Universidad de Oviedo
Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias
Máster en Biomedicina y Oncología Molecular
Marcadores en cáncer: estrategias
de análisis de expresión múltiple
Ana Cotarelo Fernández
Julio 2016
Trabajo Fin de Máster
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
RESUMEN
La RT-qPCR es, actualmente, la técnica de referencia para el análisis de la expresión
génica, debido a sus múltiples ventajas como la sensibilidad, la rapidez o el amplio rango
de cuantificación. Sin embargo, su elevado coste y la dificultad para realizar reacciones
múltiples suponen importantes inconvenientes. Debido a esto, se ha intentado explorar
la posibilidad de utilizar PCR múltiple a tiempo final combinada con espectrometría de
masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) y acoplada a electroforesis en gel
(GE), en estudios de expresión génica múltiple.
Para ello, en este trabajo, se ha llevado a cabo la optimización de las condiciones
de RT-PCR para la amplificación múltiple de cuatro genes, tres de ellos relacionados con
la respuesta a tratamientos con cisplatino (BAX, CTR1 y ERCC1), y uno, ACTB, como gen
de referencia. Una vez conseguido esto, se ha aplicado el análisis de la expresión de
dichos genes en las líneas celulares humanas de cáncer de ovario A2780 y A2780cis,
sensible y resistente a cisplatino, respectivamente, en células sin tratar y en células
tratadas con 40 μM de cisplatino, tanto inmediatamente después del tratamiento como
24 horas después de la finalización del mismo.
Los resultados muestran que es posible realizar la separación, detección y
cuantificación de los cuatro fragmentos génicos amplificados mediante GE-ICP-MS, y
que la relación entre cada uno de los genes analizados y el gen de referencia permite
cuantificar las diferencias en la expresión de los tres genes implicados en la respuesta a
cisplatino. Aunque se han encontrado algunas discrepancias en los cambios de expresión
respecto a la información disponible, y aunque serían necesarias más medidas y mejoras
en el método, los resultados obtenidos sugieren que la técnica GE-ICP-MS podría
aplicarse satisfactoriamente al estudio de la expresión génica.
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ABREVIATURAS
Ar Argón
ATP7A/B ATPasa transportadora de cobre alfa/beta (ATPase opper transporting
alpha/beta)
BAD Proteína de muerte agonista de Bcl-2 (Bcl-2-antagonist of cell death)
BAX Proteína X asociada a Bcl-2 (Bcl-2-associated X protein)
BCL-2 Proteína 2 de linfoma de células B (B-cell lymphoma 2)
BID Agonista del dominio de muerte que interactúa con BH3 (BH3 interacting
domain death agonist)
BIM Proteína mediadora de muerte celular que interacciona con Bcl-2 (Bcl-2-
interacting mediator of cell death)
cDNA ADN complementario
C Carbono
Ct Ciclo umbral (Cicle threshold)
cDDP cis-Diaminodicloroplatino(II)
CE Electroforesis capilar
Ctr1 Transportador de cobre 1 (Copper transporter receptor 1)
dNTP Desoxirribonucleótido trifosfato
ERCC1 Proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada
1 (Excision Repair Cross-Complementing 1)
GE Electroforesis en gel
GSH Glutatión
GST Glutatión-s-transferasa
H Hidrógeno
HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia
ICP-MS Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo
JNK c-Jun N-terminal Kinases
mRNA RNA mensajero
MRP2 Proteína transportadora asociada a la resistencia a múltiples fármacos
(Multidrug Resistance Associated Transporter Protein)
MT Metalotioneína
m/z Masa / Carga
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N Nitrógeno
NER Reparación por escisión de nucleótido (Nucleotide Excision Repair)
NSCLC Cáncer pulmonar de células no pequeñas
O Oxígeno
OCT2 Transportador de cationes orgánicos 2 (Organic cation transporter 2)
P Fósforo
pb Pares de bases
POLH Polimerasa η
Pt Platino
RF Radiofrecuencias
RT-qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa reversa
SEM Multiplicador de electrones secundarios
SNP Polimorfismo de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphism)
SP1 Proteína de especificidad 1 (Specificity protein 1)
TLS Síntesis translesión
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ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2
1.1 ICP-MS ................................................................................................................... 4
1.1.1 Cuantificación de ácidos nucleicos mediante ICP-MS .................................... 5
1.1.2 GE-ICP-MS ...................................................................................................... 6
1.2 CISPLATINO ............................................................................................................... 6
1.2.1 Características ............................................................................................... 6
1.2.2 Mecanismo de acción .................................................................................... 7
1.2.3 Resistencias al tratamiento con cisplatino .................................................... 9
2 OBJETIVO ............................................................................................................. 12
3 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 13
3.1 REACTIVOS ................................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.2 CULTIVO CELULAR ....................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.3 TRATAMIENTO CON CISPLATINO ..................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.4 EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE CDNA ...................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.5 DISEÑO DE CEBADORES ................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.6 PCR A TIEMPO FINAL INDIVIDUAL Y MÚLTIPLE ................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
3.7 ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON PLASMA DE ACOPLAMIENTO INDUCTIVO (ICP-MS) .... ¡ERROR!
