““Algoritmos Moleculares en Hemofilia A y B. Algoritmos Moleculares en Hemofilia A y B. ""
Liliana RossettiLiliana Rossetti
Laboratorio de GenLaboratorio de Genéética Molecular de la Hemofilia.tica Molecular de la Hemofilia.Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICETInstituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET
Academia Nacional de MedicinaAcademia Nacional de Medicina
CCáátedra de Gentedra de Genéética y Biologtica y Biologíía Molecular. Facultad de Farmacia y Bioqua Molecular. Facultad de Farmacia y Bioquíímica. mica. UBAUBA
Hemofilia A y B Hemofilia A y B
-- La hemofilia es una La hemofilia es una coagulopatcoagulopatííaa ligada al cromosoma X que afecta 1:5000 ligada al cromosoma X que afecta 1:5000 varones en todas las poblaciones humanas sin distinciones varones en todas las poblaciones humanas sin distinciones éétnicas ni tnicas ni geogrgeográáficas. ficas.
-- La hemofilia A (HA), causada por mutaciones en el gen del FVIIILa hemofilia A (HA), causada por mutaciones en el gen del FVIII ((F8F8), es 4 o ), es 4 o 5 veces m5 veces máás frecuente que la hemofilia B (HB), causada por defectos gens frecuente que la hemofilia B (HB), causada por defectos genééticos ticos en el FIX (en el FIX (F9F9).).
-- La HA y la HB pueden clasificarse segLa HA y la HB pueden clasificarse segúún su severidad cln su severidad clíínicanica--bioqubioquíímica de mica de acuerdo a los valores de actividad especacuerdo a los valores de actividad especíífica del fica del FVIII:CFVIII:C o o FIX:CFIX:C en en comparacicomparacióón con la actividad del plasma promedio de la poblacin con la actividad del plasma promedio de la poblacióón general.n general.
ActividadActividad (IU/(IU/dldl))-- SeveraSevera <1%<1%-- ModeradaModerada 11--5%5%-- Leve Leve 55--25%25%
PatrPatróón de herencia de la Hemofilia: recesivon de herencia de la Hemofilia: recesivo--ligado al Xligado al X
Madre Portadora
PatrPatróón de herencia de la Hemofilia: recesivon de herencia de la Hemofilia: recesivo--ligado al Xligado al X
Padre con HemofiliaPadre con Hemofilia
X chromosome
Catalityc domain
LocalizaciLocalizacióónn cromoscromosóómicamica y y estructuraestructura del gen del factor del gen del factor VIII y factor IX de VIII y factor IX de coagulacicoagulacióónn humanohumano
FVIII FIX
HemofilaHemofila A y Mutaciones en el A y Mutaciones en el F8F8
Tipo de mutación Severa FVIII<1% Moderada FVIII:1-5% Leve FVIII:5-20%
Inversiones tipo 1 35%Inv22 tipo 2 7%
Total 42%
Inv1 <5%
Mutaciones falso sentido 14% falso sentido >95% falso sentido >98%Puntuales no-sentido 7%
sitio splicing 4% sitio splicingTotal 25%
Deleciones >0,2kb 15% >0,2kb<0,2kb 6%Total 21%
Inserciones <20 bp 4%LINELINE--1 <1%1 <1%Total 5%Total 5%
Datos de la literatura y de la Base de DatosDatos de la literatura y de la Base de Datos www.factorviii-db.org.
Datos de la Literatura y de la Base de Datos www.factorix.org/
6Grandes deleciones (> 50 bp)
11,6Pequeñas deleciones e inserciones
(< 50 bp)
27,7No-sentido (nonsense)
54,6Falso sentido (missense)
Porcentaje observadoTipo de Mutación
HemofilaHemofila B y Mutaciones en el B y Mutaciones en el F9F9
X X cencenXqXq teltel
int22hint22h--3 3 int22hint22h--2 2 F8F8 int22hint22h--11
1 22 23 1 22 23 2626
LakichLakich et al, Nat et al, Nat GenetGenet 1993; 1993; NaylorNaylor et al, et al, HumHum MolecMolec GenetGenet 1993. 1993.
