Date post: | 17-Jul-2015 |
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Health & Medicine |
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Italia-VenezuelaResultados del proyecto
conjunto en el diagnostico
serologico del
Mal de Chagas2009-2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
COLABORADORES Lic. Franca Pace Instituto Inmunologia
UCV
Lic. Anny Perez Instituto Medicina
Tropical
Lic. Vanessa Nardelli Byo Latin America
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Emb. Luigi Maccotta
Dr. Alfredo Giorgi
Dr. Piero Di Dio
Un profundo Agradecimiento:
Mal de Chagas
Dr. Isaac Blanca
Dra. Belkisyolè de Noya
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
BIO GENETIX srl
Unipersonale
Byo
Research
Srl
Universidad
Central de Venezuela
Facultad
Medicina UCV
Instituto de Medicina
Tropical, Sección de
Immunología
Spin-off
Consiglio Nazionale
delle Ricerche (CNR)
Istituto di neurobiologia
e medicina molecolare
(INMM)
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Byo
Research
Srl
Instituto de Medicina
Tropical
Sección de Immunología
Mal de Chagas
… LA HISTORIA
CONTINUA
Desarrollo y validacion
de un
test serologicopara el
Mal de Chagas
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Mal de Chagas
Instituto de Medicina Tropical
Sección de Immunología
Byo
Research
Srl
Por Què Juntos?
Know-how venezolano
Diagnòstico de Chagas confiable
aplicado a una tecnologìa automatizada
multiparamètrica y cuantitativa
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Analisis directo – Bùsqueda del
Trypanosoma cruzi
1. Anàlisis al microscopio òptico
2. QBC (Quantitative Buffy Coat)
3. Hemocultivo
4. Xenodiagnòstico
5. PCR (Polymerase Chain Reaction)
FASE
AGUDA
ALTA
ESPECIFICIDAD
BAJA
SENSIBILIDAD
LAR
GA
COMPLEJ
A
COSTOS
A
METODOS DIAGNOSTICOS
Mal de Chagas
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Anàlisis serologico – Bùsqueda de Ac anti-
T. cruzi
1. IHA (Indirect Haemagglutination Assay)
2. IFA (Immuno Fluorescence Assay)1. Rapid Immunochromatographic Assay
2. RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)3. ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) 3. Immunoblot
TEST CONVENCIONALES TEST NO CONVENCIONALES
Test immunològicos
OTROS TEST
ALTA
SENSIBILIDAD
Y
ESPECIFICIDAD
RAPID
A
FACIL ECONOM
ICA
Ag: paràsito completo – extractos solubles o
purificados - epimastigote
Diagnosi del Mal de Chagas
4. Reacciòn de fijaciòn del complemento
Ag: Recombinante o pèptidos sinteticos
FASE
CRONICA
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Mal de Chagas
Exigencias en el diagnòstico de Chagas
Screening en donantes fase crònicapara evitar una
difusiòn de la enfermedad en poblacion no endèmica
Screening en poblaciòn asintomàtica (endèmica) fase
crònica para un tratamiento clìnico/farmacològico
antes de la apariciòn de la sintomatologìa cardìaca e
intestinal
Epidemiafase aguda
Tratamiento
clìnico/farmacològico correcto y
tempestivo
Follow-up tratamiento farmacològico
Screening en mujeres endèmicas embarazadas fase
crònica para evitar el contagio del feto con
consecuente muerte intrauterina, parto prematuro o
lesiones orgànicas al fetoCaracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Mal de Chagas
Puntos Crìticos en el diagnòstico de
ChagasAusencia de un test de referencia internacional
(Gold Standard)
T. cruzi I – regiones al norte de la Amazonia
(ciclo selvàtico – menos resistentes a fàrmacos)
Reacciòn Cruzada con otras enfermedades infecciosas: Leishmaniasis, Malaria, Lepra, EBV y enfermedades
autoinmunes (i.e. LES)
Existencia de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi
(alta diversidad genètica)
T. cruzi II - regiones al sur de la Amazonia
(ciclo domèstico – màs resistentes a fàrmacos)IIa – IIb – IIc – IId
T. cruzi III (de Freitas et al., 2006)
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Còmo diagnosticar Mal de Chagas (OPS – OMS)
TEST
CONVECIONALES
TEST
NO-CONVENCIONALES
TargetELISA IFA IHA
Ag
recomb.PCR
Evidencias serològicas
(2 test) -Screening en donantes
(1 test) - - - -Transmision placentaria
y perinatal (2 test) - Follow-up tratamiento
farmacològico (2 test) -
Mal de Chagas
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Byo
Research SrlInstituto de Medicina
Tropical
Sección de Immunología
Test ELISA
Ricerca Ab
anti-Trypanosoma cruzi
Fase solida
Ag
EE E E E E
Ac IgG Anti-T. cruzi
Ag Purificado
o
Ag Recombinante
o
Ambos?
