Los polifenoles del vino ejercen su efectoantineoplásico sobre la línea celular PC-3 andrógenoresistente a través de la inhibición de la actividadtranscripcional del promotor de COX-2 mediada porNF-k�
A. Ferrueloa, M.M. de las Herasb, C. Redondob, F. Ramón de Fatab,I. Romerob y J.C. Angulob,∗
a Unidad de Investigación, Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de Getafe, Madrid, Espanab Servicio de Urología, Hospital Universitario de Getafe, Departamento Clínico, Facultad de Ciencias Biomédicas, UniversidadEuropea de Madrid, Madrid, Espana
Recibido el 19 de febrero de 2014; aceptado el 24 de febrero de 2014
PALABRAS CLAVECáncer de próstataresistente acastración;Línea celular PC-3;Resveratrol;Polifenoles;COX-2;NF-k�
ResumenObjetivo: La dieta mediterránea puede tener un papel en la prevención del desarrollo yprogresión del cáncer de próstata (CaP). La expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) se asociacon proliferación celular aumentada, previene la apoptosis y favorece la invasión tumoral.Se intenta clarificar si el resveratrol y otros polifenoles del vino inhiben de forma efectiva laactividad de COX-2 e inducen apoptosis en la línea celular PC-3 de cáncer hormonorrefractario.Material y método: Células PC-3 fueron cultivadas y tratadas con diferentes concentracionesde ácido gálico, ácido tánico, quercetina y resveratrol en presencia del éster de forbol PMA(50 �g/ml) que induce la expresión de COX-2. Se extrajo ARN total y se analizó la expre-sión de COX-2 mediante cuantificación relativa por PCR a tiempo real (método ��Ct). Laactividad COX-2 se determinó mediante detección de PGE-2 por ELISA. Se empleó ensayo deluminiscencia Caspasa 3/7 para evaluar la apoptosis. La transfección transitoria con plásmidosshort human COX-2 (phPES2 ---327/+59) y p5xNF-k�-Luc determinó la actividad del promotor deCOX-2 y de forma particular la dependiente de NF-k�.Resultados: La expresión de COX-2 no se modificó en ausencia de PMA. No obstante, bajola inducción con PMA, ácido tánico (2,08 ± 0,21), ácido gálico (2,46 ± 0,16), quercetina
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la actividad transcripcional del promotor de COX-2 mediada porNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acuro.2014.02.017
(1,78 ± 0,14), y especialmente resveratrol (1,15 ± 0,16) inhibieron significativamente la expre-sión de COX-2 respecto al control (3,14 ± 0,07), causando una reducción del 34, 23, 46 y 61%.La inhibición en los niveles de PGE-2 siguió un patrón similar. Todos los compuestos estudiadosindujeron apoptosis a las 48 h, aunque en diferente proporción. PMA causó un aumento de
∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [email protected] (J.C. Angulo).
Wine Polyphenols Exert Antineoplasic Effect on Androgen Resistant PC-3 Cell LineThrough the Inhibition of the Transcriptional Activity of COX-2 Promoter Mediated byNF-k�
os estudios epidemiológicos proporcionan evidencia bas-ante consistente de que una dieta con un alto contenido enrutas y verduras reduce el riesgo de varios tipos de cáncer1.in embargo, los componentes de estos nutrientes que ejer-en este efecto protector y el mecanismo preciso por el cualjercen estos efectos no se conocen con certeza. El cáncere próstata (CaP) sigue siendo un gran problema de saludara los hombres de todo el mundo. Hay una gran cantidade literatura dedicada a describir el potencial quimiopre-entivo o efecto quimioterapéutico de ciertos fitoquímicosn los polifenoles del vino tinto, incluyendo la apoptosisejorada, la detención del crecimiento, la modificación del
iclo celular, la inhibición de la síntesis de ADN y la expre-
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la activNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acur
ión de modulación de enzimas, como las ciclooxigenasas ointasa de prostaglandina H2 (COX)2---5.
Los compuestos polifenólicos constituyen uno de losrupos más grandes y ubicuos de fitoquímicos. Estos
pCe
ompuestos, especialmente los flavonoides y ácidos fenó-icos, son una parte importante de la dieta humana1,3.as propiedades bioquímicas, ingesta y biodisponibilidad deiferentes compuestos polifenólicos han sido revisadas, yaue este tema es de particular interés en la quimiopreven-ión del cáncer de próstata y/o modulación de terapias6---8.
Hay 2 isoformas de COX que catalizan la formación derostaglandinas (PG) a partir del ácido araquidónico. Mien-ras que el COX-1 es un gen house keeping que se expresaonstitutivamente y es generalmente responsable de la pro-ucción de PG en condiciones fisiológicas, el COX-2 es unen altamente inducible por diferentes estímulos. Por otraarte, se cree que el COX-2 es la isoforma responsable dea producción de PG pro-inflamatorias y es muy importanteara la tumorigénesis9.
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
La ciclooxigenasa-2 (COX-2) se considera un objetivootencial para la terapia del cáncer, porque los niveles deOX-2 son elevados en la mayoría de los tumores humanosn comparación con los tejidos normales correspondientes.
