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1
CÉLULAS MADRE
PASADO Y FUTURO
JUSTO AZNAR
DIRECTOR DEL INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
ABRIL 2008
2
CÉLULAS MADRE
PASADO Y FUTURO
3
CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO
PASADO FUTURO
Cultivan por primera vez células madre
embrionarias humanas
Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación
de células adultas. Nacen las células iPS
Shinya Yamanaka 2006
James Thomson 1998 2007
Obtienen células iPS humanas
4
¿QUE SON LAS CÉLULAS MADRE?
Las células madre, también denominadas células troncales, estaminales o en inglés células stem, “son células que tienen la
capacidad, no solamente de poder cultivarse y reproducirse a si mismas, sino también de poder producir células adultas de diferente
progenie, es decir de diferentes tejidos”
I.L. Weissman. New England Journal of Medicine 346; 1576-1583, 2002
5
TIPOS DE CÉLULAS MADREPueden ser:
Totipotentes
Pluripotentes
Multipotentes
Unipotentes
Puedendar
lugar a
Capaces de formar célulasde todos los linajes del
organismo. En los mamíferossolamente lo son el cigotoy los primeros blastómeros
Capaces de formar célulasde todos los linajes del cuerpo,
son las denominadascélulas madre embrionarias.
Son las células madreadultas capaces de
formar distintos tiposde células de un mismolinaje, como las célulasmadre hematopoyéticas
Son células madre adultasque producen células de
un solo linaje, como las célulasmadre germinales, entre ellas
las espermatogonias quegeneran el esperma
Células
Po
r su
po
ten
cia
lidad
Células madre embrionarias
Células madre de tejidos adultos
Por suorigen
Textos de: R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567-582, 2008
6
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Las células madre embrionarias son células derivadas de los
embriones, no las células constituyentes de los
embriones
S. Holm. Journal of Medical Ethics 34; 63-64, 2008
7
//
cigoto
embriones de:
2 células 3 células 4 células
ser humano adulto
blastocisto
DESARROLLO EMBRIONARIO
8
DESARROLLO EMBRIONARIO
J. Rossant Cell 132, 527-531, 2008
CONSTITUCIÓN DE LA MASA CELULAR INTERNA
9
De embriones: • Sobrantes de fecundación in
vitro• Obtenidos por transferencia
nuclear somática (clonación)• Generados por partenogénesis
a partir de ovocitos animales o humanos
¿DE DÓNDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS?
10
¿QUÉ NÚMERO DE EMBRIONES CONGELADOS HAY ACTUALMENTE?
Aproximadamente:1. En España .................... 200.0002. En Estados Unidos ...... 400.0003. En todo el mundo .......1.500.000
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMRIONARIAS DE SOBRANTES DE
FECUNDACIÓN IN VITRO
11
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS A
PARTIR DE BLASTOCISTOS
GENERADOS POR TRANSFERENCIA
NUCLEAR SOMÁTICA
12
TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA
Ovocito Célula adulta
Enucleación Enucleación
ACTIVACIÓN
TRANSFERENCIA NUCLEAR
Cigoto híbrido
Embrión de dos célulasMasa granulosa interna
Resto embrionario
Células madre embrionarias
Embrión de 64 a 200 células (blastocisto)
13
PARA OBTENERLAS ES NECESARIO CLONAR UN ANIMAL O UN INDIVIDUO
HUMANO
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
AUTÓLOGAS
14
CLONACIÓN ANIMAL
RESUMEN HISTÓRICO
Heidi Ledford. Nature 445; 800-802, 2007
15
Clonación de lobos
Investigadores de la Universidad de Seúl publican en marzo de 2007 la clonación de
dos lobos, Snuwolf y Snuwolffy
M.K. Kim y col. Cloning and Stem Cells 9; 130-137, 2007
Nature / DOI: 10.1038 / News 070430- 4. 1 de mayo de 2007 )
Un equipo de la propia Universidad de Seúl confirma, el 27 de abril de 2007, que los lobos
clonados son genuinos clones
CLONACIÓN ANIMAL
16
• Se consigue por primera vez en el mundo clonar primates (macacus rhesus)
• A partir de 304 ovocitos obtenidos de 14 hembras macacus rhesus
• Se generaron 2 líneas de células madre embrionarias
Eficiencia 0.7%
J.A. Byrne y col. Nature 450; 497-502, 2007
CLONACIÓN ANIMAL
Clonación de primates
171 No consiguieron obtener células madre de los blastocistos clonados
1. Cibelli JB. J Regener Med 2; 25, 20011
2. Chen Y. Cell Res 13; 251, 2003
3. Guangxin L. Chinose Sci Bull 48, 1240, 20031
4. Hwang WS et al. Science 303; 1669, 2004
5. Hwang WS et al. Science 308; 1777, 2005
6. Stojkovic M et al. Reprod Bio Med Online 11, 226, 20051
7. Zavos P. et al. Archives of Andrology 52; 243, 2006
INTENTOS DE CLONACIÓN HUMANA
18
¿SE HA CONCEGUIDO LA CLONACIÓN HUMANA?
