REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
SÍNTESIS DE NANOPLATAFORMAS MAGNÉTICAS MULTIFUNCIONALES
PARA SU USO EN BIOMEDICINA
Mendoza Reséndez Raquel Dra1, Luna Criado Carlos Dr1
1Facultad de Ingeniería Mecánica y Eléctrica, Universidad Autónoma de Nuevo León, 2Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas, Universidad Autónoma de Nuevo León Email: [email protected], [email protected]
Introducción:
Uno de los retos más importantes de la investigación científica en el área médica es el de introducir
nuevas tecnologías que permitan realizar diagnósticos más precisos y diseñar nuevas terapias más
eficaces con efectos secundarios minimizados. A este respecto, la nanotecnología ofrece nuevas
posibilidades de resolución de algunos problemas clínicos difíciles de afrontar con los
procedimientos convencionales. En concreto, el uso de partículas nanométricas en el campo de la
biomedicina, tanto en aplicaciones in vivo como in vitro, presenta un enorme potencial debido al
reducido tamaño de estos sistemas (inferior al de los virus, bacterias y células) y a sus propiedades
únicas, considerablemente distintas a las de sus análogos macroscópicos.
Cuando están estabilizadas con ciertos ligandos, las nanopartículas exhiben una gran resistencia a la
actividad del sistema fagocítico mononuclear (SFM) pudiendo circular por el torrente sanguíneo
durante largos períodos de tiempo y superar algunas de las barreras biológicas como la barrera
hematoencefálica, las cuales dificultan la labor terapéutica y retrasan dramáticamente el
diagnóstico de enfermedades tan graves como el cáncer de cerebro1. Esta propiedad junto a su alta
relación superficie/volumen hacen que estos materiales nanoscópicos puedan emplearse
eficazmente como plataformas depositando en su superficie iones o moléculas que puedan
interactuar selectivamente con patógenos (virus, bacterias, células cancerosas, etc.) por medio de
interacciones ligando-receptor o anticuerpo-antígeno. En este aspecto, las nanopartículas que
presentan un comportamiento superparamagnético a temperatura ambiente son especialmente
interesantes debido a que es fácil dispersarlas en una solución coloidal y a que exhiben una alta
direccionalidad ante la presencia de un campo magnético distante. De este modo, se pueden
emplear estas partículas como vectores de transporte de agentes terapéuticos (medicamentos,
drogas, agentes radiactivos y genes) guiados magnéticamente a una zona en cuestión2. Por otra
parte, además de poder realizar un suministro localizado de fármacos, este tipo de nanopartículas
pueden desempeñar otras funciones después de alcanzar un tejido u órgano dañado. Por ejemplo,
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
gracias a su carácter superparamagnético, estas nanopartículas son excelentes agentes de contraste
de resonancia magnética nuclear3 (estándar y funcional) debido, principalmente, a la relajación
transversal de su momento magnético (decaimiento T2). De este modo, el principio activo de
algunos medios de contraste que se comercializan actualmente para uso diagnóstico son
nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (por ej. Endorem®). Asimismo, en estudios
experimentales recientes4 se han empleado nanopartículas superparamagnéticas como diminutos
centros de irradiación de calor (42-56°C) para destruir selectivamente células cancerígenas sin
dañar a los tejidos sanos adyacentes. Estos tratamientos térmicos localizados se basan en que las
nanopartículas superparamagnéticas disipan energía en forma de calor cuando se encuentran en el
seno de un campo magnético alterno (típicamente con amplitudes de 1 a 50 kA/m y frecuencias de
1 kHz a 1MHz) por medio de la rotación de su momento magnético (relajación de Néel) y la
rotación de las partículas producida por el torque ejercido por el campo aplicado (relajación
browniana)3. Otras tendencias en la aplicación biotecnológica de nanopartículas con
comportamientos superparamagnéticos y ferromagnéticos incluyen el diseño de nuevos protocolos
de análisis clínicos más rápidos y fiables que los ya existentes. Éstos se basan en el reconocimiento,
captura y separación magnética de patógenos y sustancias nocivas en medios líquidos como el
agua, la orina y la sangre5.
En todas (o casi todas) estas aplicaciones es crucial que los materiales empleados sean muy
uniformes dado que sus propiedades físicas y bioquímicas son, en general, muy sensibles al
tamaño, forma, estructura y composición del sistema. Asimismo, es decisivo el control de la
naturaleza de su superficie, la cual va a determinar, junto a otros factores, la estabilidad y
movilidad de las partículas en el medio en el que se encuentren (en una muestra de orina,
circulando en el torrente sanguíneo, etc.). Por estos motivos, resulta esencial desarrollar y mejorar
nuevas técnicas de preparación de nanopartículas monodispersas con propiedades adaptables a los
requerimientos específicos de las aplicaciones biomédicas. A este respecto, es importante destacar
que el disponer de partículas con formas alargadas amplía considerablemente las posibilidades de
explotación tecnológica de las nanopartículas dado que, usualmente, una forma anisotrópica
implica un cambio significativo en las propiedades químicas, térmicas, ópticas, magnéticas y
eléctricas del material según la dirección del agente que produzca el efecto estudiado (por ej. un
campo eléctrico o magnético). Sin embargo, la mayoría de las técnicas de preparación de partículas
conllevan un control muy limitado en la forma de las mismas.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
En la contribución presente se analizan las posibilidades que nos ofrecen algunas estrategias de
síntesis química en la producción de nanopartículas con tamaños y formas controlables.
Objetivo:
Analizar algunas rutas de síntesis que permitan la producción de nanopartículas magnéticas con
propiedades que puedan ajustarse flexiblemente a las necesidades requeridas para su uso como
nanoplataformas multifuncionales en el área biomédica.