Hay diferentes mecanismos posibles que podrían explicar larelación entre la COX-2 y el cáncer. El aumento de los nive-les de PG y la actividad de la COX-2 se han detectado enmúltiples cánceres epiteliales (por ejemplo, de pulmón, decolon, de próstata)10,11 y, especialmente, de PGE-2, puedenafectar y aumentar la proliferación celular y la invasividad,promoviendo la angiogénesis e inhibiendo la apoptosis encélulas malignas.
Los ésteres de forbol, tales como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) funcionan como promotores de tumores yse ha notificado que modulan diversas respuestas celularesincluyendo crecimiento celular, muerte celular programada,diferenciación y transcripción de genes. Se ha establecidoque, además de PMA, las citocinas y lipopolisacáridos tam-bién regulan al alza la expresión de la COX-212---14. Hemosdemostrado que la regulación de la transcripción del recep-tor de andrógenos (RA) media el efecto antiproliferativode resveratrol y otros polifenoles del vino en línea celularde LNCaP sensible a los andrógenos15,16. Ahora tenemos laintención de estudiar in vitro los efectos de estos compues-tos en el CaP resistente a la castración y los mecanismosimplicados.
Materiales y métodos
Materiales
PMA y los compuestos polifenólicos (ácido tánico, ácidogálico, quercetina y resveratrol) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y se disolvieron en etanola concentración de reserva y se almacenaron a ---20 ◦C.Las concentraciones finales utilizadas para diferentes expe-rimentos se prepararon diluyendo la solución madre conRPMI antes de su uso. El plástico para cultivo se obtuvode Corning-Costar (NY, EE. UU.). La mediana de RPMI-1.640con 100 U/ml de penicilina G, 0,1 mg/ml de estreptomicina,50 �g/ml de gentamicina y 2 mM de L-glutamina eran deGibco BRL (Paisley, Reino Unido). El suero bovino fetal (SBF),solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el tetraace-tato de etilendiamina-tripsina (EDTA) del 0,025% eran deBiological Industries (Beit-Hamek, Israel), Amresco (Solon,OH, EE. UU.) y Gibco BRM (Paisley, Reino Unido), respectiva-mente. La MMLV transcriptasa inversa era de Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, EE. UU.).
Cultivo celular y tratamientos
La línea celular PC-3 insensible a los andrógenos se obtuvode American type cultura collection (ATCC, Rockville, MD).Las células se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco BRL, Espana)complementado con 5% de suero bovino fetal inactivado porcalor (FCS, Linus, Espana). Las células fueron cultivadas enuna atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 a37◦ C y crecieron hasta una confluencia del 60-70%, tripsini-zadas con 0,05% de tripsina-2 mM EDTA (Gibco BRL, Espana)y se colocaron para uso experimental. Para los experimen-
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tos las células fueron tratadas con o sin PMA (50 �g/ml) y10 �M de ácido tánico, ácido gálico, quercetina y resvera-trol o vehículo (0,01% etanol) durante 24 h para la expresiónde ARNm y ensayo de transfección y 48 h para estudiar el
ecod
PRESS3
fecto de los polifenoles sobre la secreción de PGE-2 y lapoptosis en células PC-3.
a extracción de ácido ribonucleico y reacción enadena de la polimerasa en tiempo real para lasxpresiones de ciclooxigenasa-2
l ARN total de las muestras de células se obtuvotilizando RNeasy® Mini Kit, de Qiagen (Valencia, CA,E. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Elendimiento del ARN se determinó espectrofotométrica-ente a 260/280 nm y se midieron las ratios de densidad
OD260/OD280) para garantizar la calidad del ARN aisladosando espectrofotómetro ND-100 (Nanodrop Technology).a ratio media fue de 1,8 a 2,1 para todas las muestras. ParaT se utilizo una alícuota que contenía 1-2 �g del ARN totale cada muestra para cADN de primera línea en un volumennal de 20-40 �l utilizando 0,75 �l (0,5 mg) de cebadoresleatorios (Promega, Madison, WI) y 0,5 �l (12,5 mmol/l)ezcla de dNTP (Ecogen, Espana), se incubó a 70◦ C durante
0 min y se enfrió inmediatamente en hielo para evitar laenaturalización. La siguiente mezcla de RT se preparó en0-20 �l para cada muestra: tampón de 4-8 �l de MMLV RT5 x) (Sigma), 0,5 �l (20U) de inhibidor de RNasa (RNasin,romega) y 1 �l (100U) de virus de la leucemia murina Molo-ey (MMLV) de transcriptasa inversa y se incubó a 25◦ Curante 5 min y 37◦ C durante 50 min. Se detuvo la reacción
95◦ C durante 5 min para inactivar la RT. La PCR en tiempoeal se realizó utilizando un TaqMan® PCR kit protocol están-ar en un termociclador de temperatura de fluorescencia,Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Los0 �l de PCR incluyeron 0,1 ng de cADN, 2 �l de TaqMan®
niversal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 �l de unaezcla de cebadores de PCR no descritos (COX-2 or 18S
RNA) y sonda de Taqman MGB (TaqMan® Assays, Appliediosystems, Madrid, Espana). Las reacciones se incubaronn una placa de 96 pocillos a 95◦ C durante 10 min, seguidoor 40 ciclos de 95◦ C durante 15 arena 60◦ C durante 1 min.odas las reacciones se realizaron por triplicado. El ciclombral (CT) se define como el número de ciclo fraccional alue la fluorescencia pasa el umbral fijado. Para determinara expresión relativa del RA en cada muestra los resultadose normalizaron a 18 S (utilizado como un estándar interno)
se utilizó el método comparativo de CT (Boletín usuario # [2001], Applied Biosystems, Madrid, Espana).