MARCADOR NO DEFINIDO.
3.8 ANÁLISIS DE LOS DATOS ................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
4 RESULTADOS ......................................................................................................... 13
4.1 EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE CDNA ...................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
4.2 VERIFICACIÓN DE CEBADORES ........................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
4.3 OPTIMIZACIÓN DE REACCIONES MÚLTIPLES E INDIVIDUALES .. ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
4.4 CUANTIFICACIÓN DE FÓSFORO MEDIANTE GE-ICP-MS ...... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
5 DISCUSIÓN ............................................................................................................ 13
6 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 13
7 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 14
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1 INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la técnica más precisa, fiable y rápida disponible para el estudio de
los perfiles de expresión génica es la PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR), que se
ha establecido como método de referencia superando a otros métodos como el Nothern
blot o los microarrays de cDNA (VanGuilder et al. 2008; Derveaux et al. 2010; Kozera &
Rapacz 2013). Ésta técnica permite recoger los datos de la PCR a medida que se van
generando, combinando la amplificación y la detección de los fragmentos génicos en un
solo paso (Wong & Medrano 2005). Antes de realizar la medida de la expresión génica,
se debe copiar el mRNA a cDNA mediante transcripción reversa (RT-qPCR), un paso
crítico para conseguir una buena sensibilidad y precisión en la cuantificación (Kubista
et al. 2006).
La cuantificación en tiempo real es posible gracias a la incorporación de compuestos
fluorescentes que generan una señal que representa la cantidad de producto que se está
formando (Kubista et al. 2006). Durante los primeros ciclos la señal es débil y no se
distingue del fondo, ya que la cantidad de material de partida es pequeña. A medida que
se acumulan los productos, la señal se incrementa exponencialmente. El ciclo en el que
la fluorescencia detectada supera el nivel del fondo se denomina ciclo umbral (cicle
threshold, Ct), y es esta información la que se utiliza en la cuantificación. Llegado un
determinado momento, la señal se satura debido a la escasez de alguno de los
componentes y alcanza una fase de meseta (Kubista et al. 2006; Kozera & Rapacz 2013).
Los compuestos fluorescentes utilizados pueden ser tanto marcadores
inespecíficos como sondas secuencia-específicas. Uno de los más utilizados es el
compuesto intercalante SYBR Green, que se une al DNA de doble cadena de forma
inespecífica (VanGuilder et al. 2008; Kozera & Rapacz 2013). Estos marcadores no
emiten fluorescencia cuando están libres en solución, pero si lo hacen cuando se unen
al DNA (Kubista et al. 2006). Otro tipo de sondas más avanzadas consisten en
oligonucleótidos que generan fluorescencia cuando hibridan con la región
complementaria en el DNA. Estos incluyen sondas de hibridación como las TaqMan, o
sondas estructurales como las molecular beacons, y permiten incrementar la
especificidad de la reacción (Kozera & Rapacz 2013).
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Esta técnica posee múltiples ventajas como son la sensibilidad, la detección en
tiempo real del progreso de la reacción, el amplio rango de cuantificación, la rapidez del
análisis y que no requiere manipulación post-amplificación (Wong & Medrano 2005;
Derveaux et al. 2010; Kozera & Rapacz 2013). Además, cuando la expresión de un gen
es muy pequeña, la qPCR es la única técnica hasta el momento que permite detectar el
bajo número de copias de mRNA (VanGuilder et al. 2008; Kozera & Rapacz 2013).
La principal desventaja de la qPCR es el elevado coste de los equipos y reactivos.
(Wong & Medrano 2005). El compuesto fluorescente más utilizado debido a su menor
coste, SYBR Green, tiene una serie de inconvenientes ya que su unión al DNA de doble
cadena puede llevar a la generación de fluorescencia inespecífica, debido a la formación
de dímeros de cebadores y de productos de PCR no deseados (Soltany-Rezaee-Rad et al.
2015). Además, no admite la realización de reacciones múltiples que permitan
cuantificar varios genes en una única reacción, lo que sí se podría llevar a cabo con las
sondas TaqMan, utilizando un fluoróforo diferente para cada sonda, pero con un coste
muy considerable (Wong & Medrano 2005; Kubista et al. 2006; VanGuilder et al. 2008).