Materiales y Métodos:
Preparación de las muestras.- En este trabajo hemos empleado varios métodos para preparar
sistemas de partículas con características estructurales, morfológicas y magnéticas diferentes:
1) Se prepararon nanocristales coloidales uniformes de FePt, con formas casi esféricas, mediante la
descomposición térmica de hierro pentacarbonilo, Fe(CO)5, y la reducción de una sal de platino en
presencia de surfactantes estabilizadores (oleilamina y ácido oleico) siguiendo el método descrito
por Sun y colaboradores6. En estos experimentos se mezclaron acetilacetonato de platino (0.5
mmol) y 1,2-hexadecanediol (1.5 mmol) en una solución de dioctiléter (20 ml). Esta solución fue
agitada mecánicamente y calentada a 100°C en presencia de un flujo de nitrógeno. A esta
temperatura, se le añadió ácido oleico (0.5 mmol) y oleilamina (0.5 mmol), los cuales actúan como
agentes estabilizadores proporcionando una barrera estérica a las partículas. Seguidamente, se
inyectó dentro de la solución una concentración variable de hierro pentacarbonilo (0.77-7.70
mmol). Después, la solución resultante se calentó hasta alcanzar su temperatura de ebullición
(∼300ºC) a reflujo en una atmósfera de nitrógeno aplicando una tasa de calentamiento de 5 ºC/min.
Dicha temperatura se mantuvo durante 30 minutos. Transcurrido este periodo de tiempo, se dejó
enfriar el medio de reacción hasta alcanzar la temperatura ambiente manteniendo la agitación y el
flujo de nitrógeno. Posteriormente, se removió la atmósfera inerte y se añadieron 40 ml de etanol a
la dispersión obtenida. Las partículas se recuperaron en forma de polvo fino tras centrifugar la
dispersión resultante y haber despreciado el material no precipitado. La purificación de la muestra
se realizó mediante la dispersión de las partículas en hexano y su separación por centrifugación tras
añadir etanol. Finalmente, el polvo obtenido se dispersó en hexano obteniendo una suspensión
coloidal estable.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
2) Para obtener partículas con propiedades cristaloquímicas controlables y formas alargadas,
primeramente se prepararon nanoelipsoides aplanados monodispersos de hematites (α-Fe2O3)
mediante la hidrólisis asistida de una sal de hierro siguiendo el método descrito por Ocaña y
colaboradores7. El procedimiento consistió en disolver 0.1 M de perclorato de hierro (III),
Fe(ClO4)3⋅9H2O, 0.1 M de urea y una concentración entre 3.5 y 5.5 mmol·dm-3 de fosfato sódico
dihidrogenado, NaH2PO4, en 1l de agua bidestilada. Esta disolución se colocó en tubos cerrados de
vidrio Pyrex®, de 25 ml de capacidad aproximadamente, y fueron introducidos en una estufa a
100ºC por un período de 48 h. Después, se separó el precipitado de la solución madre por
centrifugación y se lavó varias veces con soluciones concentradas de NaOH (7.5M) y con agua
bidestilada. Finalmente, el polvo se secó a 50°C.
3) Para modificar las propiedades cristaloquímicas y magnéticas de los nanoelipsoides, éstos fueron
sometidos a tratamientos térmicos en atmósferas de hidrógeno en una línea de reducción8. Para
obtener nanoelipsoides de magnetita, las muestras de hematites se calentaron a 360°C durante 3
horas en una atmósfera estática de H2. Por otra parte, para obtener partículas alargadas de hierro,
las partículas de hematites precursoras fueron reducidas a su estado metálico calentándolas a 400°C
durante 4 horas en presencia de un flujo constante de H2. Después de este proceso se dejaron enfriar
hasta alcanzar la temperatura ambiente. Finalmente, la superficie de las partículas de hierro
resultantes fue pasivada para proteger a las partículas de una oxidación completa una vez que
entren en contacto con el aire. Para ello, se indujo una oxidación superficial en estas muestras
metálicas introduciendo en el sistema un flujo de N2/etanol por un período de 30 min.
Técnicas de caracterización.- Las propiedades morfológicas, cristaloquímicas y magnéticas de las
muestras obtenidas fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de transmisión (MET),
difracción de rayos X (DRX) y magnetometría de muestra vibrante y SQUID, respectivamente. La
composición química de los nanocristales ricos en hierro fue analizada mediante absorción atómica.
Resultados:
Nanocristales superparamagnéticos de FePt.- Se prepararon nanopartículas superparamagnéticas
muy uniformes, con formas casi esféricas, ricas en hierro y con tamaños controlables mediante el
método descrito por Sun y colaboradores6 (ver sección Materiales y Métodos). En los experimentos
realizados encontramos que, fijando la concentración de acetilacetonato de platino, el aumento de
la concentración del Fe(CO)5 inyectado al medio de reacción conlleva un aumento en el contenido
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
de Fe en las partículas finales y la reducción de su tamaño, ver figura 1. Las causas de esta
dependencia entre composición y tamaño de partícula no están claras debido a que no se sabe con
certeza cuáles son los procesos complejos responsables de la formación de las partículas por este
método. Los autores de otros trabajos9,10 sugieren que el mecanismo de formación de estas
partículas se inicia con la generación de núcleos ricos en platino. Después, el crecimiento de las
partículas ocurriría principalmente mediante la deposición de hierro en la superficie de los núcleos
ya formados. Seguidamente, cuando el medio de reacción se calienta hasta alcanzar su temperatura
de ebullición, desaparecería el gradiente de composición presente en cada partícula debido a un
proceso de difusión atómica. Este último paso es consistente con los patrones de DRX de las
muestras sintetizadas en este trabajo, ver fig.2, dado que no corresponden a fases separadas de Fe y
Pt, sino que se pueden relacionar con una estructura cúbica centrada en las caras de una aleación de
FePt químicamente desordenada. Adicionalmente, el tamaño promedio del cristal estimado a partir
de la reflexión (111) aplicando la fórmula de Scherrer coincidió con el tamaño de partícula
obtenido mediante análisis estadísticos de las imágenes de MET. Este resultado sugiere que cada
partícula de FePt es un monocristal de tamaño nanométrico. Finalmente, resulta esencial la
adsorción del ácido oleico y la oleilamina presentes en el medio de reacción. Estos ligandos
estabilizadores reducen la alta tensión superficial de las nanopartículas y las provee de una barrera
estérica hidrófoba que las separa entre sí, permitiendo la formación de partículas con dimensiones
de pocos nanómetros.