eterminación de la actividad de la caspasa 3/7
as células se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densi-ad de 1 × 105 células por pocillo y se trataron con las dosisás altas de cada polifenol usado en el estudio de prolife-
ación. A las 24 y 48 h de tratamiento se aspiró el medio y seavaron las células una vez con PBS. Luego anadimos M-PEReactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Pierce,ockford, IL, EE. UU.) con cóctel fresco de inhibidor de laroteasa (Boehringer Mannheim, Alemania). Las células seezclaron suavemente durante 5 min y el lisado se recogió
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
n un tubo de microfuga. El lisado se aclaró por centrifuga-ión a 13.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se utilizó
se almacenó inmediatamente a ---80◦ C. La concentracióne proteína se determinó mediante ensayo de proteína BCA
sando el protocolo del fabricante (Pierce, Rockford, IL, EE.U.). Para la cuantificación de la apoptosis se utilizó unnsayo luminiscente que mide las actividades de la caspasa-
y -7 (Caspase-Glo 3/7 Assay. Promega, Madison, WI, EE.U.). Brevemente, el ensayo proporciona un sustrato prolu-inescente para la caspasa 3/7 en un reactivo optimizadoara la actividad de la caspasa, la actividad de luciferasa ya lisis celular. La adición de los resultados de reactivos en laisis celular, la escisión de la caspasa del sustrato y la gene-ación de una senal luminiscente «de tipo brillo» producidaor la luciferasa. La luminiscencia es proporcional a la can-idad de actividad de la caspasa presente. Para este ensayoemos utilizado la proteína 1 �g para cada determinación.
ediciones de PGE-2
as células fueron tratadas como se describe en la deter-inación de la actividad de la caspasa 3/7. Los niveles deGE-2 liberados por las células se midieron por el inmu-oanálisis de la enzima de acuerdo con las instruccionesel fabricante. Las tasas de produccion de PGE-2 se nor-alizaron a concentraciones de proteína (R&D Systems,inneapolis, EE. UU.)
lásmidos reporteros y experimentos deransfección transitoria
os plásmidos reporteros utilizados fueron 5 × NF-k�-lucStratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) y el plásmido repor-ero basado en la luciferasa correspondiente a la regióneguladora flanqueante 5’ de tipo humano COX-2 (phPESs-27/+59). Estos 2 vectores de expresión se transfectaronn células PC-3 utilizando Megafectin-20 (Qbiogene, Carls-ad, CA). Brevemente, las células PC-3 se cultivaron enlacas de 24 pocillos al 60-80% de confluencia. A conti-uación, el medio de cultivo se reemplazó por medio delehículo, es decir, medio libre de suero complementado con,1% de albúmina de suero bovino (BSA), durante 18-20 h.ntonces, las células PC-3 fueron lipotransfectadas con laezcla consistente en 3-4 �g de los plásmidos mencionados
nteriormente incubados a temperatura ambiente durante5 min con 0,1 �l de potenciador, 3 �l de Hepes y 2 �l deegafectin-20 en un medio vehículo. Después de la incu-ación la mezcla de transfección se anadió a los cultivoselulares durante 4 h a 37◦ C en RPMI-1460 que contiene 5%e FCS pero sin liposomas antibióticos. Posteriormente, laezcla de transfección se reemplazó por medio de vehículo
resco que contiene los diferentes compuestos a probar. Aas 24 h las células PC-3 se extrajeron con 1 Reporter Lysisuffer (Promega, Madison, WI, EE. UU.) para el análisis dea expresión del gen reportero. La actividad de luciferasae expresó como unidades de luciferasa relativa/mg de pro-eína.
nálisis estadístico
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la activNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acur
os resultados se expresan como media ± s.e.m. ANOVA uni-ireccional con el análisis post hoc; el t-test de Dunnett setilizó para comparar el análisis de expresión ARNm entreos grupos tratados y de control. Las comparaciones con
d
Pm
PRESSA. Ferruelo et al
especto a la actividad de la caspasa 3/7 se llevaron a caboon la prueba «t» de Student independiente. Se alcanzó elivel de significación cuando p < 0,05.
esultados
os polifenoles suprimen el aumento mediado pororbol 12-miristato 13-acetato en la producción deGE-2
n estos experimentos 4 polifenoles fueron probados conespecto a su efecto sobre la producción de PGE-2 paraeterminar los efectos antiinflamatorios de estos polifeno-es: el resveratrol estilbeno, la quercetina flavonol, el ácidoánico tanino y el ácido gálico ácido benzoico (fig. 1). Lossteres de forbol son potentes inductores de COX-2, por loue determinamos el efecto del tánico, gálico, quercetina yesveratrol sobre la síntesis de PG por células PC-3 en el queOX-2 se indujo por PMA. Como se muestra en la figura 2 A,MA causó un aumento de alrededor de 4 veces en la sínte-is de PGE-2. Este efecto fue notablemente suprimido por elratamiento con resveratrol (82%), ácido tánico (64%) y quer-etina (41%) y fue inhibido con ligereza por el ácido gálico17%). Para evaluar si la inhibición de la síntesis de PGE-2ra debida a la inhibición de COX-2 o COX-1 se compararonos efectos de NS-398, un inhibidor selectivo de COX-2. Elretratado de células con NS-398 (0,1-10 �M) inhibió la sín-esis de PG a menos del 10% del nivel de control estimuladoel PMA (fig. 2 B). Este resultado significa que más del 90%e actividad de COX estimulada por PMA en células PC-3 eraebido a la isoforma de la COX-2. No se encontró ningúnambio en los niveles de síntesis de PGE-2 en ausencia deMA (datos no presentados).