La PCR múltiple consiste en la amplificación simultánea de varias dianas de DNA o
cDNA en una misma reacción, lo que permite un ahorro tanto de tiempo como de
dinero, así como un uso más eficiente de las muestras. Mientras que la PCR a tiempo
final puede abarcar un número muy elevado de amplicones, esa capacidad en qPCR
basada en sondas se limita a un número restringido de reacciones. Esto se debe, por una
parte, a que la mayoría de termocicladores utilizados en qPCR sólo pueden detectar un
número máximo de cuatro fluoróforos diferentes, y por otra, a que la combinación de
cebadores y sondas para reacciones múltiples requiere una gran optimización (Persson
et al. 2005; Zhong et al. 2011).
Por ello, a pesar del uso extendido de la qPCR, se han buscado métodos alternativos
para estudios de cuantificación múltiple. Recientemente, se ha demostrado que la PCR
clásica o a tiempo final combinada con espectrometría de masas con plasma de
acoplamiento inductivo (ICP-MS) y acoplado a una electroforesis en gel (GE) puede tener
utilidad en estudios de cuantificación, en este caso del número de copias génicas
(Iglesias et al. 2014).
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1.1 ICP-MS
La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas más utilizadas en
la actualidad para el estudio de macromoléculas biológicas, debido a su capacidad de
proporcionar información cualitativa y cuantitativa de la composición y estructura de las
mismas con gran sensibilidad y selectividad. Es una técnica basada en la formación de
iones gaseosos a partir de la muestra, y su posterior separación, detección y medida en
función de su relación masa/carga (m/z). Los iones generados pueden ser especies
moleculares, denominándose MS molecular; o atómicas, en cuyo caso se conoce como
MS elemental (López 2015).
La ICP-MS es la espectrometría de masas elemental que utiliza como fuente de
ionización un plasma de acoplamiento inductivo (Inductively Coupled Plasma, ICP), y es
la técnica más utilizada para la determinación del contenido total de elementos traza y
ultratraza en muestras biológicas. Esto es debido a una serie de características como son
su gran sensibilidad (límites de detección de 0,001-0,1 ng·L-1); gran especificidad
elemental e isotópica; capacidad para introducir de forma continua muestras gaseosas
o líquidas; amplios intervalos lineales y capacidad multi-elemental y multi-isotópica
(Łobiński et al. 2006; García 2011; Pröfrock & Prange 2012; López 2015).
En esta técnica, la muestra líquida se introduce en un nebulizador donde se
transforma en un aerosol líquido, que es arrastrado al interior del plasma mediante un
flujo de gas portador (Ar), como se puede ver en la Figura 1. El plasma se genera en una
antorcha de cuarzo que consiste en tres tubos concéntricos a través de los cuales fluyen
corrientes de argón, mediante la aplicación de energía de radiofrecuencias (RF). Por el
tubo central de la antorcha penetra el aerosol de la muestra, que, debido a las altas
temperaturas alcanzadas por el plasma (5000-10000 K), es desolvatado, vaporizado,
atomizado e ionizado, formándose principalmente iones monoatómicos y
monopositivos (Montaser et al. 1998; García 2011; López 2015).
A continuación, es necesario que esos iones sean transferidos desde el plasma al
analizador de masas. Este proceso se realiza mediante una interfase formada por dos
conos metálicos, generalmente de níquel, que se encuentra a vacío moderado (~1-2
Torr). El primero de estos conos de extracción se denomina sampler y el segundo cono
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skimmer. De ahí pasan a un sistema de lentes electrostáticas (zona de alto vacío), que
enfoca el haz de iones hacia un analizador de masas, que puede ser de varios tipos,
aunque generalmente es de tipo cuadrupolo, y en él tiene lugar la separación de los
iones en función de su relación m/z. A la salida del analizador de masas, los iones chocan
con la superficie del detector, normalmente un multiplicador de electrones secundarios
(SEM), en el que cada ion genera un pulso eléctrico (García 2011; López 2015).
Figura 1. Esquema de una fuente de plasma ICP. Tomado de (García 2011).
1.1.1 Cuantificación de ácidos nucleicos mediante ICP-MS
En los últimos años, se ha empleado esta técnica para llevar a cabo estudios de
cuantificación de biomoléculas que contengan, o tengan asociado, uno o varios
heteroátomos, es decir, cualquier elemento distinto de C, O, H y N (García 2011;
Pröfrock & Prange 2012; López 2015). El contenido de fósforo y azufre, ambos
susceptibles a ser medidos mediante ICP-MS, sirve para detectar biomoléculas que
contengan ácidos nucleicos y aminoácidos, respectivamente. Además, la medida del
contenido en fósforo es la técnica más sensible para la determinación de biomoléculas
fosforiladas, como DNA, RNA y proteínas (Leclerc et al. 2013). El fósforo puede ser
medido mediante ICP-MS y está presente en una estequiometría fija y conocida; sin
embargo, la medida de este elemento cuenta con una serie de dificultades. Es un
elemento que se ioniza mal en el plasma y que posee numerosas interferencias
poliatómicas, que están causadas por iones moleculares que tienen los mismos valores
de m/z y están presentes en el plasma de acoplamiento inductivo. Estas interferencias
se pueden solucionar utilizando equipos de alta resolución o doble enfoque, por lo que
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la medida del fósforo total se está realizando cada vez más para la cuantificación de
biomoléculas (Becker et al. 2003; López 2015).