X X cencenXqXq teltel
int22hint22h--3/3/--1 1 int22hint22h--2 2 int22hint22h--1/31/3
23 2623 26
1 22 1 22
InversiInversióón molecularn molecular
CrossoverCrossover
InversiInversióón n intrintróónn 22 del 22 del F8F8
AnAnáálisislisis de Southern blot de la Inv22de Southern blot de la Inv22
LakichLakich et al, Nat et al, Nat GenetGenet 1993.1993.
Normal Allele
21.6 kb 14 kb
int22h-1 int22h-2
16.0 kb
int22h-3
Inv22-1 ~ 80%type 1
17.5 kb 14 kb 20 kb
int22h-2int22h-1/-3 Int22h-3/-1
15.5 kb
int22h-1/-2
20 kb
Int22h-2/-1Inv22-2 ~ 20%type 2
kb
21,520
17,516
15,514
kb
23,1
9,4
Inv22 N 1 1 N 2 2 N
1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M
RestricciRestriccióón: n: BclBcl II
Sonda: F8A (1 Sonda: F8A (1 kbkb))
16.0 kb
int22h-3
AnAnáálisis de la Inv22 por long lisis de la Inv22 por long distancedistance PCRPCR
Liu et al, Liu et al, BloodBlood 1998.1998.
1010--16 16 hshs
genomic DNAgenomic DNA
BclBcl I restrictionI restriction
selfself--endend--ligationligation
standard PCRstandard PCR
Rossetti et al, Clin Chem 2005.
27 460
B
ID 487 bp IU
Normal DNA-rings21.6 kb
int22h-1
B
int22h-1/-3:2
460 99
IU 559 bp ED
B
Inv22 DNA-rings20 kb
Normal Allele21.6 kb
int22h-1
B BID IU
Inv22-1/-220 kb
Int22h-1/-3:2
B BIU ED
IU intra-F8 UPST
ID intra-F8 DWST
ED extra-F8 DWST
Ochman et al, Genetics 1988.Collins et al, PNAS 1984.
AnAnáálisis de la Inv22 por lisis de la Inv22 por InverseInverse ShiftingShifting –– PCRPCR
Patrones de SePatrones de Seññal ISal IS--PCR y DiagnPCR y Diagnóóstico de la Inv22 no stico de la Inv22 no discriminante de patrones tipo 1 y 2discriminante de patrones tipo 1 y 2
Mar
ker
bp
600500400350
bp
559487
Inv22 + – + +/–
Rossetti et al, Rossetti et al, ClinClin ChemChem 2005.2005.
Mar
ker
Nor
mal
Inv2
2/N
Inv2
2
bp
600500400350
bp
559487
Inv22 – +/– +
100
bpla
dder
Ex.
1E
x.2
Ex.
3E
x.4
Ex.
5E
x.6
Ex.
710
0 bp
ladd
erE
x.8
Ex.
9E
x.10
Ex.
11E
x.12
Ex.
13E
x.14
ab10
0 bp
ladd
er
100
bpla
dder
Ex.1
4cd
Ex.
14ef
Ex.
14gh
Ex.
14jk
Ex.
15E
x.16
Ex.1
7-18
100
bpla
dder
Ex.
19E
x.20
Ex.
21E
x.22
Ex.
23E
x.24
Ex.
25E
x.26
100
bpla
dder
ANANÁÁLISIS PRIMARIOLISIS PRIMARIO
IdentificaciIdentificacióón de grandes n de grandes delecionesdeleciones en el en el F8F8
10 11 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 25 26
10 kb
ExExóón #n #
38 38 amplamplíímerosmeros
Rossetti et al, Rossetti et al, HaematologicaHaematologica 2007.2007.