os polifenoles inhiben el aumento mediado pororbol 12-miristato 13-acetato en el ácidoibonucleico mensajero de la ciclooxigenasa-2
ara determinar si los efectos anteriores sobre la produc-ión de PGE-2 podrían estar relacionados con las diferenciasn los niveles de ARNm de la COX-2, se realizó RT-PCRe ARN total en tiempo real. La figura 3 muestra que elratamiento con PMA resultó en un marcado aumento (3eces) en los niveles de la expresión de ARNm de la COX-2rente a las células no tratadas (p ≤ 0,01). Este efecto fuearcialmente suprimido por los polifenoles. El resveratrol ya quercetina inhibieron la expresión de COX-2 un 63 y 47%,espectivamente. Sin embargo, los ácidos tánico y gáliconhibieron la expresión de ARNm de la COX-2 en menoredida (20-25%). Estos datos indicaron que estos polifenoles
nhibían la expresión de COX-2 en los niveles de transcrip-ión, siendo el resveratrol y la quercetina los inhibidores másotentes. No se encontró ningún cambio en los niveles deRNm de la COX-2 en ausencia de PMA (datos no mostrados).
fecto de los polifenoles sobre NF-k� y actividad
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
e la ciclooxigenasa-2
ara investigar más la importancia de PMA y polifenoles en laodulación de la expresión de la COX-2, las transfecciones
Figura 1 Estructura bioquímica de los diferentes polifenolesgrupos químicos a los que corresponden.
transitorias se realizaron utilizando un plásmido reporteroque lleva el promotor de la COX-2 humano corto (-327/+59pb). Como en el ARNm, el tratamiento con PMA durante
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la activNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acur
24 h aumentó significativamente la actividad del constructopromotor basado en luciferasa sobre > 7 veces. Todos lospolifenoles causaron la inhibición de la inducción mediadapor PMA de la actividad del promotor de la COX-2 (fig. 4).
cede
diados (resveratrol, quercetina, ácido tánico y ácido gálico) y
Debido a que la activación de NF-k� es crítica paraa inducción de la COX-2 por ésteres de forbol, tambiénstudiamos si uno de los principales factores de trans-
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
ripción implicados en la respuesta inflamatoria, NF-k�,s inhibido en la vía de transducción de senales que con-uce a la expresión de COX-2 causada por PMA. Paraste fin se determinó la actividad basal de transcripción
Figura 2 Los polifenoles suprimen el éster de forbol mediadoelevado en la producción de PGE-2. Las células PC-3 fueron tra-tadas con o sin PMA (50 �g/ml) y 10 �M de ácido gálico y tánico,quercetina, resveratrol y vehículo (0,01% de etanol) (A) o NS398(0-10 �M) (B) durante 48 h. El medio se recogió para determinarla tasa de síntesis de PGE-2. La producción de PGE-2 se deter-m*
Ncddfqedb
IP
LccPPr
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1 3.1 2.5 2.4 1.7 1.1
Control PMA Gallic Tannic Quercetin Resveratrol
PMA
Rel
ativ
e ex
pres
sion
leve
l (fo
ld)
* *
**
**
Figura 3 Efecto de los polifenoles sobre niveles de ARNmde COX-2 inducida por PMA en los niveles de ARNm de célu-las PC-3 tratadas con o sin PMA (50 �g/ml) y 10 �M de ácidogálico y tánico, quercetina, resveratrol o vehículo (0,01% eta-nol) durante 24 h. El ARN total celular fue aislado y analizadopor tiempo RT-PCR en tiempo real para la expresión de COX-2. El gen 18S ARNr se amplificó como un control interno. Seobservó una disminución significativa en la expresión de ARNmdp*
dLplas 48 h, aunque a un ritmo diferente: quercetina 1,6, ácidogálico 1,7, ácido tánico 3,5 y resveratrol 42,5 veces en com-paración con el control (fig. 6 A). Las pequenas diferenciaspueden ser percibidas mejor en detalle en la figura 6 B.
Control PMA Gallic Tannic Quercetin Resveratrol
**
**
**
**
PMA
500
400
300
200
100
0
Act
ivity
luci
fera
se (
x100
0)
Figura 4 Efecto de los polifenoles sobre actividad promo-tora de la COX-2 inducida por PMA. Las células PC-3 fuerontransfectadas transitoriamente con 3-4 �g de plásmido phCOX-2(---327/+59)-luc. Después de la transfección las células se tra-taron con vehículo (columna blanca), PMA (50 �g/ml, columnanegra), o PMA y polifenoles (10 �M, resto de columnas). La acti-
inó mediante inmunoanálisis enzimático.p < 0,05; **p < 0,01 vs. tratamiento con PMA.