No parece que hasta ese momento existiera evidencia de que se hubiera
logrado la clonación de seres humanos
J. Yu y col. Science 318; 1917-1920, 2006
J. Hanna y col. Science 318; 1920-1923, 2007
T. Kakahashi y col. Cell 131; 861-872, 2007
X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007
19
CLONACIÓN HUMANA
Sin embargo, existen razones fundadas para creer que se van a poder producir
clones humanos
X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007
20
• Un equipo de la firma comercial Stemagen Corporation de la Jolla, California, publica un artículo en donde afirman que han podido obtener blastocistos humanos por transferencia nuclear somática utilizando células adultas de piel y ovocitos de mujeres jóvenes (20-24 años) sobrantes de fecundación in vitro
• También han obtenido blastocistos a partir de un pequeño número de ovocitos humanos partenogenéticamente
CLONACIÓN HUMANA
AJ French. Stem Cells 26; 485-493, 2008
21
CLONACIÓN HUMANA
• Aunque hasta el momento no hay evidencia de que se haya logrado obtener líneas celulares embrionarias a partir de embriones humanos
• Existen razones fundadas para creer que se vana poder producir clones humanos
X Yang y col. Nature Genetics 39; 295, 302, 2007
22
POTENCIAL TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS
Se demuestra por primera vez que cardiomiocitos generados a partir de células madre embrionarias humanas pueden mejorar la función cardiaca de
corazones de rata infartados
M.A. Laflamme y col. Nature Biotechnology 25; 1015 – 1024, 2007
23
• A partir de células madre embrionarias obtienen células de músculo esquelético.
• Cuando estas células se transfieren a ratones con distrófia muscular se mejora la función muscular sin que se produzcan teratomas
• Estas experiencias sugieren la posibilidad de aplicarlas en pacientes con distrofia muscular, particularmente en la distrofia muscular de Duchenne
EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
R Darabi y col. Nature Medicine 14; 134-143, 2008
24
APLICACIONES PRECLÍNICAS
Se describe por primera vez la obtención de células similares a los fotoreceptores de la retina a
partir de células madre embrionarias de ratón, mono e
individuos humanos
F Osaka y col Nature Biotechnology 26; 215-224, 2008
25
No se han aplicado clínicamente por la ineficiencia del proceso de clonación, por la
falta de conocimiento de los mecanismos que lo sustentan, por la necesidad que
existiría de mantener terapia inmunosupresiva durante toda la vida, por el riesgo de inducir el desarrollo de hematomas
y por las dificultades éticas que su uso conlleva
EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS
26
M. Enserink. Science 313; 160-163, 2006
“Nadie podría prometer hoy la falsedad de que con células
madre embrionarias se puede curar a alguien inminentemente,
esto es engañar cruelmente a pacientes y público”
EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS
27
CÉLULAS MADRE DE
TEJIDOS ADULTOS
28
¿DE DONDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS
ADULTOS?
De: • Diferentes tejidos adultos• Cordón umbilical• Placenta• Fetos abortados. A partir de células madre
germinales• Teratocarcinomas o carcinomas
embrionarios, especialmente de tumores testiculares
29
• Fusionándose con las células del órgano lesionado• Diferenciándose a células específicas de ese órgano
• Favoreciendo la vasculogénesis a partir de células progenitoras endoteliales contenidas en el material celular o de células mononucleares de la médula ósea
• Ejerciendo acciones paracrinas por liberación de factores de crecimiento, proteínas angiogénicas, factores tróficos o factores moduladores del sistema inmunológico
• Remodelando físicamente la arquitectura tridimensional del órgano afectado
MECANISMOS POR LOS CUALES EJERCEN SU FUNCIÓN LAS CÉLULAS
MADRE ADULTAS
Estos mecanismos in vivo no parecen relevantes
30
EXPERIENCIAS CLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS
31
OBJETIVAS EXPECTATIVAS CLÍNICAS DERIVADAS DEL USO
DE CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS ADULTOS
“Seguramente no hay un precedente así en la
ciencia actual”J. Martin. The Lancet 365; 2070-2071, 2005
32
ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS APROBADOS POR LA FDA
En enero de 2007 había
ensayos clínicos aprobados por la Food and Drug Administration norteamericana.
