1
EFECTO DE CUBIERTAS DE QUITOSANO OBTENIDO POR FERMENTACIÓN
LÁCTICA DE CABEZAS DE CAMARÓN SOBRE EL COMPORTAMIENTO
POSTCOSECHA DE FRUTO MODELO
Cabanillas Bojorquez Luis Angel, Cristerna González José Luis, Cázares Pérez
Manuel Fernando, Castillo López Ramón Ignacio, Calderón Ayala Ignacio,
Guadalupe de Jesús Valdez Zazueta, Parra Inzunza Marco Antonio.
I. INTRODUCCION
El aumento en la distribución y consumo de mariscos en años recientes conlleva un
aumento en la cantidad de desechos producidos. La composición de estos
desechos varía con la especie pero en general contiene: quitina, proteínas, sales
minerales, pigmentos y lípidos (Franco, 2010). La quitina además de formar parte
de la estructura de crustáceos y artrópodos, está presente enla pared celular de
hongos y levaduras; es el segundo polímero más abundante en la naturaleza
después de la celulosa (Peniche, 2006; Juárez, 2010). En las cutículas de los
crustáceos, la quitina se encuentra fuertemente asociada con sales inorgánicas,
tales como carbonato de calcio, proteínas, pigmentos y lípidos. De ahí que el
proceso convencional utilizado en la industria para la obtención de quitina a partir
de esqueletos de crustáceos, consiste en una desproteinización con álcali, seguida
de una desmineralización con ácidos diluidos y finalmente, la eliminación de lípidos
con solventes orgánicos (Juárez, 2012).
Los métodos convencionales empleados para la obtención de la quitina requieren
el consumo de grandes cantidades de reactivos y agua, se producen grandes
2
volúmenes de efluentes, los cuales al ser tratados elevan los costos de producción
y causan daños ambientales (Hernández y col., 2009).
El quitosano es un polímero natural que se obtiene por desacetilación de la quitina,
y cuando se compara con otros polisacáridos, el quitosano tiene varias ventajas
tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad y que no tóxico, mientras que
también presenta propiedades funcionales como bacteriostático y fungistático.
Como alternativa, se han investigado películas comestibles de origen biológico,
tomando como criterios la permeabilidad de agua por la matriz del alimento, la
penetración de oxígeno a los medios de transporte de material de alimentos, aromas
y pérdidas de soluto. Materiales a base de quitosano se pueden utilizar como
películas o recubrimientos comestibles debido a su propiedad única de aumento de
la viscosidad después de la hidratación. Por otra parte, las películas de quitosano
son resistentes, duraderas, flexibles, y difíciles de romper (Hosseini y col., 2013).
En la actualidad se han buscado alternativas para el tratamiento de los desechos y
de esta manera se ha empleado a la fermentación láctica para un aprovechamiento
integral del desecho, que además de purificar parcialmente a la quitina, permite la
recuperación de otros compuestos de alto valor agregado ahí presentes (Peniche,
2006). Con base en lo anterior, el presente trabajo está encaminado a establecer
las condiciones de fermentación óptimas para la obtención de quitina y quitosano a
partir de desechos de camarón, así como también evaluar la actividad del quitosano
como inhibidor del crecimiento de microorganismos, en un fruto modelo.
3
II. REVISIÓN DE LITERATURA
El advenimiento de la biotecnología moderna ha transformado radicalmente la
opinión de los científicos acerca de los organismos y de los materiales que producen
mediante el aprovechamiento de las enzimas en la naturaleza o de la materia prima
marina y agrícola para la transformación de una nueva clase de materiales
biodegradables, biocompatibles y renovables (Juárez, 2010).
Las razones que conducen en la actualidad a la sociedad a volver a utilizar los
polímeros naturales que se venían usando desde hace cientos de años, son el
creciente interés por compatibilizar la fabricación de productos manufacturados con
la sostenibilidad del medio ambiente y el alto coste de algunos materiales sintéticos.
Además, el problema de una alta acumulación de residuos en los últimos tiempos
ha promovido el uso de estos reciclándolos como materia prima.
(López, 2012).
La quitina fue aislada por primera vez por Braconnot en 1811, a partir de hongos
superiores, y por su origen se denominó fungina. El nombre de quitina del griego
xitwuy, y por su origen se debe a Odier, que en 1923 la aisló a partir de escarabajos
en soluciones alcalinas (Peniche, 2006).
La quitina es un polisacárido muy abundante en la naturaleza, se encuentra
principalmente en crustáceos, insectos y hongos. En los animales aparece asociada
a otros constituyentes, tales como lípidos, pigmentos, carbonato de calcio y
proteínas. Posee una estructura lineal de alto peso molecular constituida por
unidades de N-acetil-glucosamina unidas por enlaces -D. Es altamente insoluble y
presenta baja reactividad (Figura 1) (Mármol y col., 2011).