F-k�-dependiente en PC-3 transfectada transitoriamenteon p5 × NF-k�-luc. La estimulación de las células con PMAurante 24 h tiene como resultado un aumento del doblee la actividad de la luciferasa NF-k�. Esta estimulaciónue parcialmente suprimida por gálico (24%), tánico (33%) yuercetina (37%) (fig. 5). El resveratrol era el más potente yra capaz de inhibir casi completamente (> 90%) la actividadel promotor de NF-k�, incluso con respecto a condicionesasales, en ausencia de PMA (> 90% de inhibición).
nducción de la apoptosis por polifenoles en célulasC-3
a actividad de caspasa 3/7 en el control y células tratadason polifenoles era determinar para evaluar si la inhibi-
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ión del metabolismo de la COX-2 (expresión y secreción deGE2) puede causar inducción de la apoptosis. Las célulasC-3 fueron tratadas durante 24 y 48 h en presencia de dife-entes polifenoles (10 �M), se lisaron y se midió la presencia
vLn*
e la COX-2 para todos los polifenoles. El resveratrol era el másotente.p < 0,05; **p < 0,01 vs. tratamiento con PMA.
e caspasa activa 3/7 con el ensayo de caspasa-Glo 3/7.a actividad de la caspasa 3/7 se incrementó notablementeor todos los polifenoles probados con respecto a control a
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada por
ro.2014.02.017
idad reportera se midió en extractos celulares 24 h después.a actividad de la luciferasa representa los datos que se hanormalizado con la concentración de proteína.p < 0,05; **p < 0,01 frente a tratamiento con PMA.
Figura 5 Efecto de polifenoles sobre actividad promotora deNF-k� inducida por PMA. Las células PC-3 fueron transfectadastransitoriamente con 3-4 �g de plásmido phCOX-2 (---327/+59)-luc. Después de la transfección las células se trataron convehículo (columna blanca), PMA (50 �g/ml, columna negra),o PMA y polifenoles (10 �M, resto de columnas). La actividadreportera se midió en extractos celulares 24 h después. La acti-
3000
2500
250
200
150
100
50
0
2000
1500
1000
500
0Control Gallic Tannic Quercetin Resveratrol
Control Gallic Tannic Quercetin
RLU
x 1
04R
LU x
104
A
B
Figura 6 Inducción de la apoptosis por los polifenoles en lascélulas de PC-3 determinadas por la actividad de la caspasa3/7 en las células de control y tratadas. Todos los compuestosindujeron la apoptosis a las 48 h, aunque a un ritmo diferente:ácido tánico 3,5, ácido gálico 1,7, quercetina 1,6 y resveratrol4d
acrdqcadchTdl
pmpmecs
vidad de luciferasa representa los datos que se han normalizadocon la concentración de proteína.*p < 0,05; **p < 0,01 frente a tratamiento con PMA.
Discusión
El resveratrol es una fitoalexina que se encuentra en altasconcentraciones en las uvas y se ha demostrado que inhibecarcinógenos químicos en varios modelos17. Este compuestonatural se ha propuesto de potencial terapéutico en mode-los preclínicos, animales y estudios en humanos en variasmalignidades18. Ha surgido interés específico por el cáncerde próstata, ya que el resveratrol ha demostrado regresióntranscripcional de la expresión de RA, degradación acele-rada de RA y modulación de coactivadores de RA16,19---21.El resveratrol en la dieta suprime de forma espontáneadesarrollar tumores de próstata en el modelo TransgenicAdenocarcinoma Mouse Prostate (TRAMP) a través de lasubregulación de fosfo-ERK, un efector descendente delreceptor de esteroides sexuales y de senalización del factorde crecimiento22. Las altas concentraciones de resveratroltambién han resultado en inhibición significativa depen-diente de la dosis de fosforilación de PKB/Akt, tanto enlíneas celulares PC- 3 como en LNCaP23,24. La inhibición dePI3K mediada por resveratrol puede estar mediada en partepor la inhibición de la fosforilación de supresión tumoral dela familia FOXO, permitiendo así los objetivos proapoptóti-cos como TRAIL o p2725.
En el adenocarcinoma mamario se ha demostrado queel resveratrol inhibe la enzima COX-2, isoforma induciblede las enzimas limitantes de la velocidad que conviertenel ácido araquidónico en prostaglandinas proinflamatorias,que se incrementa después de la estimulación de mitógenoscomo el éster de forbol18,26. Esta inhibición que se manifiesta
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en diferentes niveles, que incluyen la actividad enzimáticadirecta, ARNm y la síntesis de proteínas, el elemento derespuesta a AMP cíclico y la expresión génica mediada porAP-126,27. El resveratrol también ha confirmado suprimir la
tmom
2,5 veces en comparación con el control (A). Las pequenasiferencias se pueden apreciar en detalle (B).
ctividad promotora de la COX-2 en células de cáncer deolon humano DLD-128. En cuanto a la próstata, la COX-2 seegula al alza en la atrofia inflamatoria proliferativa (AIP)e la próstata, pero no en el CaP29, aunque se ha defendidoue promueve la progresión del cáncer de próstata30. Lasatequinas presentes en el té verde inhiben la COX-2 sinfectar a la expresión de la COX-1 en ARNm y los nivelese proteína, tanto en LNCaP que responde a los andrógenosomo en PC-3 refractario a los andrógenos. Esta acción sea demostrado tanto in vitro como in vivo usando el modeloRAMP de ratón31,32. También los efectos de los polifenolesel té verde en el CaP son sinérgicos con los inhibidores dea COX-233.