La cuantificación de la cantidad de DNA presente en una muestra mediante ICP-MS
se llevó a cabo por primera vez en 2003 (Becker et al. 2003), y, más recientemente, se
ha aplicado ésta técnica para la cuantificación de Legionella (Leclerc et al. 2013).
También se ha utilizado para la cuantificación de RNA (Fujii et al. 2014), demostrando
que es un método de gran exactitud y precisión para la determinación de fósforo en
pequeñas cantidades en muestras biológicas.
1.1.2 GE-ICP-MS
El ICP-MS posee unas características que lo hacen adecuado para su acoplamiento
a técnicas de separación como HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) o CE
(electroforesis capilar), lo que permite llevar a cabo de forma simultánea la separación,
detección y cuantificación de las biomoléculas (Pröfrock & Prange 2012; López 2015).
Además, en algunos estudios se ha utilizado el acoplamiento de la electroforesis en
gel en tubo con la detección por ICP-MS (GE-ICP-MS). Esta técnica fue desarrollada por
primera vez para la determinación de fragmentos de DNA de doble cadena
comprendidos entre los 100 y los 1000 pb mediante la medida de fósforo (Brüchert &
Bettmer 2005). Desde entonces, se ha utilizado para diferentes aplicaciones como la
determinación de hierro en metaloproteínas, la determinación del grado de
fosforilación de la caseína, la detección de fósforo en fosfoproteínas o el estudio de las
interacciones cisplatino-oligonucleótido, entre otras (Haider et al. 2011).
1.2 CISPLATINO
1.2.1 Características
El cisplatino (cis-diaminodicloroplatino (II), cDDP) ha constituido durante las cuatro
últimas décadas el principal tratamiento en determinados tumores sólidos, y es un
componente esencial en quimioterapias tanto curativas como paliativas (Kilari et al.
2016). Se utiliza frente a una gran variedad de tumores que incluyen el de testículo,
ovario, vejiga, células pequeñas de pulmón (NSCLC) y cabeza y cuello, entre otros
(Amable 2016; Kilari et al. 2016). Este compuesto fue descrito por primera vez en 1845,
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pero sus propiedades anticancerígenas no fueron descubiertas hasta 1964 (Rosenberg
et al. 1965). Los ensayos clínicos comenzaron en 1971, y fue aprobado por la FDA en
1978 con el nombre de Platinol (Reedijk 2003).
El cisplatino es un agente basado en platino que entra en las células mediante
difusión pasiva o por transporte activo a través del transportador de cobre CTR1 o del
transportador de cationes OCT2. Una vez en el interior se une al DNA y produce enlaces
cruzados intra e intercatenarios, que interfieren con la división celular. Estas lesiones en
el DNA impiden que tenga lugar la correcta transcripción y replicación del mismo, lo que
provoca la apoptosis de la célula (Roos & Kaina 2013; Kilari et al. 2016).
La estructura del cisplatino, a diferencia de la de otros fármacos antineoplásicos, es
muy simple. Se trata de una molécula inorgánica con un átomo central de platino (II),
unido a dos átomos de cloro y dos moléculas de amoniaco en posición cis. Las uniones
con los ligandos cloruro, en medio acuoso y bajo determinadas condiciones de pH y
temperatura, son extremadamente lábiles, por lo que se producen reacciones de
hidrólisis con formación de derivados acuo (hidroxi). Estos complejos son muy reactivos
y tienen una fuerte tendencia a sustituir las moléculas de agua por otros ligandos
nucleofílicos con átomos de azufre o nitrógeno donadores de electrones, por los que el
Pt(II) tiene gran afinidad (Reedijk 2003; García 2011).