4
Figura. 1 Estructura de Quitina (De Alvarenga, 2011).
La quitina es un polisacárido cristalino que cuenta con tres diferentes formas
cristalográficas: y quitinas. La quitina es la isoforma más abundante,
se encuentra compactada dando una estructura cristalina donde sus cadenas se
encuentran antiparalelas, favoreciendo los enlaces de hidrógeno. La quitina tiene
un arreglo paralelo con una fuerza intermolecular más débil, dando una molécula
menos estable de quitina y la quitina es una mezcla de las dos anteriores
(Ramírez y col., 2006).
Comparando la abundancia natural de las formas polifórmicas, encontramos que la
quitina es la más abundante y estable mientras que las otras dos se presentan
en pequeñas proporciones y tienden a ser transformadas en quitina (Hirano,
1999). En general, la quitina es obtenida por métodos químicos a partir de conchas
de crustáceos que incluyen tratamientos con álcalis y ácidos, con modificación de
condiciones como la temperatura, tiempo de reacción, concentración de álcalis y
ácidos, entre otros (Zulay Mármol y col., 2011).
5
El esqueleto de camarón y cangrejo son las principales fuentes para la producción
de la quitina a nivel comercial asociada con proteínas, minerales, lípidos y
pigmentos, estos tienen que ser removidos para alcanzar un grado de pureza para
diferentes aplicaciones biológicas necesarias (Percot y col., 2003). Diversos
procesos de obtención de quitina se han empleado, destacando los métodos
químicos y los biológicos. Dentro de los biológicos tenemos el ensilado, que se
define como un proceso de conservación en el cual los ácidos adicionados o
producidos inhiben el crecimiento de patógenos, presenta ciertas ventajas respecto
a los otros, como el permitir la recuperación de productos con valor agregado. Dos
tipos de ensilado son los más frecuentes: el ensilado químico, que se basa en la
adición de ácidos inorgánicos u orgánicos y posteriormente es neutralizado y el
ensilado obtenido por fermentación láctica, en el que el ácido es producido in situ
por la fermentación bacteriana de una fuente de hidratos de carbono (Shirai y col.,
2001; Cira y col., 2002).
El quitosano fue descubierto en 1859 por Rouget al hervir quitina con KOH,
convirtiéndose en una sustancia soluble en ácidos orgánicos. Le llamó quitina
modificada. El quitosano es obtenido comercialmente mediante una desacetilación
alcalina de la quitina. Se han propuesto muchos métodos, pero el más reportado es
cuando la quitina es sometida a la acción del NaOH al 50% a temperatura de
ebullición por un periodo de 3 horas. La calidad del quitosano es determinada por
las condiciones de desacetilación empleadas (Muzzarelli, 1978).
Cuando la desacetilación del material de partida es incompleta se crea una mezcla
de cadenas que tienen distintas proporciones de unidades β(1-4)-2-acetamido-2-
desoxi-D-glucosa y β(1-4)-2-amino-2-desoxi-D-glucosa, cuya relación depende de
6
las condiciones de reacción y que, obviamente, genera materiales con distintas
propiedades denominados quitosanos (Figura 2). La diferencia en las propiedades
de estos materiales puede llegar a ser notable, como por ejemplo la distinta
solubilidad en medio acuoso que pueden llegar a tener (Lárez, 2003).
Figura 2. Estructura de Quitosano (De Alvarenga S., 2011).
El quitosano es un biopolímero natural con importantes propiedades funcionales y
a este hecho se suma el valor añadido de obtenerse a partir de la quitina, que se
extrae principalmente de las cáscaras de crustáceos y que constituye un
subproducto importante procedente de la industria pesquera. El estudio de este
polímero a lo largo de todos estos años ha generado su empleo en múltiples
aplicaciones (Cuadro 1). Entre las numerosas propiedades funcionales que se le
han atribuido están: biodegradabilidad, biocompatibilidad, capacidad filmogénica,
actividad antimicrobiana, actividad antifúngica, actividad hipocolesterolémica,
actividad antioxidante, mucoadhesión, hemostático y promotor de absorción
(Caprile, 2005)
7
Cuadro 1. Aplicaciones de Quitosano.
APLICACIONES USOS
Tratamiento de aguas y efluentes
industriales
Remoción de iones metálicos y pesticidas: remoción de fenoles,
radioisótopos, PCBs y colorantes, recuperación de materiales sólidos de
la industria alimenticia (proteínas,polisacáridos,etc.).
Fabricación de papel Tratamiento de superficies, papel fotográfico.