ReuniReunióón de extremos, n de extremos, ligado covalente ligado covalente
de las secuencias del de las secuencias del intrintróónn 1 y 21 y 2
Rupturas de Doble CadenaRupturas de Doble Cadenaen el DNAen el DNA
En En intrintróónn 1 e 1 e intrintróónn 2 2
Gran deleciGran delecióón n del del F8F8 o o F9F9
11°° Variante Estructural.Variante Estructural.22°° DuplicaciDuplicacióón n
33°° InversiInversióónn
Gran Deleción del F8 o F9: ejemplo-esquema
NotaciNotacióón HGVSn HGVS c.1520+340_1796c.1520+340_1796--955del955del
ExExóón 1n 1 ExExóón 2n 2 ExExóón 3n 3IntrIntróónn 11 IntrIntróónn 22 IntrIntróónn 33
IntrIntróónn 1::21::2 ExExóón 3n 3 IntrIntróónn 33ExExóón 1n 1
gtgt agag gtgt agag
gtgt agag
15201520
17961796+340+340 --955955
11
bp
725
441
M2
Pr Pr.M
o
Co
i3f-i10r-4bPCR
E3 E4 E11
3a i3f 4b
i10r 11b
5.7 kb
441 bp
725 bp
Xq tel
X cen
Alu
4.3 kb
kb
5.74.3
M1
Pr Pr.M
oC
oC
oP
r.Mo
3a-11b 3a-4bLD-PCRs
DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante PCR de PCR de LargaLarga DistanciaDistancia & Standard& Standard((ejemploejemplo casocaso ííndicendice, CHE EX4_EX10del), CHE EX4_EX10del)
AnAnáálisis lisis de de Mapas de Mapas de restriccirestriccióónn del del productoproductoLDLD--PCR [3APCR [3A--11B]11B]
M H1 M N M H1 M N
LDLD--PCRPCR [3A[3A--11B]11B]
kb
5.7
M
M
Und
Und Eco
RI
Eco
RI
Msp
IM
spI
Hin
dIII
Hin
dIII
Eco
RI
Eco
RI ++
Msp
IM
spI
Hin
dIII
Hin
dIII ++
Msp
IM
spI
MM
BioinformBioinformááticaticaAlineamientoAlineamiento e e identificaciidentificacióón de las n de las secuencias involucradas secuencias involucradas MegalignMegalign DNA DNA LasergeneLasergene
CaracterizaciCaracterizacióón final n final y completa de los puntos de ruptura, por y completa de los puntos de ruptura, por secuenciacisecuenciacióón de DNAn de DNA directa y nuevo andirecta y nuevo anáálisis lisis
bioinformbioinformááticotico (BLASTN) para recabar datos acerca del mecanismo que origin(BLASTN) para recabar datos acerca del mecanismo que originóó la delecila delecióón n (por ejemplo recombinaci(por ejemplo recombinacióón homn homóóloga loga AluAlu--AluAlu).).
DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante PCR de PCR de LargaLarga DistanciaDistancia & Standard& Standard((ejemploejemplo casocaso ííndicendice, CHE EX4_EX10del), CHE EX4_EX10del)
XX
Curvas de probabilidad de simple y doble dosis del cromosoma X (Curvas de probabilidad de simple y doble dosis del cromosoma X (TargetTarget)/ )/ AutosomaAutosoma ((ReferenceReference); e ); e interpolaciinterpolacióón de valores T/R de las mujeres en riesgo de ser portadoras de gn de valores T/R de las mujeres en riesgo de ser portadoras de grandes randes delecionesdeleciones en distintas en distintas regiones del regiones del F8F8. Las curvas (Normal . Las curvas (Normal --GaussianaGaussiana) rayadas y abiertas caracterizan los valores T/R de la poblaci) rayadas y abiertas caracterizan los valores T/R de la poblacióón n general de varones (46, XY) (n = 15) y mujeres (46, XX) (n = 15)general de varones (46, XY) (n = 15) y mujeres (46, XX) (n = 15), respectivamente. Se muestra el an, respectivamente. Se muestra el anáálisis de lisis de F8 F8 Ex6, 26, F9 Ex8 y F8 Ex6, 26, F9 Ex8 y F8 PromProm en siete familias. Se muestran gren siete familias. Se muestran grááficamente los valores T/R de las catorce mujeres en ficamente los valores T/R de las catorce mujeres en riesgo. Los valores de nueve de ellas interpolan claramente la criesgo. Los valores de nueve de ellas interpolan claramente la curva de varones (resultando portadoras con urva de varones (resultando portadoras con PcPc=100%) y cinco de ellas interpol=100%) y cinco de ellas interpolóó en la curva de mujeres (resultando no portadoras con en la curva de mujeres (resultando no portadoras con PcPc=0%).=0%).
DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante Real Time Real Time qPCRqPCRMediciMedicióónn relativarelativa de de dosisdosis ggéénicanica
XXXX
Abelleyro et al, Haemophilia 2015.
MMéétodos de todos de screeningscreening para la deteccipara la deteccióón de mutacionesn de mutaciones
Existen una variedad de mExisten una variedad de méétodos de todos de screeningscreening que permiten localizar mutaciones:que permiten localizar mutaciones:
-- SSCPSSCP ((Single Single StrandStrand ConformationConformation PolymorphismPolymorphism))
-- DGGEDGGE ((DenaturingDenaturing GradientGradient Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))
-- TGGETGGE ((TemperatureTemperature GradientGradient Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))
-- CMCCMC ((ChemicalChemical MismatchMismatch CleavageCleavage))
-- CSGECSGE ((ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))
-- Eficiencia Eficiencia ~~80%.80%.-- Productos PCR 200Productos PCR 200--800 800 bpbp (rango ideal 300(rango ideal 300--500 500 bpbp, eficiencia ~95%. )., eficiencia ~95%. ).-- ÚÚnica condicinica condicióón de electroforesis.n de electroforesis.-- Revelado por tinciRevelado por tincióón con n con EtBrEtBr/UV o con Plata/Luz blanca./UV o con Plata/Luz blanca.-- Los resultados son fLos resultados son fááciles de interpretar.ciles de interpretar.-- No detecta mutaciones en los bordes de las secuencias analizadaNo detecta mutaciones en los bordes de las secuencias analizadas (40 s (40 bpbp), ni), nien dominios ricos en GC.en dominios ricos en GC.
MMéétodo de todo de screeningscreening de mutacionesde mutaciones
HeterodHeterodúúplexplex
C S G E C S G E
ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis
DesnaturalizaciDesnaturalizacióón crecienten creciente(Por (Por ej.ej. % % FormamidaFormamida, , EtilenEtilen Glicol)Glicol)
ConformaciConformacióón Hipotn Hipotééticatica
Electroforesis en Gel (45 Electroforesis en Gel (45 cm) de Poliacrilamida (10cm) de Poliacrilamida (10--15%, Bajo CL 99:1), tinci15%, Bajo CL 99:1), tincióón n con Et Br. con Et Br.
BubbleBubble BendBend BulgeBulge
100
bpla
dder
Ex.
1E
x.2
Ex.
3E
x.4
Ex.
5E
x.6
Ex.
710
0 bp
ladd
erE
x.8
Ex.
9E
x.10
Ex.
11E
x.12
Ex.
13E
x.14
ab10
0 bp
ladd
er
100
bpla
dder
Ex.1
4cd
Ex.
14ef
Ex.
14gh
Ex.
14jk
Ex.
15E
x.16
Ex.1
7-18
100
bpla
dder
Ex.
19E
x.20
Ex.
21E
x.22
Ex.
23E
x.24
Ex.
25E
x.26
100
bpla
dder
10 11 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 25 26
10 kb
Exón #
ProductosProductos PCR de los PCR de los exonesexones y y sussus secuenciassecuencias de splicing de de splicing de F8F8
WildWild--typetypeDNADNA
HeteroduplexHeteroduplex DNADNA
GC AT+
G T A C GC AT
Mutante Mutante DNADNA
DesnaturalizaciDesnaturalizacióón a 98 n a 98 °°C 5 C 5 minmin
RenaturalizaciRenaturalizacióónn a 65 a 65 °°C 30 C 30 minmin
HomoduplexHomoduplex DNADNA
FormaciFormacióón de n de heterodheterodúúplexplex
TTéécnica para el monitoreo de Mutacionescnica para el monitoreo de MutacionesConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE)(CSGE)
ScreeningScreening para identificacipara identificacióón de Mutaciones pequen de Mutaciones pequeññas:as:HighHigh resolutionresolution ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel
ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE)(CSGE)
Ejemplo Ejemplo correspondiente al correspondiente al exexóón 26 (primers n 26 (primers 26a y 26a2)26a y 26a2)
Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11
Electroforesis en Electroforesis en gelesgeles de poliacrilamida (12%) de gran tamade poliacrilamida (12%) de gran tamañño (40 cm) o (40 cm) medianamente medianamente desnaturalizantesdesnaturalizantes (15% (15% formamidaformamida, y 10% , y 10% etilenetilen--glicol).glicol).Se siembran mezclas (Se siembran mezclas (heterodheterodúúplexplex) de productos de amplificaci) de productos de amplificacióón de n de muestras de DNA controlmuestras de DNA control--normal con los pacientes hemofnormal con los pacientes hemofíílicos.licos.