1.2.2 Mecanismo de acción
En la sangre, el cisplatino está protegido por la alta concentración de iones cloruro,
lo que impide que tenga lugar su hidrólisis y permite que alcance la membrana externa
de las células en su forma neutra. Sin embargo, una vez en el interior celular la
concentración de cloruro es mucho menor, por lo que el cisplatino sufre hidrólisis
perdiendo un ligando de cloruro y formando principalmente un derivado
monoclorohidratado ([Pt(NH3)2Cl(H2O)]+), que puede reaccionar con el DNA y con otras
moléculas en la célula (Jamieson & Lippard 1999; Reedijk 2003). La unión se da
preferentemente con el nitrógeno en posición 7 (N7) de las bases púricas, especialmente
de la guanina, siendo desplazada la molécula de agua y formando así un aducto
monofuncional (Figura 2) (Eastman 1983; Jamieson & Lippard 1999). La pérdida del
segundo ligando de cloruro mediante hidrólisis permite la formación de aductos
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bifuncionales, mediante una nueva unión a N7 de una guanina o adenina adyacente, o
bien de una guanina no adyacente. Estos aductos bifuncionales pueden ser
intracatenarios, cuando se dan entre las bases de una misma cadena de DNA, o
intercatenarios, cuando tienen lugar entre bases de distinta cadena (Eastman 1987;
Jamieson & Lippard 1999).
Figura 2. Aductos inducidos por el cisplatino en el DNA: monofuncionales de guanina, enlaces cruzados intracatenarios G-G, G-A o G-X-G, y enlaces cruzados intercatenarios G-G. Todos ellos pueden llevar a un bloqueo en la replicación o en la transcripción del DNA que finalmente desencadene la apoptosis celular. Modificado de Roos & Kaina (2013).
Los principales aductos que se forman son los enlaces cruzados intracatenarios
guanina-guanina, con una proporción de alrededor del 65%, mientras que los aductos
guanina-adenina suponen un 25%; menos frecuentes son los aductos intracatenarios
entre guaninas no adyacentes y los intercatenarios guanina-guanina, que constituyen
un 5-10%, y los aductos monofuncionales, que suponen aproximadamente el 2% del
total (Kartalou & Essigmann 2001b).
Los aductos formados provocan una modificación de la estructura tridimensional
del DNA, lo que impide que tenga lugar su replicación y transcripción. Si la cantidad de
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lesiones es limitada, pueden ser reconocidas y eliminadas correctamente por varios
sistemas de reparación, gracias a una detención temporal del ciclo celular. Sin embargo,
cuando el daño inducido en el DNA es irreparable, esta detención se vuelve permanente
y las células entran un proceso de muerte celular, en la mayor parte de los casos
apoptosis por vía mitocondrial (Galluzzi et al. 2014).
1.2.3 Resistencias al tratamiento con cisplatino
Existen dos problemas principales asociados al uso del cisplatino en la clínica: la
toxicidad y la resistencia. Este compuesto tiene una serie de toxicidades asociadas, como
daño renal, sordera o neuropatía periférica (Amable 2016). Por otra parte, la utilidad del
cisplatino está limitada por la aparición de resistencia tanto intrínseca como adquirida
(Amable 2016; Kilari et al. 2016). Esta resistencia es compleja y está regulada por una
cascada de eventos que interfieren con alguno de los pasos de su acción citotóxica,
desde la entrada del fármaco en la célula hasta las etapas finales de apoptosis, tal y
como se representa en la Figura 3 (Kilari et al. 2016).
Figura 3. Diferentes mecanismos relacionados con la resistencia al cisplatino. El cisplatino atraviesa la membrana por difusión pasiva o a través de transportadores transmembrana (CTR1, CTR2, OCT2). Una vez en la célula, se puede unir al DNA causando daños que son reparados por el sistema NER, en el cual interviene ERCC1. También se inactiva uniéndose a glutatión (GSH) mediante glutatión-s-transferasas (GST), o a metalotioneínas (MT). Por último, puede ser exportado a través de transportadores como ATP7A y ATP7B o MRP2. Modificado de Amable (2016).
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Así, los siguientes mecanismos están implicados en el desarrollo de dicha
resistencia: reducción de la entrada de cisplatino en la célula, aumento de su excreción,
incremento de las vías de reparación del DNA y de tolerancia, aumento de la inactivación
intracelular del cisplatino y desregulación de la apoptosis (Köberle et al. 2010; Kilari
et al. 2016).
Dentro de los mecanismos de resistencia, uno de ellos está relacionado con los
diferentes niveles de expresión de los mecanismos que controlan la concentración
intracelular de cisplatino, que determina la cantidad de lesiones formadas y por lo tanto
la efectividad de la activación de la apoptosis (Roos & Kaina 2013). Estos cambios
pueden ser debidos a una disminución del flujo de entrada, en el que intervienen
transportadores como CTR1 y OCT2, o a un aumento del flujo de salida, debido a la
sobreexpresión de otros transportadores como MRP2 o ATP7A y ATP7B (Kilari et al.
2016).