La vía inflamatoria de la COX-2 es considerada un objetivootencial en la neoplasia epitelial y también específica-ente en el CaP. La activación de NF-k� se considera críticaara la inducción de la COX-2 por ésteres de forbol34. Esás, la COX-2 sobreexpresada es secundaria a la sobre-
xpresión de NF-k�35. Hussain et al. demostraron que elomponente de té verde epigalocatequina-3-galato inhibeelectivamente la COX-2 en células de carcinoma de prós-
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ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
ata humano, tanto LNCaP como PC-3 . Esta acción es laisma que demostramos que se ejerce por el resveratrol y
tros polifenoles en el vino tinto, todo abundante en la dietaediterránea37.
NF-k� es un factor de transcripción a menudo sobre-xpresado que regula diferentes actividades celulares,ncluyendo la inflamación, la inmunidad y la muerte celular.a regulación a la baja de NF-k� se sabe que desencadenafectos apoptóticos y antiproliferativos, y se considera unecanismo que puede prestar beneficios para la salud del
onsumo de los polifenoles del té verde38. Sin embargo,a realidad es muy compleja, ya que los polifenoles delé verde se dirigen a muchos otros mecanismos diferen-es, incluyendo la detención del ciclo celular, las enzimase desintoxicación, IGF, la apoptosis inducida por TRAIL,as quinasas MAP, Hh (senalización hedgehog), PI3K-Aktsenalización de rapamicina) y PKC39,40. De acuerdo conuestros resultados, los polifenoles del vino tinto tambiéne dirigen a las vías inflamatorias y podrían ser responsablesel efecto antiproliferativo in vitro de resveratrol, quer-etina, ácido gálico y ácido tánico en la línea celular PC-. Esta senalización aparece totalmente diferente de la dea RA observada en la línea celular LNCaP16. La inhibicióne la senalización de NF-k� en ratones TRAMP activa lapoptosis a través de un aumento de la relación Bax/Bcl-41. Este efecto también se ha demostrado para el zumo deranada de la fruta Punica granatum42; la delfinidina, unamportante antocianina presente en muchas frutas y ver-uras pigmentadas43, y también recientemente �-tomatina,a principal saponina presente en el tomate (Lycopersiconsculentum)44,45. Es muy comprensible que el mecanismoue describimos para el resveratrol y otros polifenoles delino tinto en la línea celular PC-3 refractario a andrógenosiga una lógica muy similar.
En este estudio se muestra que diferentes polifenolesresentes en el vino tinto inhiben la estimulación con PMA dea expresión de COX-2, la actividad promotora de la COX-2 ya liberación de PGE2 en carcinoma de próstata humano PC-
insensible a los andrógenos que conduce a aumento de lapoptosis. A pesar de la gran experiencia acumulada in vitro,e han realizado muy pocos ensayos clínicos que utilizan lasoncentraciones exactas de compuestos quimiopreventivosrobables. En este sentido, un estudio aleatorizado de fase
i ha demostrado recientemente que el extracto de granadae asocia con más de 6 meses de aumento del tiempo deuplicación del PSA en hombres con recurrencia bioquímicaespués de la terapia local; sin embargo, no se utilizó ningúnrazo de control46.
Definitivamente no hay evidencia para considerar el res-eratrol un agente antineoplásico terapéutico. Sin embargo,e ha considerado que mejora la sensibilidad a la radia-ión en varias malignidades, incluyendo la de próstata47,48.osiblemente en un futuro podría encontrarse algún papeleneficioso como complemento en el tratamiento de lanfermedad resistente a la castración, o al menos ser bene-cioso para atenuar la progresión del CaP. En la actualidadenemos que admitir que, desde el punto de vista clínico,l efecto de los antioxidantes de la dieta sobre el cáncer deróstata aún no está definido49.
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la activNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acur
onflicto de intereses
os autores declaran que no tienen ningún conflicto de inte-eses.
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PRESSA. Ferruelo et al
inancianción
ste trabajo ha sido financiado por la Beca Fundación paraa Investigación en Urología (FIU) de la Asociación Espanolae Urología.
ibliografía
1. Donaldson MS. Nutrition and cancer: A review of the evidencefor anti-cancer diet. Nutr J. 2004;3, doi:10.1186/1475-2891-3-19.
3. Davalli P, Rizzi F, Caporali A, Pellacani D, Davoli S, BettuzziS, et al. Anticancer activity of green tea polyphenols in pros-tate gland. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:984219, doi:10.1155/2012/984219.
4. Mimeault M, Batra SK. Frequent gene products and molecularpathways altered in prostate cancer- and metastasis-initiatingcells and their progenies and novel promising multitargetedtherapies. Mol Med. 2011;17:949---64.
5. Iguchi K, Toyama T, Ito T, Shakui T, Usui S, Oyama M, et al.Antiandrogenic activity of resveratrol analogs in prostate cancerLNCaP cells. J Androl. 2012;33:1208---15.