De ellos, más de 250 en infarto de miocardio, 24 en linfoma de tipo no-Hodgkin y 5 en
tumores testiculares
A. D. Prentice y G. Tarne Science 315; 328,2007
ENSAYOS CLÍNICOS REALIZADOS
1238
33Updated 14/04/2007
34
ESTUDIOS EN INFARTO DE MIOCARDIO CON CÉLULAS MADRE
ADULTAS
35
ENSAYOS CLÍNICOS PARA TRATAR EL INFARTO DE MIOCARDIO
Hasta ahora en los ensayos clínicos promovidos para tratar el
infarto de miocardio se han utilizado solamente células madre
de médula ósea y células endoteliales progenitoras
VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008
36
APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS
En un interesante artículo del pasado febrero se revisan los estudios realizados entre
enero de 1997 y diciembre de 2007 sobre la utilización de las células madre de tejidos
adultos con fines terapéuticos
FUENTES: MEDLINE, EMBASE, Science Citatim Index, pagmes web FDA y de INS de Estados Unidos
R.K. Burt y col. JAMA 299; 925-936, 2008
37
ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS
Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008
38Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008
Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Acute Myocardial Infarction With >=30 Patients
39
ENSAYOS CLÍNICOS EN INFARTO DE MIOCARDIO AGUDO
VALORACIÓN GLOBAL
• Se observa un modesto beneficio de la fracción de eyección ventrícular izquierda. En los interensayos es de 8’6 % y en los intraensayos del 2’4 %
• No se producen efectos secundarios negativos
Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008
40Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936, 2008
Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Chronic Myocardial Ischemia and/or Heart Failure With >=20 Patients
41
ENSAYOS CLÍNICOS EN ENFERMEDAD ISQUÉMICA CORONARIA CRÓNICA
VALORACIÓN GLOBAL
• Aumento de la perfusión regional
• Mejora de la contractibilidad cardiaca
• Modesto aumento de la fracción de eyección ventricular izquierda
• Reducción del dolor anginoso
Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008
42
ACCIONES FUTURAS EN RELACIÓN CON EL INFARTO DE MIOCARDIO
• En la mayoría de los estudios el número de miocardiocitos que se generan y que se integran en el miocardio lesionado es demasiado pequeño para justificar la mejora de la función cardiaca observada
• Esta mejora podría deberse a un efecto paracrino, por lo que la identificación de los factores que condicionan esta acción celular puede ser importante
• Utilizar las células adecuadas en el lugar adecuado y desarrollar métodos más eficientes para generar el tipo celular deseado
• Conocer mejor los mecanismos que regulan el metabolismo de los miocardiocitos
• Conocer mejor los mecanismos del “homing”• Definir los factores presentes en el entorno celular lesionado
que limitan la supervivencia y la integración funcional de las células transplantadas
• Supresión del rechazo inmunológico para mejorar el efecto terapéutico
VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008 H.E. Fleming. Cell 132; 505-509, 2008
43
TERAPIA CELULAR
• Terapia celular preparada de forma individual para cada paciente
• Bancos universales de células madre
• Utilización de fármacos que estimulen el aumento endógeno de células madre
G.Q. Daley y D.T. Scadden. Cell 132; 544-548, 2008
OPCIONES FUTURAS
44
CREACIÓN DE ÓRGANOS BIOARTIFICIALES.
INGENIERÍA DE ÓRGANOS
POSIBLES ALTERNATIVAS AL TRANSPLANTE DE
ÓRGANOS
45
PROBLEMAS FUNDAMENTALES DEL TRANSPLANTE DE ÓRGANOS
• Limitación de órganos disponibles
• Necesidad de inmunosupresión durante toda la vida
46
INGENIERÍA DE ÓRGANOS
Depositando cardiomiocitos sobre delgadas láminas de material
biocompatible se ha conseguido formar estructuras orgánicas de
tres dimensiones
A.W. Feinberg y col. Science 317; 1366-1370, 2007
CONSTRUCCIÓN DE ÓRGANOS SOBRE UNA MATRIZ ARTIFICIAL
47
PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL
• El equipo de Doris A. Taylor, de la Universidad de Minessota ha conseguido por primera vez crear un corazón bioartificial
HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008
48
PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL
METÓDICA PARA OBTENERLO
•Descelularización de corazones de cadáver de rata por perfusión con detergentes
•Mantenimiento de la matriz extracelular, con conservación de una estructura espacial cardiaca acelular
•Reperfusión con células cardiacas neonatales o células endoteliales aórticas de rata
•Cultivo de estas estructuras recelularizadas en un medio similar al que se utiliza para el mantenimiento de órganos
•Mantenimiento de la perfusión durante 28 días
HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008
49
• A los 4 días de finalizar la reperfusión celular la estructura cardiaca generada se contrae
• A los 8 días adquiere la función de la bomba cardiaca
PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL
RESULTADOS
HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008
50
• La misma técnica de descelularización se ha utilizado con corazones de cerdo, de un tamaño similar al humano
• También han conseguido descelularizar, pulmones, hígado, riñón y tejido muscular de diversos mamíferos
PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL
PERSPECTIVAS FUTURAS
HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008
51
ALTERNATIVAS PARA LA ALTERNATIVAS PARA LA OBTENCIÓN OBTENCIÓN
DE CÉLULAS MADRE DE CÉLULAS MADRE DE TIPO EMBRIONARIO. DE TIPO EMBRIONARIO.