Medicina
Gasas, algodón, contenedor artificial de sangre, control de colesterol, inhibidor tumoral, membranas, inhibición de placas dentarias,
cicatrización de heridas, piel artificial, tratamientos de enfermedades óseas,
lentes de contacto, membranas de diálisis, bolsas desangre,
anticoagulante.
Cosmética Maquillaje, esmalte de uñas, loción de baño,cremas, dentífrico.
Biotecnología Inmovilización de enzimas y células,
separación de proteínas, cromatografía, recuperacióncelular.
Agricultura Recubrimientos de semillas y frutas
(film), fertilizante, fungicida, antivirósico.
Alimenticia
Remoción de colorantes, conservantes, estabilizante de color,
exaltador del sabornatural, preservante, antioxidante,
emulsionante, aditivo de alimentos para animales.
Fuente: Caprile, 2005
8
Estas propiedades funcionales han promovido su utilización a lo largo de los años
en varios campos distintos como son la agricultura, la industria alimentaria y
farmacéutica y la medicina (Rinaudo, 2006).
Quitosano es particularmente atractivo para aplicaciones biológicas y clínicas
debido a su no toxicidad, biodegradabilidad, fisiológica, y propiedades
antibacterianas (Rinaudo, 2006; Geng y col., 2012).
La carga positiva que inducen los grupos amino da al quitosano la capacidad de
atrapar sustancias como macromoléculas, proteínas, lípidos, metales, etc.,
cargados negativamente, esta propiedad junto con las anteriores hace que el
quitosano tenga un gran potencial para diferentes aplicaciones (Juárez, 2012).
En cuanto a la industria alimentaria, el quitosano ofrece un amplio espectro de
aplicaciones únicas. La mayoría se relacionan con su actividad antimicrobiana
como, por ejemplo, su uso como conservante en el empaquetamiento y en películas
comestibles que recubren alimentos, y su empleo también como conservante en
emulsiones. La capacidad de unirse a grasas permite su utilización como agente
hipocolesterolémico en productos dietéticos. Por otro lado, se han estudiado las
propiedades tecnológicas como espesante, gelificante y emulgente. En su uso como
agente emulgente es capaz deformar emulsiones y en la formación de emulsiones
con proteínas del suero lácteo se havisto que mejora su estabilidad. Además se
emplea como agente quelante y floculante para tratamiento de aguas residuales
resultantes del procesado de alimentos y para clarificación de bebidas (López.,
2012).
9
El quitosano es eficaz en la inhibición del desarrollo de hongos y levaduras,
seguidos de bacterias gram-positivas y finalmente gram-negativas. Los
mecanismos de actividad antimicrobiana no han sido explicados completamente. El
carácter antimicrobiano del quitosano se atribuye a la presencia de grupos amino
con carga positiva (NH3+) que interaccionan con las cargas negativas de los
fosfolípidos formadores de membrana celular de bacterias y hongos; al adherirse el
quitosano a la membrana, provoca alteraciones en proteínas y diversos compuestos
y causa una filtración a través de ella hasta llegar al citosol; el quitosano utiliza
energía para atravesar la membrana, sin embargo, este proceso no involucra al
proceso de endocitosis. Las bacterias y hongos normalmente mantienen en su
citosol niveles muy bajos de Ca2+, esto es gracias a la barrera que forma la
membrana plasmática, la cual posee reguladores herméticos que impiden el paso
libre de gradientes de Ca2+, este proceso en el que también se involucra al
mecanismo homeostático, donde dentro del citosol se regula la concentración de
Ca2+, enviando fuera de la célula al exceso de Ca2+, o los almacena en organelos
de la propia célula. Por lo tanto, al introducirse el quitosano al interior del citosol se
transforma drásticamente el mecanismo homeostático, ya que al formar canales en
la membrana permite el paso libre de gradientes de calcio, además de causar la
fuga de otros componentes intracelulares, ocasionando una inestabilidad en la
célula hasta su muerte (Ramos-García y col., 2010). Además, la actividad
antimicrobiana también se relaciona con la interacción selectiva de trazas de
metales necesarios para el desarrollo de los microorganismos (Rodríguez-Núñez y
col., 2010).
10
III. JUSTIFICACION
La producción de crustáceos, apoyada fuertemente por el crecimiento de la
acuicultura, es cada vez mayor en los países en desarrollo. Sin embargo, en la
actualidad no se aplica un manejo efectivo de los desechos sólidos que genera esta
industria, calculados en alrededor del 50% de la producción total. En los últimos
años, ha existido un gran interés en la búsqueda de nuevos métodos para la
obtención de quitina y su principal producto que es el quitosano a partir del
desperdicio de camarón, ya que estos polímeros tienen una amplia área de
aplicaciones debido a sus características.