Fig. 1 Imágenes MET de nanocristales de a) Fe45Pt55, b) Fe55Pt45 y c) Fe75Pt25 sintetizados
inyectando al medio de reacción 0.77, 2.00 y 7.70 mmoles de Fe(CO)5.
Es importante destacar que, si no se tienen en cuenta algunos procesos, la disminución del tamaño
de partícula con el aumento de Fe(CO)5 inyectado podría parecer disonante con la hipótesis de una
nucleación de platino. De hecho, esta dependencia podría explicarse si una parte importante del
Fe(CO)5 inyectado se descompone antes de la reducción de la sal de platino, produciendo núcleos
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
de hierro. En estas circunstancias, un aumento de la concentración de Fe(CO)5 inyectado al medio
de reacción debería generar un número más grande de núcleos, y por lo tanto, fijando la
concentración de la sal de Pt a una dada, se esperaría una disminución en el tamaño de los
nanocristales generados de FePt. Sin embargo existen otras dependencias complejas que deberían
tenerse en consideración. Por ejemplo, varios estudios han demostrado que la variación de la
relación de concentraciones [agentes surfactantes]/[precursores metálicos] puede influir
significativamente en los tamaños finales de las nanopartículas ya que algunos surfactantes como el
ácido oleico forman complejos con las especies metálicas precursoras en solución, retrasando el
proceso de la nucleación11. Por otra parte, dada la gran diferencia entre las densidades del Fe y el
Pt, cabría esperar que la difusión atómica producida en una partícula con un corazón de platino
cubierto por una capa de hierro conlleve una ligera disminución del volumen de la partícula. Por
tanto, se necesitan más estudios para esclarecer cuáles son los procesos involucrados en la
formación de estas partículas y cuáles son sus dependencias.
Todas las muestras de FePt analizadas exhibieron un comportamiento superparamagnético a
temperatura ambiente con una respuesta ante un campo externo modulable con la variación del
contenido de hierro en las partículas y su tamaño (ver figura 3).
Fig. 2 Patrones de DRX de nanocristales de a)
Fe55Pt45 (2.67±0.26 nm) y b) Fe75Pt25
(1.79±0.34 nm).
Fig. 3 Dependencia de la magnetización de
las muestras de FePt con un campo magnético
aplicado. Las muestras, en forma de polvo
compactado, se midieron a temperatura
ambiente.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
Nanoelipsoides magnéticos.- Con la intención de preparar nanopartículas magnéticas con formas
anisotrópicas, se prepararon primeramente partículas alargadas de hematites mediante la hidrólisis
asistida de una sal de hierro en presencia de iones fosfato y urea (ver sección Materiales y
Métodos). Las imágenes MET obtenidas con altos aumentos revelaron que cada partícula está
formada por cientos de nanocristales ordenados espontáneamente para formar un agregado con
forma elipsoidal aplanada (ver figura 4.a). La forma alargada de estos agregados se modificó
controladamente variando la concentración de iones fosfato en el medio de reacción (ver tabla 1).
Esto es debido a que los cristales de hematites tienden a adsorber estos iones en las caras
superficiales paralelas al eje cristalográfico c. Esta adsorción selectiva introduce interacciones
anisotrópicas adicionales al sistema que entran en competición con otras interacciones (magnéticas,
de van der Wals, etc.). El balance de estas interacciones promueve la auto-organización de los
nanocristales en superestructuras alargadas con propiedades similares a las de un monocristal7.
Para poder modular las propiedades cristaloquímicas y magnéticas de los nanoelipsoides, los
agregados elipsoidales de hematites fueron tratados térmicamente en atmósferas de hidrógeno tal
como se describió en la sección Materiales y Métodos. Los estudios de MET de las muestras
tratadas indicaron que la uniformidad y la relación axial del sistema no experimentaron un cambio
significativo (ver figuras 4b y 4c), sin embargo los patrones de difracción de rayos X mostraron que
estos tratamientos permiten modificar controladamente las propiedades cristaloquímicas de los
nanoelipsoides (figura 5). Adicionalmente, el comportamiento magnético de estos materiales varió
significativamente acorde a las transformaciones inducidas (figura 6).
50 nm
a b c
Fig. 4 Imágenes MET de nanoelipsoides aplanados de a) hematites, b) magnetita y c) hierro.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
Tabla 1 Relación entre la concentración de NaH2PO4 empleada en la síntesis de las muestras
de hematites y las características morfológicas de estas partículas determinadas mediante
análisis estadísticos de las imágenes MET.
Dimensiones promedio de las partículas Muestra
[NaH2PO4]
(mmol·dm-3) Longitud (nm) Ancho (nm) Relación axial
1 3.5 177±35 67±9 ∼2.65
2 4.5 243±20 54±5 ∼4.50
3 5.5 315±24 46±5 ∼6.85
Fig. 5 Patrones de DRX de nanoelipsoides
con relación axial 5 antes (hematites) y
después (magnetita y hierro) de tratarlos
térmicamente en atmósferas reductoras.
Fig. 6 Dependencia de la magnetización de
nanoelipsoides con relación axial 5 y
propiedades cristaloquímicas diferentes con la
variación de un campo magnético aplicado.
Las muestras se midieron a temperatura
ambiente en forma de polvo compactado.