CONSIDERACIONES BIOLÓGICAS Y CONSIDERACIONES BIOLÓGICAS Y ÉTICASÉTICAS
52
ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Para obtener células madre embrionarias hay que destruir al embrión del cual se obtienen, lo que indudablemente supone un importante problema ético. Por ello, hace unos años se
planteó el reto de obtener células madre similares a las de los embriones humanos por procedimientos que no requirieran la
destrucción de embriones
Best Practical Research Clinical Obstetrics and Gynecology 18; 929-940, 2004
53
ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Esta inquietud fue recogida por el Consejo Asesor de Bioética
del presidente de Estados Unidos, que en 2005 propuso cuatro posibles alternativas
White Paper Alternate Sources of Human Pluripotent Stem Cells. Washington DC. President’s Councel on Bioethics. 2005
54
ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Estas cuatro propuestas se han ampliado ocho:• Embriones en fase muy temprana de
desarrollo
• Estructuras biológicas no embrionarias generadas por transferencia nuclear somática alternada (ATN)
• Estructuras biológicas obtenidas por transferencia nuclear somática alterada (ATN) con reprogramación asistida del ovocito (OAR)
55
ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
• Por fusión de núcleos de células somáticas adultas con células madre embrionarias
• De pseudoembriones• De células madre germinales• De ovocitos activados por partenogénesis • Por reprogramación de células somáticas
adultas
56
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE
CÉLULAS DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE
DESARROLLO
57
58
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA
DE DESARROLLO
Los primeros en proponer esta técnica fueron Strelchenko y col, del Instituto de Genética Reproductiva de Chicago, dirigido por Verlinsky, que las obtuvieron de embriones de 60 a 70 células, es decir solamente un día antes de que el embrión llegara a la fase de blastocisto
N. Strelchenko y col. Reproduction BioMedicine Online 9; 623-629, 2004
59
OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO
Posteriormente Robert Lanza y colaboradores de la Advanced Cell Technology, consiguen extraer blastómeros de embriones de ocho células y a partir de ellos generar líneas celulares que pudieron diferenciarse a células de distintos tejidosLos embriones de siete células resultantes se implantaron en hembras subrrogadas pseudogestantes, obteniendose ratones aparentemente normales, con una eficiencia similar a cuando se obtenían a partir de embriones de 8 células
Cheng Y. y col. Nature 439; 216-219, 2006
60
OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO
• Los embriones donantes proceden de los sobrantes de la fecundación in vitro. Por ello,
las células madre así obtenidas podrían ocasionar problemas de rechazo
inmunológico similares a los de los trasplantes alogénicos si se utilizaran con
fines terapéuticos• Estas células tendrían por tanto una
aplicación fundamentalmente experimental
DIFICULTADES TÉCNICAS
61
GENERACIÓN DE ESTRUCTURAS BIOLÓGICAS
NO EMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)
62
TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA
Célula de tejido adulto
Célula genéticamente modificada
MODIFICACIÓN GENÉTICA
Ovocito
Ente biológico no embrionario
Células similares a las células madre
embrionarias
ACTIVACIÓN
Pseudoembrión
63
UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR
SOMÁTICA ALTERADA (ANT)
La ANT fue propuesta por William B Hurlbut, de la Universidad de Stanford
Perspectives in Biology and Medicine 48; 211-228, 2005
64
UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)
La propuesta teórica de Hulburt fue llevada a la práctica por A. Meissner y R. Jaenish
En sus experiencias utilizaron fibroblastos de ratones que modificaron genéticamente para que no pudieran expresar
el gen Cdx2 que produce un factor de trascripción necesario para que se forme adecuadamente el trofoblasto
Si este gen no se expresa el embrión, en teoría, no podría implantarse
Nature 439; 212-215, 2005
65
66
TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)
DIFICULTADES ÉTICAS DE LA TRANSFERENCIA
1. No se tiene la certeza de que el gen Cxd2 cumpla la misma función en humanos que en ratones
2. No se puede tener la seguridad de que cada una de las entidades biológicas creadas sea incapaz de desarrollar un embrión viable
3. No se puede tener la certeza de que durante los tres o cuatro primeros días de vida esa entidad biológica no sea diferente de un embrión humano creado in vitro por transferencia nuclear somática