Comercialmente, los desechos de crustáceos son tratados esencialmente para la
extracción y aislamiento de quitina y su derivado el quitosano, por el método
tradicional ácido-alcalino. Por estos motivos, se ha propuesto a la fermentación
acido láctica como una alternativa para la recuperación de quitina, debido a que este
proceso puede ser llevado a cabo a bajos costos de inversión y en lugares en donde
no se cuenta con infraestructura sofisticada.
Además, el producto obtenido tiene una gran aplicabilidad en la industria
alimentaria, entre otros, como inhibidor de crecimiento de microorganismos.
IV. HIPOTESIS
Quitosano, obtenido mediante la utilización de la fermentación láctica, usando
productos de desecho como suero y melaza, sobre desechos de camarón, puede
producir un biopolímero con características similares a los comerciales, el cual
11
puede utilizarse como inhibidor del crecimiento de ciertos microorganismos que son
los principales causantes de pérdidas de calidad en alimentos de la región.
V. OBJETIVOS
a. GENERAL
Obtener quitina y quitosano por medio de la fermentación láctica de desechos de
camarón, optimizar las condiciones de procesamiento y evaluar su actividad como
antimicrobiano.
b. ESPECÍFICOS
Los objetivos específicos de este estudio se basan en:
a) Evaluación de las condiciones de procesamiento de fermentación láctica
para la obtención de quitina y quitosano.
b) Obtener quitina y quitosano en las mejores condiciones de
procesamiento.
c) Caracterización de quitina y quitosano obtenidos en las mejores
condiciones de procesamiento.
d) Evaluar la actividad antimicrobiana del quitosano obtenido con las
mejores condiciones de procesamiento.
e)
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 MATERIALES
12
Se utilizarán cabezas de camarón de desecho (Litopenaeus vannamei) obtenidas
en el mercado, restaurantes y pescaderías localizadas en Culiacán Sinaloa, las
cabezas de camarón se congelarán hasta su uso.
Suero de leche se obtendrá de una empresa quesera de la localidad, la melaza se
adquirirá de un ingenio azucarero aledaño a la comunidad.
Las cabezas serán lavadas con abundante agua y trituradas para reducir su tamaño,
y lograr mayor contacto entre las fases.
7.2 MÉTODOS
7.2.1 Fermentación
Cabezas de camarón trituradas se pondrán en contacto con suero de leche en un
reactor por lotes, se le añadirá melaza como sustrato para las bacterias, se dejaran
fermentar por un determinado tiempo, se variarán la concentración de melaza y los
tiempos de fermentación.
7.2.2 Síntesis de quitina
Después del periodo de fermentación, las cabezas de camarón se pasarán por un
colador y se lavarán con abundante agua fría para remover todos los residuos que
hayan quedado.
7.2.2.1 Desproteinizacion
Se procederá a poner en contacto los residuos de las cabezas de camarón extraídas
en una solución de hidróxido de sodio 1 M, en relación de 1/10 de (p/v) durante un
13
periodo de 1 hora. Al finalizar este periodo la materia sólida se lavará con abundante
agua hasta que alcance un pH de 7.0.
7.2.2.2 Desmineralización
Este proceso tiene como objetivo eliminar los minerales que aún permanezcan en
la muestra, esto se hace con una solución de Ácido Clorhídrico 1N, en relación de
1/10 de (p/v) durante un periodo de 1 hora. Al finalizar dicho periodo la materia sólida
se lavará con abundante agua hasta que alcance un pH de 7.0.
7.2.2.3 Despigmentación
Esta etapa tiene el propósito de eliminar los pigmentos que aún acompañan la
muestra, colocando las cabezas de camarón en una solución de Hipoclorito de
Sodio al 10% en relación 1/10 de (p/v) durante un periodo de 1 hora. Al finalizar este
periodo la materia sólida se lavará con abundante agua.
7.2.3 Síntesis de quitosano
La desacetilación de la quitina se llevará a cabo por método heterogéneo en un
reactor tipo Batch, con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 50%
a 110°C, con un tiempo de reacción de 3.5 horas a una relación de 1:15(p/v). El
producto será enjuagado con agua corriente hasta neutralidad, secado a 35ºC
durante 24 h para su posterior análisis y caracterización (Juárez, 2010).
14
7.2.4 Caracterización de quitosano
El primer paso en la caracterización de quitosano será purificar la muestra: se
disolverá en un exceso de ácido y se filtrará en membranas porosas (con diferentes
diámetros de poro hasta 0.45 mm). Ajustará el pH de la solución a 7.5 mediante la
adición de NaOH o NH4OH, la cual provocará la floculación debido a la
desprotonación y la insolubilidad del polímero a pH neutro. El polímero se lavará a
continuación con agua y se secará (Rinaudo, 2006).