Discusión y Conclusiones:
La multifuncionalidad sin precedentes de las partículas nanométricas en las áreas de la biomedicina
y la biotecnología ha suscitado un entusiasmo generalizado en la comunidad científica. Sin
embargo, para poder evaluar el potencial real del uso de estos sistemas en alguna aplicación
específica es necesario diseñar técnicas de preparación que nos permitan preparar materiales
nanoscópicos uniformes con propiedades ajustables a los requerimientos de dicha aplicación.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
Los métodos de preparación estudiados en el presente trabajo resultan apropiados para sintetizar
nanopartículas uniformes biocompatibles con propiedades morfológicas y magnéticas ajustables a
las necesidades requeridas en su uso científico y tecnológico. Dado su reducido tamaño y su posible
funcionalización con la adsorción de diferentes capas de ligandos, estos materiales podrían
emplearse como nanoplataformas magnéticas en diversas aplicaciones biomédicas. De este modo, a
los nanoelipsoides se les puede adherir directamente fármacos hidrófilos, mientras que a las
nanoplataformas estabilizadas con ácido oleico y oleilamina se les pueden adherir agentes
terapéuticos hidrófobos. Por otro lado, para poder dispersar a estas últimas en medios acuosos y/o
adherirlas ligandos hidrófilos, deben someterse a recubrimientos adicionales con copolímeros en
bloque que dispongan de cadenas hidrófobas e hidrófilas, tales como pluronic®. Asimismo,
después de la síntesis de las nanopartículas, el ácido oleico y la oleilamina pueden reemplazarse por
medicamentos o drogas tales como glicopéptidos de acción bactericida como la vancomicina5, la
cuál es sumamente efectiva contra bacterias Gram positivas.
Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por la Universidad Autónoma de Nuevo León mediante el
Programa de Apoyo a la Investigación Científica y Tecnológica (PAICYT) con la subvención del
proyecto CA1498-07.
Bibliografía: 1. Lee Koo Y.-E., Reddy G. R., Bhojani M., Schneider R., Philbert M. A., Rehemtulla A., Ross B.
D., Kopelman R. Brain cancer diagnosis and therapy with nanoplatforms. Advanced Drug
Delivery Reviews 2006;58:1556-1577
2. Zhou J., Leuschner C., Kumar C., Hormes J., Soboyejo W. O. A TEM study of functionalized
magnetic nanoparticles targeting breast cáncer cells. Materials Science and Engineering C
2006;26:1451-1455.
3. Mornet S., Vasseur S., Grasset F., Duguet E. Magnetic nanoparticle design for medical
diagnosis and therapy. J. Mater. Chem. 2004;14:2161-2175.
4. Hilger I., Andrä W., Hergt R., Hiergeist R., Schubert H., Kaiser W. A. Electromagnetic heating
of breast tumors in interventional radiology: in vitro and in vivo studies in human cadavers and
mice. Radiology 2001;218:570-575.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
5. Gu H., Ho P.-L., Tsang K. W. T., Wang L., Xu B. Using biofunctional magnetic nanoparticles to
capture vancomycin-resistant enterococci and other gran-positive bacteria at ultralow
concentration. J. Am. Chm. Soc. 2003;125:15702-15703.
6. Sun S., Murray C. B., Weller D., Folks L., Moser A. Monodispersed FePt nanoparticles and
ferromagnetic FePt nanocrystal superlattices. Science 2000;287:1989-1992.
7. Ocaña M., Morales M. P., Serna, C. Homogeneous Precipitation of Uniform α-Fe2O3 Particles
from Iron Salts Solutions in the Presence of Urea. J. Colloid Interface Sci. 1999; 212:317-323.
8. Mendoza-Reséndez R., Morales M. P., Serna C. J. Materials Science and Engineering C
2003;23:1139-1142.
9. Chen M., Liu J. P., Sun S. J. Am. Chm. Soc.2004;126:8394-8395.
10. Bagaria H. G., Johnson D.T., Srivastava C., Thompson, G. B., Shasuzzoha M., Nikles D. E.
Formation of FePt nanoparticles by organometallic synthesis. J. Appl. Phys. 2007;101:104313.
11. Luna C., Mendoza-Reséndez R. Formación de partículas nanométricas en soluciones
sobresaturadas. CIENCIA UANL (aceptado).