4. Necesidad de utilizar un gran número de ovocitos humanos
Solter D. N. Engl. J. Med. 353; 2321-2323, 2005
67
CREACIÓN DE ESTRUCTURAS
BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA
ALTERADA CON REPROGRAMACIÓN
ASISTIDA DEL OVOCITO (ANT - OAR)
68
ANT - OAR
Resto celular
Núcleo genéticamentemodificado
TRANSFERENCIA NUCLEAR
Ovocito enucleado
Ente biológicoembrionario
ACTIVACIÓN
Pseudoembrión
Células madre similares a las embrionarias
Célula de tejido adulto
69
CREACIÓN DE ESTRUCTURAS
BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS
POR FUSIÓN DE LAS CÉLULAS SOMÁTICAS
ADULTAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
70
FUSIÓN CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Para solventar el grave problema del uso de ovocitos humanos que la ANT y la ANT-
OAR tienen, se propuso fusionar el núcleo de las células somáticas adultas
genéticamente modificadas con células madre embrionarias en lugar de
transferirlas a ovocitos enucleados
71
EXPERIENCIAS DE COWAN Y COLABORADORES
Célula madre embrionaria
Célula adulta genéticamente
modificada
ACTIVACIÓN
Híbrido
Células pluripotentes
FUSIÓN
FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
72
FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Esta propuesta ha sido aplicada en humanos, fusionando el núcleo de células somáticas con
células troncales embrionarias
Tras la fusión se ha conseguido que el genoma de las células somáticas se
reprogramara hasta un estado evolutivo similar al de las células pluripotentes, a partir del cual se pudieron obtener líneas celulares
similares a las embrionarias
Cowan CA. Science 309; 1369-1373, 2005
73
DIFICULTADES TÉCNICAS
Dificultades técnicas:• Por ser células tetraploides no podrían ser utilizadas con fines
terapéuticos• Para hacerlas terapéuticamente útiles habría que desarrollar un
método para convertir la célula tetraploide en diploide
B.M. Kuehn. JAMA; 1475-1476, 2005
• Actualmente es posible una eliminación selectiva de algunos cromosomas derivados de las células madre embrionarias pero parece difícil generar células diploides reprogramadas por este mecanismo debido al riesgo de producir inestabilidad genómica
• Por la baja eficiencia del proceso de fusión ha sido difícil estudiar los mecanismos responsables de la reprogramación de la célula somática
H. Matsumura y col. Nature Methods 4; 23-25, 2007
R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567- 582, 2008
74
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A
PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES
75
EMBRIONES ANEUPLOIDES
PARTENOTES
ANDROGENOTES
PSEUDOEMBRIONES
76
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES
De embriones aneuploides se pueden obtener células madre de tipo embrionario
normalesE. Suss-Toby y col. Human Reproduction 19; 670 – 675, 2004
77
• Se consigue generar blastocistos a partir de partenotes humanos
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PARTENOTES
• Los partenotes se producen por activación de ovocitos sin el material cromosómico procedente de los espermatozoides
• De ellos se pueden obtener células madre embrionarias que podrían tener un hipotético papel terapéutico
Editorial. Cloning and Stem Cells 9; 291, 2007
JB Cibelli y col. Journal of Regenerative Medicine 2; 25-31, 2001
78
fg
fg
Parthenote (only maternal genome)
(in mice) can develop only till day 12,
exhibiting heart beating and blood
circulation
Androgenote(only paternal genome)
Can implant, but produces a
hydatiform mole without proper
embryo
Tomado de: A. Suárez, M. Lang y J. Huarte(www.embryoperson.org) Febrero 2006
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE
A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES
79
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A
PARTIR DE CÉLULAS GERMINALES
80
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR
DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES
Se confirma la pluripotencialidad y plasticidad de las células germinales masculinas inmaduras obtenidas de ratones adultos. Se han denominado
células madre germinales multipotenciales adultas o células
maGSCs
Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006
81
Neuronal differentiation of maGSCs
Striated muscleNeural tissueCartilage
Epithelial cell/hepatocyte differentiation
Intestine tissue
OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE DIFERENTES TEJIDOS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES
a-c: células neurales g-i: teratomasd-f: células epiteliales hepáticas j-l: células epiteliales intestinales
Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006
82
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR
DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES
A partir del estroma testicular se pueden obtener células progenitoras de las
espermatogonias (SPCs) y de las SPCs se pueden derivar células madre adultas
multipotentes (MACs)A partir de las células MACs obtienen células cardíacas contráctiles y trasplantándolas a un animal vivo, vasos sanguíneos funcionantes
M. Seandel y col. Nature 449; 346 – 350, 2007
83
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A
LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS
NO ACTIVADOS
84
OVOCITO NO ACTIVADO
BLASTOCISTO
CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS
HUMANAS
CÉLULAS DE DIVERSOS TEJIDOS
ACTIVACIÓN (PARTÉNOGÉNESIS)
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIAS A PARTIR
DE OVOCITOS NO ACTIVADOS
E. Revazova y col. Cloning and Stem Cells 9; 432-450, 2007
85
Esta técnica también ha sido utilizada en ratonas evitando
el rechazo inmunológico
K. Kim. Science 315; 482-486, 2007
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES
A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS
86
LIMITACIONES
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIASA PARTIR
DE OVOCITOS NO ACTIVADOS
Se requiere utilizar un gran número de ovocitos humanos
Sólo podría utilizarse para tratar a mujeres
87
Para evitar el uso de ovocitos se podrían utilizar ovocitos creados in
vitro, lo cual ya se ha logrado a partir de células madre de
embriones de ratón o de células madre de piel de fetos de cerdo
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIASA PARTIR
DE OVOCITOS NO ACTIVADOS
1
2
1. K Hulner y col Science 300; 1251-1256, 2003
2. P W Dyce y col Nature Cell Biology 8; 384-390, 2006
88
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES
A LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS POR REPROGRAMACIÓN
DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS
89
CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO
PASADO FUTURO
Cultivan por primera vez células madre
embrionarias humanas
Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación
de células adultas. Nacen las células iPS
Shinya Yamanaka 2006
James Thomson 1998 2007
Obtienen células iPS humanas
90
Célula adulta
Célula pluripotente Células de todo
tipo de tejidos
REPROGRAMACIÓN
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS
Célula totipotente Embrión
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
POR REPROGRAMACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS
91
CÉLULAS ADULTAS
CÉLULAS SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS
(CÉLULAS iPS)
CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS
Genes codificadores de proteínas de transcripción
Proteínas de transcripción
Genes reprogramadores
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES
K. Takahashi y S. Yamanaka.
Cell 126; 652-655, 2006
92
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS A UN ESTADO PLURIPOTENTE
Célula somática
Oct4 Sox2 c-Myc Klf4
Proceso de reprogramación
Reprogramada
parcialmente Reprogramada
totalmente
Célula pluripotente
Fbx15 NanogOct4
No expresan Oct4 y Nanog endógenos
No generan chimeras
Producen teratomas
Expresan Oct4 y Nanog endógenos
Modificado de: R. Jaenisch y R. Young Cell
132; 567-582, 2008
93
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES
K. Okita y col. Nature 448; 313-317, 2007
Estos resultados fueron ampliados y confirmados en un trabajo posterior del
mismo grupo. Además, si las células iPS se inyectaban en blastocistos murinos se consiguían quimeras
adultas de ratones que eran capaces de transmitir sus características
genéticas a la siguiente generación
94
Confirman las experiencias realizadas en animales por Takahashi y Yamanaka
M. Wernig y col. Nature; 318-324, 2007
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES
Confirman las anteriores experiencias y además consiguen producir quimeras que si son inyectadas en blastocistos murinos pueden generar embriones
vivosN. Maherali y col. Cell Stem Cell 1; 55-70, 2007
95
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
Pero el paso de las experiencias animales a humanos no parecía fácil
Así, Janet Rossant se preguntaba el pasado mes de julio:
“¿Serán eficientes los mismos mágicos factores moleculares para generar células iPS humanas?
