Oya PAZARLI, Füsun CÖMERT, Elif AKTAŞ, Füruzan KÖKTÜRK1,
Canan KÜLAH
Zonguldak Karaelmas ÜniversitesiTıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji A.D., 1Biyoistatistik A.D.
Kinolon Dirençli
Escherichia coli ve Klebsiella spp.
Suşlarında Direnç Genlerinin Araştırılması
Kinolonların etki mekanizması
• DNA Giraz
• GyrA
• GyrB
• Topoizomeraz IV
• ParC
• ParE
2
Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response.
J Antimicrob Chemother, 51 Suppl S1: S29–35, 2003
Direnç mekanizmaları
İlaç hedefinde değişiklik
Hücrede ilaç birikiminin azalması
Membran permeabilitesinde azalma
Dış membran porin protein değişiklikleri
E.coli OmpF, OmpC
Aktif pompalama ile antibiyotiğin hücre dışına atılması E.coli AcrAB-TolC
Plazmid aracılı direnç aktarımı
3
Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response. JAC 2003,51 Suppl S1: S29–35,
Jacoby AG. Mechanisms of resistance to quinolones. CID 2005; 41:S120–6
Li XZ. Quinolone resistance in bacteria: emphasis on plasmid-mediated mechanisms. Int J Antimicrob Agents 2005, 25: 453-463
Direnç mekanizmaları
İlaç hedefinde değişiklik
Kinolon direnci belirleyici bölge
gyrA Ala67-Gln106
gyrB Asp426-Lys447
parC
parE
4
Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response. JAC 2003,51 Suppl S1: S29–35,
Jacoby AG. Mechanisms of resistance to quinolones. CID 2005; 41:S120–6
Direnç mekanizmaları
Plazmid aracılı direnç aktarımı
İlacın enzimatik inaktivasyonu
Aminoglikozid asetil transferaz
aac(6’)-Ib
aac(6’)-Ib-cr
İlacın letal etkisinden koruyan genler
qnrA
qnrS
qnrB
qnrC
qnrD
Aktif pompa sistemi
qepA Poirel L,Cattoir V and P. Nordmann.
Is plasmid-mediated quinolone resistance a clinically significant problem?
CMI 2008; 14: 295–297
Çalışmanın amacı
Escherichia coli ve Klebsiella spp. izolatlarında;
Kinolon direnç oranlarının belirlenmesi
GSBL üretiminin araştırılması
En sık görülen kinolon direnç mekanizmalarından
gyrA ve parC mutasyonlarının
Plazmid geçişli kinolon direnç genlerinden qnrA, qnrB,
qnrS ve aac(6’)-Ib varlığının araştırılması
7
İzolatların Toplanması
Şubat-Ağustos 2009 arasında izole edilen
508 Escherichia coli
120 Klebsiella spp.
Nalidiksik asite dirençli/orta duyarlı 300 izolat ayrıldı
Kültür ve bakteri tanımlaması
Biyokimyasal özellikler
BBL Crystal Identification Systems E/NF (Becton Dickinson, ABD)
Murray PR. Manual of Clinical Microbiology. Vol. 1. 2003, 8th ed. ASM Press, Washington, DC
Antibiyotik Duyarlılık Testleri
Disk Difüzyon Yöntemi
Agar Dilüsyon Yöntemi
Antibiyotik MİK (µg/ml)
Duyarlı Orta duyarlı Dirençli
Nalidiksik asit ≤16 _ ≥32
Siprofloksasin ≤1 2 ≥4
-CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;
Eightenth Informational Supplement. CLSI document M100-S18. 2009
-CLSI. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically;
Approved Standard 7th ed. M7-A7. 2006.
GSBL Üretiminin Gösterilmesi
Çift disk sinerji yöntemi
Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A: Rev Inf Dis;10: 867. 1988
DNA eldesi ve çoğaltılması
Gen bölgesi Forward primer Reverse primer Bant büyüklüğü (bç)
qnrA 5`-atttctcacgccaggatttg-3` 5`-gatcggcaaaggttaggtca-3` 516
qnrB 5`-gatcgtgaaagccagaaagg-3' 5`-acgatgcctggtagttgtcc-3 469
qnrS 5`-acgacattcgtcaactgcaa-3' 5`-taaattggcaccctgtaggc-3 417
aac(6’)-Ib 5'-ttgcgatgctctatgagtggcta-3' 5'-ctcgaatgcctggcgtgttt-3' 482
parE 5'-tacaccggtcaacattgagg-3' 5'-ttaatattgccgccgtcgg-3' 648
parC 5'-aaacctgttcagcgccgcatt-3' 5'-gtggtgccgttaagcaaa-3' 395
Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm D.F, Jacoby G.A, Hooper D.C. AAC, 50: 2872–74. 2006
Park C.H, Robicsek A, Jacoby G.A, Sahm D, and Hooper D.C. AAC, 50: 3953-3955, 2006
Saenz Y, Zarazaga M, Brinas L, Ruiz-Larrea F, Torres C.. JAC, 51:1001-1005, 2003
Vila J, Ruiz J, Goni P, Jimenez de Anta MT. AAC, 40: 491-493, 1996
Nükleik asit dizileme
gyrA ve parC bölgelerinde QRDR dizilemesi
TÜBİTAK MAM GMBE de yapıldı
İlgili kodonlarda mutasyonların varlığı, standart
dizilerle karşılaştırılmak suretiyle saptandı
Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence lignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp, 41: 95-98,1999.