CTR1 es una proteína de 190 aminoácidos con tres dominios transmembrana, y es
el transportador de platino más estudiado (Kilari et al. 2016). Diferentes estudios in vitro
han demostrado que la disminución en la expresión de CTR1 conlleva un descenso en
los niveles de platino intracelulares y una mayor resistencia, mientras que una mayor
expresión se asocia a mayor sensibilidad al cisplatino (Kilari et al. 2016). Se han realizado
también estudios en la clínica sobre el papel de CTR1 en la resistencia al cisplatino, en
los que se han evaluado dos tipos de cáncer, el de ovario y el de pulmón. En pacientes
con NSCLC, una expresión indetectable de CTR1 se corresponde con una reducción del
platino intracelular y de la respuesta tumoral (Kim et al. 2014), mientras que en
pacientes con cáncer de ovario, altos niveles de expresión del transportador se
correlacionan con un aumento de la supervivencia libre de enfermedad (Ishida et al.
2010).
La expresión de CTR1 está regulada tanto a nivel transcripcional como post-
transcripcional. El factor de transcripción SP1 (Specificity protein 1) funciona como un
sensor de cobre que regula la expresión de CTR1 en respuesta a variaciones en la
concentración de cobre. Además, en varias líneas celulares la exposición a platino lleva
consigo una disminución de la expresión de CTR1 (Kilari et al. 2016). Por todo ello, CTR1
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tiene gran potencial para ser utilizado como biomarcador predictivo de la sensibilidad al
cisplatino, y además la modulación de su expresión puede constituir una nueva
estrategia terapéutica para aumentar la eficacia de la quimioterapia con agentes de
platino (Kim et al. 2014; Kilari et al. 2016).
En cuanto a la reparación del DNA, los aductos intracatenarios formados debido a
la acción del cisplatino son reconocidos y reparados principalmente por el sistema NER
(Nucleotide Excision Repair). Algunos daños no son reparados, pero las células pueden
tolerarlos mediante el mecanismo de síntesis translesión (TLS), llevado a cabo por un
grupo de DNA polimerasas especializadas, como pol η (POLH), la cual se ha visto en
algunos casos relacionada con la resistencia a cisplatino (Köberle et al. 2010; Amable
2016). Por su parte, el sistema NER implica un gran número de proteínas, que se
encargan de reconocer el daño en el DNA, realizar una incisión a ambos lados de la
lesión, eliminar un oligonucleótido con el daño, sintetizar nuevo DNA copiando la
cadena complementaria para reemplazar el fragmento eliminado y volver a ligar el
fragmento reparado (Sancar 1996).
Concretamente, la proteína ERCC1 (Excision Repair Cross-Complementing 1) forma
un complejo con XPF (ERCC1-XPF) que se encarga de realizar la incisión en 5’ para
eliminar el daño del DNA (Sancar 1996). Existe una correlación entre la expresión de
ERCC1 y la sensibilidad al cisplatino, ya que las células con sistema NER defectivo debido
a mutaciones en este gen son hipersensibles al cisplatino, mientras que las líneas
celulares resistentes expresan más ERCC1 en comparación con las sensibles (Roos &
Kaina 2013; Amable 2016). Las células mutantes para ERCC1 muestran altos niveles de
apoptosis tras el tratamiento con cisplatino, lo que evidencia que la falta de reparación
de las lesiones inducidas por el mismo lleva a muerte celular (Roos & Kaina 2013). Se
han encontrado niveles elevados de mRNA de ERCC1 en pacientes con formas
resistentes de cáncer para una gran variedad de tumores diferentes (Amable 2016).
Por otra parte, la inactivación intracelular de cisplatino provoca la incapacidad del
cisplatino para unirse al DNA, por lo que el daño es menor y las células cancerígenas
sobreviven. La principal forma de inactivación es la conjugación del cisplatino con
glutatión (GSH), lo que lleva a su expulsión de la célula a través de transportadores, o
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bien mediante una segunda forma de inactivación que consiste en su unión a
metalotioneínas (MTs) (Amable 2016). En líneas celulares de cáncer de ovario, cuello de
útero, pulmón, vejiga y embrionario una mayor concentración de GSH se correlaciona
con resistencia a cisplatino (Köberle et al. 2010).
Por último, cambios en las vías de apoptosis también contribuyen a la resistencia
al cisplatino. La apoptosis inducida por el cisplatino puede ocurrir a través de la vía
extrínseca, o a través de la vía intrínseca o de la mitocondria, mediada por proteínas
como las de la vía de señalización de JNK, p53 y proteínas anti- o pro-apoptóticas de la
familia Bcl-2 (Köberle et al. 2010). Las alteraciones en la expresión de reguladores de
apoptosis puede modificar la sensibilidad de las células a la apoptosis por el tratamiento
con cisplatino. Las células que expresen mayores niveles de un inhibidor de apoptosis o
menores de un promotor de apoptosis podrían requerir mayores niveles de daño para
inducir muerte celular (Kartalou & Essigmann 2001a).
