Cultivos Celulares

Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

Objetivos

1. -Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular2. -Cultivos primarios y líneas estables3. -Preparación del medio de cultivo4. -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad5. -Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable6. -Congelación y almacenamiento de las líneas celulares

Puntos que deben ser asimilados

Microscopio InvertidoSeguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación,

contaminación.Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas,

de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Botellas y Placas de Cultivo

Puntos Importantes

• Esterilidad• Asepsia• Hábito de trabajo

Cultivos Primarios(El principio de la historia.....)

A- Aislamiento del tejido B- Disección/disgregación C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario)

Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

Preparación cultivos

Cultivos secundarios y líneas estables

2. Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario.

3. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinará qué células se desarrollarán.

4. Las líneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

Selección de la línea estable

Líneas celulares estables

• Control del entorno celular

• Homogeneidad celular

• Conocimiento del tipo celular

• Economía

Ventajas Desventajas

Falta de diferenciación

Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)

Medios de Cultivo: Medios Base

Medios base: Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc.

Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales minerales, oligoelementos.

*Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

Medios de Cultivo: Aditivos

• Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos)

• Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc.• Indicador pH.• Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10%

(2-50%).• Aditivos específicos: Suplemento de

piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Propiedades físico-químicos del Medio

CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-]

pH.............................................................(7.0-7.7)

Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg

Viscosidad................................................ Suero

Temperatura............................................. 37ºC (mamífero)

(aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)

Test de medio completo con suero

• Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles.

3. Posible Contaminación4. Niveles de Proliferación Celular

(eficiencia)

Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celular

• Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la elección del medio más adecuado a las características de nuestra línea.

• Las pruebas consisten en la realización de diferentes curvas de crecimiento

Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea estable

• Subcultivo• Confluencia• Tiempo de duplicación• Criogenización

• Ciclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0

¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos?

Objetivos: ii. Propagación de la línea celulariii. Producción de células para la

experimentación

Usualmente se realizan al llegar a confluencia.

Evitar que el medio de cultivo esté agotado.

Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivo

•Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular.•Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas.•Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).•Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.