Diversos grupos están intentándolo, pero trasladar estas pruebas a humanos tiene muchas dificultades”
J. Rossant. Nature 448; 260-262, 2007
96
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
EXPERIENCIAS DE LOS GRUPOS DE SHINYA YAMANAKA Y JAMES
THOMSON
97
CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO
PASADO FUTURO
Cultivan por primera vez células madre
embrionarias humanas
Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación
de células adultas. Nacen las células iPS
Shinya Yamanaka 2006
James Thomson 1998 2007
Obtienen células iPS humanas
98
CÉLULAS DE PIEL HUMANA
CÉLULAS iPS
GENES REPROGRAMADORES
CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
J. Yu y col. (grupo Thomson).
Science 318; 1917-1920, 2007
K. Takahashi y col. (grupo Yamanaka).
Cell 131; 861-872, 2007
99
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
Takahashi y col. (grupo Yamanaka):Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, c-Myc y Klf4Medio para transferirlos: retrovirusFuente de células adultas: prepucio de recién nacido
Yu y col. (grupo Thomson): Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, Lin 28 y NanongMedio para transferirlos: lentivirusFuente de células adultas: fibroblastos fetales y neonatales
100
Las células iPS generadas muestran expresión genética y modelos de metilación muy parecidos a los de las células madre embrionarias, crecen internamente mientras expresan telomerasa, tienen un cariotipo normal y forman teratomas si se trasplantan a ratones inmunosuprimidos
Ch.E. Murry y G. Keller. Cell 132; 661-680, 2008
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
101
I-H. Park y col. (grupo de G.Q. Daley) Derivan células iPS de células adultas, especialmente fibroblastos de fetos neonatos y sujetos adultos, utilizando los
cuatro mismo genes reprogramadores. Comprueban que los factores de reprogramación
fundamentales son el Oct-4 y el Sox2. Las células iPS se asemejan a las embrionarias
humanas en morfología y expresión genética y tienen la capacidad de producir teratomas en
ratones inmunodeficientes
CONFIRMACIÓN DE LAS EXPERIENCIAS DE YAMANAKA Y THOMSON
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
I-H. Park. Nature 451; 141-146, 2008
102
Consiguen generar células iPS a partir de fibroblastos de piel
humana que pueden diferenciarse a todo tipo de tejidos, lo que avala
su pluripotencialidad
WE Lowry y col. PNAS 105; 2883-2888, 2008
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS
103
UTILIDAD EXPERIMENTAL DE LAS CÉLULAS iPS
Las células iPS podrían suplir mucha de la información que ahora
proporcionan las células madre embrionarias en investigación y en
medicina
MF Pera Nature 451; 135-136, 2008
104
El grupo de Yamanaka demuestra que las células iPS pueden ser
directamente derivadas a cardiomiocitos y células
neuronales
UTILIDAD EXPERIMENTAL
K. Takahashi y col.
Cell 131; 861 – 872, 2007
105
CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS
Estos ratones tienen tres progenitores biológicos: el macho que aporte el
esperma y la hembra que da el óvulo para la generación del embrión de ratón por fecundación in vitro y el
tercer ratón del que se extrae la célula de piel con que se generaran las
células iPS
S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology
106
.
.
.
Reprogramar
Fibroblasto Células iPS
Clon parcial
Clon completoCélula iPS Embrión de ratón
Fusión
CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS
S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology
107
Consiguen mejorar los síntomas clínicos de ratones con anemia falciforme
utilizando células iPSLos tres animales que las recibieron
sobrevivieron más de 20 semanas, mientras los que no, murieron antes de
la séptima semana
EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS
iPS
J. Hanna y col. Science 318; 1920 – 1923, 2007
108
• Demuestran que células iPS se pueden diferenciar en células madre precursoras neurales que en cultivo puede generar células neurales o de glia
• Si las células generadas se transfieren al cerebro de fetos de ratones, migran a distintas regiones y se diferencian en glia y neuronas
• También las células iPS se diferencian a neuronas dopaminérgicas
• Cuando las neuronas dopaminérgicas se transplantan a cerebro de ratas con Parkinson se consigue mejorar sus síntomas clínicos
• Estos resultados demuestran el potencial terapéutico de células iPS procedentes de fibroblastos para el reemplazo de células neuronales patológicas en un modelo animal
M Wernig y col PNAS 105; 5856-5861, 2008 (publicado 15-IV-2008)
EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS
109
OTRAS APLICACIONES DE LAS CÉLULAS iPS
• Las células iPS pueden ser el más práctico y eficiente camino para
producir grandes bancos de células humanas pluripotentes de los
haplotipos deseados • Esto evitaría el uso y destrucción de
miles de embriones
MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008
110
VENTAJAS ÉTICAS