SecuenciaciSecuenciacióón: n:
Ejemplo Ejemplo correspondiente correspondiente a los exones: a los exones: 11, 14H, 2211, 14H, 22
Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 10
SecuenciaciSecuenciacióónn: :
ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE) (CSGE) MULTIPLEXMULTIPLEX
pb
445
364
280
Algoritmo de análisis molecular del F8 Hemofilia A
Rossetti et al, Clin Chem 2005.Rossetti-Radic et al, J Thromb Haemost 2008.Abelleyro et al, Thromb Haemost 2016.
Screeningmutaciones pequeñas
Amplificación PCR del gen
38 productos PCR
F8
Caracterización
Inverse shift-PCR
Inversión del Intrón 1
Inverse shift-PCR
Gap-PCRCaso específica
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Diagnóstico de portadoras
Rossetti et al, Haematologica 2007.Rossetti et al, Haemophilia 2013.Marchione et al, Haemophilia 2017.
Rossetti et al, Hum Mutat 2004.
Abelleyro et al, Haemophilia 2015.
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Inversión del Intrón 22
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
CSGE38 / F8
Secuenciación de Sanger
Moderate/Mild HASevere HA
qPCR
Screeningmutaciones pequeñas
Amplificación PCR del gen
12 productos PCR
F9
Caracterización
Gap-PCRCaso específica
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Diagnóstico de portadoras
qPCR
Radic-Abelleyro et al, unpublished.
Abelleyro et al, Haemophilia 2015.
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
Secuenciación de Sanger
Detección y confirmación de
grandes Deleciones
CSGE12 / F9Radic et al, Thromb Haemost 2013.
Severe/Moderate/Mild HB
Algoritmo de análisis molecular del F9 Hemofilia B
AsignaciAsignacióónn del del GenotipoGenotipo al al FenotipoFenotipo en en HemofiliaHemofilia
1. Estudio de los reportes previos en la literatura y/o en las bases de datos de HA o HB. Los características bioquímicas y clínicas asociadas deben ser concordantes. HADB: http://www.factorviii-db.org/ y HBDB: http://www.factorix.org/.
2. Experiencia en otras enfermedades y otros genes (e.g., cambios del marco de lectura, mutaciones nonsense, etc).
3. Descartar que el defecto observado no sea una variante polimórfica en al menos, 300 cromosomas X de varones no afectados de la misma población a la quepertenece el paciente.
4. En defectos missense, la proteína es alineada por identidad de residuos con susortólogos (e.g., FVIII humano, porcino, murino y canino). Cambios missense en residuos conservados son más severos que en los no-conservados.
5. Análisis teóricos in silico. E.g., análisis de consenso de splicing, modeladoestructural 3D de defectos missense (cambios de la estructura 2aria y 3ria) de la proteína, etc.
6. Estudios funcionales in vitro para investigar mutaciones de splicing del RNA (sistema de miniexones) o ensayos de unión para proteínas para missense, etc.
De De BrasiBrasi et al, et al, HaemophiliaHaemophilia 2014. 2014.
DiagnDiagnóóstico Genstico Genéético en hemofilia en Argentina tico en hemofilia en Argentina –– 1995 2016 1995 2016 ––
1199 muestras de ADN genómico: 1109 individuos indexados (probandos y familiares).480 familias con Hemofilia A: 378 severas HA, 36 moderadas HA y 58 leves HA.96 familias con Hemofilia B: 68 severas HB, 16 moderadas HB y 12 leves HB.