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
COMPORTAMIENTO DEL SEGMENTO N-TERMINAL DE LA PROTEÍNA SP-C DEL SURFACTANTE PULMONAR EN PELÍCULAS FOSFOLIPÍDICAS INTERFACIALES
González-Horta, Azucena1 y Pérez-Gil, Jesús2 1Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León 2Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid Introducción: El surfactante pulmonar es una compleja mezcla lipoproteica esencial para facilitar el trabajo respiratorio. Es sintetizada por los neumocitos tipo II y secretada en la interfase aire-líquido donde el surfactante reduce la tensión superficial previniendo el colapso alveolar1. El principal componente del surfactante es la dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) que representa cerca de un 40% del peso total2,3 siendo el responsable de las propiedades tensioactivas de este material4. El surfactante cuenta además con cuatro proteínas específicas: SP-A y SP-D proteína hidrofílicas implicadas en el sistema de defensa innata del epitelio pulmonar5,6 y SP-B y SP-C proteínas hidrofóbicas que interaccionan fuertemente con los lípidos y promueven la formación y el adecuado comportamiento dinámico de la película tensioactiva en la interfase aire-líquido7. La proteína SP-C, es un péptido de 35 aminoácidos que contiene una α-hélice transmembrana y un segmento N-terminal catiónico con dos cisteínas palmitoiladas. La mayor parte de las funciones atribuidas a la SP-C en el surfactante están relacionadas con el establecimiento de interacciones bicapa-monocapa que facilitan la transferencia de material tensioactivo durante la dinámica respiratoria, ya sea promoviendo la adsorción interfacial de fosfolípidos y estabilizando la monocapa durante los ciclos dinámicos de compresión-expansión o bien participando en la formación del reservorio superficial de material tensioactivo a partir del cual se restituyen las moléculas de surfactante de la película interfacial durante los sucesivos ciclos respiratorios8,9. Objetivo: Se sintetizaron dos péptidos con la secuencia correspondiente al segmento N-terminal de la SP-C, uno con las cisteínas libres y otro con las cisteínas palmitoiladas para caracterizar el modo y la extensión de la interacción de los péptidos con monocapas fosfolipídicas modelo con especial énfasis en el análisis del efecto de la palmitoilación de este segmento en la estructura y dinámica interfacial. Materiales y Métodos: La actividad interfacial de los péptidos se evaluó mediante cinéticas de adsorción, isotermas de compresión y organización interfacial de películas lipopeptídicas, empleando para ello una balanza de superficies de tipo Langmuir-Wilhelmy y monitorizando los cambios de presión superficial tras inyectar pequeños volúmenes de cada uno de los péptidos en solución metanólica. La subfase
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
estaba formada por tampón Tris 5mM NaCl 150mM pH 7.0 en agua bidestilada termostatizado a 25ºC. Resultados: La capacidad de una suspensión acuosa de surfactante para facilitar la formación de una película tensioactiva interfacial puede medirse de una manera sencilla mediante experimentos de extensión o spreading. La figura 1 muestra cómo cantidades crecientes del péptido con cisteínas libres mejora la capacidad de extensión tanto de DPPC como de la mezcla lipídica DPPC/PG 7:3 (p/p). En ausencia de fosfolípidos cargados negativamente, la presión máxima alcanzada por las suspensiones conteniendo péptido no acilado fue de alrededor de 14mN/m, valor que se incrementó hasta 30mN/m para suspensiones conteniendo cantidades equivalentes de péptido en presencia de PG. Esto sugiere que las interacciones electrostáticas lípido/péptido facilitan el tipo de perturbación que promueve la salida de moléculas lipídicas desde las membranas a la interfase. El péptido palmitoilado presentó un efecto casi nulo en el spreading de las muestras lipídicas, de manera que solo con un 10% (p/p) de péptido en suspensiones de DPPC/PG 7:3 se observó un aumento en la presión superficial hasta 12mN/m, lo que indica diferencias notables en el modo de interacción entre el péptido palmitoilado y el no-acilado.
Figura 1. Cinéticas de adsorción interfacial por spreading a partir de suspensiones acuosas de DPPC o DPPC/PG 7:3 (p/p) en presencia de diferentes porcentajes de péptido palmitoilado o no palmitoilado. Los porcentajes empleados son 0% ()1% (○), 5% (•) o 10% (•) en peso de cada uno de los péptidos.
El efecto de los péptidos en el comportamiento interfacial de las películas lipopeptídicas se analizó mediante isotermas de compresión las cuales en el caso de los péptidos puros, proporcionan información sobre su estructura y disposición interfacial. Dos datos importantes pueden obtenerse de estas gráficas. En primer lugar, el área por residuo a la cual la compresión comienza a inducir un
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
incremento en la presión superficial, da idea de lo que ocupa cada molécula de péptido en la disposición más extendida. Por otra parte, la máxima presión a la que puede comprimirse la película peptídica, indica el grado de estabilidad del péptido en la conformación más comprimida. La figura 2 muestra el comportamiento interfacial de monocapas exclusivamente peptídicas sujetas a compresión. Ambos péptidos, con cisteínas libres o palmitoiladas, tienen la capacidad de formar monocapas estables sobre la superficie acuosa como consecuencia de su carácter anfipático. Puede observarse como en ausencia de la acilación, la secuencia N-terminal de SP-C presenta una disposición interfacial mucho más extendida (21-22 A2/residuo vs 6-7A2/residuo). La monocapa de péptido con cisteínas libres colapsa aproximadamente a 24mN/m, mientras que el péptido palmitoilado puede mantener monocapas a presiones superficiales mayores, en torno a 46mN/m. La isoterma del péptido palmitoilado presenta un “plateau” a alrededor de 30mN/m antes de alcanzar las mayores presiones superficiales lo que indica la expulsión de la interfase de los segmentos peptídicos. La transición interfacial del péptido palmitoilado conduciría a una película en la que, tras la expulsión de la mayor parte de péptido, permanecerían orientadas hacia el aire las cadenas de palmítico, permitiendo todavía alcanzar presiones superficiales de casi 50mN/m. Este resultado confirma el papel de la palmitoilación para estabilizar la asociación de la secuencia N-terminal de la SP-C en la interfase, en estados de elevada compresión.
Figura 2. Isotermas de compresión de monocapas de cada uno de los péptidos formadas en ausencia de lípido.
Para analizar los efectos de esta interacción en el empaquetamiento y organización de las moléculas lipídicas se realizó microscopía de epifluorescencia (figura 3). En las isotermas de compresión de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de cantidades crecientes de cada uno de los péptidos puede observarse como la inclusión de cualquiera de los dos péptidos provoca un ligero pero progresivo desplazamiento de las isotermas hacia mayores áreas con respecto a la isoterma del lípido puro como consecuencia de la inserción de las secuencias peptídicas en la interfase. La inserción del péptido desacilado induce una reducción del tamaño de los dominios a la vez que aumenta su número en todo el rango de presiones analizado. Sin embargo no tiene un efecto importante en el empaquetamiento de las cadenas de acilo ya que no produce cambios significativos en la cantidad total de área condensada (datos no mostrados) lo que sugiere que el
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
péptido interacciona con la monocapa de una manera superficial. El péptido palmitoilado muestra un efecto bifásico, por debajo de ∼18mN/m el péptido no perturba el empaquetamiento lipídico de la monocapa de DPPC como se deduce del tamaño y número de los dominios observados en las imágenes de epifluorescencia. Sin embargo a presiones mayores, el péptido produce una drástica disminución del área total ocupada por fase condensada lo que ocurre posiblemente como consecuencia de la inserción de los palmíticos en las regiones más condensadas de la monocapa una vez que la región peptídico ha sido expulsada de la interfase.
