HPLC

Jesús Anzano

Copyright-2002-J.A.

Esquema de separación en cromatografía líquida

N, número de platos teórico .

GENERALIDADES

Introducción de muestras

• Inyección directa• No es necesario que las muestras sean muy solubles en la fase móvil • Rara es la vez en la que se produce descomposición de la muestra • Algunas veces se inyectan derivados de la muestra. • Poca preparación de la muestra• Muestra inyectada: ng-2 mg

Columnas

• Columna: 25-50 cm• Diámetro interno de columna: 2-5 mm• Diámetro de partícula: 5-15 µm

Mecanismos de reparto

Tipo Fase estacionaria Fase móvil Aplicaciones ADSORCIÓN Gel de sílice Hexano, cloroformo, isopropanol Eteres, esteres, vitaminas

Alúmina Hexano, cloroformo, isopropanol AminasREPARTO:Fase Normal Amino Hexano, cloroformo, isopropanol Azucares, nitroderivados

Ciano Hexano, cloroformo, isopropanol Nitroderivados, aminoácidosFase inversa Dimetilsilano Agua, acetonitrilo, metanol Aminas,fenoles, vitaminas

Octilsilano Hexano, cloroformo, isopropanol Aceites, esenciales, esteroidesINTERCAMBIO IÓNICO:Intercambiador fuerte de cationes Ácido sulfónico Na2HPO4 Aminoácidos

Intercambiador fuerte de aniones Amonio cuaternario Na2HPO4 Nucleótidos

Intercambiador débil de aniones -NH2 H3PO4 Colorantes, carbohidratos

EXCLUSIÓN Gel acuoso Agua Proteínas, péptidos,

Gel orgánico Cloroformo, THF PolímerosGel de sílice THF, alcoholes, agua Compuestos biológicosVidrio poroso Hexano, cloroformo, isopropanol Compuestos biológicos

Instrumentación en HPLC

Columnas

Características de los detectores

Detector Límite de detección(masa)

Absorbancia 100 pg-1ngFluorescencia 1-10 pgElectroquimico 10 pg- 1ngIndice de refracción 100 ng-1µgConductividad 500 pg-1ngEspectrometría de masas 100 pg-1 ngFT-IR 1µgDispersión de luz 10µg

ACOPLAMIENTO HPLC-EA

- La conexión entre CL y un ICP es bastante fácil

- El caudal de aspiración de las muestras es compatible con el caudal de los eluyentes cromatográficos líquidos

- W. SLAVIN: formación de una gota la salida del eluyente cuando éste alcanza un determinado tamaño (100 mL) se desprende y cae sobre un micro-embudo de teflón conectado directamente al nebulizador.

INTERFASES

• Conexión sencilla• Dilución del analito.• Los ompuestos termolábiles, se descomponen• Posible obturación de la interfase. Interfase con cinta transportadora móvil Interfase con formación de un termosprayInterfase con ionización a presión atmosféricaIntroducción directa