Mutaciones en F9 : Hemofilia BMutaciones en F8 : Hemofilia A
HB.M.DB: http://HB.M.DB: http://www.factorix.orgwww.factorix.org//HA.M.DB: HA.M.DB: http://http://www.factorviiiwww.factorviii--db.orgdb.org//
Promoter2%
Nonsense15%
Splicing defect8%
Missense60%
Large deletions8%
Indels7%
Splicing defect5% Indels
15%
Intron 22 inversions type 1
35%Intron 22
inversions type 27%
Large deletions5%
Intron 1 inversions
1%
Missense24%
Nonsense8%
MATERIAL: Muestra de sangre periférica
ESTUDIO MOLECULAR:Se efectuó el análisis molecular de la inversión del intrón 22 (Inv22) y del
intrón 1 (Inv1) del F8 por la técnica de inverse shifting-PCR (Rossetti et al, J Thromb Haemost 2008, 6: 830-6) resultando no informativa, y el screening molecular de pequeñas mutaciones por la técnica de PCR-CSGE (45cm) (Rossetti et al, 2007, Haematologica 92:842-5) y secuenciación automática de DNA. La familia resultó informativa sobre el amplímero del exón 13 (primers 13A y 13B) mostrando un cambio de base (notación HGSV) NM_000132.3:c.2048A>G condicionando una mutación de falso sentido o missense (notación Legacy) NP_000123.1:p.Tyr664Cys reportada en la base de datos de HA (URL: factorfviii-db.org) asociada a HA severa.
1-NNH (Probando con HA severa): Mostró la mutación missensep.Tyr664Cys en hemicigosis como causa de HA severa en la familia.
2-NNM (Madre del Probando con HA severa): Mostró la mutación missensep.Tyr664Cys en heterocigosis indicando su condición de Portadora de HA severa.
Mutación missense
Probando familiar y Portadora
Informe Molecular
HA severa
INHIBIDORESINHIBIDORESAmbientalesAmbientales
pacientepacienteTerapiaTerapia
antihemofantihemofíílicalica
GenGenééticaticadeldel
pacientepaciente
MutaciMutacióón causal (n causal (F8F8, , F9F9).).Historia familiarHistoria familiarFenotipo MHC Clase I/II.Fenotipo MHC Clase I/II.Etnia no caucEtnia no caucáásicasica
Repertorio del receptor T.Repertorio del receptor T.Polimorfismos de Polimorfismos de citoquinascitoquinas y y molmolééculas culas inmunoreguladorasinmunoreguladoras..
-- IL10IL10 , , TNFTNF S, CTLA4.S, CTLA4.
Tipo de factor concentrado.Tipo de factor concentrado.
Modo de administraciModo de administracióón.n.
Factores que influencian el riesgo de formaciFactores que influencian el riesgo de formacióón de inhibidor n de inhibidor en pacientes con hemofiliaen pacientes con hemofilia
Edad de la 1ra infusiEdad de la 1ra infusióón de n de FVIII o FIX.FVIII o FIX.
DesafDesafííos al sistema inmune:os al sistema inmune:-- Inmunizaciones.Inmunizaciones.-- Inflamaciones.Inflamaciones.-- Traumas/cirugTraumas/cirugíías.as.
RASGORASGOMULTIFACTORIALMULTIFACTORIAL
AdaptadoAdaptado de de AstermarkAstermark, , HaemophiliaHaemophilia 2006.2006.
Factor VIII genotype characterisation of haemophilia A affected Factor VIII genotype characterisation of haemophilia A affected patients with transient and patients with transient and permanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitpermanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitor risks.or risks.
5’ 3’
COOH
9
40
TransientTransient InhibitorsInhibitorsPermanentPermanent Low Low RespondersRespondersPermanentPermanent HighHigh RespondersResponders
MissenseIns/Del frameshift (An: within an A-run) NonsenseSplicing defectInversionLarge deletion
10
2
22
8765421 9 10 11 12 13 14 20 22 233 19181715 16 2524 2621
SP a1 a2 a3B A3 C1 C2A1 A2
Light ChainHeavy Chain
An An An An An
22
22
An
Rossetti et al, Rossetti et al, HaemophiliaHaemophilia 2013.2013.
Table 1. FVIII inhibitor development vs F8 mutation type/location in Argentine patients with severe HA.