Figura 3. Isotermas de compresión (π-A) de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de diferentes proporciones de los péptidos indicados (% en peso), obtenidas a 25ºC. A derecha e izquierda se muestran imágenes de epifluorescencia de monocapas de DPPC comprimidas hasta las presiones indicadas (mN/m) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de un 10% en peso del péptido con cisteínas libres o del péptido palmitoilado. Cada imagen cubre una distancia de 350µm.
Figura 4. Isotermas de compresión (π-A) de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de diferentes proporciones de los péptidos indicados (% en peso), obtenidas a 25ºC. A derecha e izquierda se muestran imágenes de epifluorescencia de monocapas de DPPC/PG 7:3 (p/p) comprimidas hasta las presiones indicadas (mN/m) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de un 10% en peso del péptido con cisteínas libres o del péptido palmitoilado. Cada imagen cubre una distancia de 350µm.
En las monocapas de DPPC/DPPG (7:3) ambos péptidos producen un aumento en el tamaño de los dominios y reducen su número (figura 4) debido a que el establecimiento de interacciones
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
electrostáticas permiten una mayor condensación favoreciendo la nucleación de regiones condensadas lo que lleva a un aumento en el porcentaje de área total condensada a presiones superficiales mayores a 11mN/m. Al igual que ocurría en las películas de DPPC, el péptido palmitoilado muestra un efecto bifásico. Estos resultados sugieren que durante la compresión, los segmentos peptídicos son expulsados de la interfase mientras que el péptido palmitoilado mantiene la interacción de los palmíticos en las películas interfaciales altamente comprimidas. Discusión y Conclusiones: Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína SP-C del surfactante pulmonar es capaz por sí sola de promover la inserción de moléculas fosfolipídicas desde los complejos lipoproteicos en que el surfactante es secretado a la interfase aire-líquido8-10. El segmento transmembranal de la SP-C es fundamental para la función de la proteína, sin embargo algunas características funcionales esenciales de la SP-C pueden residir en las interacciones lípido-proteína en las que participa el segmento N-terminal, especialmente si se considera que este segmento puede ser la única parte de la estructura que la SP-C proyecta hacia el exterior de las membranas y monocapas de surfactante11. El segmento N-terminal de la SP-C inicia posiblemente su contacto con la interfase aire-líquido durante el proceso de adsorción de los complejos lipoproteicos del surfactante a la interfase. Este proceso de adsorción debe estar necesariamente relacionado con la perturbación que el segmento N-terminal de SP-C es capaz de producir en el empaquetamiento lipídico de bicapas y monocapas12,13. La mayor parte de los modelos planteados sobre la estructura y disposición de la SP-C en las bicapas y monocapas de surfactante suponen que el segmento N-terminal de la proteína se asocia con las membranas a través de la palmitoilación de sus cisteínas14. Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la inclusión del péptido palmitoilado en membranas fosfolipídicas no resulta muy eficiente para promover la transferencia de especies fosfolipídicas tensioactivas desde las bicapas a la interfase. La diferencia en actividad debe necesariamente estar relacionada con la diferencia que introduce la palmitoilación en la extensión y modo de interacción del segmento N-terminal con las superficies lipídicas. La adsorción interfacial de fosfolípidos desde las bicapas probablemente requiere la perturbación simultánea del empaquetamiento lipídico en bicapas y monocapa. Esta perturbación podría ser más accesible al péptido desacilado, con una conformación aparentemente más extendida, que al péptido palmitoilado. La eficiente actividad interfacial de la SP-C nativa, a pesar de poseer su segmento N-terminal estequiométricamente palmitoilado, podría depender de la simultánea presencia del segmento helicoidal, que manteniéndose integrado en la membrana permite el acercamiento y perturbación por parte del segmento N-terminal en una monocapa adyacente. El hecho de que el segmento N-terminal palmitoilado aislado pueda poseer una conformación más compacta es probable que dificulte la capacidad para perturbar simultáneamente membrana y monocapa, y de ahí el poco efecto observado durante la extensión de suspensiones lipídicas en la interfase aire-líquido. Sin embargo, una vez en la película interfacial, el péptido palmitoilado resulta asociarse
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
con la interfase de una manera más estable que el péptido no palmitoilado, como había sido propuesto mediante estudios de IRRAS15, manteniéndose asociado a presiones mucho mayores que las necesarias para expulsar el péptido desacilado. Los experimentos aquí presentados sugieren que la compresión primero expulsa los segmentos peptídicos y después permite la integración a través de la intercalación de los palmíticos en las regiones hidrofóbicas altamente empaquetadas de los fosfolípidos comprimidos de las películas interfaciales. Esta asociación podría entonces mantenerse hasta las mayores presiones superficiales y ser consistente con un papel de la palmitoilación en la capacidad de la SP-C para sostener la asociación de los complejos lipoproteicos del surfactante con las fases comprimidas de las películas interfaciales que se forman al final de la espiración, facilitando su posterior reextensión tras cada ciclo respiratorio. Bibliografía:
1. Daniels, D.B. and S. Orgeig, Pulmonary surfactant: the key to the evolution of air breathing. News Physiol Sci, 2003. 18: 151-175.
2. Hawgood, S., Surfactant: composition, structure and metabolism. The Lung: Scientific Foundations, 1993, Philadelphia: W.J. Crystal R.G., Wibel ER, Barnes PJ. Lippincott-Raven. Publishers. 701-734.
3. Veldhuizen, J.A. and H.P. Haagsman, Role of pulmonary surfactant component in surface film formation and dynamics. Biochim Biophys Acta, 2000. 1467: 255-270.