7.2.4.1 Grado de N-acetilación
7.2.4.1.1 Caracterización mediante espectroscopia
infrarrojo
Espectroscopía de absorción infrarroja se puede emplear en análisis cuantitativos y
determinación de la estructura de los compuestos. El hecho de ciertos grupos de
átomos que presentan bandas en o cerca de la misma frecuencia y la huella digital
única de moléculas de IR permite conocer la estructura química de un compuesto.
El grado de acetilación (DA) se calculará por la siguiente fórmula, donde A1655 y
A3450 son la absorbencia de bandas a 1655 y 3450 cm-1, respectivamente.
1655
3450
( )*115A
DAA
Esta relación es válida para las muestras con DA de hasta 55%. La cantidad de
muestra en el haz debe ser lo suficientemente pequeña para asegurar que la banda
de 3450 cm-1 tenga una transmisión de al menos 10% (De Alvarenga., 2011).
15
7.2.4.1.2 Caracterización mediante Resonancia
Magnética nuclear
El área integral del pico CH3 se comparará con el área de los carbonos glucósido
en 13C NMR de estado sólido para determinar la DD (grado de desacetilación) de
las muestras de quitosano. El DD podría calcularse también por las áreas integradas
de carbonilo de etilo en relación con el carbono C1 del anillo de glucósido.
DD obtenida por RMN de 13C en estado sólido para la baja acetilación de quitosano
no es coincidente con los resultados de otras técnicas. Sin embargo, RMN de estado
sólido es el método recomendado para muestras de alta DA, ya que éstas muestras
son insolubles en disolventes más comunes (De Alvarenga., 2011).
7.2.4.1.3 Determinación Potenciométrica
Para la determinación del contenido de grupos amino de las distintas muestras de
quitosano se procederá a la disolución de 0.5 g de cada uno de ellos por separado
en 20 mL de HCl 0.3 M. A continuación se titulará con una solución de NaOH 0.1 M.
La valoración se llevará a cabo midiendo el cambio de pH cada 2 mL de base
añadida, la adición se realizará de forma lenta y con agitación continua para
homogenizar la solución y evitar errores debidos a la posible precipitación del
biopolímero. Las medidas se realizarán tres veces para cada muestra.
El gráfico de la variación del pH frente al volumen añadido de base tiene dos puntos
de inflexión: el primero corresponde a la neutralización de HCl, y la segunda a la
neutralización de los iones de amonio de quitosano. La diferencia entre los dos
16
puntos de inflexión dará la cantidad de grupos amino en quitosano (grado de
desacetilación, DD). El grado de acetilación (DA) se obtendrán de la fórmula:
% 100 %DA DD
2 1[ ]( )161%
base V VDD
m
Donde V2 es el punto de inflexión mayor, V1 corresponde al punto de inflexión
menor, ambos expresados como volúmenes (ml), [base] es la molaridad de la
solución de NaOH (mol L-1), m el peso de la muestra (mg) y 161 es la masa molar
del monómero (C6H11O4N).
Este método presenta algunas dificultades, tales como: Las muestras de quitosano
tienen que ser purificadadas y secadas antes de las mediciones. Los contenidos de
humedad y cenizas tienen que ser determinados. Muestras de bajo grado de
acetilación no se miden adecuadamente por valoración Potenciométrica (De
Alvarenga, 2011).
7.2.4.2 Determinación del contenido de Cenizas (%C)
El porcentaje de cenizas será determinado después de la combustión de
aproximadamente 2g de muestra en crisoles a peso constante, en una mufla a
550ºC, durante 4 h (hasta llegar a peso constante), obteniendo así la diferencia de
pesos (AOAC, 1990).
)
(% *100
Peso crisol con cenizas Peso crisol
Peso muestraC
El proceso final de enfriado se llevará a cabo con un desecador.
17
7.2.4.3 Determinación del contenido de humedad (%H)
El porcentaje de humedad se determinará después de secar aproximadamente 2g
de muestra en charolas de aluminio durante 24h a 105ºC hasta alcanzar peso
constante en una estufa con temperatura controlada, calculando el porcentaje por
diferencia de pesos (AOAC, 1990).
( %
– )* 0
1 0
Peso charola con muestra sin humedad Peso charola
Peso mue raH
st
7.2.4.4 Determinación Viscosidad intrínseca y Masa
Molecular
La viscosidad intrínseca de quitosano se determinará usando un viscosímetro
capilar que tiene un tamaño capilar de 0.38 mm en un baño de agua a 25°C.