Mutation Type
SHA1
[%] Cases2 N= 84
Controls3 N= 143
OR4(CI 95) IP5(CI 95) [%] P value6
INV22 44.0 48 60 1.84(1.07-3.18) 24(18-29) 0.0287*
INV1 1.9 0 2 0.33(0.02-7.07) 5.9(0.3-100) 0.5317
MED 6.5 8 4 3.66(1.07-12.55) 55(19-100) 0.0604
SED 3.7 3 5 1.02(0.24-4.39) 18(4-69) 1.0000
NS.LCH 6.5 5 7 1.23(0.38-4.01) 21(7-59) 0.7642
NS.HCH 3.7 4 9 0.74(0.22-2.50) 13(4-41) 0.7719
FS.I/D 15.9 13 27 0.79(0.38-1.62) 14(7-26) 0.5905
IF.I/D 1.9 0 2 0.33(0.02-7.07) 5.9(0.3-100) 0.5317
MS 12.2 2 21 0.14(0.03-0.62) 3(0.6-11) 0.0025**
SPD 3.7 1 6 0.27(0.03-2.33) 5(0.6-39) 0.2641 1 SHA [%]: Natural (unbiased) Mutational Prevalence in Severe HA showing an absolute inhibitor prevalence estimation of 17.6% (N=107), similar to those previously reported in the same population [11]. 2 Cases: Permanent Inhibitor Positive cases (high and low responders). 3 Controls: Inhibitor Negative or Transient. 4 OR: Inhibitor Likelihood Odds Ratio (Mutation positive/Mutation negative); (CI95): Confidence interval of 95%. 5 IP [%]: Absolute Inhibitor Prevalence; (CI95). 6 P value: Fisher Exact Test P value; *P<0.05 significant; **P<0.01 highly significant. MED: Multi Exon Deletion; SED: Single Exon Deletion; NS.LCH: Nonsense Light Chain; NS.HCH: Nonsense Heavy Chain; FS.I/D: Frameshift Indel; IF.I/D: In-Frame Indel; MS: Missense; SPD: Splicing Defect.
Rossetti et al, Rossetti et al, HaemophiliaHaemophilia 2013.2013.
Table 2. FVIII inhibitor status concordance/discordance vs related/expected-if-unrelated in patients with severe HA. Patient Group (Consanguinity1)
Concordant2 Discordant3 OR4(CI95) P value5
All Mutations6 Related (≥ 1/8) Obs. 36 10 2.8(1.1-6.9) 0.0261* Expected-if-Ho 26 20
F8 Intron 22 Inversions Related (≥ 1/8) Obs. 20 6 3.3(1.0-11.0) 0.0438* Expected-if-Ho 13 13 1 Consanguinity coefficients ≥ 1/8 included: monozygotic twins (1); full brothers (1/2); uncle-nephew, half brothers and Grandfather-grandson (1/4); and 1st degree cousins (1/8). 2 Concordant: In related patients, cases with a concordant inhibitor status matching pair; in expected if Ho (null hypothesis: concordant/discordant matching pairs expected by chance in the same population, or “apart from the causative mutation, no additional genetic factors influence the development of inhibitors”), the expected matching pair was calculated using the Binomial distribution and the frequency of patients with inhibitors (p) and without inhibitors (q) (i.e., ExpConcHo=(2pq)N) (N=46 for the all mutations group and N=26 for Inv22 patients). 3 Discordant: In related patients, same as concordant inhibitor status matching pair; in expected if Ho, the discordant expected matching pair was calculated using the formula ExpDiscHo=N-ExpConcHo (i.e., ExpDiscHo=N-(2pq)N).. 4 OR: Inhibitor Concordance Odds Ratio (Related-Obs/Expected-if-Ho); (CI95): Confidence interval of 95%. 5 P value: Chi square test. P value; * P<0.05, significant differences. 6 All mutation group included 46 cases: 26 Inv22, 10 ins/del frameshifts, 6 large deletions and 4 nonsense mutations.
Riesgo de Inhibidor en HAHoHoSHASHA: 17.6% N: 107 (1995: 17.6% N: 107 (1995--2008)2008)
N: 227 N: 227 pacientespacientes
ConclusiConclusióónn::
ExistenExisten factoresfactoresgengenééticosticos adicionalesadicionalesademademááss del del genotipogenotipodel del F8F8
RiesgoRiesgo de de InhibidorInhibidor en HBen HB
RadicRadic et al, TH 2013.et al, TH 2013.