Mal de Chagas
Caracas, 12 giugno 2010
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Automatizado
Multiparàmetrico
(Chagas, Dengue, Malaria etc.)
Cuantitativo
Efficient New Enzymatic Antigen SYSTEM
ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale
Caracas, 12 giugno 2010
Mal de Chagas
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale
Test Automatizado – 150 anàlisis 90 min
Cuantitativo (U/ml)
Multiparàmetrico
Anàlisis de varios paràmetros simultàneamente
-Test Chagas con Ag Recombinante (TcF)
-Test Chagas con Ag Puro Entero (IMT)
Caracas, 12 giugno 2010
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
AB
S
U/ml
Mal de Chagas
Antìgeno recombinante - TcFpolipèptido de fusiòn producido con E. coli formado por 4
pèptidos inmunoreactivos identificados mediante libreria
de cDNA del Trypanosoma cruzi
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Antìgenos:
Antìgeno purificado entero - IMTExtracto total del epimastigote
Caracas, 12 giugno 2010
Mal de Chagas
Ag Recombinante - TcF
Ag Puro Entero - IMT
A.C.E. – Allergen/Antigen Chamber Enzymatic
FASE SOLIDA
5 micropozos ACE (55 ul) al que se le adhiere el antìgeno especìfico
15
mm
25
2
Caracas, 12 giugno 2010Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Mal de Chagas
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Positivos – en lo posible Fase Aguda/Crònica
Negativos – zonas endèmicas y no-endèmicas
Positivos a otras enfermedades diferentes al Chagas que podrìa cross-
reaccionar: Leishmaniasis, Trypanosoma rangeli, otras enfermedades
infecciosas (i.e. EBV, Malaria) enfermedades autoinmunes (i.e. LES)
Sensibilidad clìnica/relativa
Especificidad clinica/relativa
Caracterizaciòn clìnica
Caracterizaciòn serològica con una metòdica de
referencia
Especificidad analìtica – cross reacciòn
PANEL MUESTRAS
Mal de Chagas
Sueros positivos Chagas IgG
n=13 Poblaciòn endèmica venezolana
Sueros caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT e HIA
IMT en el IDI-UCV Caracas - Venezuela
Sueros negativos Chagas IgG
n=25 Poblaciòn no-endèmica italiana
Sueros provenientes de la seroteca BYO GENETIX srl – Trieste – Italia
PANEL SUEROS
RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Sueros positivos Chagas IgG - n = 100
Caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT y HIA IMT
Sueros negativos Chagas IgG – Poblacion endèmica - n = 99
Caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT
PANEL DE SUEROS
Sueros negativos Chagas y positivos para otras
enfermedades:
- Leishmaniasis n=21
- Malaria n=5
- Tiroiditis Autoinmune n=5
- Mononucleosis n=5
- Sifilis n=19
Realizada en el Laboratorio del IDI-UCV
Caracas - Venezuela
VALIDACION EXTERNA antigeno TcF
Caracas, 12 giugno 2010
Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
AB
S
sieri negativi
n=25
sieri positivi
n=13
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Cut off 150
Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%
Cut off 250
Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%
VALIDACION EXTERNA antìgeno TcF
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Cut-off 150
sensibilità 99% - specificità 70%
Cut-off 250
sensibilità 99% - specificità 96%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
AB
S
Sieri
negativi (n=99)
Sieri
positivi(n=100)
Cut-off 410
Sensibilidad 98% - Especificidad 99%
Cut-off 270
sensibilidad 99% - specificidad 97%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
AB
S
Sieri
negativi (n=85)
Sieri
positivi(n=84)
VALIDACION EXTERNA antigeno TcF
0
100
200
300
400
500
600
Cut-off 150
sensibilità 99% - specificità 69%
Cut-off 250
sensibilità 99% - specificità 96%
Cut-off 410
sensibilidad 99% - especificidad 100%
Cut-off 270
sensibilidad 99% - especificidad 98%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
AB
S
Sieri
negativi (n=99)
Sieri
positivi(n=100)
VALIDACION EXTERNAAntìgeno TcF
Leishmaniosis
(n=21)
Malaria
(n=5)
Tiroidite
Autoimmune(n=5)
Mononucleosi