BLAST. National Center for Biotechnology Information. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
İstatistiksel Analiz
SPSS (Versiyon 13.0) programı kullanılarak yapıldı
Tanımlayıcı istatistikler sayı ve yüzde olarak ifade edildi
Kategorik yapıdaki değişkenler bakımından gruplar arası
farklılıklar Ki-kare testi ile incelendi
Sonuçlar %95 güven aralığında değerlendirildi
p<0.05 değeri anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Nalidiksik asit direnci;
E. coli % 52
Klebsiella spp. % 27.5
GSBL üretimi;
İzolatların tümünde % 36.1
E. coli %37.4
Klebsiella spp % 30.8
Nalidiksik aside dirençli izolatlarda % 83.3
Nalidiksik aside duyarlı izolatlarda % 16.7
BULGULAR
Yatan hasta izolatlarında nalidiksik asit direnci
anlamlı olarak yüksek bulundu (p=0.049)
Nalidiksik aside dirençli/orta duyarlı olan izolatlar, ampisilin
amoksisilin/klavulonik asit
sefalotin
sefepim
sefotaksim
anlamlı olarak daha dirençli bulundu (p<0.001).
sefuroksim
sefoksitin
gentamisin
tobramisin
amikasin
trimetoprim-
sülfometoksazol’e
BULGULAR
gyrA; Ala67-Gly106 arasında
Ser83Leu ile birlikte Asp87Asn veya Asp87Tyr
16
İzolat BakteriCIP MIK
µg/ml
QRDR
gyrA ParC
1 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
3 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
9 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
14 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
20 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Ala
24 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
37 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
40 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
47 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
48 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,GluE84Gly
50 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
BULGULAR
parC; ….
Ser80Ile
İlave bir mutasyon olarak;
Glu84Val, Glu84Gly, Glu84Ala
İzolat No Bakteri CIP MIK
µg/ml
QRDR
GyrA ParC
55 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
56 K. oxytoca >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
57 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
61 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
63 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
68 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile
70 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,GluE84Gly
71 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Tyr Ser80Ile,GluE84Gly
72 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
73 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
74 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val
BULGULAR
aac(6’)-Ib
E. coli; % 37.4
K. pneumoniae ; % 12.1
K. oxytoca; 0
tobramisin ve gentamisin direnci anlamlı düzeyde
yüksek bulundu
GSBL üretimi anlamlı olarak yüksek bulundu
18
BULGULAR
İzolatlarda qnrA, qnrB ve qnrS geni bulunmadı
19
TARTIŞMA
2003-2008 yıllarında florokinolon dirençli E.coli izolatları
TARTIŞMA
2006-2008 yıllarında florokinolon dirençli K. pneumoniae izolatları
TARTIŞMA
Ülkemizde hedef bölge değişimi üzerine çalışmalar
Eraç B, Gill A, Amyes SGB, Gülay Z.
Siprofloksasine dirençli Escherichia coli suşlarında Gyr A
mutasyonlarnın incelenmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, 37: 125-130, 2003.
8 izolat; Ser-83-Leu ve Asp-87-Tyr veya Asp-87-Asn
Güven Ö.
Sağlıklı çocuklarda dışkıda kinolon dirençli Escherichia coli
taşıyıcılığının ve direnç mekanizmalarının saptanması.
İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 2007.
6 izolat; gyrA Ser-83-Leu ve Asp-87-Asn
par C Ser-80-Ile ve Ser-83-Tyr
ve eşlik eden Glu84Gly veya Glu84Val
TARTIŞMA
Bu çalışmada;
gyrA QRDR çift mutasyon
Ser83Leu
Asp87Asn veya Asp87Tyr
parC QRDR
İki izolat dışında en az bir mutasyon
Ser80Ile
Ek olarak
23
Glu84Val
Gly
Ala
TARTIŞMA
aac(6’)-Ib
Aminoglikozid transferaz
aac(6’)-Ib-cr
Siprofloksasini asetilleme
Siprofloksasine maruziyet ile kromozomal mutasyon
sıklığını arttırıyor
Qnr ile birliktelik
Belirlenen aac(6’)-Ib lerin %58-92’si aac(6’)-Ib-cr
Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby G.A, Macielag M, Abbanat D, Bush K, and Hooper D.C. Fluoroquinolone modifying enzyme: a novel
adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nature Medicine. 12: 83-88, 2006.24
TARTIŞMA
Poirel L, Gür D, Minarini L, Arslan U, Nordmann P.
Molecular epidemiology of plasmid mediated quinolone resistance determinants in extended spectrum
beta-lactamase producing E.coli and K.pneumoniae isolates from Turkey,
18th European Congres of Cilinical Microbiology and Infectious Diseases, P1527, Barcelona (2008).
GSBL üreten 50 izolatta 39 aac(6’)-Ib-cr (+)
Bu çalışmada;
E. coli; % 37.4
K. pneumoniae ; % 12.1
25
Ülkemizde plazmid aracılı kinolon direnci ile ilgili
çalışmalar Nazik H, Öngen B. ANKEM Derg 2010;24(1):46-54
SONUÇ
Bu çalışma ile;
Belirlenen direnç oranları, kinolon grubu antibiyotiklerin
ilimizde E.coli ve Klebsiella spp. kaynaklı infeksiyonların
ampirik tedavisinde güvenilir olmadığı
Dirençli bakteri popülasyonunun mutant seçimine bağlı
olduğu gösterilmiştir
27
Teşekkür
Sayın Prof. Dr. Zeynep GÜLAY’a;
qnrA, qnrB, qnrS pozitif kontrol suşlarını temin ettiği için
teşekkür ederiz
Bu çalışma, Z.K.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
tarafından (Proje No: 2009-20-01-14) desteklenmiştir