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CROMATOGRAFÍA 1 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN- ADSORCIÓN MOLECULAR Y DE FILTRACIÓN POR GEL
CROMATOGRAFÍA 1
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN-ADSORCIÓN MOLECULAR
Y DE FILTRACIÓN POR GEL
CROMATOGRAFÍA 2
Conceptos Básicos
LA SORCIÓN O ADSORCIÓN: es la transferencia selectiva de uno o más solutos de una fase fluida a un lote de partículas sólidas.
La selectividad común de un sorbente entre el soluto y el fluido portador o entre varios solutos, hace posible la separación entre ciertos solutos presentes en el fluido portador o entre sí.
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Conceptos BásicosADSORCIÓN: los adsorbentes son materiales
naturales o sintéticos de estructura amorfa y microcristalina altamente poros con áreas internas muy grandes por unidad de volumen.
Adsorbentes: carbón activado, alúmina activada, gel de sílice, tierra de fuller, otras arcillas y mallas moleculares.
La adsorción es causada por lo general por las furzas intermoleculares (furezas de Van der Waals)a temperartura ordianria, ADSORCIÓN FÍSICA O FISIOSORCIÓN.
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Conceptos Básicos
A temperaturas más elevadas ( arriba, aproximadamente,de 200 a 400 °F) se dispone de la energía de activación necesaria para hacer o romper las uniones químicas QUIMIOSORCIÓN.
Elución: es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.
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Conceptos Básicos
Eluyente: es un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.
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Conceptos Básicos
DISOLVENTE POTENCIA
ELUYENTE
DISOLVENTE POTENCIA
ELUYENTE
FLUOROCARBONOS -0.25 CLOROFORMO 0.40
N-PENTANO 0.00 METILETILCETONA 0.51
ETER DE PETROLEO 0.01 ACETONA 0.56
CICLOHEXANO 0.04 DIETILETILAMINA 0.63
TETRACLORURO DE CARBONO
0.18 PIRIDINA 0.71
CLORURO DE
n-PROPILO0.30 n-PROPANOL 0.82
BENCENO 0.32 METANOL 0.95
L.R. SNYDER, PRINCIPLES OF ADSORPTION CHROMATOFRAPHY, NEW YORK; DEKKER, 1968
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Se utiliza un tubo de vidrio con un diámetro de alrededor de 10 a 50 mm que sostiene una columna de partículas sólidas las cuales constituye la fase estacionaria
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PROCESO
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CROMATOGRAFÍA EN GEL
Es una técnica en la que el fraccionamiento se basa, por la menos en parte, en el tamaño y la forma molecular de las especies de las muestras.
Recibe varios nombres: permeación en gel, cromatografia de exclusión y cromatografia de tamizado.
La cromatografía en gel se efectúa en una columna por el método de elución.
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CROMATOGRAFÍA EN GEL
El grado de retardo depende del grado en que las moléculas o iones de soluto pueden penetrar en aquella parte de la fase de la solución que se mantiene dentro de los poros del material de empaque, que es un gel muy poroso.
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CROMATOGRAFÍA EN GEL
Las moléculas o iones mayores que los poros del gel son completamente excluidos del interior, mientras que las especies monores pueden penetrar en esta región más o menos libre.
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CROMATOGRAFÍA EN GEL
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ASPECTOS DIFERENCIALES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO CON RESPECTO A OTRAS MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA.
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1) La fase estacionaria actúa de soporte inerte, aportando solo una porocidad controlada que retiene la fase móvil estancada.
2) Teóricamente no existe interacción química ni fisico-química soluto-fase estacionaria.
3) El mecanismo de retención o retraso es atípico y se establece por entropía más que por entalpía.
4) Las características de la fase móvil no constituyen un factor decisivo en la descriminación entre los solutos; casi nunca se trabaja con gradiente de elución.
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5) La columna no se desactiva debido a su carácter fisico-químico inerte.
6) La muestra solutos no sufren alteraciones por interacciones químicas irreversibles o cuasireversibles al pasar por la columna.
7) Debido a que las fuerzas de retención son bajas los picos cromatográficos son estrechos, es decir, con propiedades favorables para reducir solapamientos y facilitar la detección.
8) Los solutos son, en general, sustancias poliméricas de amplio rango de pesos moleculares.
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9) El empleo de la modalidad de baja presión (configuración clásica) es mucho mas frecuente que en otras alternativas de la cromatografía líquida en columna, a excepción de la de afinidad.
10) Una de las propiedades de gran interes es la determinación de pesos moléculares y distribución de los mismos en mezclas complejas poliméricas.
