6.8 y cambia al rojo por encima de pH
7.4.
Si el microorganismo no fermenta el carbohidrato pero usa la peptona se va a acumular
amonio, esto elevaría el pH.
1- Control sin inocular
2- Amarillo: Utilización del azúcar, producción de ácido sin gas.
3- Amarillo y producción de gas.
4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del medio
de cultivo producto de utilización de peptonas y liberación
de amonio.
5- Negativo
orgamismos
1. Control Negative
2. S. aureus Acid
3. P. vulgaris Acid, Gas
4. P. aeruginosa Negative
5. E. coli Acid, Gas
resultados
Fermentación de glucosa
Identificación y Caracterización
Catalasa
Fermentación de azúcares
Hemólisis
Detección de genes de virulencia (toxinas-PCR hblA, B, C, D.)
Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Selección de esporas
Calentamiento
Enriquecimiento
Agotamiento por estrías Mossel
Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))
Repique
Tinciones
Cultivo puro