Viscosidad media MM se calculará a partir de la viscosidad intrínseca medido de
acuerdo con la ecuaciónde Mark-Houwink-Sakurada (MHS). Para cada muestra, se
emplearán cuatro diferentes concentraciones de quitosano en un intervalo de 0,33
a 1% para medir la viscosidad de las muestras. La viscosidad intrínseca fue
determinada por la intersección entre la viscosidad relativa Huggins y Kraemer. La
18
viscosidad relativa, viscosidad reducida, y la viscosidad intrínseca se determinará
como:
0rel
t
t
1sp rel
sp
rel C
ln[ ] /ln[ ]
sp relC
C C
Donde t es el tiempo de flujo medido para la solución de la muestra en un t (s) tiempo
determinado; t0 (s) es el tiempo de flujo de la solución (0.1 M HOAc) sin muestra de
quitosano; C es la concentración de la muestra de quitosano en solución diluida (g
/ ml); y [η] era viscosidad intrínseca (ml / g) (Zhang y col., 2013). La masa molecular
promedio en viscosidad (MM) de quitosano se calculará por la ecuación de MHS:
[ ] ( )aK MM
Donde K y a fueron las constantes, K = 1,81 × 103, a = 0,93, [η] será la viscosidad
intrínseca obtenida a partir de los gráficos de Huggins y Kraemer (Zhang y col.,
2012).
7.2.5 ANALISIS ESTADÍSTICOS
Se utilizará la metodología de superficie respuesta (MSR) para optimizar las mejores
condiciones de procesamiento (concentración de melaza, y tiempo de fermentación)
19
para la obtención de Quitina y Quitosano, teniendo como variables de respuesta
grado de desacetilación, masa molecular, porcentaje de ceniza, porcentaje de
humedad (Cuadro 2).
Cuadro 2. Diseño experimental
X1,
Codificada
X2,
Codificada
°Brix
Tiempo de
fermentación
Grado de
desacetilación
Masa
Molecular
% H % C
-1 -1 8 48
1 -1 10 48
-1 1 8 72
1 1 10 72
-1.4142 0 7.59 60
1.4142 0 10.41 60
0 -1.4142 9 43.03
0 1.4142 9 76.97
20
0 0 9 60
0 0 9 60
0 0 9 60
0 0 9 60
0 0 9 60
7.2.6 APLICACIÓN EN UN FRUTO MODELO
7.2.6.1 Preparación de las muestras
La fruta modelo se seleccionará en base a uniformidad, tamaño, color, forma, y
ausencia de daño y microorganismos. Después serán sumergidas en una solución
de Quitosano, será dispersado en 900 mL de agua destilada y se le agregará 50 ml
de acido acético glacial para disolver el Quitosano, para preparar las soluciones de
1 L de Quitosano. El pH de las soluciones se ajustará a pH 5.0 con 0.1 M NaOH y
la solución se llevará hasta 1 L. Una solución de ácido a un pH de 5.0, sin quitosano
se utilizará como control. Después será removido el exceso de humedad con aire
seco a 25°C por 30 min (Chien y Col., 2005).
7.2.6.2 Determinación de la pérdida de peso y contenido
de humedad
21
El porcentaje de humedad se determinará después de secar aproximadamente 2 g
de muestra en charolas de aluminio durante 24h a 105ºC hasta alcanzar peso
constante en una estufa con temperatura controlada, calculando el porcentaje por
diferencia de pesos (AOAC, 1990).
(
% – )
* 0
1 0Peso charola con muestra sin humedad Peso charola
Peso mue raH
st
7.2.6.3 Determinación del Color
La determinación de color se realizará de acuerdo a la metodología reportada por
Ayón y col (2015) utilizando un colorímetro Minolta CR 200 (Minolta Chromameter,
Japón), registrando los parámetros L*, a* y b* de la escala de color CIELAB, en el
cual L* define la luminosidad y a* y b* son dos componentes cromáticos y son de
verde a rojo, y de azul a amarillo, respectivamente.
7.2.6.4 Determinación de Sólidos Solubles Totales
El contenido de sólidos solubles totales se determinará de acuerdo al método oficial
22.014 de la AOAC (1999) utilizando un refractómetro manual (Fisher Cientific
S66366). Se reportará como porcentaje de azúcar (ºBrix).
7.2.6.5 Determinación de pH
Se determinará utilizando el método 981.12 de la AOAC (1999); que consiste en
homogenizar 20 g de muestra con agua destilada neutra, posteriormente se filtrará
22
en tela de organza y se aforará a 100 mL. El pH se evaluará mediante la inmersión
directa del electrodo de vidrio de un potenciómetro Orion (Orion research Inc,
Boston, MA USA) en la solución aforada. Las determinaciones se realizarán por
triplicado, expresándose los resultados como iones hidrógeno.
