1. Cultivos CelularesCultivos Celulares Mtodos y Tcnicas de Estudio en Biologa Celular 2. ObjetivosObjetivos 1. -Equipo bsico de un laboratorio de cultivo celular 2. -Cultivos primarios y lneas estables 3. -Preparacin del medio de cultivo 4. -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad 5. -Rutina en el mantenimiento de la lnea celular estable 6. -Congelacin y almacenamiento de las lneas celulares Puntos que deben ser asimilados 3. Equipo Bsico de un laboratorio de Cultivo Celular 1. Campana de flujo laminar 2. Bao termostatizado 3. Incubador CO2 4. Autoclave 5. Nevera y Congelador 6. Microscopio Invertido 7. Micro centrifuga 8. Depsito de Nitrgeno lquido 4. AutoclaveAutoclave Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada 5. Tanque de Nitrgeno lquidoTanque de Nitrgeno lquido Congelacin de lneas estables 6. Campana de Flujo LaminarCampana de Flujo Laminar Esterilidad!! (no evita contaminacin un mal uso) 7. Incubador COIncubador CO22 Atmsfera controlada con elevada humedad y tensin de CO2 8. Micro CentrifugaMicro Centrifuga Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos) 9. Microscopio InvertidoMicroscopio Invertido Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicacin, contaminacin. Control sobre cambios morfolgicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc. 10. Botellas y Placas de CultivoBotellas y Placas de Cultivo 11. Puntos ImportantesPuntos Importantes Esterilidad Asepsia Hbito de trabajo 12. Cultivos PrimariosCultivos Primarios (El principio de la historia.....)(El principio de la historia.....) A- Aislamiento del tejido B- Diseccin/disgregacin C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor. 13. Preparacin cultivosPreparacin cultivos 14. Cultivos secundarios y lneasCultivos secundarios y lneas establesestables 1. Si uno o varios tipos de clulas de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. 2. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinar qu clulas se desarrollarn. 3. Las lneas estables son las que se obtienen por sub- cultivo y seleccin de cultivos secundarios. Tambin se pueden obtener a partir de tejidos tumorales. 15. Seleccin de la lnea estableSeleccin de la lnea estable 16. Lneas celulares establesLneas celulares estables Control del entorno celular Homogeneidad celular Conocimiento del tipo celular Economa Ventajas Desventajas Falta de diferenciacin Inestabilidad de la lnea (mutaciones DNA) 17. Medios de Cultivo: Medios BaseMedios de Cultivo: Medios Base Medios base: Eagles Basal Medium, Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc. Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales minerales, oligoelementos. *Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio 18. Medios de Cultivo: AditivosMedios de Cultivo: Aditivos Antibiticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc. Indicador pH. Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2- 50%). Aditivos especficos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc. 19. Tamponadores de pHTamponadores de pH Hepes Buffer tamponador que acta de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6 *Importancia de la ppCO2en el mantenimiento del pH H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3 - * Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH) 20. Propiedades fsico-qumicosPropiedades fsico-qumicos del Mediodel Medio CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3 - ] pH.............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37C (mamfero) (aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C) 21. Test de medio completo conTest de medio completo con suerosuero Previamente a la realizacin de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. 1. Posible Contaminacin 2. Niveles de Proliferacin Celular (eficiencia) 22. Eleccin del medio de cultivoEleccin del medio de cultivo adecuado a cada lnea celularadecuado a cada lnea celular Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la eleccin del medio ms adecuado a las caractersticas de nuestra lnea. Las pruebas consisten en la realizacin de diferentes curvas de crecimiento 23. Conceptos bsicos en elConceptos bsicos en el mantenimiento de una lnea establemantenimiento de una lnea estable Subcultivo Confluencia Tiempo de duplicacin Criogenizacin Ciclo celular: Fases G1 ,S,G2,M y G0 24. Qu son y cmo se realizanQu son y cmo se realizan los subcultivos?los subcultivos? Objetivos: i. Propagacin de la lnea celular ii. Produccin de clulas para la experimentacin Usualmente se realizan al llegar a confluencia. Evitar que el medio de cultivo est agotado. 25. Curva de Crecimiento (lneasCurva de Crecimiento (lneas estables): Fases del cultivoestables): Fases del cultivo Fase de latencia (perodo lag). Fijacin al sustrato e inicio del ciclo celular. Fase de crecimiento exponencial. El nmero de clulas se duplica aproximadamente cada 24 horas. Fase de confluencia. Las clulas del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibicin por contacto; suspensin: consumo del medio). Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las clulas entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las clulas en cultivo. 26. Subcultivos CelularesSubcultivos Celulares 27. Protocolo SubcultivoProtocolo Subcultivo Depende de las caractersticas de la lnea celular con la que se esta trabajando. 1. Clulas en suspensin 2. Clulas adheridas al substrato 28. Clulas AdheridasClulas Adheridas Para realizar el subcultivo de clulas adheridas se debe proceder al levantamiento de las mismas: Tripsinizacin. Levantamiento Mecnico (raspado). En clulas en suspensin es suficiente con realizar una dilucin en medio nuevo (o bien adicin de medio tras centrifugacin). 29. La Fase ExperimentalLa Fase Experimental Objetivos: i. Investigacin de un fenmeno biolgico ii. Estudio de las bases moleculares de una patologa iii. Investigacin de los mecanismos empleados por los frmacos iv. Estudio de la toxicidad de determinados compuestos v. Investigacin de la estructura y funcin de macromolculas y orgnulos celulares 30. La Fase ExperimentalLa Fase Experimental Planteamiento: Se cultivan en frascos separados las clulas control y las clulas problema. Se adiciona un compuesto o se cambian las condiciones experimentales del frasco problema y se mantiene la incubacin durante un tiempo (minutos a das). Finalmente se determinan las diferencias entre las clulas tratadas (problema) y las no tratadas (control). En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en paralelo de clulas en diferentes frascos, sino un tratamiento secuencial de las clulas control (antes y despus de ciertas condiciones). 31. La Fase ExperimentalLa Fase Experimental Investigacin: Es la fase en la que utilizando una tcnica experimental determinamos algn fenmeno celular. Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre la localizacin de protenas celulares mediante microscopia confocal (clulas vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o western blot la expresin de un determinado gen o hacer un estudio completo de la expresin gnica mediante protemica y/o genmica (clulas muertas). 32. La Fase ExperimentalLa Fase Experimental Transfeccin: Introduccin de DNA externo con un vector de expresin. TIPOS: Transitoria o estable. MTODOS: Electroporacin Fosfato clcico Lipofeccin Microinyeccin