4. van Golde, L.M.G. and C. Casals, Metabolism of lipids in the lung. The Lung: Scientific Foundations. 1997, Philadelphia W.J. Crystal R.G., Wibel ER, Barnes PJ. Lippincott-Raven. Publishers.
5. Lawson, P.R. and K.B. Reid, The roles of surfactant proteins A and D in innate immunity. Immunol Rev, 2000. 173: 66-78
6. Goerke, J., Pulmonary surfactant functions and molecular composition. Biochim Biophys Acta, 1998. 1408: 79-89.
7. Possmayer, F., et al., Surface activity in vitro : role of surfactant proeins. Comp Biochem Physiol, 2001. 129: 209-220.
8. Perez-Gil, J., et al., Pulmonary surfactant proein SP-C causes packing rearrangements of dipalmitoylphosphatidylcholine in spread monolayers. Biophys J, 1992. 63: 197-204.
9. Lukovic, D. et al., Production and characterisation of recombinant forms of human pulmonary surfactant protein C (SP-C): Structure and surface activity. Biochim Biophys Acta, 2006. 1758 (4): 509-518.
10. Oosterlaken-Dijksterhuis, M.A., et al., Surfactant protein composition of lamellar bodies isolated from rat lung. Biochem J, 1991. 273: 115-119.
11. Plasencia, I., et al., Superficial disposition of the N-terminal region of the surfactant protein SP-C and the absence of specific SP-B SP-C interactions in phospholipids bilayers. Biochem J, 2001. 359: 651-659.
12. Plasencia, I., K.M.W. Keough and J. Perez-Gil, Interaction of the N-terminal segment of pulmonary surfactant protein SP-C with interfacial phospholipids films. Biochim Biophys Acta, 2005. 1713: 118-128.
13. Plasencia, I., et al., The N-terminal segment of pulmonary surfactant lipopeptide SP-C has intrinsic propensity to interact with and perturb phospholipids bilayers. Biochim J, 2004. 377: 183-193.
14. Johansson, J., Structure and properties of surfactant protein C. Biochim Biophys Acta, 1998. 1408: 161-172. 15. Bi, X., et al., Secondary structure and lipid interactions of the N-terminal segment of pulmonary surfactant
SP-C in Langmuir films: IR reflection-adsorption spectroscopy and surface pressure studies. Biochemistry 2002, 41: 8385-8395.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
EFECTO HEPATOPROTECTOR DE leucophyllum frutescens EN RATAS ALBINO
WISTAR INTOXICADAS CON TETRACLORURO DE CARBONO
José Ángel Merino Mascorro1, Isaías Balderas Rentería1, María del Rayo Camacho-Corona1, Pilar Carranza-Rosales2, Héctor G. Lozano-Garza2
1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, 2Centro de Investigación Biomédica del Noreste, IMSS.
Introducción:
Las enfermedades hepáticas como la cirrosis, hígado graso, y hepatitis crónica son temas de
importancia mundial. La efectividad del tratamiento con interferón, colchicina, penicilamina, y
corticosteroides, son inconsistentes y tienen severos efectos adversos. Existe la necesidad de
agentes terapéuticos efectivos. La medicina Herbolaria tradicional se ha practicado por miles de
años y está basada en la experiencia y práctica. Por estas razones, el desarrollo de drogas para el
tratamiento de enfermedades hepáticas obtenidas a partir de plantas utilizadas en la medicina
tradicional, puede mejorar las terapias.
Existen aproximadamente 1000 plantas utilizadas en la medicina tradicional Mexicana, y solo un
20% ha sido estudiado química y biológicamente. Leucophyllum frutescens (Berl.) I.M. Johnst
(Scrophulariaceae) es nativo de Texas, Nuevo México, y el norte de México. En la actualidad, es
ampliamente cultivado en Florida y el Sudeste de Asia, donde florece magníficamente en un clima
húmedo tropical. L. frutescens es utilizado para aliviar fiebres, tos, asma, y dolor reumático.
También es utilizado para tratar desordenes de higado y vejiga en México. Con el fin de validar su
uso en la medicina tradicional Mexicana, se evaluó el efecto hepatoprotector del extracto
metanólico de L. frutescens contra la hepatotoxicidad en ratas inducida por CCl4.
Objetivo:
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto anticirrótico del extracto metanólico de
Leucophyllum frutescens nativa del noreste de México, sobre ratas intoxicadas con tetracloruro de
carbono como modelo experimental de cirrosis hepática.
Materiales y Métodos:
Material de las Plantas
Las partes aéreas de la planta fueron recolectadas en Lampazos de Naranjo, Nuevo León, México
en Mayo del 2003. La planta fue autentificada por M.C. Mauricio González Ferrara. El número de
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
referencia (24759) fue dado por la Dra. Marcela González y se depositó una muestra en el Herbario
UNL ubicado en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León,
México.
Extracto de la Planta
El material vegetal fue secado y pulverizado en un molino Wiley. Un kg de polvo del material
vegetal fue macerado exhaustivamente con metanol a temperatura ambiente. El extracto fue filtrado
y destilado al vacío. El rendimiento de la extracción fue de 2.6 por ciento p/p de extracto
metanólico, el cual se almacenó en refrigeración para su uso posterior.
Animales
Se utilizaron ratas macho albino Wistar, alrededor de los 200 g de peso. Con acceso libre a dieta
estándar (Rodent Laboratory Chow 500I-PMI Purina) y agua. Los animales fueron contenidos en
cajas de flujo laminar a 22±2 ºC, humedad relativa 50-60%, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.
Todos los animales recibieron 1 ml de aceite mineral oralmente, dos veces por semana durante 28
días como acondicionamiento.