11) Es una metodología muy útil para fraccionar en grupos de mezclas complajas de solutos, que posterirmente pueden ser cromatografiados por otras modalidades de la cromatografía de alto rendimiento (HPLC).
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CROMATOGRAFÍA EN GEL
Empaque de la columna: la fase estacionaria en la cromatografía de columna consiste en partículas esféricas de un polímero poroso que absorve facilmente el agua y se hincha a consecuencia de ello.
El sólido resultante contiene una gran cantidad de disolvente fijo en los intersticios de la red polimérica.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
El concepto de fase estacionaria es vago en cromatografía de exclusión por tamaños. Por una parte, el sólido poroso de la estructura de gel ejerce una influencia decisiva a través del tamaño del poro y, por otra parte, hay que considerar la fase móvil estancado en el volumen Vi que puede considerarse en el sentido laxo una fase estacionaria líquida.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Las características ideales de un material poroso, en forma de pequeñas esferas, que debe reunir para alcanzar los objetivos básicos de la separación en cromatografía de exclusión por tamaño:
1) Uniformidad en el tamño de partícula.2) Uniformidad en el tamaño de poro.3) Asequibilidad de materiales con un grado my
diferente de porosidad.4) Estabilidad química( cambios de pH, temperatura,
insolubilidad en disolventes órgánicos).
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
5) Máxima inercia frente a los solutos-analitos para evitar alteraciones que afecten la separación basada en en los diferentes tameños.
6) Preparación previa sencilla y rápida.
7) Resistencia mecánica cuando se trabaja en la modalidad CLAR.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Calsificacion de los materiales:Según su naturaleza: orgánicos e inorgánicos.Según la felxividad de su estructura: hinchables y
rígidos.Según su microestructura: aerogeles (en cuyos
poros puede penetrar el aire), xerogeles y mixtos aero-xerogeles.
Según su origen: naturales, sintéticos y combinados.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Los geles inorgánicos son aerogles y tienen estructura rígida de naturaleza silícia. La porosidad es de 7-300 nm. El rango de pesos moleculares esta comprendido entre 1E 03 y 1E 07. Disponibles en el comercio como bio-glas, CPG y parasil.
Los geles orgánicos tienen, generalmente, una estructura polimérica entrecruzada. Existen cuatro tipo fundamentales: poliacridamidas, dextranos, agarosas y poliestirenos.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Uno de los polímeros más usados se prepara por entrecruzamiento del polisacárido dextrano con epiclorhidrina (nombre comercial de Sephadex).
Haciendo variar la cantidad de epiclorhidrina en el polímero, se obtiene una serie de resinas con diferentes tamaños de poro.
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
A temperatura ambiente, el tiempo de inchamiento oscila entre 3 horas (menos poroso) y 3 días (más poroso); con agua irviendo este intervalo es de 1 a 5 horas.
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DESIGNACIÓN DEL GEL
RALACIÓN DE VOLUMEN (ml/g DE
GEL ORIGINAL) LÍMITE DE EXCLUSIÓN
APROXIMADO PESO MOLVg Vi Vo
G-10 0.6 1.0 0.9 700
G-15 0.6 1.5 0.9 1500
G-25 0.5 2.5 2 5 000
G-50 1 5 4 10 000
G-75 1 7 5 50 000
G-100 1 10 6 100 000
G-150 1 15 6 150 000
G-200 1 20 9 200 000
PROPIEDADES DE LOS GELES SEPHADEX
PHARMACIA FINE CHEMICALS, SUECIA
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Los geles de poliacridamida(biogeles) se obtiene por copolimerizción de la arcilamida (CH2=CH-CO-NH2) con la N,N’-metil-bis-acrilamida como agente entrecruzante, cuya concentración en la mezcla sintética inicial determina la porosidad.
Debe incharse previamente a su uso durante un tiempo que oscila entre 2 horas y un día a temperatura ambiente.