6. Scalbert A, Williamson G. Dietary intake and bioavailability ofpolyphenols. J Nutr. 2000;130 8 S Suppl:2073S---85S.
7. Yang CS, Landau JM, Huang MT, Newmark HL. Inhibition of car-cinogenesis by dietary polyphenolic compounds. Annu Rev Nutr.2001;21:381---406.
8. Cimino S, Sortino G, Favilla V, Castelli T, Madonia M, SansaloneS, et al. Polyphenols: Key issues involved in chemoprevention ofprostate cancer. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:632959, doi:10.1155/2012/632959.
9. Chan CC, Boyce S, Brideau C, Ford-Hutchinson AW, Gordon R,Guay D, et al. Pharmacology of a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, L-745,337: A novel nonsteroidal anti-inflammatoryagent with an ulcerogenic sparing effect in rat and nonhumanprimate stomach. J Pharmacol Exp Ther. 1995;274:1531---7.
0. Kargman SL, O’Neill GP, Vickers PJ, Evans JF, Mancini JA, JothyS. Expression of prostaglandin G/H synthase-1 and -2 protein inhuman colon cancer. Cancer Res. 1995;55:2556---9.
1. Kirschenbaum A, Klausner AP, Lee R, Unger P, Yao S, Liu XH,et al. Expression of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 inthe human prostate. Urology. 2000;56:671---6.
2. Inoue H, Yokoyama C, Hara S, Tone Y, Tanabe T. Transcriptio-nal regulation of human prostaglandin-endoperoxide synthase-2gene by lipopolysaccharide and phorbol ester in vascular endot-helial cells. Involvement of both nuclear factor for interleukin-6expression site and cAMP response element. J Biol Chem.1995;270:24965---71.
3. Chang MS, Lee WS, Teng CM, Lee HM, Sheu JR, Hsiao G,et al. YC-1 increases cyclo-oxygenase-2 expression throughprotein kinase G- and p44/42 mitogen-activated proteinkinase-dependent pathways in A549 cells. Br J Pharmacol.2002;136:558---67.
4. Mestre JR, Subbaramaiah K, Sacks PG, Schantz SP, Tanabe T,Inoue H, et al. Retinoids suppress epidermal growth factor-induced transcription of cyclooxygenase-2 in human oralsquamous carcinoma cells. Cancer Res. 1997;57:2890---5.
5. Romero I, Páez A, Ferruelo A, Luján M, Berenguer A. Polyphenols
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
in red wine inhibit the proliferation and induced apoptosis ofLnCap cells. BJU Int. 2002;89:950---4.
6. Ferruelo A, Romero I, Cabrera PM, Arance I, Andrés G, AnguloJC. Effects of resveratrol and other wine polyphenols on the
proliferation, apoptosis and androgen receptor expression inLNCaP cells. Actas Urol Esp. 2014 en prensa.
17. Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW,et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a naturalproduct derived from grapes. Science. 1997;275:218---20.
18. Klempner SJ, Bubley G. Complementary and alternative medi-cines in prostate cancer: From bench to bedside? Oncologist.2012;17:830---7.
19. Goldberg DM, Soleas GJ. Resveratrol: Biochemistry cell biologyand the potential role in disease prevention. En: Sander M, Pin-der R, editores. Wine a scientific exploration. Boca Raton: CRCPress; 2003. p. 160---98.
20. Gao S, Liu GZ, Wang Z. Modulation of androgen receptor-dependent transcription by resveratrol and genistein in prostatecancer cells. Prostate. 2004;59:214---25.
21. Benitez DA, Pozo-Guisado E, Alvarez-Barrientos A, Fernandez-Salguero PM, Castellón EA. Mechanisms involved in resveratrol-induced apoptosis and cell cycle arrest in prostate cancer-derived cell lines. J Androl. 2007;28:282---93.
22. Harper CE, Patel BB, Wang J, Arabshahi A, Eltoum IA, Lamarti-niere CA. Resveratrol suppresses prostate cancer progression intransgenic mice. Carcinogenesis. 2007;28:1946---53.
23. Shi WF, Leong M, Cho E, Farrell J, Chen HC, Tian J,et al. Repressive effects of resveratrol on androgen recep-tor transcriptional activity. PLoS One. 2009;4:e7398, doi:10.1371/journal.pone.0007398.
24. Benitez DA, Pozo-Guisado E, Clementi M, Castellón E,Fernandez-Salguero PM. Non-genomic action of resveratrol onandrogen and oestrogen receptors in prostate cancer: Modu-lation of the phosphoinositide 3-kinase pathway. Br J Cancer.2007;96:1595---604.
25. Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK. Resve-ratrol induces growth arrest and apoptosis through activation ofFOXO transcription factors in prostate cancer cells. PLoS One.2010;5:e15288, doi: 10.1371/journal.pone. 0015288.
26. Subbaramaiah K, Dannenberg AJ. Resveratrol inhibits theexpression of cyclooxygenase-2 in mammary epithelial cells.Adv Exp Med Biol. 2001;492:147---57.
27. Brown L, Kroon PA, Das DK, Das S, Tosaki A, Chan V, et al. Thebiological responses to resveratrol and other polyphenols fromalcoholic beverages. Alcohol Clin Exp Res. 2009;33:1513---23.