Tabla 1: Diseño Experimental
GRUPO CARACTERÍSTICAS INTOXICACIÓN (1º PERÍODO) TRATAMIENTO
(2º PERÍODO)
I Grupo blanco, sin tratamiento
alguno Ninguno Ninguno
II Grupo control positivo, que sólo
recibió CCl4
2 ml/kg de peso oralmente dos veces
por semana por 50 días Ninguno
III
Grupo testigo, que recibió CCl4 y
posterior tratamiento con un
preparado farmacéutico de
Silimarina
2 ml/kg de peso oralmente dos veces
por semana por 50 días
20 mg/kg de peso, 3 veces por
semana por 28 días
IV Grupo de prueba para el L.
frutescens
2 ml/kg de peso oralmente dos veces
por semana por 50 días
100 mg/kg de peso, del
extracto metanólico de cenizo
disuelto en agua potable, 3
veces por semana por 28 días
V Grupo de prueba para el L.
frutescens
2 ml/kg de peso oralmente dos veces
por semana por 50 días
200 mg/kg de peso, del
extracto metanólico de cenizo
disuelto en agua potable, 3
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
veces por semana por 28 días
Evaluación del daño hepático:
El Sacrificio se hizo mediante la sedación con Fenobarbital y una vez que se extrajeron la sangre y
el hígado, se procedió a la inyección de aire directamente a músculo cardiaco para provocar la
muerte del animal.
La sangre se centrifugó para separar el suero y evaluar las enzimas de funcionamiento hepático
AST y ALT, por medio de un kit convencional (Johnson&Johnson)
Los hígados fueron extraídos y se preservaron en buffer de formalina, se observaron sus
características macroscópicas y fueron procesados en parafina para su estudio histopatológico.
Se tiñeron con hematoxilina y eosina, así como con la técnica Tricrómica de Mason y fueron
procesados para observar los cambios histopatológicos
Resultados:
Tabla 2: Efecto del extracto metabólico de L. frutescens sobre la actividad de enzimas séricas
en ratas. N = 6 ratas por cada grupo. Los resultados están dados como el promedio ± la
desviación estándar. ALT = Alanin aminotransferasa, AST = Aspartato aminotransferasa.
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
Grupo/Niveles
séricos de
enzima
Grupo I Control
Normal
Grupo II
Control CCl4
Grupo III
Tratado con
Silimarina
(6mg/kg)
Grupo IV
Tratado con L.
frutescens (100
mg/kg)
Grupo V Tratado
con L. frutescens
(200 mg/kg)
ALT (IU/ml) 202.08 ± 2.19 385.85 ± 8.62 228.22 ± 3.6 226.73 ± 3.48 247.07 ± 2.22
AST (IU/ml) 193.29 ±1.51 402.68 ± 1.96 202.67 ± 5.12 223.68 ± 3.10 255.38 ± 7.03
Discusión y Conclusiones:
El Hígado es un órgano muy importante, altamente involucrado en las funciones metabólicas y
frecuentemente es objeto de agentes tóxicos. El CCl4 es un agente muy eficiente en la inducción de
daño hepático, debido a la formación de radicales libres. La eficacia de una droga con acción
hepatoprotectora, escencialemente depende de su habilidad de reducir los efectos dañinos
provocados por una hepatotoxina o mantener la fisiología hepática en condiciones normales. En el
presente estudio, se observó que la administración de 100 o 200 mg/Kg de extracto metanólico de
L. frutescens disminuyó la elevación inducida de los niveles de enzimas hepáticas, por CCl4. Esto
sugiere que el mantenimiento de la estructura del hepatocito o la regeneración del daño se observó
en las células que se trataron con el extracto.
El presente estudio ha demostrado que el extracto metanólico de L. frutescens tiene efecto
hepatoprotector contra daño inducido por CCl4. No obstante, es necesario determinar otros
parámetros como marcadores de estrés oxidativo y ensayos de biología molecular para confirmar
este descubrimiento. La siguiente etapa consistirá en aislar y purificar el principio activo
responsable de la actividad hepatoprotectora y determinar su mecanismo de acción
Bibliografía:
Ferenci P, Dragosics B, Dittrich H. 1989. Randomized controlled trial of silymarin treatment in
patients with cirrhosis of the liver. J Hepatol 9: 105-113.
Galigher AE, Kozloft EN. 1971. Essential Practical Microtechnique (2nd edn). Lea and Febiger.
Philadelphia, USA.
García Alvarado JS, Verde Star MJ, Heredia N. 2001. Traditional uses and scientific knowledge of
medicinal plants from México and Central America. J Herbs Spices Med. Plants 8: 37-81.
González Ferrara MM. 1998. Plantas Medicinales del Noreste de México (1st edn). El Sol, S. A. de
C. V. Monterrey N.L., México
REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN
Luper SND. 1998. A review of plants used in the treatment of liver disease: Part 1. Alternative
Medicine Review 3: 410-421.
Meyer SA, Kulkarni AP. 2001. Hepatotoxicity. In: Introduction to biochemical toxicology Hodgson
E, Smart RC, editors (3rd edn). John Wiley & Sons: New York, USA.
Nan J.-X, Park E.-J, Kim Y.-C, Ko G, Sohn D.-H. 2002. Scutellaria baicalensis inhibits liver
fibrosis induced by bile duct ligation or carbon tetrachloride in rats. Journal of Pharmacy and
Pharmacology 54: 555-563.
Recknagel RO, Glende EA Jr, Dolak JA, Waller RL. 1989. Mechanisms of carbon tetrachloride
toxicity. Pharmacol Ther 43: 139-45.
Rimando AM, Dayan FE, Mikell JR, Moraes RM. 1999. Phytotoxic lignans of Leucophyllum
frutescens. Nat Toxins 7: 39-43.
Sherlock S. 1981. Biochemical assessment of liver function. (1st edn). Blackwell Scientific
Publication. Oxord, UK.
Trinchet IC, Coste T, Levy VG. 1989. Treatment of alcoholic hepatitis with silymarin. A double-
blind comparative study in 116 patients. Gastroenterol Clin Biol 13: 120-124.