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TIPO RANGO DE FRACCIONAMIENTO PESO MOLECULAR
POLICRILAMIDA(BIOGELES)
P-2P-4P-6P-10P-30P-60P-100P-150P-200P-300
200-2,000500-4,000
1,000-5,0005,000-17,00020,000-50,00030,000-70,00040,000-100,00050,000-150,00080,000-300,000
100,000-400,000
AGAROSA 0.5 m 10%1.0 m 8%1.5 m2.0 m 6%5.0 m15.0 m 4%50.0 m 150 m 2%
10,000-250,00025,000-700,000
10,000-1,000,00050,000-2,000,00010,000-5,000,000
200,000-15,000,000100,000-50,000,000
500,000-150,000,000
POLIESTIRENO(ESTIRAGLES)
601004001 E 035 E 0310 E 0330 E 031 E 053 E 055 E 0510 E 05
8002,0008,00020,000
100,000200,000600,000
2,000,0006,000,00010,000,00020,000,000
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Los geles de agarosa son de tipo natural, su estructura reticular se debe a los enlaces de hidrógeno entre cadenas poliméricas naturales. La diferencia de porosidad se obtiene a partir de disoluciones con difeerentes concentraciones de agarosa. Se caracteriza por su gran porosidad, que no puede obtenerse con otros tipos de geles.
Un inconveniente importante de los mismos es su inestabilidad: a) no puede emplearse a temperaturas superiores a 30°C; b) el pH de la fase movil debe estar comprendido entre 6 y 8;
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
C) son sensibles a ciertos agentes químicos como el borato, que interactuan con los grupos hidroxilo rompiendo la estructura entrecruzada.
Los geles de poliestireno (styragles) son polímeros sintéticos derivados del estireno con divinilbenceno como agente entrecruzante. Presentan dos caracteristicas importantes: a) permiten cromatografiar sustancias con un amplio rango de peso molecular, b) tienen una estructura muy rígida lo que los hace especialmente adecuados para trabajar a alta presión (CLAR).
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EMPAQUE DE LA COLUMNA
Tienen el inconveniente de facilitar las retenciones no específicas debido a fenómenos de adsorción, en especial con proteinas.
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
Volumen total de la columna rellena con un gel hinchado en agua (u otro disolvente) está dado por: Vt = Vg + Vi + Vo
donde:
Vg volumen ocupado por la matriz sólida del gel.
Vi volumen interno de las partículas porosas que contienen la fase móvil estancada.
Vo volumen libre correspondientes a los intersticios de las partículas porosas.
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
En este tipo peculiar de cromatografía, la retención se basa en la distirbución del soluto entre dos fases móviles miscibles: la externa y la interna o estancada, por lo que el concepto de retención es muy diferentes.
Una separación se completa cuando un volumen de fase móvil equivalente al volumen total ha pasado a través de la columna; por ello, el volumen de elución será menor o igual que el volumen vacío (Ve<Vt).
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
Para caracterizar el comportamiento de un soluto en una columna de exclusión por tamaño se utiliza el denominado coeficiente de partición:
Este se define como la ralación de la diferencia entre los volumenes de elución e intersticial, y el volumen interno de los poros.
KAV = Ve – VO
Vi
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
Este coeficiente de partición corresponde a la relación entre las concentraciones medias del soluto en la fase móvil dentro (Ci) y fuera (Co) del material poroso (KAV = Ci/Co). La concentración del soluto dentro de los poros en la fase móvil estancada decrece al aumentar el tamaño del soluto, por lo que su valor decrecerá al aumentar el peso molecular del mismo.
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El valor del coeficiente de partición oscila entre 0 y 1. Cuando su valor es nulo, el soluto es totalmente excluido, por lo que el volumen de elución coincide con el intersticial ( Ve = Vo ).
Se define el límite de exclusión como el tamaño mínimo (peso molecular mínimo) para que el soluto sea excluido .
Caundo KAV = 1, el soluto tiene la máxima penetrabilidad (movilidad) entre los poros, por lo que el volumen de elución conincidirá con el volumen total de la fase móvil de la columna de exclusión (Ve = Vo + Vi + Vt).
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Así pues, Vo y Vt son los volumenes límites entre los cuales debe situarse los volumenes de elución de la mezcla de analitos-solutos.
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CROMATOGRAFÍA 38
La cromatografía de exclusión por tamaño es más restringida que otras modalidades de cromatografía en columna, lo que básicamente se debe a que, en ausencia de interacciones adicionales, la variación del coeficiente de partición está restringido entre 0 y 1, al contrario la amplia variabilidad de otras constantes que rigen otros procesos cromatográficos.
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
En este tipo de cromatografía, la altura equivalente de plato teórico se debe exclusivamente a la dispersión del soluto en la fase móvil interna o estancada y la trasferencia de materia entre las dos fases móviles internas y externa. Debido que las substancias de alto peso molecular tienen coeficientes de difusión muy bajos, la contribución a la difusión longitudinal puede prácticamente despreciarse.