La familia Bcl-2 incluye proteínas pro-apoptoticas como BAX (Bcl-2-associated X
protein), BIM (Bcl-2-interacting mediator of cell death), BAD (Bcl-2 antagonist of cell
death) o BID (BH3 interacting domain death agonist). Los estímulos apoptóticos llevan
a la translocación de BAX y BAD a la mitocondria, formando poros que aumentan la
permeabilidad de la membrana y causan la liberación de citocromo c, lo que inicia la
cascada de caspasas que finalmente conduce a la muerte celular (Biagosch et al. 2010).
Debido a sus efectos proapoptóticos, una menor expresión de estas proteínas podría
causar resistencia a cisplatino, lo que se ha visto tanto en líneas celulares de cáncer de
pulmón de células pequeñas como de cáncer de ovario resistentes a cisplatino (Kartalou
& Essigmann 2001a; Biagosch et al. 2010).
A partir de todo lo mencionado hasta el momento, sería interesante desarrollar una
metodología que permita estudiar expresión génica en reacciones múltiples, así como
poner a punto esta técnica para estudiar la expresión de varios genes implicados en la
resistencia a cisplatino.
2 OBJETIVO
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3 MATERIAL Y MÉTODOS
4 RESULTADOS
5 DISCUSIÓN
6 CONCLUSIONES
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7 BIBLIOGRAFÍA
Amable, L., 2016. Cisplatin Resistance and Opportunities for Precision Medicine.
Pharmacological Research, 106, pp.27-36.
Becker, J.S. et al., 2003. Determination of phosphorus in small amounts of proteins
samples by ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 375(375), p.561.
Biagosch, J., Huber, R.M. & Bergner, A., 2010. Reduced expression of Bax in small cell
lung cancer cells is not sufficient to induce cisplatin-resistance. European journal of
medical research, 15(10), pp.448-451.
Brüchert, W. & Bettmer, J., 2005. On-line coupling of gel electrophoresis and inductively
coupled plasma-sector field-mass spectrometry for the determination of dsDNA
fragments. Analytical Chemistry, 77(15), pp.5072-5075.
Derveaux, S., Vandesompele, J. & Hellemans, J., 2010. How to do successful gene
expression analysis using real-time PCR. Methods, 50(4), pp.227-230.
Eastman, A., 1983. Characterization of the adducts produced in DNA by cis-
diamminedichloroplatinum(II) and cis-dichloro(ethylenediamine)platinum(II).
Biochemistry, 22(16), pp.3927-3933.
Eastman, A., 1987. The formation, isolation and characterization of DNA adducts
produced by anticancer platinum complexes. Pharmacology & Therapeutics, 34,
pp.155-166.
Elmore, S., 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic pathology,
35(4), pp.495-516.
Espina, M. et al. Cisplatin resistance analysis: insights on the usefulness of accurated
DNA adducts quantitation. Enviado para su publicación.
Feldmann, I. et al., 1994. Performance characteristics of inductively coupled plasma
mass spectrometry with high mass resolution. Journal of Analytical Atomic
Spectrometry, 9(9), p.1007.
Ferry, K. V, Hamilton, T.C. & Johnson, S.W., 2000. Increased nucleotide excision repair in
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
15
cisplatin-resistant ovarian cancer cells: role of ERCC1-XPF. Biochemical
pharmacology, 60(9), pp.1305-1313.
Fujii, S. et al., 2014. Separation and quantification of RNA molecules using size-exclusion
chromatography hyphenated with inductively coupled plasma-mass spectrometry.
Electrophoresis, 35(9), pp.1315-8.
Galluzzi, L. et al., 2014. Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future.
Cell death & disease, 5(e1257), pp.1-18.
García, D., 2011. Cuantificación de aductos de ADN inducidos por cisplatino y evaluación
del efecto de la selenometionina en la nefrotoxicidad del fármaco in vivo. Oviedo.
Haider, S.R., Sharp, B.L. & Reid, H.J., 2011. On-line coupling of gel electrophoresis and
inductively coupled plasma-mass spectrometry. Trac-Trends in Analytical
Chemistry, 30(11), pp.1793-1808.
Iglesias, T. et al., 2014. Enhanced detection of DNA sequences using end-point PCR
amplification and online gel electrophoresis (GE)-ICP-MS: Determination of gene
copy number variations. Analytical Chemistry, 86(22), pp.11028-11032.
Ishida, S. et al., 2010. Enhancing Tumor-Specific Uptake of the Anticancer Drug Cisplatin
with a Copper Chelator. Cancer Cell, 17(6), pp.574-583.
Ishida, S. et al., 2002. Uptake of the anticancer drug cisplatin mediated by the copper
transporter Ctr1 in yeast and mammals. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 99(22), pp.14298-14302.