(n=5)Sifilide
(n=19)
410250
CROSS-REACTIVIDAD
0.0% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2%4.3% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2%
Sueros positivos Chagas IgG:
n = 10 Poblaciòn endèmica residente en Venezuela
Caracterizados serologicamente mediante test ELISA IMT en el IDI - Caracas
PANEL DE SUEROS
VALIDACION INTERNAAg recombinante TcF
Ag purificado entero IMT
n = 64 Poblaciòn no endèmica residente en Italia
Donantes de sangre
n = 20 Poblacion endèmica residente in Italia
Sueros caracterizados mediante test ELISA con Ag recombinantes y Rapid Test
Inmunocromatogràfico en el CMT – Negrar – Verona – Italia
Sueros negativos Chagas IgG:
n = 30 Poblacion endèmica residente en Venezuela
Suero caracterizado mediante test ELISA IMT y HIA IMT en el IDI – Caracas
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Realizada en Byo Research srl
0
100
200
300
400
500
600
Cut-off 300
Sensibilidad 98% - Especificidad 100%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
AB
S
Sieri
negativi(n=74)
Sieri
positivi(n=50)
Cut-off 200
Sensibilidad 98% - Especificidad 100%
VALIDACION INTERNA antìgeno TcF
VALIDACION INTERNA antìgeno IMT
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
AB
S
Sieri
negativi(n=74)
Sieri
positivi(n=50)
0
100
200
300
400
500
600
Cut-off 300
sensibilidad 96% - especificidad 99%
Cut-off 200
sensibilidad 100% - especificidad 96%
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Sieri
negativi(n=99)
Sieri
positivi(n=100)
Antigene TCF (Validazione esterna)
Discusion de los resultados
sensibilità 98%
specificità 100%
VPP 100%
VPN 99%
sensibilità 100%
specificità 96%
VPP 94%
VPN 100%
Antigene IMT
0
100
200
300
400
500
600
Sieri
negativi
(n=74)
Sieri
positivi
(n=50)
Antigene TCF
0
100
200
300
400
500
600
Sieri
negativi
(n=74)
Sieri
positivi
(n=50)
N 148
Donatore
N 148
Donatore
N 60
Venezuela
N 115
Donatore
N 17
Venezuela
N 101
Negrar
N 17
Venezuela
N 101
Negrar
N 53
Venezuela
N 60-115
Venezuela
270
410
N 53
Venezuela
Luego optimizaciòn de la fase sòlida Y del tampone di dilucion sueros
Validacion Interna
Cut-off 270
sensibilità 99%
specificità 97%
Cut-off 410
sensibilità 98%
specificità 99%
Reproducibilidad del test
CV% < 20% en sueros bajos positivos
Caracas, 12 giugno 2010Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy
Analisis Cuantitativo Mal de Chagas
Cut-off TcF
200 – 300 ABS
0.08 – 0.11 U/ml
Cut-off IMT
200 – 300 ABS
0.11 – 0.15 U/ml
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
AB
S
U/ml
Curva STD su IMT
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
AB
S
U/ml
Curva STD su TcF
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Diagnostico Mal de Chagas
n = 30 sueros positivos
n = 10 sueros
negativos y = 0,804x + 200,6R² = 0,785
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Ag
IMT
Mic
rop
iast
ra 9
6 p
ozz
ett
i
Ag IMT ENEASYSTEMIII
Correlacion test ENEASYSTEM III y Microplaca (96 pozos)
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
sensibilidad 98%
Especificidad 96%
Antìgeno Recombinante
Antìgeno Entero Puro
50 sueros positivos 30 venezolanos y 20 de poblaciòn endèmica residente en
Italia:
75 sueros negativos 10 venezolanos y 65 donantes Italianos:
Especificidad 100%
1 suero falso negativo – venezolano
0 sueros falsos negativos
sensibilidad 100%
0 sieri falsi positivi Antìgeno Recombinante
3 sueros falsos positivos – 2 donantes italianos y 1 venezolano
Antìgeno Entero Puro
Positivos
Negativos Antìgeno Recombinante
Antìgeno Entero Purificado
CONCLUSION
Diagnòstico Mal de Chagas
Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010
Byo
Research Srl
Instituto de Medicina
Tropical Sección de
Immunología Caracas -
Venezuela
Centro Malattie Tropicali
Ospedale Sacro Cuore Don
Calabria
Negrar – Verona - Italia
Diagnòstico Mal de Chagas
…LA HISTORIA
CONTINUA …1. Aumentando el panel de sueros
Positivos, Negativos y Cross-
Reactivos;2. Desarrollando el test para las IgM
(fase aguda)