HoSHB: 3% N: 55 pacientes
34
Ho: 17.6%
**
*
***
Severe HA
n=107(unbiased cohort)
n=352
* P<0.05** P<0.01*** P<0.001
High-risk groupIntermediate-risk groupLow-risk group
RiesgoRiesgo relativorelativo de de desarrollodesarrollo de de inhibidorinhibidor vsvs tipotipo de de mutacimutacióónn causal en HA causal en HA severasevera
20162016
Estudios moleculares en hemofiliaEstudios moleculares en hemofilia
¿¿para qupara quéé??
La determinaciLa determinacióón de la mutacin de la mutacióón causal de hemofilia permite la n causal de hemofilia permite la provisiprovisióón de informacin de informacióón directa y segura para el asesoramiento n directa y segura para el asesoramiento gengenéético de lastico de las familias afectadasfamilias afectadas. . En particular para elEn particular para elDiagnDiagnóóstico de Portadorasstico de Portadoras..
TambiTambiéén saber la mutacin saber la mutacióón causal de la hemofilia en cada caso n causal de la hemofilia en cada caso particular ayuda alparticular ayuda al mméédico hematdico hematóólogo tratante de la hemofilialogo tratante de la hemofilia aatener un conocimiento mtener un conocimiento máás amplio y especs amplio y especíífico del paciente. fico del paciente. Puede estimarse elPuede estimarse el riesgo a desarrollar inhibidorriesgo a desarrollar inhibidor. .
Laboratorio de Genética Molecular de la Hemofilia
EmilceEmilceMoraMora
MartMartíínnAbelleyroAbelleyro
Vanina Vanina MarchioneMarchione
PamelaPamelaRadicRadic
LiliLiliRossettiRossetti
CarlosCarlosDe De BrasiBrasi
Irene Irene LarripaLarripa
PamelaPamelaRadicRadic
LiliLiliRossettiRossetti
CarlosCarlosDe De BrasiBrasi
Irene Irene LarripaLarripa
20142004
2017
AgradecimientosAgradecimientos
•• AgradecemosAgradecemos a la a la comunidadcomunidad formadaformada porpor los los pacientespacientes hemofhemofíílicoslicos, , sussusfamiliaresfamiliares y el personal y el personal ttéécnicocnico y y profesionalprofesional abocadoabocado al al tratamientotratamiento de la de la HemofiliaHemofilia en Argentina, en particular a los en Argentina, en particular a los DresDres Daniela Daniela NemeNeme, Laura , Laura PPrimianirimiani, , Miguel Candela y Miguel de Miguel Candela y Miguel de TezanosTezanos PintoPinto..
•• AgradecemosAgradecemos a los a los investigadoresinvestigadores Eduardo Eduardo TizzanoTizzano (Barcelona, (Barcelona, EspaEspaññaa), Carol ), Carol Kasper (Los Angeles, Kasper (Los Angeles, EstadosEstados UnidosUnidos), Amy ), Amy CurtoCurto, , HHééctorctor TargovnikTargovnik y y VivianaVivianaVarela (Buenos Aires, Argentina), Peter Collins, Derrick Bowen, Varela (Buenos Aires, Argentina), Peter Collins, Derrick Bowen, Michael Michael MakrisMakris, , Anne Anne GoodeveGoodeve (Cardiff y Sheffield, (Cardiff y Sheffield, ReinoReino UnidoUnido), Enrique Medina), Enrique Medina--Acosta (Acosta (BrasilBrasil) ) y Ana y Ana RebecaRebeca JalomaJaloma--Cruz (Guadalajara, Cruz (Guadalajara, MMééjicojico) ) porpor susu valiosavaliosa ayudaayuda..
•• PorPor el el apoyoapoyo econeconóómicomico, , agradecemosagradecemos a la a la FundaciFundacióónn RenRenéé BarBaróónn, a la , a la FundaciFundacióónn Florencio Florencio FioriniFiorini, a la , a la FundaciFundacióónn Alberto J Alberto J RoemmersRoemmers, a la , a la FundaciFundacióónnAdolfo H Adolfo H AztiriaAztiria, a la , a la FederaciFederacióónn Mundial de la Mundial de la HemofiliaHemofilia, al CONICET, a la , al CONICET, a la ANPCyTANPCyT y a la Academia y a la Academia NacionalNacional de de MedicinaMedicina..