Jamieson, E.R. & Lippard, S.J., 1999. Structure, Recognition, and Processing of Cisplatin-
DNA Adducts. Chemical reviews, 99(9), pp.2467-98.
Kartalou, M. & Essigmann, J.M., 2001a. Mechanisms of resistance to cisplatin. Mutation
Research, 478, pp.23-43.
Kartalou, M. & Essigmann, J.M., 2001b. Recognition of cisplatin adducts by cellular
proteins. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of
Mutagenesis, 478, pp.1-21.
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
16
Kilari, D., Guancial, E. & Kim, E.S., 2016. Role of copper transporters in platinum
resistance. World J Clin Oncol, 7(1), pp.106-113.
Kim, E.S. et al., 2014. Copper transporter CTR1 expression and tissue platinum
concentration in non-small cell lung cancer. Lung Cancer, 85(1), pp.88-93.
Köberle, B. et al., 2010. Cisplatin resistance: Preclinical findings and clinical implications.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer, 1806(2), pp.172-182.
Kozera, B. & Rapacz, M., 2013. Reference genes in real-time PCR. Journal of Applied
Genetics, 54(4), pp.391-406.
Kubista, M. et al., 2006. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of
Medicine, 27(2-3), pp.95-125.
Leclerc, O. et al., 2013. Method development for genomic Legionella pneumophila DNA
quantification by inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical
biochemistry, 435(2), pp.153-8.
Li, X. et al., 2015. Identification of appropriate reference genes for human mesenchymal
stem cell analysis by quantitative real-time PCR. Biotechnology Letters, 37(1),
pp.67-73.
Łobiński, R., Schaumlöffel, D. & Szpunar, J., 2006. Mass spectrometry in bioinorganic
analytical chemistry. Mass Spectrometry Reviews, 25(2), pp.255-289.
López, L., 2015. Desarrollo de metodologías analíticas para la determinación de
moléculas de ácidos nucléicos basadas en la técnica de ICP-MS. Oviedo.
Montaser, A. et al., 1998. An Introduction to ICP Spectrometries for Elemental Analysis.
En A. Montaser, ed. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Washington,
DC: Wiley-VCH, pp. 1-31.
Muscolini, M. et al., 2008. Trichostatin A up-regulates p73 and induces Bax-dependent
apoptosis in cisplatin-resistant ovarian cancer cells. Molecular Cancer Therapeutics,
7(6), pp.1410-1419.
Persson, K., Hamby, K. & Ugozzoli, L.A., 2005. Four-color multiplex reverse transcription
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
17
polymerase chain reaction - Overcoming its limitations. Analytical Biochemistry,
344(1), pp.33-42.
Pröfrock, D. & Prange, A., 2012. Inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS)
for quantitative analysis in environmental and life sciences: A review of challenges,
solutions, and trends. Applied Spectroscopy, 66(8), pp.843-868.
Reedijk, J., 2003. New clues for platinum antitumor chemistry: kinetically controlled
metal binding to DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 100(7), pp.3611-6.
Roos, W.P. & Kaina, B., 2013. DNA damage-induced cell death: From specific DNA lesions
to the DNA damage response and apoptosis. Cancer Letters, 332(2), pp.237-248.
Rosenberg, B., Van Camp, L. & Krigas, T., 1965. Inhibition of cell division in Escherichia
coli by electrolysis products from a platinum electrode. Nature, 205, pp.698-99.
Sancar, A., 1996. DNA excision repair. Annual review of biochemistry, 65, pp.43-81.
Selvakumaran, M. et al., 2003. Enhanced cisplatin cytotoxicity by disturbing the
nucleotide excision repair pathway in ovarian cancer cell lines. Cancer Research,
63(6), pp.1311-1316.
Selvey, S. et al., 2001. Beta-actin--an unsuitable internal control for RT-PCR. Molecular
and cellular probes, 15(5), pp.307-11.
Soltany-Rezaee-Rad, M. et al., 2015. Comparison of SYBR Green and TaqMan real-time
PCR methods for quantitative detection of residual CHO host-cell DNA in
biopharmaceuticals. Biologicals, 43(2), pp.130-135.
VanGuilder, H.D., Vrana, K.E. & Freeman, W.M., 2008. Twenty-five years of quantitative
PCR for gene expression analysis. BioTechniques, 44(5), pp.619-626.
Wong, M.L. & Medrano, J.F., 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation.
BioTechniques, 39(1), pp.75-85.
Zhong, Q. et al., 2011. Multiplex digital PCR: breaking the one target per color barrier of
quantitative PCR. Lab on a Chip, 11(13), p.2167.
MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ
18
Zisowsky, J. et al., 2007. Relevance of drug uptake and efflux for cisplatin sensitivity of
tumor cells. Biochemical Pharmacology, 73(2), pp.298-307.