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TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL
GASES LIQUIDA EXCLUSIÓN400 21 13 52500 51 31 11
10000 101 61 21
NÚMERO MÁXIMO DE PICOS EN CROMATOGRAFÍAPLATOS TEÓRICOS
CAPACIDAD DE PICOS EN DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
CROMATOGRAFÍA 41
CROMATOGRAFÍA POR GEL
VOLUMEN DE ELUCIÓN:Para moléculas de tamaño intermedio es :
Ve = Vo + KAV(Vi)Para moléculas demasiado grandes para
penetrar en los poros de gel: KAV = 0 y Ve = Vo
Para moléculas de que pueden entrar en los poros sin obstáculos KAV = 1 y Ve = ( Vo + Vi ).
CROMATOGRAFÍA 42
CROMATOGRAFÍA POR GEL
Esto con el supuesto de que no hay interacción, por ejemplo como adsorción, entre las moléculas del soluto y la superficie del gel. En caso contrario, aumentaría la cantidad de soluto retenido en los intersticios, para solutos que actúa entre sí y que pueden penetrar libremente en los poros, KAV sería mayor que la unidad.
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FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN
Relación con el material cromatográfico:Tamño de partícula.Porosidad.
En relación con la fase móvil:Caudal.Viscocidad.Temperatura.Fuerza iónica.pH
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FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN
En relación con la muestra:Peso molecular.Cantidad o concentración.Configuración espacial.
En relación con la columna cromatográfica:Longitud.Empaquetamiento.
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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.
En geles muy entrecruzados con tamaños de poro pequeño, como Sephadex G-25 y G-50 han encontrado amplia aplicación a la desalación o eliminación de moléculas de bajo peso molecular, de moléculas de productos naturales de alto peso molecular.
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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.
Los geles Sephadex G-25 y G-50 han resultado útilies también para el fraccionamiento péptidos que tiene un tamaño intermedio entre algunas proteinas.(triptófano, glicina, ribonucleasa, tripsina, albúmina sérica, hemogobina fibrinógeno.)
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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.
Las geles más porosos han encontrado una gran aplicación al fraccionamiento y purificación de macromoléculas como proteinas, ácidos nucleicos, y polisacáridos.
La cromatografía en gel es usada por los químicos de polímeros y los bioquímicos para la estimación de pesos moleculares de moléculas grandes.
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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.
En este caso, el volumen de elución de la incognita se conpara con los volúmenes de elución de una serie de compuestos estandar que tienen las mismas caracteristicas químicas.
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Las resinas de intercambio iónico se encuentran entre los empaques más utilizados para la cromatografía de columna. A diferencia de los demás métodos en columna, el disolvente es por lo general agua y las especies a separar son iones. Por lo tanto, la cromatografia de intercambio iónico es muy utilizada en química inorgánica. También se utiliza para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases inorgánicas.
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
El intercambio iónoico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de inones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. Muchas substancias, tanto naturales como sintéticas, actúan como intercambiadores de iones. Entre las primeras se encuentran las arcillas y las ceolitas.
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular que contienen gran números de grupos funcionales iónicos por moléculas. Para el intercambio de cationes se puede escoger entre resinas ácidas fuertes que contienen grupos de ácidos sulfónico ( RSO3
-H+ ) y resinas ácidas débiles que contienen grupos de ácidos carboxilicos ( RCOOH ). Las primeras tienen una aplicación más amplia.
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Las resinas de intercambio de aniones contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula del polímero. Estas son generalmente aminas. Los intercambiadores básicos fuertes contienen aminas cuaternarias (RN(CH3)3
+OH-); y los básicos débiles contienen aminas secundarias y terciarias.
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Un proceso de intercambio catiónico se ilustra por el equilibrio:
Donde: Mx+ representa un catión
R representa una parte de la molécula de resina.
xHMRSOMHxRSO xx
x33
Sólido solución sólido solución
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
El proceso análogo en el que interviene una resina de intercambio de aniones típicas se escribe:
Donde Ax-es un anión.
xOHACHRNAOHCHxRN xx
x3333)(
sólido solución sólido solución
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Debe indicarse que la interacción entre el soluto orgánico y el material cambiador ( generalmente una resina de poliestireno) es muy compleja ya que, ademas del fenómeno de intercambio de iones, se producen otros fenómenos:
a) Adsorción por efecto de la matriz polimérica hidrocarbonada de la resina.
b) Partición en sus dos modalidades: de fase invertida con una alta proporción de un disolvente orgánica en el interior de la resinade bajo entrecruzamiento,
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
c) Exclusión de iones.
d) Intercambio de ligados entre un complejo catiónico retendo y los solutos-ligados a la fase móvil.