7.2.6.6 Acidez Titulable
La acidez titulable se determinará de acuerdo al método oficial 942.15 de la AOAC
(1999). A partir de la solución aforada para la determinación del pH, se tomaran
alícuotas de 20 mL y se titularán con NaOH 0.1 N hasta un pH de 8.1±0.2. Se
reportará como porcentaje de ácido cítrico (Ayón y Col., 2015).
7.2.6.7 Análisis Microbiológico
La muestra a analizar fue preparada de acuerdo a la metodología reportada por
Ayón y Col. (2015) cincuenta gramos de fruto modelo se mezclarán con 450 mL de
agua peptonada (1 %) y se homogeneizaran por 1 minuto en una licuadora
(Osterizer M4108 10 VEL) bajo condiciones estériles, obteniéndose una dilución
1:10. A partir de esta dilución se preparó la dilución 1:100, mezclando 1 mL de la
dilución con 9 mL del medio BHI (Infusión Cerebro Corazón, BD Bioxon) en un tubo
falcon de 15 mL estéril.
7.2.6.7.1 Mesófilos y psicrófilos
Para el recuento de mesófilos y psicrófilos aerobios se tomarán 100 μL de las
diluciones preparadas (10-1 y 10-2) por duplicado y se pipetearán asépticamente
en placas con agar para cuenta estándar (PCA, por sus siglas en inglés). Se
utilizarán asas de plástico estériles para distribuir uniformemente el inóculo en las
placas. Para el caso de mesófilos las placas se incubaran por 24-48 h a 37°C y para
23
psicrófilos se incubaron por 13-15 días a 5°C (Ruiz-Cruz y col., 2010; NOM-092). El
conteo microbiológico de mesófilos y psicrófilos serán reportados como UFC/g
(unidades formadoras de colonia por gramo de muestra).
7.2.6.7.2 Hongos y levaduras
Para la determinación de hongos y levaduras se tomarán 100 μL de las diluciones
preparadas (10-1 y 10-2) y se inocularán en placas con agar Sabouraud.
Las placas se incubarán por 3-5 días a 25°C, el conteo de hongos y levaduras será
expresado en UFC/g de tejido (NOM-111).
7.2.6.8 Análisis Estadístico
La comparación de medias entre quitosano comercial y quitosano obtenido por
medio de fermentación láctica, aplicados como cubiertas en el alimento modelo, se
realizará mediante la prueba de Tukey con un nivel de significancia del 5% (P≤0.05).
VII. BIBLIOGRAFIA
AOAC. 1999. Official Methods of Analysis. 16aed. Association of Official Analytical
Chemists Washington, D. C. USA.
AOAC. 1990.Official methods of analysis, 13th edition. Association of Official
Analytical Chemists, Washington, D.C.
Ayón L., Tamayo R., Cárdenas F., López M., López G., López H., López J.,
López J., Vega M. 2015.Effectiveness of Hydrothermal-Calcium Chloride Treatment
24
and Chitosan on Quality Retentionand Microbial Growth during Storageof Fresh-Cut
Papaya. Journal of Food Science.
Baxter A., Dillon M., Taylor K. D. A., Roberts G. A. F. 1992. Improved method for
I.R. determination of the degree of N-acetylation of chitosan. Int. J. Biol. Macromol.,
Vol. 14, pp. 166-169.
Caprile D. 2005.Obtención y Utilización de Quitina y Quitosano apartir de desechos
de crustáceos. Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca, Buenos Aires,
Argentina. International Solid Waste Association.
Chien P., Sheu F., Yang F. 2005.Effects of edible chitosan coating on quality and
shelf life of sliced mango fruit.Department of Food Science, Yuanpei University of
Science and Technology, No. 306, Yuanpei Street, 300, Hsinchu 30051, Taiwan,
ROC. Journal of Food Science.
Cira L.A., Huerta S., Shirai K. 2002.Fermentación Láctica de Cabezas de Camarón
(Penaeussp) en un Reactor de Fermentación Sólida. Tesis. Universidad Autónoma
Metropolitana. Depto. de Biotecnología, Laboratorio de Biopolímeros.
De Alvarenga S., 2011.Characterization and Properties of Chitosan. Universidade
Federal de Viçosa, Departamento de Química, Viçosa, MG, Brazil. Biotechnology of
Biopolymers.
Franco M. 2010. Extracción de Astaxantina a partir de Residuos de Camarón
Ensilados por Métodos Ácido y Bacteriano. Tesis Doctorado. Universidad
Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa.
Geng X., Yang R., Huang J., Zhang X., Wang X. 2012. Evaluation Antibacterial
Activity of Quaternary-Based Chitin/Chitosan Derivatives in Vitro. Journal of Food
Science.