NO SE REQUIERE LA DESTRUCCIÓN DE
EMBRIONES HUMANOS
111
RAZONES DE YAMANAKA PARA SUS INVESTIGACIONES
• “Cuando vi el embrión, rápidamente me di cuenta de que no había diferencia entre él y mis hijas”
• “Pensé que no podemos permitirnos destruir embriones para nuestras investigaciones”
• “Tiene que haber otro camino”
M Fackler “The New York Times” 11-XI-2007
112
VENTAJAS TÉCNICAS
• No inducen rechazo inmunológico Lo que abre la posibilidad de crear fármacos específicos para un paciente determinado
• No requiere la utilización de ovocitos humanos
• Facilidad técnica
• Coste reducido
113
INCONVENIENTES TÉCNICOS
• Posibilidad de transmisión de enfermedades virales
• Posibilidad, aunque menor, de producir tumores
• Posibles problemas genéticos debido a la introducción del ADN de los genes reprogramadores
114
OTROS INCONVENIENTES TÉCNICOS
Los actuales protocolos para generar células iPS tienen el peligro de facilitar una integración genómica aleatoria y el riesgo de ocasionar mutagénesis
Además, aunque los genes reprogramadores son generalmente silenciados después de la reprogramación, la activación epigenética del Oct-4 y Sox2 podría inducir efectos no deseados en las células iPS transferidas
MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008
115
Técnicos:• Sustituir los vectores virales• Sustituir el oncogén c-MycBiológicos:• Conocer mejor los mecanismos de la
reprogramación celular, especialmente si es debida a modificaciones epigenéticas o a modificaciones genéticas todavía no identificadas
PROBLEMAS A RESOLVER
J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007
116
• Un aspecto crucial es establecer qué genes son suficientes y necesarios para la reprogramación y son requeridos para inducir la proliferación de las células generadas
• Parece ser que los genes Oct-4 y Sox2 son los necesarios para la reprogramación
MF Pera Nature 451; 135-136, 2008
PROBLEMAS A RESOLVER
117
El mismo grupo de Yamanaka, en el reducido tiempo de tres meses
consigue reprogramar hepatocitos y células de epitelio de mucosa gástrica sin utilizar el c-Myc, tanto en humanos como en ratones, sin que se generaran
tumores
PROBLEMAS RESUELTOS
N. Nakagama y col. Nature Biothecnology 26; 101-106, 2008
118
También comprueban que al reprogramar células de estómago e
hígado murinas, utilizando retrovirus, estos no penetran en la célula adulta a reprogramar y por
tanto no alteran su genoma
PROBLEMAS RESUELTOS
T. Aoki y col. Science: DOI 10.1126 / science 1154884 (14 – 2 – 2008)
119
A la vista de las anteriores experiencias J. Cibelli se preguna:
“¿Será la clonación humana con fines terapéuticos necesaria?”
“La respuesta inmediata es no. Es cuestión de tiempo el que todas las
hipotéticas ventajas de la clonación terapéutica puedan
mejorarse utilizando células iPS”
J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007
120
¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS?
• Sería un importante error llegar a la conclusión de que la obtención de las células iPS evita la necesidad de usar células madre embrionarias
• D Melton: Es prematuro afirmar esto• GQ Daley: En el momento actual no estamos seguros de que
las células iPS sean absolutamente equivalentes a las células madre embrionarias
• K Egan: Para estar seguro de la utilidad de las células iPS se necesita hacer un gran número de experiencias con células iPS de diferentes individuos y compararlos con células madre embrionarias
C Holden y G Vogel Science319; 560-563, 2008
I Hyun y col. Cell Stem Cell 1; 367-368, 2007
121
La investigación con células iPS debería continuar junto con la
investigación con células madre embrionarias
I-Hyun Park. Hastings Center Report 38; 20-22, 2008
¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS?
BM Kuehn JAMA 299; 26, 2008
122
Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las
células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como
terapéuticos
¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS?
123
CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS
CÉLULAS iPS
Es este un gran avance experimental, que hay que saludar como una gran esperanza para encontrar caminos
éticos que permitan el desarrollo que la medicina reparadora y regenerativa
requiere
124
Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las
células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como
terapéuticos
¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE
EMBRIONARIAS?
125
Por ello, Ian Wilmut el creador de la oveja Dolly, manifiesta que abandona la clonación para utilizar
las células iPS
Y el propio James Thomson comentaba (Gina Kolata. The New York Times, 22/11/2007) que probablemente “dentro de una década la guerra de las células madre embrionarias será solo una nota al pie de una página
curiosa de la historia de la ciencia”
CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS
CÉLULAS iPS
R Highfield Daily Telegraph (http://www.telegraph.co.uk) 16-XI-2007
126