28. Mutoh M, Takahashi M, Fukuda K, Matsushima-Hibiya Y, Mutoh H,Sugimura T, et al. Suppression of cyclooxygenase-2 promoter-dependent transcriptional activity in colon cancer cells bychemopreventive agents with a resorcin-type structure. Carci-nogenesis. 2000;21:959---63.
29. Zha S, Gage WR, Sauvageot J, Saria EA, Putzi MJ, Ewing CM,et al. Cyclooxygenase-2 is up-regulated in proliferative inflam-matory atrophy of the prostate, but not in prostate carcinoma.Cancer Res. 2001;61:8617---23.
30. Fujita H, Koshida K, Keller ET, Takahashi Y, Yoshimito T, NamikiM, et al. Cyclooxygenase-2 promotes prostate cancer progres-sion. Prostate. 2002;53:232---40.
31. Harper CE, Patel BB, Wang J, Eltoum IA, Lamartiniere CA.Epigallocatechin-3-Gallate suppresses early stage, but not latestage prostate cancer in TRAMP mice: Mechanisms of action.Prostate. 2007;67:1576---89.
32. Pandey M, Gupta S. Green tea and prostate cancer: From benchto clinic. Front Biosci (Elite Ed). 2009;1:13---25.
33. Adhami VM, Malik A, Zaman N, Sarfaraz S, Siddiqui IA, Syed DN,
Cómo citar este artículo: Ferruelo A, et al. Los polifenoles del vPC-3 andrógeno resistente a través de la inhibición de la activNF-k�. Actas Urol Esp. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.acur
et al. Combined inhibitory effects of green tea polyphenols andselective cyclooxygenase-2 inhibitors on the growth of humanprostate cancer cells both in vitro and in vivo. Clin Cancer Res.2007;13:1611---9.
4
PRESS9
4. Chang MS, Chen BC, Yu MT, Sheu JR, Chen TF, Lin CH. Phorbol12-myristate 13-acetate upregulates cyclooxygenase-2 expres-sion in human pulmonary epithelial cells via Ras, Raf-1, ERK,and NF-kappaB, but not p38 MAPK, pathways. Cell Signal.2005;17:299---310.
8. Queen BL, Tollefsbol TO. Polyphenols and aging. Curr Aging Sci.2010;3:34---42.
9. Johnson JJ, Bailey HH, Mukhtar H. Green tea polyphenols forprostate cancer chemoprevention: A translational perspective.Phytomedicine. 2010;17:3---13.
0. Sarkar FH, Li Y, Wang Z, Kong D. Novel targets for prostate can-cer chemoprevention. Endocr Relat Cancer. 2010;17:R195---212,doi: 10.1677/ERC-10-0074.
1. Siddiqui IA, Shukla Y, Adhami VM, Sarfaraz S, Asim M, HafeezBB, et al. Suppression of NFkappaB and its regulated geneproducts by oral administration of green tea polyphenols inan autochthonous mouse prostate cancer model. Pharm Res.2008;25:2135---42.
2. Rettig MB, Heber D, An J, Seeram NP, Rao JY, Liu H, et al. Pome-granate extract inhibits androgen-independent prostate cancergrowth through a nuclear factor-kappaB-dependent mecha-nism. Mol Cancer Ther. 2008;7:2662---71.
3. Hafeez BB, Siddiqui IA, Asim M, Malik A, Afaq F, Adhami VM,et al. A dietary anthocyanidin delphinidin induces apopto-sis of human prostate cancer PC3 cells in vitro and in vivo:Involvement of nuclear factor-kappaB signaling. Cancer Res.2008;68:8564---72.
4. Lee ST, Wong PF, Cheah SC, Mustafa MR. Alpha-tomatine indu-ces apoptosis and inhibits nuclear factor-kappa B activationon human prostatic adenocarcinoma PC-3 cells. PLoS One.2011;6:e18915, doi: 10.1371/journal.pone.0018915.
5. Lee ST, Wong PF, He H, Hooper JD, Mustafa MR. Alpha-tomatineattenuation of in vivo growth of subcutaneous and ortho-topic xenograft tumors of human prostate carcinoma PC-3cells is accompanied by inactivation of nuclear factor-kappaB signaling. PLoS One. 2013;8:e57708, doi: 10.1371/jour-nal.pone.0057708.
6. Paller CJ, Ye X, Wozniak PJ, Gillespie BK, Sieber PR, Green-gold RH, et al. A randomized phase ii study of pomegranateextract for men with rising PSA following initial therapy for loca-lized prostate cancer. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2013;16:50---5.
7. Fang Y, DeMarco VG, Nicholl MB. Resveratrol enhances radia-tion sensitivity in prostate cancer by inhibiting cell proliferationand promoting cell senescence and apoptosis. Cancer Sci.2012;103:1090---8.
8. Fang Y, Herrick EJ, Nicholl MB. A possible role for perforin andgranzyme B in resveratrol-enhanced radiosensitivity of prostate
ino ejercen su efecto antineoplásico sobre la línea celularidad transcripcional del promotor de COX-2 mediada poro.2014.02.017
cancer. J Androl. 2012;33:752---60.9. Vance TM, Su J, Fontham ET, Koo SI, Chun OK. Dietary
antioxidants and prostate cancer: A review. Nutr Cancer.2013;65:793---801.