25
Hernández C., Águila A., Flores A., Viveros N., Ramos C. 2009. Obtención y
caracterización de quitosano a partir de exoesqueletos de camarón. Facultad de
Ingeniería Química, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Sociedad
Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales.
Hirano S., 1999.Chitin and chitosan as novel biotechnological materials. Polymer
International. 48:732-734.
Hosseini S., Rezaei M., Zandi M., Ghavi F. 2013. Preparation and functional
properties of fish gelatin–chitosan blend edible films. Dept. of Fisheries, Faculty of
Marine Sciences, Tarbiat Modares University, P.O. Box 46414-356, Noor, Iran. Food
Chemistry.
Juárez C., 2010. Estudio del uso de enzimas comerciales en la preparación de
quitina a partir de desperdicios de camarón. Tesis especialización en Biotecnología.
Universidad Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa.
Juárez C., 2012. Obtención y caracterización de Quitina biológica y su
Desacetilación a Quitosano. Tesis Maestría. Universidad Autónoma Metropolitana
unidad Iztapalapa.
Lárez V., 2003. Algunos Usos del Quitosano en Sistemas Acuosos. Universidad de
los Andes, Facultad de Ciencias. La Hechicera. Departamento de Química, Grupo
de Polímeros. Mérida (Venezuela). Revista Iberoamericana de Polímeros.
López M., 2012. Obtención y caracterización de quitosanos modificados:
ingredientes funcionales con aplicaciones tecnológicas y biológicas en la industria
alimentaria. Tesis Doctorado. Departamento de Nutrición, Bromatología y
Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Madrid, España.
26
Mármol Z., Páez G., Rincón M., Araujo K., Aiello C., Chandler C., Gutiérrez E.,
2011. Quitina y Quitosano Polímeros Amigables. Una revisión de sus aplicaciones.
Laboratorio de Tecnología de Alimentos. Facultad de Ingeniería. Universidad del
Zulia. Revista Tecnocientífica URU.
[NOM-111] Norma Oficial Mexicana (NOM-111-SSA1-1994). Bienes y servicios.
Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
Muzzarelli R., 1978.Chitin. Pergamon Press. Londres, Inglaterra.
Pacheco N. 2007. Efectos de quitosanos y Pichia Guilliermondii como agentes de
biocontrol contra Penicillium digitatum. Tesis de Maestría. Universidad Autónoma
Metropolitana-Iztapalapa.
Peniche C., 2006. Estudios sobre quitina y quitosano. Tesis Doctorado. Universidad
de la Habana. Facultad de Química.
Percot A., Viton C., Domard A. 2003. Optimization of Chitin Extraction from Shrimp
Shells. Biomacromolecules. 4: 12-18.
Ramírez L., Marín M., Huerta S., Revah S., Shirai K. 2006. Enzymatic hydrolysis
of chitin in the production of oligosaccharides using lecanicillium fungicola
chitinases. Process Biochemistry. 41: 1106-1110.
Ramos-García ML, Bautista-Baños S, Barrera-Necha LL, Bosquez-Molina E,
Alia-Tejacal I, Estrada-Carrillo M. 2010. Compuestos antimicrobianos
adicionadosen recubrimientos comestibles para uso en productos hortofrutícolas.
Revista Mexicana de Fitopatología 28:44-57.
Rinaudo M., 2006. Chitin and Chitosan: Properties and applications, CERMAV-
CNRS, affiliated with Joseph Fourier University, BP53, 38041 Grenoble Cedex,
France. Progress in Polymer Science.
27
Rodríguez-Núñez JR, López-Cervantes J, Sánchez-Machado DI, Soto-Valdez
H, Sánchez-Silva AT, Paseiro-Losada P, Sendón R, Aurrekoetxea GP, Angulo
I. 2010. Capacidad Antimicrobiana de las Películas de Quitosano. VII Congreso del
Noroeste y III Nacional de Ciencias Alimentarias y Biotecnología Centro de las Artes,
Universidad de Sonora.
Shirai K., Guerrero I., Huerta S., Castillo A., Gonzales R., Hall G. 2001. Effect of
initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp
waste ensilation. Enzyme and microbial Technology. 28:446-452.
Zhang H., Yang S., Fang J., Deng Y., Wang D., Zhao Y. 2013. Optimization of the
fermentation conditions of Rhizopus japonicas M193 for the production of chitin
deacetylase and chitosan. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong
University, Shanghai 200240, PR China. Carbohydrate Polymers.
Zhang, H., Jin, Y., Deng, Y., Wang, D., Zhao, Y. 2012. Production of chitin from
shrimp shell powders using Serratia marcescens B742 and Lacto-bacillus plantarum
ATCC 8014 successive fermentation. Carbohydrate Research, 362, 13–20.
Carbohydrate Polymers.